CN102458429A - 新的1型鞘氨醇激酶抑制剂、组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供了独特地抑制1型鞘氨醇激酶(SphK1)并且可用于多种应用的新的组分，所述应用包括：杀死或损伤癌细胞，诱导细胞凋亡，抑制癌细胞、白血病的生长、转移和其中化疗抗性的产生，增加抗癌试剂的有效性，减弱免疫反应性，抑制癌细胞中的生存信号，和减少多发性硬化的症状。
Description
本发明总体上涉及鞘脂调节、鞘脂介导子和鞘激酶(sphingokinase)抑制剂(尤其包括1型)的领域，以及此类抑制剂用于治疗癌症、哮喘、过敏反应、自噬、中枢神经系统等的用途。
本申请中引用或提及的所有专利、专利申请、专利公开、科技文献等，在此皆通过引用方式全文并入本文，以更完整地描述本发明所属领域的水平。
相关申请
本申请涉及2008年4月29日提交的临时申请号61/048,638。
背景技术
鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，一种由鞘氨醇激酶(SphK)从鞘氨醇中产生的有力的脂介导子，调节对于癌症进展有重要意义的很多过程，包括细胞生长和生存(Spiegel等人，Nature Rev Mol Cell Biol.4：397-407，2003)。与S1P不同，其前体，鞘氨醇和神经酰胺，则与生长阻抑和细胞调亡的诱导相关(Ogretman & Hannun，Nature Rev Cancer 4：604-616，2004)。因此，这些可相互转化的鞘脂代谢物之间的平衡已经被认为是决定细胞命运的细胞调节物(Cuvillier等人，Nature 381：800-803，1996)。已经有多项研究表明：S1P/神经酰胺调节物的波动参与对于肿瘤细胞(包括造血起源的那些)的化疗和放疗的抗性的调控(Ogretman等人，见上文；Hait等人，Biochim Biophys Acta 1758：2016-2026.2006；and Milstien &Spiegel，Cancer Cell 9：148-150，2006)。
已经描述了两种Sphk同工酶——SphK1和SphK2，虽然它们共有很多特征(Kohama等人，J.Biol Chem 273：23722-23728，1998；和Liu等人，J.Biol Chem 275：19513-19520，2000)，但显示出不同的功能。SphK1促进细胞生长和生存(Olivera等人，J Cell Biol 147：545-558，1999；Xia等人，J.Biol Chem 277：7996-8003，2002；Bonhoure等人，Leukemia20：95-102，2006；和Sukocheva等人，J Cell Biol 173：301-310，2006)，而SphK2当过表达时，具有相反的效应(Maceyka等人，J Biol Chem280：37118-37129，2005；和Okada等人，J Biol Chem 280：36318-36325，2005)。SphK1是调节S1P/神经酰胺调节物的关键酶(Maceyka等人，见上文；Berdyshev等人，Cell Signal 18：1779-1792，2006；和Taha等人，FASEB J 20：482-484，2006)。确实，S1P和SphK1长期以来被指牵涉于原代白血病细胞和白血病细胞系对于由通常使用的细胞毒性剂诱导的细胞凋亡的抗性(Cuvillier等人，Nature，2004见上文；Cuvillier等人，J.Biol Chem 273：2910-2916，1998；Cuvillier等人，Blood 98：2828-2836，2001；和Jendiroba等人，Leuk Res 26：301-310，2002)。SphK的非同工酶特异性抑制剂，例如L-苏-二氢鞘氨醇(safingol)和N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)，对于白血病细胞是有细胞毒性的(Jarvis等人，Mol Pharmacol54：844-856，1998；and Jendiroba等人，2002，见上文)。有趣的是，多药物抗性HL-60骨髓性白血病细胞比亲代细胞对于DMS更敏感(Jendiroba等人，2002，见上文)。此外，SphK1在对于多柔比星或依托泊甙敏感的HL-60细胞中的活性低于其在MDRI-或MRP1-阳性的HL-60细胞中的活性。在敏感性HL-60细胞中的SphK1的增强的表达阻断细胞调亡，而SphK1的下调通过诱导线粒体依赖性细胞凋亡而克服化疗抗性(Bonhoure等人，2006，见上文)。鉴于MDR的表达是急性骨髓性白血病(AML)中的强预后指示剂(Filipits等人，Leukemia 14：68-76，2000)，并且MDR表型(其通常在以蒽环类或基于植物的生物碱类治疗AML之后出现)被认为是实现成功化疗的阻碍，这些观察具有附加的意义。另外，K562人慢性骨髓性白血病细胞对伊马替尼(Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂)的抗性与SphK1的表达和S1P的产生相关，而SphK1的下调增加抗性细胞对伊马替尼诱导的细胞调亡的敏感性(Baran等人，JBiol Chem 282：10922-10934，2007)。因此，SphK1的有效且特异性的抑制剂的开发不仅对于降低促生存S1P的水平、而且对于加强神经酰胺的产生可能是有用的，该过程至少部分介导某些细胞毒性剂的促细胞调亡作用(Maggio等人，Cancer Res 64：2590-2600，2004；Rahmani等人，Cancer Res 65：2422-2432，2005；和Rosato等人，Mol Pharmacol69：216-225，2006)。
已经描述了鞘氨醇激酶抑制剂(Kim等人，Bioorg & Med Chem13：3475-3485，2005；Kono等人，J.Antibiotics 53：459-466，2000；Kono等人，J.Antibiotics 53：753-758，2000；Marsolais & Rosen，NatureReviews/Drug Discovery 8：297-307，2009；和US 2008/0167352 A1(Smith等人，公开于2008年7月10日)。然而，这些公开物没有一篇描述了本文中的新的1型鞘氨醇激酶抑制剂。
在本文中，我们描述了一种有力的、水溶性的SphK1抑制剂(SK1-I)，其引发多种信号传导及生存相关蛋白的激活中的多项混乱。Sk1-I显著诱导人白血病细胞系以及获自患有AML的患者的母细胞的细胞调亡，并抑制AML异种移植物肿瘤的生长。Sk1-I用作如下文进一步描述的其它相关化合物的模型。
发明内容
本发明提供了这样的组分：其在测定鞘氨醇激酶活性的体外测验中，对于鞘氨醇激酶1(SphK1)的抑制比其对于鞘氨醇激酶2(SphK2)的抑制高至少5倍。
本发明提供了包含以下结构的组分：
其中X是C或N，并且其中R1，R2，R3和R4独立地包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物或醚基团，并且其中R1和R2，R3和R4可以独立地融合在一起以形成一个或多个环，或前述的任意组合。
本发明的组分用于多种应用或状况，包括杀死或破坏癌细胞，诱导细胞调亡，抑制癌细胞、白血病生长、转移和其中化疗抗性的出现，增强抗癌试剂的有效性，减弱免疫反应性，抑制癌细胞中的生存信号传导，以及减少多发性硬化的症状。
附图说明
图1A显示了SK1-I(BML-258)的结构。
图1B-E的结果显示了SK1-I对于重组SphK1和SphK2的效应。
图2A的显示了SK1-I对于U937细胞的生长之浓度效应。
图2B显示了SK1-I对于T-成淋巴细胞Jurkat细胞的生长之浓度效应。
图2C显示了通过siRNA靶向下调SphK1的表达而降低U937细胞的生长速率。
图2D显示了在暴露于SK1-I之后，U937细胞的凋亡之时间依赖性和浓度依赖性增加。
图2E例示了U937细胞的状态：大部分是早期凋亡的，小百分率是坏死的(PI-阳性的)。
图2F显示了与DNA链的断裂紧密相关的结果，如通过TUNEL测验所测定。
图2G显示了对于U937细胞的血清浓度效应。
图3A和3B显示：以SK1-I处理U937细胞增加了胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9的激活，并诱导了聚ADP核糖聚合酶(PARP)的切割并诱导了细胞凋亡。
图3C显示了以泛-胱天蛋白酶抑制剂ZVAD和BOC预处理U937细胞对于SK1-I诱导的细胞凋亡和DNA损伤剂依托泊甙的诱导之结果。
图3D显示了Bcl-2的离原位表达对于SK1-I诱导的致命性之效应。
图4A显示了SK1-I对于鞘脂代谢物水平的影响，如HPLCESI-MS/MS所测定。
图4B显示了：通过以剂量依赖性方式加入外源S1P，SK1-I诱导的细胞凋亡的结果。
图5A-C显示了：当以SK1-I处理U937细胞时，ERK1/2和Akt的磷酸化的降低。
图5D显示了：在浓度低于15μM时，U937细胞中的组成型活性的肉豆蔻酰化的Akt的过表达对于SK1-I诱导的细胞凋亡的效应。
图6A和6B显示了当暴露于SK1-I时，两个患者样品中的细胞凋亡的增加。
图7A显示了施用了SK1-I的免疫缺陷型小鼠中的异种移植物中的肿瘤生长的减少。
图7B显示了SK1-I处理对于小鼠中肿瘤重量的效应。
图7C显示了来自经SK1-I处理的小鼠的肿瘤的免疫组化分析。
具体实施方式
本发明提供了包含以下结构的组分：
其中X是C或N，并且其中R1，R2，R3和R4独立地包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物或醚基团，并且其中R1和R2，R3和R4可以独立地融合在一起以形成一个或多个环，或前述的任意组合。
本发明还提供了包含以下结构的组分：
本发明还提供了具有以下结构的组分：
其中R5和R6独立地包含线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
本发明还提供了另外的组分：其中R5和R6连接在一起以形成环，所述组分包含以下结构：
其中R7包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
在另一个方面，提供了这样的组分：其中R1是H，并且R2是CH3。在另一个组分中，R3或R4是硫化物，SR5，其中R5包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
提取了另一组分：其中SR5具有以下结构：
在另一组分中，X是C，R1和R3是H，R4是SR5，所述组分具有以下结构：
R2可以是CH3。X可以是C，R1和R4是H，R3是SR5，所述组分具有以下结构：
在以上组分中，R2可以是CH3，R3可以是H。
在另一实施方式中，X是C，R1是H，R2是CH3，并且R4是(CH2)4CH3，所述组分具有以下结构：
R4的末端碳可以被一个或多个卤素取代，其中所述卤素是溴、氯或氟。
在另一实施方式中，所述组分具有以下结构：
其中R4可以是H，R2是甲基，R1是氢或甲基。
同样，R1和R2可以是融合在一起以形成取代或非取代的环。
在另一实施方式中，本发明提供了具有以下结构的组分：
其中X可以是C。
另一种组分具有以下结构：
其中，X是C。同样，R4可以是醚，该化合物具有以下结构：
其中R5包括线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
在另一实施方式中，X可以是C，R1是H，并且R2是CH3。
与上述组分一起提供了很多有用的方法。
这些包括：杀死或损伤癌细胞的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以死伤或损伤所述癌细胞的量的所述组分。此类癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
本发明提供的另一个方法引起癌细胞进行细胞凋亡，并且包括以下步骤：将癌细胞暴露于足以引起所述细胞进行细胞凋亡的量的所述组分。同样，此类癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
本发明还提供了用于抑制癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的方法，包括以下步骤：将癌细胞暴露于足以抑制所述癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的量的所述组分。同样，癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
另一个方法是用于治疗或减少有此需要的患者中的白血病的症状，包括以下步骤：向所述患者施用足以治疗或减少所述患者中的白血病症状的量的所述组分。
另一个方法是用于增强抗癌试剂在有此需要的患者中杀死癌细胞的能力，包括以下步骤：向所述患者施用抗癌试剂和所述组分，所述组分以足以增强抗癌试剂杀死该患者中的癌细胞的能力的量施用。癌细胞可以包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
还提供了减弱有此需要的患者中的免疫反应性的方法，包括以下步骤：向该患者施用足以减弱该患者中的免疫反应性的量的所述组分。在另一实施方式中，通过减弱肥大细胞功能来减弱免疫反应性。同样，免疫反应性的减弱可用于减少有此需要的患者中的哮喘症状。免疫反应性的减弱也可用于减少过敏性休克的症状或者其可用于减少自身免疫病的症状。
提供了另一方法，其是用于抑制癌细胞中的生存信号传导，包括以下步骤：向癌细胞施用足以抑制生存信号传导的量的权利要求1的组分。在另一实施方式中，通过减弱Akt或ERK1/2或二者的磷酸化来抑制生存信号传导。
还提供了另一方法：减少有此需要的患者中的多发性硬化的症状，包括以下步骤：向该患者施用足以减少该患者中的多发性硬化的症状的量的所述组分。
本发明还提供了这样的组分：其在测定鞘氨醇激酶活性的体外测验中，对于鞘氨醇激酶1(SphK1)的抑制比其对于鞘氨醇激酶2(SphK2)的抑制高至少5倍。对于SphK1的抑制也可以比对于SphK2的抑制高至少10倍。体外测验中是以10μM的浓度测定抑制情况的。也可以在产生SphK1的百分之五十(50％)抑制的浓度在体外测验中测定抑制情况。
上述组分也用于多种应用或环境。这些包括：杀死或损伤癌细胞的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以死伤或损伤所述癌细胞的量的上述组分。此类癌细胞可以包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
在另一实施方式中，上述组分用于引起癌细胞进行细胞凋亡的方法，包括以下步骤：将癌细胞暴露于足以引起所述细胞进行细胞凋亡的量的权利要求44的组分。同样，此类癌细胞可以包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
在涉及上述组分的另一方法中，本发明提供了用于抑制癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的方法，包括以下步骤：将癌细胞暴露于足以抑制所述癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的量的所述组分。
癌细胞可以包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
治疗或减少有此需要的患者中的白血病的症状的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以治疗或减少所述患者中的白血病症状的量的上述组分。
在另一个实施方式中，提供了增强抗癌试剂在有此需要的患者中杀死癌细胞的能力的方法，包括以下步骤：向所述患者施用抗癌试剂和上述组分，所述组分以足以增强抗癌试剂杀死该患者中的癌细胞的能力的量施用。癌细胞可以包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
还提供了减弱有此需要的患者中的免疫反应性的方法，包括以下步骤：向该患者施用足以减弱该患者中的免疫反应性的量的上述组分。在其它实施方式中，通过减弱肥大细胞功能来减弱免疫反应性。免疫反应性的减弱可用于减少有此需要的患者中的哮喘症状，用于减少过敏性休克的症状或者用于减少自身免疫病的症状。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于抑制癌细胞中的生存信号传导的方法，包括以下步骤：向癌细胞施用足以抑制生存信号传导的量的上述组分。可以通过减弱Akt或ERK1/2或二者的磷酸化来抑制生存信号传导。
本发明提供了另一方法：用于减少有此需要的患者中的多发性硬化的症状，包括以下步骤：向该患者施用足以减少该患者中的多发性硬化的症状的量的上述组分。
应该认识到，在本文中描述的本发明的任何组分可以配制为寡聚物或多聚物形式的组合物。
同样，可以使用本领域技术人员已知的方法将本发明的组分与常规成分组合以配制为药物组合物。这些组分可以配制为药品、药丸、胶囊、脂、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等，以被患者摄取。
通过举例方式而非限制本发明的方式提供了以下实施例。
优选实施方式的描述
实施例1：BML-258的合成
根据以下程序和步骤合成如下文所述和使用的化合物BML-258。
BML-258合成程序
在-20℃，在N2氛围下，向65mL干THF中的4-正戊基苯基乙炔1(3.343g，0.01776mol)中逐滴加入n-BuLi(10.2mL，1.6M，在己烷中，0.01628mol)。将反应混合物在-20℃搅拌2小时。通过插管/N2加入25mL干THF中的甲基(R)-(+)-3-(叔丁氧基-羰基)-2，2-二甲基-4-噁唑烷羧酸酯2(3.393g，0.01480mol)。将反应在-20℃搅拌过夜。TLC(20％乙酸乙酯/己烷)表明反应完成。以Et2O稀释混合物并小心地以水和盐水洗涤。闪柱层析(12％乙酸乙酯/己烷，硅胶)产生4.50g(73％)赤式和苏式产物的混合物。制备型HPLC(Dynamax Si，15％乙酸乙酯/己烷，260nm)产生3.71g赤式3和0.49g苏式。1H NMR(CDCl3)赤式：7.34-7.32(d，2H)，7.12-7.09(d，2H)，5.19-5.16(d，1H)，4.73-4.70(d，1H)，4.26-3.96(m，3H)，2.61-2.56(t，2H)，1.62(s，3H)，1.60-1.50(m，2H)，1.54(s，3H)，1.50(s，9H)，1.34-1.27(m，4H)，0.91-0.86(t，3H)。
向100mL MeOH中的噁唑烷3(3.48g，0.00814mol)中加入Amberlyst-15(200mg)。将反应在室温搅拌过夜。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)表明反应完成。过滤混合物并进行急骤层析(5％MeOH/二氯甲烷，硅胶)以产生2.44g(79％)氨基醇4。1H NMR(CDCl3)：7.34-7.32(d，2H)，7.12-7.09(d，2H)，5.45-5.38(d，1H)，4.88-4.82(m，1H)，4.25-4.19(m，1H)，3.91-3.80(m，2H)，3.26-3.23(d，1H)，2.61-2.56(t，2H)，1.63-1.54(m，2H)，1.49(s，9H)，1.35-1.26(m，4H)，0.91-0.86(t，3H)。
在0℃，在N2的氛围下，向125mL干燥的Et2O中的炔4(2.44g，0.00646mol)中逐滴加入Red-Al(9.85mL，65wt％，在甲苯中，0.03232mol)。加入之后，使反应升温至室温，并搅拌36小时。TLC(40％乙酸乙酯/己烷)表明反应完成。将反应冷却至0℃并以15％NaOH溶液小心地猝灭。剧烈搅拌该混合物直至两层都澄清(45分钟)。分离各层，以氯仿萃取含水层(3次)。以15％NaOH、水和盐水洗涤合并的有机层。急骤层析(5％MeOH/二氯甲烷至20％MeOH/二氯甲烷+1％NH4OH的梯度，硅胶)产生1.76g(72％)反式烯5。1H NMR(CDCl3)：7.31-7.29(d，2H)，7.15-7.12(d，2H)，6.70-6.65(d，1H，J＝16Hz)，6.26-6.18(dd，1H，J＝16Hz)，5.35-5.32(d，1H)，4.55-4.49(m，1H)，4.03-3.96(m，1H)，3.80-3.68(m，2H)，2.83-2.79(d，1H)，2.61-2.56(t，2H)，1.65-1.55(m，2H)，1.44(s，9H)，1.34-1.25(m，4H)，0.91-0.86(t，3H)。
在N2的氛围下，在室温，向20mL干THF中的BOC-烯5(0.350g，0.00092mol)中小心地加入DIBAL(9.22mL，1M，在THF中，0.00922mol)。加入之后，使反应回流。回流24小时之后，使反应物冷却至室温，加入另外5.0mL DIBAL溶液(0.00500mol)。继续回流另外24小时。使反应冷却至0℃并以水(0.60mL)、15％NaOH(0.60mL)小心地猝灭并再次以水(1.50mL)猝灭。加入THF(50mL)，剧烈搅拌混合物15分钟。然后加入Na2SO4(2g)和西莱特(celite)(2g)，继续搅拌30分钟，同时升温至室温。过滤混合物并以丰富的THF提取滤饼。急骤层析(2％MeOH/二氯甲烷至10％MeOH/二氯甲烷+0.75％NH4OH的梯度)产生0.187g(73％)胺6。1H NMR(CDCl3)：7.31-7.29(d，2H)，7.15-7.12(d，2H)，6.68-6.63(d，1H，J＝16Hz)，6.22-6.14(dd，1H，J＝16Hz)，4.51-4.47(m，1H)，3.80-3.74(m，3H)，2.61-2.56(t，2H)，2.50(s，3H)，2.40-2.10(broad，2H)，1.65-1.55(m，2H)，1.34-1.25(m，4H)，0.91-0.86(t，3H)。HRMS(MH+)：计算值为278.2120，测定值为278.2119。
在0℃，向15mL干燥的Et2O中的胺6(0.335g，0.00121mol)中加入3.0mL 1M HCl/Et2O。立即形成白色沉淀物。在室温搅拌15分钟之后，过滤沉淀物并以Et2O洗涤以产生0.325g(89％)BML-258。1HNMR(DMSO)：8.75-8.50(bd，2H)，7.38-7.34(d，2H)，7.19-7.15(d，2H)，6.65-6.60(d，1H，J＝16Hz)，6.30-6.22(dd，1H，J＝16Hz)，5.84-5.82(m，1H)，5.30-5.25(m，1H)，4.60-4.54(m，1H)，3.76-3.72(m，2H)，3.18-3.10(m，1H)，2.64(s，3H)，2.56-2.50(t，2H)，1.60-1.50(m，2H)，1.34-1.23(m，4H)，0.90-0.85(t，3H)。
按照实施例1的描述，由BIOMOL International(PlymouthMeeting，PA)合成SKI-I，(2R，3S，4E)-N-甲基-5-(4’-戊基苯基)-2-氨基戊-4-烯-1，3-二醇(BML-258)。鞘氨醇和N，N-二甲基鞘氨醇获自BIOMOL。[y-32P]ATP(3000Ci/mmol)购自Perkin Elmer(Boston，MA)。Boc-D-FMK(BOC)、Z-VAD-FMK(ZVAD)和依托泊甙来自EMDBiosciences(San Diego，CA)。用于流式细胞术的末端脱氧核苷酸转移酶Br-dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒来自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。用于免疫组织化学的TUNEL试剂盒来自Roche Applied Science(Indianapolis，IN)。用于细胞凋亡的FITC4标记的Annexin V/碘化丙啶染色试剂盒来自BD Biosciences(San Jose，CA)。
细胞和细胞培养
U937人组织细胞白血病和Jurkat急性T细胞白血病细胞获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。除非另有指明，否则细胞培养于补充了L-谷氨酸、青霉素、链霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并维持于对数生长期(Dai等人，CancerRes 61：5106-5115，2001)。U937细胞稳定地过表达Bcl-2、Bcl-xL、组成型活性的Akt(Myc-标签化的豆蔻酰化的Akt)，获得它们的空载体对应物并在存在合适的选择抗生素的情况下培养，正如所描述的那样(Rahmani等人，2005，见上文)。
白血病母细胞获自知情同意的两位经历常规诊断抽吸术的AML患者，并经过Virginia Commonwealth University的机构审查委员会批准。根据Helsinki声明提供知情同意书。两个患者样品表征如下：
患者#1：FAB亚型M2，无已知的融合或突变蛋白，无已知的染色体异常。
患者#2：FAB亚型M4，无已知的融合或突变蛋白，16号染色体倒置。
通过在Ficoll/Hypaque(比重1.077-1.081；Sigma，St Louis，MO，USA)上在室温以400xg离心而分离样品，在每种情况下包含85％母细胞。使用无菌巴斯德移液管吸出主要含有母细胞的界面层，并重悬于含有10％FBS的培养基中。通过台盼蓝排除法测定，细胞显示出大于95％的存活，按照上文描述进行培养。从健康供体中类似地分离外周血单核白细胞。
RNA干扰
以获自Qiagen(Valencia，CA)的100pmol的靶向SphK1的RNAi寡核苷酸[靶向的序列为GGGCAAGGCCTTGCAGCTC(SEQ IDNO：1)]和非靶向对照siRNA(非特异性随机序列)转染U937细胞。根据生产商的说明书，使用Cell Line Nucleofector Kit V(Amaxa GmbH，Cologne，Germany)，以Amaxa Nucleofector(程序V-001)进行转染。
鞘氨醇激酶的表达和活性
HEK 293细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM中，并按照之前的描述(Paugh等人，FEBS Lett 554：189-193，2003)，使用LipofectaminePLUS(Invitrogen)，以V5-His-pcDNA3.1载体(Invitrogen)、V5-His-标签化的人SphK1或V5-His-标签化的人SphK2进行转染。然后将细胞培养2天，通过冷冻-解冻裂解，使用0.25％Triton X-100[其抑制SphK2(Hait等人，J Biol Chem 280：29462-29469，2005)]中的[y-32P]ATP(10pCi，1mM，含有10mM MgCI2)和鞘氨醇测定SphK1活性。SphK2活性这样测定：在存在1M KCl的情况下，加入鞘氨醇与4mg/ml BSA形成复合物，在这样的条件下，SphK2的活性是最佳的并且SphK1被强烈抑制(Hait等人，J Biol Chem，2005，见上文)。使用氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/H2O(10∶4∶3∶2∶1.v/v)作为溶剂，在硅胶G60上通过TLC提取并分离标记的S1P。使用FX Molecular Imager(Bio-Rad，Hercules，CA)定量对应于S1P的放射活性带。SphK比活性表示为形成的pmol S1P/分钟/毫克蛋白。
Western印迹分析
将细胞重悬浮于细胞裂解缓冲液(50mM Tris pH7.5，150mMNaCl，1％Nonidet P40，0.5％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，5μg/ml亮抑酶肽，5μg/ml抑肽酶，1mM DTT)中。通过10％SDS-PAGE分离等量的蛋白(60pg)，然后转渍至硝酸纤维素膜。以含有5％脱脂干牛奶和0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS)中的一抗(1∶1000)温育印迹，然后以抗-兔子HRP缀合的IgG(1∶10,000，Jackson Immunoresearch Laboratories)温育。使用Kodak或Phenix科研产品X-射线膜，通过增强的化学发光(Pierce)使免疫复合物显色。使用来自Alpha Innotech Corporation(SanLeandro，CA)的AlphaEaseFC 4.0.0软件定量蛋白。
使用下列一抗：磷酸化-p44/42MAP激酶(Thr2O2/Tyr2O4)抗体、磷酸化-p38 MAP激酶(Thr180/Tyr182)抗体(Cell Signaling，Beverly，MA，USA)、磷酸化-JNK(Thr183/Tyr185)抗体、Bcl-xS/L抗体(S-18，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)、抗-人Bcl-2(Dako，Carpinteria，CA)、Mcl-1抗体、抗-胱天蛋白酶-3和抗-胱天蛋白酶-9(Pharmingen)和抗-PARP(Biomol)。
蛋白激酶谱
通过SelectScreenTM Kinase Profiling(Invitrogen Drug DiscoverySolutions，Madison，WI)测定SK1-I对于多种蛋白激酶活性的效应。简而言之，在不存在或存在5pM SK1-I和浓度为针对各蛋白激酶的Kmapp的ATP的情况下，使用含有构成FRET配对的两个荧光团的肽底物，使用基于荧光共振能量转移(FRET)的激酶测验系统，在384孔板中进行测验。显色试剂包含特异性消化非磷酸化肽的蛋白酶，并且产生荧光信号。分别在445nm和520nm监视香豆素荧光和荧光素FRET信号。香豆素发射仅在未经切割(磷酸化)的底物肽中激发荧光素(通过FRET)。
含有未经磷酸化的肽及激酶(在不存在ATP的情况下)和化学计量的磷酸化肽的反应分别作为0％和100％磷酸化对照。就背景校正原始荧光值。反应终点计算为：香豆素荧光除以荧光素FRET信号的发射比率。然后，根据以100％磷酸化对照获得的比率校正这些比率。
用于细胞凋亡的Annexin V/PI检验法
以annexin V-荧光素异硫氰酸酯和碘化丙啶(PI)染色细胞，然后，根据生产商的说明书(BD PharMingen，San Diego，CA)，通过流式细胞术评价细胞凋亡。简而言之，以磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤106个细胞2次，并在黑暗中、在室温以处于缓冲液中的5μl annexin V-荧光素异硫氰酸酯和5μl PI(50μg/ml)将细胞染色15分钟，所述缓冲液包含10mMHEPES，pH7.4，140mM NaOH和2.5mM CaCl2。使用EXPO32流式细胞术分析程序(Beckman Coulter，Fullerton，CA)，使用CoulterEpics-XL-MCL细胞荧光计测定凋亡细胞。右下象限中的百分率对应于早期凋亡细胞(annexin V阳性)，而右上象限中的百分率对应于晚期凋亡细胞(annexin V和P1阳性)。
通过TUNEL测验法检测DNA链的断裂
在冰上以1％(w/v)多聚甲醛将细胞(106)固定15分钟，以PBS洗涤2次，并在冰上在70％乙醇中进行透化处理30分钟。洗涤细胞并重悬于含有末端脱氧核苷酸转移酶和溴代脱氧尿苷(BrdU)的DNA标记溶液中，并在37℃温育1小时：根据生产商的说明书(Sigma)进行。然后在室温在黑暗中以抗-BrdU-荧光素抗体温育细胞30分钟，并使用EXPO32流式细胞仪分析程序(Beckman Coulter)使用CoulterEpics-XL-MCL细胞荧光计进行分析。
鞘脂和代谢物的质谱分析
以冷的PBS彻底洗涤细胞，并通过在2000xg离心10分钟使之沉淀。取出细胞的等份试样进行DNA和蛋白测定。向其余细胞中加入内部标准物(各0.5nmol的C12-SM、C12-Cer、C12-GlcCer、C12-LacCer、C17-鞘氨醇、C17-二氢鞘氨醇、C17-鞘氨醇1-磷酸、C17-二氢鞘氨醇-1-磷酸和C12-Cer-磷酸、Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)，通过液体色谱、电喷雾离子化-串联质谱(ESI-MS/MS，4000 QTRAP，AppliedBiosystems)定量提取的脂和各个神经酰胺酰基链的种类：按照之前的描述(Sullards等人，Science STKE 2001：L1，2001)进行。
异种移植肿瘤模型
所有涉及动物的实验都经过VCU IACUC批准。将U937细胞(2x106，悬浮于100μl无菌PBS中)注射进入6周龄CB17 SCID/beige小鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)的双侧腰窝的2个位点，并允许生长7天，达到可触及的肿瘤。当肿瘤达到50-100mm3的体积时，将动物随机分配为2个组：连续7天腹膜内注射200μl盐水或SK1-I(20mg/kg)。每天以卡钳测定肿瘤，并使用公式(πx[以毫米为单位的长度]x[以毫米为单位的宽度]2)/6计算肿瘤体积。在实验末尾，杀死动物并取出肿瘤，固定于福尔马林中并包埋于石蜡或冷冻于液氮中。以苏木精-伊红或以针对Ki-67的抗体(Novocastra，Newcastle，UK)染色福尔马林固定的切片。通过免疫组织化学和过氧化物酶缀合的物种特异性二抗检测抗体结合，并以3，3-二氨基联苯胺显色。使石蜡切片脱蜡、复水化并以蛋白酶K处理，然后进行通透化。以荧光素TUNEL标记试剂盒染色冷冻的切片，然后以DAPI对比染色。通过荧光显微镜分析玻片。
统计分析
实验进行至少三次重复，具有一致性结果。对于每个实验，计算来自一式三份样品的数据并表达为平均值±S.D.。通过用于非配对观测的Student’s t检验测定实验条件之间的差异的显著性。
结果
SK1-I是SphK1而非SphK2的有力的和选择性抑制剂
目前，没有关于SphK的结构信息以允许使用计算机对接方法来推理设计抑制剂。因此，替代性方法是使用获自抑制剂研究的信息来设计更有力和选择性的抑制剂。之前已经研究了多种化学合成的短链的鞘氨醇和二氢鞘氨醇类似物作为SphK的抑制剂(Edsall等人，Biochemistry37：12892-12898，1998；De Jonghe等人，Bioorg Med Chem Lett9：3175-4180，1999；Johnson等人，J.Pharmacol Exp 309：452-461，2004；和Niiro等人，Bioorg Med Chem 12：45-51，2004)。发现：将烷基链替换为苯环或以氟取代3-羟基会产生有力的SphK抑制剂。此外，具有4，5-反式双键的类似物一般是良好的抑制剂(Johnson等人，J Pharmacol Exp，2004，见上文)。基于这些较早期的发现，我们合成了(2R，3S，4E)-N-甲基-5-(4’-戊基苯基)-2-氨基戊-4-烯-1，3-二醇(图1A)并测试了其对于重组SphK1和SphK2的效应(图1B-E)。这种水溶性的鞘氨醇类似物以剂量依赖性方式强有力地抑制SphK1的活性(图1C)，在5μM时有60％-70％的抑制。如之前所报道的(Edsall等人，Biochemistry，1998，见上文；和Kohama等人，J Biol Chem，1998，见上文)，N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)也抑制SphK1的活性，虽然效力较低。重要的是，DMS也抑制SphK2(Liu等人，J Biol Chem，2000，见上文)和神经酰胺激酶(Sugiura等人，JBiol Chem 277：23294-23300，2002)，与其不同的是，我们的化合物不抑制重组SphK2(图1C、E)或神经酰胺激酶(数据未显示)。因此，由于其对于SphK的特异性抑制效应，该化合物在下文中被称作SK1-I。
Lineweaver-Burk分析揭示：SphK1活性被SK1-I竞争性抑制，Ki值为大约10μM(图1D)，几乎等于针对鞘氨醇的Km。SK1-I不被SphK1或SphK2磷酸化(数据未显示)。由于DMS和几种其它的泛SphK抑制剂也抑制蛋白激酶C(Igarashi等人，Biochemistry 28：6796-6800，1989)和潜在地抑制其它激酶(De Luca等人，Biofactors 25：43-60，2005；和Gamble等人，Int J Cancer 118：2412-2420，2006)，所以，测定SK1-I对于蛋白激酶的效应具有重要意义。使用了蛋白激酶活性筛选，其包括数种不同的重组蛋白激酶，荧光标记的多肽底物和浓度为针对每种激酶的Kmapp的ATP。SK1-I不显著抑制任何蛋白激酶：其中包括PKC家族的两个不同成员PKCα和PKCδ，PKA，Akt1，ERKI，EGFR，CDK2，1KKβ或CamKIIβ(图1F)。因此，SK1-I在已知的SphK抑制剂中是独特的，因为其同工酶选择性，水溶性，并且对于蛋白激酶无效应。
SK1-I有力地抑制人白血病细胞的生长
之前的研究已经证明：泛SphK抑制剂DMS显著诱导U937和Jurkat T细胞的凋亡(Cuvillier等人，Nature，1996，见上文；Jarvis等人，Mol Pharmacol 52：935-947，1997；Edsall等人，见上文；Hamada等人，Biochem Biophys Res Commun 244：745-750，1998；和Cuvillier等人，Blood，2001，见上文)。如图2A所示，浓度低至5μM的SK1-I显著降低培养于存在10％血清情况下的U937细胞的生长，在培养72小时之后是明显的。T-成淋巴细胞Jurkat细胞对于SK1-I更加敏感，因为5μM的浓度抑制了50％的生长，10μM则完全阻止了细胞生长(图2B)。类似地，10μM SK1-I减少其它白血病细胞系的生长，包括原髓细胞性HL-60、Molt-4T-细胞白血病和K-562 CML细胞，在48小时处理内分别抑制50％、70％、90％。
类似于以SK1-I进行的处理的效应并与其它白血病细胞系的研究(Bonhoure等人，见上文；and Baran等人，见上文)一致，使用靶向独特序列的siRNA下调SphK1的表达(SphK1蛋白和mRNA水平下降超过60％，见图2C)，显著降低了培养于存在2％或10％血清情况下的U937细胞的生长速率(图2C)。综合起来，这些发现是一致性的，注意到：通过药理学或遗传学方法特异性抑制SphK1显著抑制了人骨髓性和淋巴性白血病细胞的生长。
SK1-I诱导人白血病细胞的凋亡
使用DMS抑制SphK或SphK1表达的下调与很多细胞类型中的细胞凋亡的诱导相关，包括人白血病细胞(Cuvillier等人，Nature，1996，见上文；Jarvis等人，1998，见上文，Jendiroba等人，2002，见上文；和Bonhoure等人，见上文)。因此，我们接下来测定了SK1-I对于U937细胞的凋亡的效应：使用了流式细胞术监视在外细胞膜上表达磷脂酰丝氨酸的细胞，通过annexin V染色和PI作为细胞膜通透性的度量。在暴露于SK1-I之后，有时间和浓度依赖性的U937细胞凋亡的增加(图2D)。如图2E所示，大多数细胞是早期凋亡的，非常低的百分率的细胞是坏死的(仅PI阳性)。这些结果与DNA链断裂的发生密切相关，如通过TUNEL测验法所测(图2F)。此外，类似于SphK1的下调(当细胞培养于存在低浓度的血清的情况下时，其更有效地抑制细胞生长，见图2C)，当血清浓度降低时，U937细胞对于SK1-I诱导的凋亡更加敏感(图2G)。
SK1-I诱导的细胞死亡中的胱天蛋白酶激活和Bcl-2切割的功能性作用
之前已经证明：在HL-60细胞中以siRNA下调SphK1(Bonhoure等人，见上文)或在Jurkat细胞中以DMS抑制SphK(Cuvillier等人，JBiol Chem 275：15691-15700，2000)足以激发执行者胱天蛋白酶-3的激活以及PARP的切割(细胞凋亡的标志)。类似地，伴随着细胞凋亡的诱导，以SK1-I处理U937细胞增加了胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-9的激活并诱导了聚ADP核糖聚合酶(PARP)的切割(图3A、B)。此外，暴露于SK1-I16-24小时导致Bcl-2的切割(图3B)，Bcl-2为阻止线粒体功能紊乱的抗凋亡蛋白。另一方面，Mcl-1(在恶性造血细胞的存活中具有重要作用的抗凋亡蛋白，见Moulding等人，Blood 96：1756-1763，2000)的水平未显著改变(图3A、B)。接下来，我们研究了胱天蛋白酶激活和Bcl-2切割在SK1-I诱导的致死中的功能性作用。以泛胱天蛋白酶抑制剂ZVAD和BOC预处理U937细胞显著减弱了SK1-I诱导的细胞凋亡以及由DNA损伤剂依托泊甙诱导的细胞凋亡(图3C)。此外，Bcl-2的离原位表达完全免除了SK1-I诱导的致死，并且Bcl-xL的表达使细胞死亡减少60％(图3D)。综合起来，这些发现表明：SK1-I引起的致死主要是通过内部线粒体途径介导的，其为Bcl-2所对抗的事件。
由于SphK1是促细胞凋亡性神经酰胺和抗细胞凋亡性S1P之间的平衡的重要调节者(Olivera等人，见上文；和Bonhoure等人，见上文)，所以通过高效液相色谱ESI-MS/MS(Sullards等人，见上文)测定了SK1-I对于这些鞘脂代谢物水平的影响。以SK1-I进行的处理导致总的细胞S1P下降50％(图4A)，未改变鞘氨醇或二氢鞘氨醇(sphinganine)的水平，伴随着总的细胞神经酰胺的升高和鞘磷脂的下降(图4A)。U937细胞中最丰富的神经酰胺种类为24∶1(图4A)。以Sk1-I进行的处理分别使C16∶0和C24∶1神经酰胺种类的水平升高3倍和2倍，但是对于其它神经酰胺种类无显著影响(图4A)。
为了确认SK1-I的细胞凋亡效应是由于其抑制SphK1的能力造成的，进行了反加入S1P的实验。与SK1-I引起的S1P水平的下降相一致，外源S1P的加入以剂量依赖性方式减少了SK1-I诱导的细胞凋亡(图4B)。联合起来，这些发现表明：SK1-I通过抑制SphK1和S1P的产生而诱导人白血病细胞的凋亡，并且伴随着神经酰胺的升高。
SK1-I诱导的细胞凋亡与ERK1/2和Ark生存信号的失活相关
众多证据表明：有丝分裂原激活的蛋白激酶(ERK1/2，JNK和p38MAPK)和Akt在白血病细胞命运中具有重要作用(Steelman等人，Leukemia 18：189-218，2004)。以SK1-I处理U937细胞引起ERK1/2和Akt的磷酸化的迅速且显著的减少(图5A-C)。在存在低浓度血清的情况下，生存信号的这些失活持续长达2小时(图5A)，而在存在10％血清的情况下，p-ERK1/2和p-Akt水平的减弱逐渐克服(图5B)，并且依赖于SK1-I的浓度(图5C)。此外，在5分钟的时候观察到p38磷酸化的短暂增加，然后是后来的较不稳健的激活(图5A、B)。另外，在较晚的时间也检测到JNK激活和c-Jun磷酸化(图5A、B)。因为SK1-I显著灭活Akt，所以测定其在SK1-I的致死效应中的作用是有趣的。在U937细胞中过表达组成型活性的豆蔻酰化的Akt显著减弱了浓度低于15μM的SK1-I诱导的细胞凋亡(图5D)，这说明Akt的失活可能是促成SK1-I的细胞凋亡效应的因素之一。
原代人AML母细胞对于SK1-I诱导的细胞凋亡高度敏感
为了测定SK1-I对于原代AML样品的有效性，在获自两位具有AML(FAB，M2亚型)的患者的骨髓抽吸物的白血病母细胞中进行了平行研究。使用浓度渐增的SK1-I处理母细胞揭示出相对于U937和Jurkat细胞系而言对于细胞凋亡诱导的增强的敏感性。当暴露于Sk1-I 24小时的时候，两位患者的样品都显示出细胞凋亡的显著增加，使用7.5μMSk1-I观察到40％-50％的细胞凋亡，如annexin V/PI分析所揭示(图6A)。与之前的结果(Rosato等人，Mol Cancer Ther 6：692-702，2007)一致，在不存在处理的情况下，小于10％的母细胞显示出细胞凋亡，这非常类似于正常外周血单核细胞的细胞凋亡。值得注意的是，SK1-I对于正常外周血单核细胞的生存具有不甚显著的效应(图6B)。这结果说明，被报道为过表达SphK1的原代人AML细胞(Sobue等人，Leukemia20：2042-2046，2006)，对于SK1-I的易感性比连续培养的白血病细胞系更高，而SK1-I对于正常外周血单核白细胞是相对无影响的。
SK1-I在体内的抗白血病活性
我们接下来测定了SK1-I在免疫缺陷小鼠中的异种移植物中抑制白血病细胞的肿瘤生长的能力，免疫缺陷小鼠是已经被广泛用于促进开发数种新的治疗形式的模型(McCormack等人，Leukemia 19：687-706，2005)。皮下注射进入SCID/beige小鼠的腰窝的U937细胞迅速产生指数生长的肿瘤。当肿瘤达到50-100mm3的体积时，每日向小鼠腹膜内注射盐水或Sk1-I(20mg/kg)。如图7A中可以看出，SK1-I显著减少了肿瘤生长。在7天后，以SK1-I处理的小鼠中的U937肿瘤的平均体积比以盐水处理的小鼠中的肿瘤小50％以上(对照组平均值＝747mm3，Sk1-I组平均值＝332mm3，p＜0.001)。以SK1-I处理的小鼠在尸体解剖时的肿瘤重量也显著较低(图7B)。以SK1-I处理的小鼠未显示出消瘦的迹象，7天之后的体重与对照无显著性差异。
如预期的那样，来自以盐水处理的小鼠的肿瘤被Ki67强烈染色，这表明肿瘤组成为高度增殖性的细胞，极少有凋亡细胞被TUNEL染色(图7C)。与此相反，来自以SK1-I处理的小鼠的肿瘤的免疫组织化学分析揭示有很多凋亡细胞，如细胞核片段化(TUNEL染色)和致密的细胞核(图7C)所测定。SK1-I也显著减少肿瘤中的有丝分裂细胞(图7C)。这些结果表明：SK1-I在体内具有有力的抗白血病活性。
讨论
有充足的证据证明：在很多类型的癌症中，S1P的产生失调，导致异常细胞生长和生存信号传导(Milstien等人，见上文；和RA Sabbadini，Br J Cancer 95：1131-1135，2006)。Sphk1在多种实体肿瘤中过表达(French等人，Cancer Res 63：5962-5969，2003)，在AML中也过表达(Sobue等人，见上文)。此外，已经证明bcr/abl(慢性髓性白血病中的常见的遗传异常和至少20％的患有急性淋巴细胞性白血病的患者中的差预后指示)上调SphK1的表达(Li等人，Oncogene 26：7904-7908，2007)。因此，SphK1现在被认为是用于药理学干预(尤其是在白血病细胞中)的潜在靶标，在白血病细胞中，其水平与化疗抗性和放疗抗性相关联(Bonhoure等人，见上文；和Baran等人，见上文)。之前关于SphKi在白血病细胞中的作用的研究着眼于通过特异性siRNA或使用抑制SphK1和SphK2二者和潜在地抑制蛋白激酶的药理学试剂使之下调。本研究描述了第一个有力的且水溶性的SphK1同工酶特异性抑制剂SK1-I的开发。此外，SK1-I不抑制PKC或很多其它蛋白激酶。与多数小分子蛋白激酶抑制剂不同，SK1-I与脂底物是竞争性的，而多数小分子蛋白激酶抑制剂是在非常保守的ATP结合袋处与ATP竞争性的，并且潜在有交叉反应。
Sk1-I在数种白血病细胞系和AML白血病母细胞中有力地诱导细胞凋亡，如通过磷脂酰丝氨酸的外化、增加的DNA链断裂、胱天蛋白酶3和9的激活、PARP和Bcl-2的切割所反映。SK1-I是通过什么机制如此深刻地诱导这些致死效应的呢？这可能是由于数种非互斥的相关作用造成的。SK1-I抑制促生存性S1P的产生，S1P能够在细胞内作用以增强生长和生存，虽然其细胞内靶标仍然未知(Kohno等人，MolCell Biol 26：7211-7223，2006)。普遍接受的是：细胞内产生的S1P可以从细胞中释放(Mitra等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：16394-16399，2006)，并且通过与生存途径、包括ERK1/2和Akt相关的其细胞表面受体而作用(Spiegel等人，见上文)。在此意义上，SK1-I的减少白血病细胞中的激活的ERK1/2和Akt的能力可能是相关的，因为Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt途径在AML中通常是组成型激活的(Steelman等人，见上文；和Nyakern等人，Leukemia 20：230-238，2006)。由于ERK1/2磷酸化SphK1并将其激活(Pitson等人，J Exp Med201：49-54，2005)、导致S1P增加，S1P继而又能够刺激ERK1/2，所以，Sk1-I能够通过抑制SphK1而打断该阳性回馈回路，减少促生长和生存的S1P，同时增加其前体，促细胞凋亡的神经酰胺。因此，SK1-I整合了白血病中的多个分子治疗靶标。
长期以来，神经酰胺的产生被指参与人白血病细胞中细胞凋亡的诱导(Jarvis等人，Proc Natl Acad Sci USA 91：73-77，1994)，最近证明，细胞凋亡的数种不同信号转导抑制剂的协同作用与神经酰胺产量的显著增加相关联。例如，向人白血病细胞共同施用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和哌立福新(perifosine)导致了Akt和ERK的破坏，神经酰胺和反应性氧产量的显著升高，以及线粒体损伤和细胞凋亡的陡然增加(Rahmani等人，见上文；和Rosato等人，Mol Pharmacol 69：216-225，2006)。神经酰胺可以通过多个途径转导其细胞凋亡作用(Ogretmen等人，见上文)。所鉴定的重要的神经酰胺靶标包括丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP1和PP2A，它们使Akt以及SR蛋白去磷酸化，SR蛋白是Bcl-2的备选剪接的调节者(Ogretmen等人，见上文)。我们发现：暴露于SK1-I导致Bcl-2的切割，已经证明该应答与线粒体依赖性细胞凋亡相关(Cheng等人，Science 278：1966-1968，1997)。此外，已经确证，Bcl-2的过表达在很多细胞类型、包括急性淋巴母细胞性白血病和AML中阻止神经酰胺的形成并抵抗神经酰胺诱导的细胞凋亡(Zhang等人，Proc Natl Acad SciUSA 93：5325-5328，1996；Amarante-Mendes等人，Blood 91：1700-1705，1998；和Ogretmen等人，见上文)。与此相符，我们发现：Bcl-2的过表达也阻止SK1-I诱导的致死，这强调了内在的线粒体死亡途径的重要性。与该发现一致，最近已经证明S1P通过以MEK/ERK1/2依赖性方式阻断Bax向线粒体的转位而在Jurkat细胞的凋亡过程中发挥其对线粒体事件的细胞保护性效应(Betito等人，biochem Biophys Res Commun340：1273-1277，2006)。最近的研究表明，神经酰胺在内质网上的持续升高协调性激活ER应激应答并灭活抗-凋亡性Akt，从而导致细胞凋亡(Swanton等人，Cancer Cell 11：498-512，2007)。因此，有可能的是，SK1-I诱导的Akt失活不仅通过减少S1P的形成而介导，而且是通过增加神经酰胺而介导。也已经证明，免疫抑制性药物FTY72O(结构上类似于SK1-I)减少Akt的磷酸化，但是，其为SphK的竞争性底物而非竞争性抑制剂(Ng等人，Int J Oncol 30：375-380，2007)。FTY72O在临床试验中对于多发性硬化具有相对小的毒性(Brinkman等人，Pharmacol Ther115：84-105，2007)，最近已经建议其作为治疗慢性髓细胞性白血病原始细胞危象和费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病的替代品(Neviani等人，J Clin Invest 117：2408-2421，2007)。
我们发现，SK1-I有力地诱导分离自患有AML的患者的白血病母细胞中的细胞凋亡、但是对于正常的外周血单核白细胞是相对无细胞毒性的，该发现突出显示了其对于白血病细胞的选择性。此外，在异种移植物AML模型中，SK1-I具有明显的单试剂活性，其抑制肿瘤生长、诱导肿瘤中的细胞凋亡，并减少增殖，这与其体外的作用类似。对于肝脏、肾脏和脾的毒性的初步分析未显示出任何值得注意的效应。因此，特异性SphK1抑制剂值得考虑用作白血病中的潜在药理学干预，可单独使用或作为常规或其它已知的靶向试剂的辅佐。
根据以上详述的本发明的说明书和实施例，毫无疑问对于本领域普通技术人员可以暗示很多明显的变体。本领域技术人员将认识到，经计算用于实现相同目的的任意排列可以替换所显示的具体实施方式。本申请和发明旨在涵盖本发明的改编或变体。所有这些变体都完全包括在本发明的范围和精神内，如随附的权利要求中更具体地定义。
Claims (66)
1.包含以下结构的组分：
其中X是C或N，并且其中R1，R2，R3和R4独立地包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物或醚基团，并且其中R1和R2，R3和R4可以独立地融合在一起以形成一个或多个环，或前述的任意组合。
2.包含以下结构的权利要求1的组分：
3.权利要求2的组分，其中R3和R4是醚，所述组分具有以下结构：
其中R5和R6独立地包含线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
4.权利要求3的组分，其中R5和R6连接在一起以形成环，所述组分包含以下结构：
其中R7包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
5.权利要求3或4的组分，其中R1是H，并且R2是CH3。
6.权利要求2的组分，其中R3或R4是硫化物，SR5，其中R5包括氢、线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
7.权利要求6的组分，其中SR5具有以下结构：
8.权利要求7的组分，其中X是C，R1和R3是H，R4是SR5，所述组分具有以下结构：
9.权利要求8的组分，其中R2是CH3。
10.权利要求7的组分，其中X是C，R1和R4是H，R3是SR5，所述组分具有以下结构：
11.权利要求10的组分，其中R2是CH3。
12.权利要求2的组分，其中R3是H。
13.权利要求12的组分，其中X是C，R1是H，R2是CH3，并且R4是(CH2)4CH3，所述组分具有以下结构：
14.权利要求13的组分，其中R4的末端碳被一个或多个卤素取代。
15.权利要求14的组分，其中所述卤素是溴、氯或氟。
16.权利要求14的组分，其具有以下结构：
17.权利要求2的组分，其中R4是H。
18.权利要求12或17的组分，其中R2是甲基。
19.权利要求18的组分，其中R1是氢。
20.权利要求18的组分，其中R1是甲基。
21.权利要求12或17的组分，其中R1和R2融合在一起以形成取代或非取代的环。
22.权利要求21的组分，其具有以下结构：
23.权利要求22的组分，其中X是C。
24.权利要求21的组分，其具有以下结构：
25.权利要求24的组分，其中，X是C。
26.权利要求12的组分，其中R4是醚，所述组分具有以下结构：
其中R5包括线性或分支的(C1-C18)烷基、取代的线性或分支的(C1-C16)烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯基、取代的烯基、炔基、酰基、硫化物、醚基团或前述的任意组合。
27.权利要求26的组分，其中X是C，R1是H，并且R2是CH3。
28.杀死或损伤癌细胞的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以死伤或损伤所述癌细胞的量的权利要求1的组分。
29.权利要求28的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
30.引起癌细胞进行细胞凋亡的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以引起所述癌细胞进行细胞凋亡的量的权利要求1的组分。
31.权利要求30的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
32.用于抑制癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以抑制所述癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的量的权利要求1的组分。
33.权利要求32的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
34.治疗或减少有此需要的患者中的白血病的症状的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以治疗或减少所述患者中的白血病症状的量的权利要求1的组分。
35.增强抗癌试剂在有此需要的患者中杀死癌细胞的能力的方法，包括以下步骤：向所述患者施用所述抗癌试剂和权利要求1的组分，所述组分以足以增强所述抗癌试剂杀死所述患者中的所述癌细胞的能力的量施用。
36.权利要求35的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
37.减弱有此需要的患者中的免疫反应性的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以减弱所述患者中的免疫反应性的量的权利要求1的组分。
38.权利要求37的方法，其中通过减弱肥大细胞功能来减弱免疫反应性。
39.权利要求37的方法，其中免疫反应性的减弱旨在减少有此需要的患者中的哮喘的症状。
40.权利要求37的方法，其中免疫反应性的减弱旨在减少过敏性休克的症状。
41.权利要求37的方法，其中免疫反应性的减弱旨在减少自身免疫疾病的症状。
42.用于抑制癌细胞中的生存信号传导的方法，包括以下步骤：向所述癌细胞施用足以抑制所述生存信号传导的量的权利要求1的组分。
43.权利要求42的方法，其中通过减弱Akt或ERK1/2或二者的磷酸化来抑制生存信号传导。
44.减少有此需要的患者中的多发性硬化的症状的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以减少所述患者中的多发性硬化的症状的量的权利要求1的组分。
45.组分：其在测定鞘氨醇激酶活性的体外测验中，对于鞘氨醇激酶1(SphK1)的抑制比其对于鞘氨醇激酶2(SphK2)的抑制高至少5倍。
46.权利要求45的组分，其中对于SphK1的抑制比对于SphK2的抑制高至少10倍。
47.权利要求45的组分，其中在所述体外测验中以10μM的浓度测定抑制情况。
48.权利要求45的组分，其中在产生SphK1的百分之五十(50％)抑制的浓度在所述体外测验中测定抑制情况。
49.杀死或损伤癌细胞的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以杀死或损伤所述癌细胞的量的权利要求45的组分。
50.权利要求45的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
51.引起癌细胞进行细胞凋亡的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以引起所述细胞进行细胞凋亡的量的权利要求45的组分。
52.权利要求51的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
53.抑制癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的方法，包括以下步骤：将所述癌细胞暴露于足以抑制所述癌细胞生长、转移和产生化疗抗性的量的权利要求45的组分。
54.权利要求53的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
55.用于治疗或减少有此需要的患者中的白血病的症状的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以治疗或减少所述患者中的白血病症状的量的权利要求45的组分。
56.增强抗癌试剂在有此需要的患者中杀死癌细胞的能力的方法，包括以下步骤：向所述患者施用所述抗癌试剂和权利要求45的组分，所述组分以足以增强所述抗癌试剂杀死所述患者中的所述癌细胞的能力的量施用。
57.权利要求56的方法，其中所述癌细胞包括白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、神经胶质瘤癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞或肾癌细胞，以及它们的组合。
58.减弱有此需要的患者中的免疫反应性的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以减弱所述患者中的免疫反应性的量的权利要求45的组分。
59.权利要求58的方法，其中通过减弱肥大细胞功能来减弱免疫反应性。
60.权利要求58的方法，其中免疫反应性的减弱旨在减少有此需要的患者中的哮喘症状。
61.权利要求58的方法，其中免疫反应性的减弱旨在减少过敏性休克的症状。
62.权利要求58的方法，其中免疫反应性的减弱旨在减少自身免疫病的症状。
63.用于抑制癌细胞中的生存信号传导的方法，包括以下步骤：向所述癌细胞施用足以抑制所述生存信号传导的量的权利要求45的组分。
64.权利要求63的方法，其中通过减弱Akt或ERK1/2或二者的磷酸化来抑制生存信号传导。
65.减少有此需要的患者中的多发性硬化的症状的方法，包括以下步骤：向所述患者施用足以减少所述患者中的多发性硬化的症状的量的权利要求45的组分。
66.进一步包含寡聚物或多聚物形式的权利要求1的组分的组合物。
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