CN105158474A - 一种用于检测血清her2的试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测血清HER2的试剂盒及用途。所述试剂盒包括配对的抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗和生物素化的A18。本发明还提供了抗HER2抗体和血清专用样品稀释液在检测血清HER2中的用途以及在制造用于检测血清HER2的试剂盒中的用途。本发明可以作为一种无创伤性、简便、迅速的诊断和监测HER2阳性肿瘤病程发展的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域。具体地说,本发明涉及一种用于检测肿瘤患者尤其是乳腺癌血清中的表皮生长因子受体2(HER2)含量的试剂盒及其用途,例如用于通过酶联免疫吸附法(ELISA)来检测乳腺癌患者血清中的HER2含量的试剂盒及其用途。更具体的说,本发明涉及一种在通过可定量检测肿瘤患者尤其是乳腺癌患者血清中HER2的量的一种ELISA检测方法中使用的试剂盒及其在患者尤其是乳腺癌患者诊断和治疗中的用途。
背景技术
肿瘤是严重影响公众健康的主要疾病之一。我国目前每年有新发肿瘤患者近220万人,因肿瘤死亡患者超过160万人,给家庭和社会造成了严重的经济负担。肿瘤的有效治疗依赖于对肿瘤的早期筛查与及时诊断,其中肿瘤标志物检测对肿瘤研究和临床治疗实践有着重大作用,已被广泛应用于肿瘤早期筛查、诊断、治疗、疗效评价及预后监测等。国内肿瘤诊断试剂行业2009年市场规模为37亿元,并每年以15%的速度增长。但是,该市场长期由罗氏等外资企业所把持,目前外资企业的市场份额仍然高达80%。因此,研究新的肿瘤标志物并开发相应的肿瘤标志物检测技术,对提升我国医药产业技术水平和人民群众的健康水平有着重要的现实意义。
表皮生长因子受体2(HER2)在乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中高表达,目前检测肿瘤组织HER2表达水平已作为一个独立指标用于肿瘤的临床诊断和治疗。近年来,肿瘤患者血清HER2水平在肿瘤临床实践中的应用价值已引起越来越多的关注,国外已有HER2血清检测试剂盒被批准用于临床,但是国内尚无同类产品上市。但是,在现有的HER2血清检测试剂盒中,由于血清中复杂成分的干扰,往往导致HER2血清水平定量的不准确性,由此影响了HER2血清检测技术在肿瘤研究和临床使用的效果。
近年来,以单克隆抗体药物为代表的肿瘤靶向药物在肿瘤临床治疗中得到了广泛应用并取得了较好的疗效,针对HER2的人源化抗体药物曲妥珠单抗(trastuzumab,商品名Herceptin)已经在包括中国在内的很多国家用于HER2表达阳性的转移性乳腺癌和胃癌的临床治疗。
传统的HER2检测主要通过创伤性的肿瘤组织活检,使用免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)等方法,但是这些方法不能检测手术治疗后患者或复发及转移性肿瘤患者体内的HER2水平。大量研究表明,肿瘤病人血清中可溶性的HER2胞外区片段与肿瘤组织的HER2表达水平存在明显相关性,且有高达50%以上的转移性乳腺癌患者血清中存在HER2水平升高现象(大于15ng/mL即可提示肿瘤有进展),并且HER2血清水平及其变化趋势可用作肿瘤治疗效果的评价与预后评估指标。因此HER2血清水平检测在肿瘤诊断和治疗中有着重要的应用价值。
在国家“863”计划、科技部“新药创制”重大科技专项与国家自然科学基金等项目的资助,我们研制了两株高度特异的HER2单克隆抗体A21和A18,并以此开发了HER2免疫组化体外诊断试剂盒,获得了二项国家发明专利授权(专利号:ZL01113787.8,ZL98116523.0)和一项诊断试剂新药证书(证书号:国药证字S20040023)。针对目前使用的HER2血清检测试剂盒存在容易受到血清中的其他物质的干扰而导致检测结果准确性和稳定性较低的问题,本发明提供了一种新的试剂盒可显著改善这方面问题。
发明内容
本发明的目的是为了通过提供检测结果稳定性和/或准确性高的HER2血清检测试剂盒,从而避免或者减少在检测血清HER2时血清中的其他物质对检测结果造成的干扰现象。
在第一方面,本发明提供了一种用于检测血清HER2的试剂盒,其中,所述试剂盒包括:
抗HER2抗体;和血清专用样品稀释液。
在第二方面,本发明提供了抗HER2抗体与所述血清专用样品稀释液在制造本发明第一方面所述的试剂盒中的应用。
本发明人发现,本发明的血清专用样品稀释液可以避免或减轻血清尤其是血清中除了HER2之外的其他物质对HER2检测结果干扰的现象,从而提供能够获得稳定性和准确性高的HER2血清检测结果。因此,本发明对HER2血清水平检测在肿瘤诊断和治疗中有着重要的应用价值。
附图说明
图1是梯度稀释的HER2/ECD(extracellulardomain,ECD)的检测结果和是否加入血清的结果,结果显示血清对实验结果具有一定的干扰性,降低了试剂盒检测的灵敏性。
图2是是否加入本发明的血清专用样品稀释液检测的结果,结果显示血清专用样品稀释液可降低血清对HER2/ECD的干扰,提高试剂盒的灵敏度和稳定性。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于通过ELISA方法来检测患者尤其是乳腺癌患者血清中HER2的量的试剂盒。优选的是,所述检测试剂盒包括曲妥珠单抗和生物素化的A18(biotin-A18)双夹心抗体;进一步优选的是,所述试剂盒包括血清专用稀释液缓冲液,以减少受检血清中其他物质实验的干扰。
本发明的第一方面提供了一种用于检测血清HER2的试剂盒,其中,所述试剂盒包括:抗HER2抗体;和用于配制血清专用样品稀释液的稀释液试剂,所述稀释液试剂包括DTT(二硫苏糖醇)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、盐酸、乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)、脱氧胆酸钠、氯化钠(NaCL)。也就是说,所述血清专用样品稀释液采用DTT(二硫苏糖醇)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、盐酸、乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)、脱氧胆酸钠、NaCL和水制得。
在一个优选的实施方式中,所述血清专用样品稀释液由20mmol/L的DTT、0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL缓冲液、1%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇、10g/L脱氧胆酸钠和25g/L的NaCL和余量的水组成。使用本所述血清专用样品稀释液可以使血清样品处理、稀释、上样一次完成,操作简便,并有效降低了血清成分的干扰。
HER2片段进入血液,从而可以在患者尤其是乳腺癌患者血清中检测到HER2,且其含量的多少及其变化均与患者尤其是乳腺癌患者的治疗和预后有着密切的关系。本发明采用了biotin-A18和曲妥珠单抗两种抗HER2抗体以及所述血清专用样品稀释液的ELISA方法可以准确的检测出血清中HER2的含量及提高其灵敏度,为乳腺癌患者在诊断、及其病情的发展程度及其治疗效果提供参考标准。
在一些实施方式中,所述试剂盒进一步包括选自由如下物质组成的组中的一种或者多种物质:牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)、HER2ECD、biotin-A18、辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)、显色剂和硫酸。
在另外一些实施方式中,所述抗HER2抗体为选自由曲妥珠单抗、4D5(曲妥珠单抗对应的鼠源性单抗)、A18及A21组成的组。
在另外一些实施方式中,所述双夹心抗体为包含曲妥珠单抗和biotin-A18的双夹心抗体。
在另外一些实施方式中,组成所述血清专用样品稀释液的至少一种组分在所述试剂盒中是与其他组分分开保存的,或者组成所述血清专用样品稀释液的至少一种组分是与其他另外一种或者多种组分以组合物的形式保存。
在又一些实施方式中,组成所述血清专用样品稀释液的各组分在所述试剂盒中是以一种或者多种溶液的形式存在;优选的是,组成所述血清专用样品稀释液的各组分以能够直接使用的浓度。
本发明的第二方面提供了抗HER2抗体与所述血清专用样品稀释液在制造如上所述的试剂盒中的用途。
本发明所述的HER2蛋白,其对应的基因为ERBB2,核苷酸序列以及氨基酸序列均能从公开发布的GenBank的数据库中获得,其核苷酸序列收录号例如为NG007503,其氨基酸序列收录号例如为P04626。
本发明的特点为使用了一种新的抗体,biotin-A18和曲妥珠单抗双夹心的ELISA方法检测血清中HER2的水平且将血清专用样品稀释液应用到试剂盒中以降低血清对试剂盒检测结果的干扰,可简便快速且准确地检测出血清中HER2的水平,并且对患者是无创的,此方法成本低、利于推广且可在患者治疗过程中对患者的病情和治疗效果进行检测和估计。
下文将通过实施例对本发明进行进一步的描述,但是这些实施例仅出于说明目的,本发明不限于这些实施例。
实施例
本发明实施例通过ELISA方法检测血清中HER2含量的变化,实施例中使用的血清专用样品稀释液为含有20mmol/L的DTT、0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL缓冲液、1%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇、10g/L脱氧胆酸钠和25g/L的NaCL的水溶液。
实施例1
将曲妥珠单抗稀释到2μg/mL后每孔加50μL铺板4℃过夜,洗板三次后常温下用1%BSA封闭1小时;将0.4mg/mLHER2ECD分别用1%BSA或1%BSA+血清专用样品稀释液稀释到20ng/mL,并分别用七个管进行2倍稀释成含ECD的梯度溶液,洗板(每次洗板使用的缓冲液是含万分之五浓度Tween20、PH7.0的磷酸盐缓冲液,下面洗板使用与此相同的缓冲液)三次后分别加入该梯度溶液,每孔50uL,振荡1小时,然后洗板三次后加biotin-A18,每孔50uL,振荡1小时,洗板三次后每孔加入辣根过氧化物酶50uL,振荡1小时,洗板三次后每孔加入TMB显色液(ThermoFisher公司生产)50uL,避光显色4分钟后,加硫酸终止液终止反应,使用BIO-TEKELX-800酶标仪在450nm下读板。结果请参见图1。
实施例2
将曲妥珠单抗稀释到5μg/mL,每孔加50μL铺板4℃过夜,洗板三次后每孔加300μL1%BSA溶液,37℃下封闭1小时,将0.4mg/mLECD分别在1%BSA+血清(10:1)、血清专用样品稀释液+血清(10:1)、血清专用样品稀释液+胎牛血清(10:1)中稀释成20ng/mL的溶液,然后用七个管进行2倍稀释以得到梯度溶液,洗板(每次洗板使用的缓冲液是含万分之五浓度Tween20、PH7.0的磷酸盐缓冲液,下面洗板使用与此相同的缓冲液)三次后加梯度溶液每孔50μL振荡1小时,洗板后加入biotin-A18每孔50μL振荡1小时,洗板后每孔加入50μL的辣根过氧化物酶振荡1小时,洗板三次后每孔加入TMB(即3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,中文名为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)溶液50μL,避光显色后,加硫酸终止反应,使用BIO-TEKELX-800酶标仪在450nm下读板。结果请参见图2。
本发明利用一种ELISA方法检测血清中的HER2水平,通过检测不同浓度和是否加入血清和血清专用稀释液缓冲液的HER2,研究结果表明血清对此新型试剂盒是有干扰,而血清专用稀释液缓冲液则可降低血清的干扰。
Claims (9)
1.一种用于检测血清HER2的试剂盒,其中,所述试剂盒包括:抗HER2抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括选自由如下物质组成的组中的一种或者多种物质:牛血清白蛋白、血清专用样品稀释液、HER2胞外区片段、生物素化的A18、辣根过氧化物酶、显色底物四甲基联苯胺和硫酸。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒,其中,所述抗HER2抗体为选自由曲妥珠单抗与A18组成的抗体对。
4.如权利要求1至3中任一项所述的试剂盒,其中,所述抗HER2抗体为包含抗HER2抗体与生物素化抗体的双夹心抗体。
5.如权利要求1至4中任一项所述的试剂盒,其中,所述双夹心抗体为包含曲妥珠单抗和biotin-A18的双夹心抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒,其中,组成所述血清专用样品稀释液的至少一种组分在所述试剂盒中是与其他组分分开保存的,或者组成所述血清专用样品稀释液的至少一种组分是与其他另外一种或者多种组分以组合物的形式保存。
7.如权利要求1至6所述的试剂盒,其中,组成所述血清专用样品稀释液的各组分在所述试剂盒中是以一种或者多种溶液的形式存在;优选的是,组成所述改良巴比妥缓冲剂的各组分以能够直接使用的浓度。
8.如权利要求1至7所述的试剂盒,其中,所述血清专用样品稀释液包含如下组分或者由如下组分制得:DTT(二硫苏糖醇)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、盐酸、乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)、脱氧胆酸钠、NaCL和水;优选的是,所述血清专用样品稀释液由20mmol/L的DTT、0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL缓冲液、1%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇、10g/L脱氧胆酸钠和25g/L的NaCL和余量的水组成。
9.抗HER2抗体在制造权利要求1至8中任一项所述的试剂盒中的用途或者在检测HER2中的用途;优选的是,抗HER2抗体与所述血清专用样品稀释液在在制造权利要求1至8中任一项所述的试剂盒中的用途或者或者在检测HER2中的用途。
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Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151216 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |