JPS62259063A - Ｃ−反応性蛋白質の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｃ−反応性蛋白質を定量する方法に関するも
のである。

（産業上の利用分野） 一般に、Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ７ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐ
ｒｏｔａｉｎ。

以下ＣＲＰという）は各種感染症や炎症性疾患の患者血
中には正常人と比較して多量に含まれているため、臨床
検査の分野では、これら病気の診断によく測定される項
目の一つになっている。

また、各種の癌でも血中ＣＲＰ量が増加することがわか
っており１．癌の診断、特に手術後の予後のモニターリ
ングに測定されるようになってきている。

しかしながら、血中のＣＲＰの含量は少なく、酵素のよ
うにそれ自体の活性により分析できるものではないたや
に、ＣＲＰと特異的に結合する抗体もしくは抗血清を用
いて毛細管法、−次元免疫拡散法、免疫比濁法、ラテッ
クス凝集反応等で測定されることが多い。

（従来の技術） これらの抗血清を用いた測定法は、理論的には共通した
原理によっている。

即ち、抗原であるＣＲＰと抗体が結合すると大きな免疫
複合体となり、肉眼でも濁りとして確認できる様になる
現象を利用して、ＣＲＰは測、定されている。

この濁りの量は、抗原の量に依存し、ある特定の領域で
は抗原の量が増すにつれて濁り度合いも増す、この濁り
の量を沈殿物として、沈殿物の量を毛細管中の高さで判
断するのが毛細管法である。

また、この濁りの発生量をアガロースゲル中で、濁りの
量の広がりで見るのが一次元免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）
である、また、キューペット中の濁りの量を透過する光
の減少で測定するのが免疫比濁法であり、濁りにより乱
反射する光の量の増加量を測定するのがネフェロメトリ
ーである。

また、ラテックス凝集反応は、直径数μＩ１１〜０．１
μｍ程度のポリスチレン等の微粒子に抗体を感作させて
、抗原と結合した場合の濁りの発生量が、抗体だけを用
いた場合よりも大巾に増大する測定感度の高い方法であ
るが、原理的には同様である。

これら抗原体反応による濁りを測定する反応には原理的
にどうしても解決しえない欠点がある。

１つは、プレゾーン現象と呼ばれ、もう一つはプロゾー
ン現象と呼ばれるものである。

プレゾーン現象とは抗原量が低濃度の場合、免疫複合体
が小さすぎて濁りとして検出しえない現象をいうが、こ
のことは低濃度の抗原は測定できないことを意味してい
る。さらに大きな開運であるプロゾーン現象とは、抗体
の等量以上の高濃度の抗原では、抗Ｍｆｉが増えるにつ
れ逆に濁りが減少してゆく現象である。このことは、Ｃ
ＲＰの血中濃度測定に際して、ＣＲＰ濃度が高く、すぐ
にでも適切な処置を必要とする患者でも、実際よりかな
り低い測定値しか得られないことがあることを意味し、
濁りによるＣＲＰ免疫反応測定の最大の欠点となってい
る。

そこでプロゾーン現象を解決する目的で種々の試みがな
されている。たとえば、濁り度を測定し終った反応混液
中にさらに抗原であるＣＲＰを追加し、濁りがさらに上
昇するのか逆に減少するのかによってプロゾーン現象で
あるのかどうかを判断するといった方法があるが、かな
り繁雑であり、一般的ではない。

さらに抗体は、ＣＲＰを動物に免疫投与して得るもので
あるから動物個体差によって品質もまちまちであり、プ
レゾーン現象、プロゾーン現象の表れ方もまちまちで、
ｍ定値自体も大巾に変動するし、また同じ個体でも抗体
の採取時によっても性能が変化するなどの欠点がある。

゛ そこで、濁り度を測定する試薬の組成を組み立てる際に
は、目的に合った抗体の選択から始まってかなり繁雑な
操作を必要とする欠点もあるのである。

（問題を解決する手段） そこで、抗体以外でＣＲＰと特異的に結合する物質とし
てリン脂質の前駆体であるホスホリルコリン（Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、以下、　ｐｃと略記する
こともある）がある、ＰＣはカルシウムイオンの存在下
ＣＲＰと特異的に結合することが知られており、ＰＣを
多数結合した水溶性高分子化合物は、ＣＲＰ　　と結合
して濁りを発生することが知られている（Ｏｌｉｖａｉ
ｒａ、　Ｅ、　Ｂ、　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉａｍｕｎ
ｏｌ、、　１２１３９６　（１９８０））。

本発明者らは、ＰＣを多数結合した水溶性高分子化合物
を、抗体の代りとしてＣＲＰの定量に活用し、上記の問
題点を解決すべく鋭意研究した結果、ｐｃを多数結合し
た水溶性高分子化合物は、ＣＲＰの量に応じて濁りを発
生し、ＣＲＰの定量に用いうろこと、及び、抗体と共存
させた場合プロゾーン現象が回避できることを見い出し
１本発明を完成した。

本発明は、ホスホリルコリンを結合した高分子化合物を
含む組成物とＣ−反応性蛋白質を反応させ、生じた濁り
を測定することを特徴とするＣ−反応性蛋白質の定量方
法である。

また１本発明はホスホリルコリンを結合した高分子化合
物とＣ−反応性蛋白質に対する特異抗体の両方を含む組
成物とＣ−反応性蛋白質を反応させ、生じた濁りを測定
することを特徴とするＣ−反応性蛋白質の定量方法であ
る。

すなわち１本発明はｐｃを高分子化合物に結合した結合
物を抗体の代りに用い、ＣＲＰとこの結合物との複合体
を濁り度合いで測定しようとするものであり、さらには
、ＰＣを高分子化合物に結合した結合物を抗体と共存さ
せることにより、抗原抗体結合物を濁り度合いで測定す
る際のプロゾーン現象を回避する手段を提供するもので
ある。

本発明において、ＰＣ及び、ＰＣと高分子化合物との結
合方法は純粋な化学反応に依るためつねに品質の一定し
たものが得られ、そのため抗体に見られる様なロット開
蓋はほとんど無視することができる。また、高分子化合
物の分子の大きさは、目的に応じて選択できるのでかな
り低い濃度のＣＲＰの定量から高い濃度のＣＲＰの定量
まで可能となるなど、従来の抗体のもつ欠点をほとんど
カバーすることが可能となるものである。また、試薬の
安定性という点についても、ＰＣは、抗体のような生理
活性蛋白質ではないので、試薬の安定化にすぐれてる。

また、プロゾーン現象を回避することが出来るというこ
とにより、誤った測定値を出す心配が無くなり、この事
は、医療ミスを防止しつるという重大な利点がある。

本発明に用いる高分子化合物は、生体成分である蛋白質
や多糖体、核酸や１合成高分子化合物であるポリスチレ
ン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミンなど水
溶性のものもしくは微粒子として水溶液中に分散させる
ことの可能なものが用いられるが、ＰＣと化学的に結合
させるために、分子表面にアミノ基、カルボキシル基、
　ＯＨ基など化学結合に用いる基があるかもしくは導入
しうるちのである必要がある。また、ＰＣをこれら高分
子化合物に導入する方法についてはすでに種々報告させ
ておりいづれの方法を用いてもよい（Ｒｏｂａｙ。

Ｆ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｔｅｎ−Ｙｕｎｇ　Ｌｉｕ、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５６゜９６９　（１
９８１））。

更に、本発明に用いる高分子化合物としては血清アルブ
ミン、卵白アルブミン、カゼインなどの比較的安価で高
純度のものであって多量に入手しえるものが好ましい。

これら可溶性蛋白質に対し、ホスホリルコリンの誘導体
でアルデヒド基を有するコリンホスホリルグリコアルデ
ヒドは、蛋白質のアミノ基と、還元的アミノ化反応によ
り反応し、炭素原子２個分のスペーサーのついた形でホ
スホリルコリンを導入することができる。

そのためには次の式（１）で表される コリンホスホリルグリコアルデヒドと可溶性蛋白質１例
えば市販の牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略するこ
とがある）とを緩衝液中で還元アミノ化反応を行なえば
よい、還元剤としては、ジメチルアミンボラン、シアノ
水素化はう素ナトリウムなどがあるが、シアノ水素化は
う素ナトリウムが。

一般的である０反応は３７℃程度に加温し、　１０〜３
０時間の反応によって、可溶性蛋白質のアミノ基に式（
１）の化合物が結合する。

反応後は、水に対して透析し、未反応低分子化合物を除
去し、透析内液を凍結乾燥し、ホスホリルコリン誘導体
（ＰＣ−誘導体）を粉末で得ることができる。

得られたホスホリルコリン誘導体は、適宜水に溶屏して
、ＣＲＰの測定に供することができる。

また１本発明で使用するＣ−反応性蛋白質に対する特異
抗体としては、抗ＣＲＰ　ＩｇＧであればその給源はい
ずれでもよい。

濁りの判定方法は、従来がら免疫反応にて用いられてい
る毛細管法、免疫比濁法、レーザーネフェロメトリーな
どいづれかの方法を用いても達成することができる。

次に本発明の製造例及び実施例を示す。

以下に示すのは、高分子化合物にウシ血清アルブミンを
用い、そこにホスホリルコリンを結合させたホスホリル
コリン−ＢＳＡ結金物を用いてＣＲＰを測定する方法で
ある。

製造例１゜ ＰＣ５５ＢＳＡの製造： ＳＯ＋ｍＭのＬ−グリセロホスホリルコリン水溶液５２
ｒａｎにメタ過ヨウ素酸ナトリウムを終濃度１００ｍＭ
となるように溶解し、室温で３０分間放置することによ
り、コリンホスホリルグリコアルデヒドとホルムアルデ
ヒドの混合生成物を得た０次に、この混合生成物を水浴
中で２時間冷却し、加えた過ヨウ素酸と等モル量のエチ
レングリコールを加え乾固した。得られた白色の粉末を
０．ＩＭの酢酸１０ｍｆｌに溶解しＱ、　１Ｍ酢酸であ
らかじめ平衡化しておいたセファデックスＧ−７５（フ
ァルマシア社製）カラムでゲルロカを行なった。ネオカ
プロイン法で確認したコリンホスホリルグリコアルデヒ
ド溶出画分を集め濃縮した６分子内リン酸残基を定量す
ることによりコリンホスホリルグリコアルデヒドのＬ−
グリセロホスホリルコリンよりの収率を求めたところ８
０％であった。

ここに得られたコリンホスホリルグリコアルデヒド１０
８ｍｇを０．２Ｍリン酸バッフｙ　−（ｐＨ７，０）の
溶液７０ｍＱに溶解し、さらに牛血清アルブミンを４０
ｍｇ加えた１次にシアノ水素化ホウ素ナトリウム９００
．３Ｂを加え、３７℃で２０時間インキュベートした。

インキュベート後１反応液を水に対して透析し、透析内
液を凍結乾燥することによりホスホリルコリンとＢＳＡ
の結合物を得た。　ＢＳ’Ａ　１分子につき平均５５分
子のホスホリルコリンが結合した誘導体であった。

この誘導体をＰＣ５５ＢＳＡとした。

実施例１゜ ０．１％のＮａＮ３を含むリン酸バッファー（１０１ｎ
Ｍ、ｐ）１７．２）２ｍ１１に、ｌＩＩＩｇ／ｍＱのＰ
Ｃ５５−ＢＳＡを１００　μＱ加えて、６本用意する。

それぞれにＯｍｇ／＋１から０．２４ｍｇ／＋４の種々
の濃度のＣＲＰを含む標準血清１００μΩを加え、２５
℃で８分間反応させた後の３４０ｎｍの吸光度を測定す
る。

得られた標準曲線は第１図に示されるが、ＣＲＰの濃度
がきわめて正確に測定できるのが分る。

実施例２゜ ０．１％ＮａＮ、を含むリン酸バッファ　　（１０ｍＭ
、ｐＨ７゜２）０．５＋ｍＱに、　１０ｍｇ／ｍＲの抗
ＣＲＰＩｇＧ（ヤギ）の５０μＱ又はリン酸バッファー
（ｌｏｍＭ、ｐＨ７，２）５０μＱを加え、そこに１〜
３０ｍｇ／ｍｌ！のＰＣ５５−ＢＳＡを２５μＱもしく
はリン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７，２）２５μＱ
加える。

そこにリン酸バッファー（ｌｏｍＭ、ｐＨ７，２）に溶
解したＯ〜１．５ｍｇ／−の　ＣＲＰ２５１１を加え２
５℃で１時間反応した後、　３４０ｎｍの吸光度を測定
する。

結果は第２図に示される。　　　　− 第２図からＣＲＰの濃度が高くなっても、プロゾーン現
象が起っていないのが分る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で求めた標準曲線を示す図で。 第２図多士実施例２で求めた標準曲線を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ホスホリルコリンを結合した高分子化合物を含む
   組成物とＣ−反応性蛋白質を反応させ、生じた濁りを測
   定することを特徴とするＣ−反応性蛋白質の定量方法。
2. （２）ホスホリルコリンを結合した高分子化合物とＣ−
   反応性蛋白質に対する特異抗体の両方を含む組成物とＣ
   −反応性蛋白質を反応させ、生じた濁りを測定すること
   を特徴とするＣ−反応性蛋白質の定量方法。
3. （３）高分子化合物がアルブミンである特許請求の範囲
   第１項記載のＣ−反応性蛋白質の定量方法。
4. （４）高分子化合物がアルブミンである特許請求の範囲
   第２項記載のＣ−反応性蛋白質の定量方法。