ES2895850T3 - Procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar en un sujeto, comprendiendo el uso administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz del inhibidor de SphKl para prevenir o tratar la enfermedad o afección pulmonar del sujeto, donde el inhibidor de SphKl es permeable en las células, tiene un valor de CI50 de menos de 10 μM, tiene una Ki de menos de 10 μM, y exhibe al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que SphK2; donde el inhibidor de SphKl comprende [(2R)-1-[[4-[[3-(bencenosulfonilmetil)-5-metilfenoxi]metil]fenil]metil] pirrolidin- 2-il]metanol (PF-543) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar

Introducción

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/083.693, depositada el lunes, 24 de noviembre de 2014.

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el número de contrato HL P01 98050, P01 58064, HL66109 y ES11869 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención. Antecedentes

La displasia broncopulmonar (DBP) es una enfermedad pulmonar crónica que se produce como consecuencia de una lesión en los pulmones prematuros de rápido desarrollo de un recién nacido prematuro. Los bebés prematuros reciben atención con respirador y suplementación con oxígeno inhalado durante períodos variables de tiempo después del parto y la exposición prolongada de los pulmones prematuros a la hiperoxia produce inflamación, edema pulmonar, lesión pulmonar y, en última instancia, la muerte. La DBP se caracteriza por una disminución de la tabicación secundaria de los alvéolos que da como resultado la formación de alvéolos agrandados simplificados y un área reducida para el intercambio de gases. Más del 25% de los bebés prematuros con peso al nacer < 1500 g desarrollan DBP. Los bebés con DBP tienen mayores tasas de rehospitalización debido a asma, infecciones, hipertensión pulmonar y otras dolencias respiratorias. Muchos pacientes con DBP neonatales supervivientes que ahora alcanzan la edad adulta muestran una fuerte disminución de la capacidad pulmonar, lo que indica que los efectos adversos de la agresión en la etapa neonatal pueden ser duraderos. No existe un tratamiento eficaz para la DBP y las estrategias para prevenir la DBP mediante la administración de una ventilación más suave y otros enfoques terapéuticos no han sido eficaces. La identificación de nuevas vías de señalización que relacionen la lesión pulmonar inducida por hiperoxia en la DBP neonatal es necesaria para nuevos enfoques terapéuticos.

Se ha descrito una correlación entre la actividad de la esfingosina cinasa (SphK) y la lesión pulmonar. Por ejemplo, se ha descubierto una mayor expresión de esfingosina cinasa 1 (SphKl) en tejidos pulmonares de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática y animales tratados con bleomicina. Además, se ha demostrado que la eliminación de SphKl o la inhibición de la actividad de SphK con un inhibidor no selectivo reduce la generación de esfininosina-1-fosfato (S1P) intracelular y la secreción de TGF-p en un modelo en ratón de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina que se acompañó de una reducción de fosforilación de Smad2 y MAPK en tejido pulmonar (Huang, y col. (2013) FASEB J. 27: 1749-1760; Huang & Natarajan (2015) Adv. Biol. Regul. 57: 55-63; Huang, y col. (2015) Thorax doi:10.1136/thoraxjnl-2014-206684). También se ha demostrado el aumento de la expresión pulmonar de SphKl y la regulación positiva de los niveles de S1P y dihidroesfingosina-1-fosfato (DHS1P) en un modelo en ratón de fibrosis pulmonar inducida por radiación (Gorshkova, y col. (2012) J. Lipid Res. 53:1553-68). De manera similar, los niveles de ARNm y proteína de SphKl, pero no SphK2, aumentan significativamente en los pulmones y en las células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMc ) aisladas de pacientes con hipertensión arterial pulmonar (HAP) y en los pulmones de modelos experimentales en roedores de hipertensión pulmonar mediada por hipoxia (HPH) de modo que ratones SphK1'/_ y la inhibición no selectiva de SphKl proporciona protección contra HPH (Chen, y col. (2014) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 190: 1032-43). De manera similar, la deficiencia de SphKl ofrece protección contra la lesión pulmonar inducida por hiperoxia en ratones y la inhibición no selectiva de SphKl atenúa la generación de S1P inducida por hiperoxia (Harijith, y col. (2013) Am. J. Pathol. 183: 1169-82).

Los inhibidores selectivos de SphKl se describen en la técnica. Por ejemplo, el documento US 8.557.800 enseña compuestos de adamantano sustituidos para inhibir la esfingosina cinasa y para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias tales como asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, o enfermedades angiogénicas tales como cáncer. De manera similar, el documento US 8.372.888 divulga inhibidores de SphKl de uso en el tratamiento del cáncer, asma, anafilaxia, autofagia y trastornos del sistema nervioso central, y los documentos US 8.436.186 y US 2012/0214858 describen inhibidores de SphKl que se utilizan en el tratamiento del cáncer. El documento US 2012/0252815 describe inhibidores de esfingosina cinasa para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas como el cáncer y enfermedades inducidas por inflamación como el asma. El documento WO 2014/118556 divulga además inhibidores selectivos de SphKl para el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar y el cáncer, así como activadores de SphKl para su uso en enfermedades tales como la fibrosis. Además, el documento WO 2014/157382 describe inhibidores de la esfingosina cinasa para prevenir o tratar la enfermedad inflamatoria intestinal. Se describen inhibidores adicionales de la esfingosina cinasa en Edsall, y col. (1998) Biochemistry 37: 12892-8; DeJonghe y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3175-3180; Johnson y col. (2004) J. Pharmacol. Exp. Ther. 309: 452-461; Niro, y col. (2004) Bioorg. Med. Chem. 12: 45-51; Baek, y col. (2013) Chem. Commun. 49: 2136­ 2138; Gustin, y col. (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23: 4608-4616; Kennedy, y col. (2011) J. Med. Chem. 54: 3524­ 48; Byun, y col. (2013) Med. Chem. Commun. 4: 1394 y Schnute, y col. (2012) Biochem. J. 444: 79-88. El documento WO2014/118556 divulga que la esfingosina 1-fosfato (S1P) está involucrada en enfermedades hiperproliferativas, tales como el cáncer y la remodelación vascular en la hipertensión arterial pulmonar. Los inhibidores de esfingosina cinasa 1 y 2 (SK1 y SK2), que catalizan la síntesis de S1P, pueden ser agentes antiproliferativos útiles. Se han sintetizado una serie de inhibidores de SK y SK2 basados en esfingosina. También se proporcionan en esta invención compuestos que activan SK1 que pueden usarse en enfermedades tales como fibrosis, donde la S1P intracelular es antifibrótica. El documento WO2013/119946 divulga inhibidores de la actividad enzimática de la esfingosina cinasa, compuestos y composiciones farmacéuticas que inhiben la esfingosina cinasa 1 y la esfingosina cinasa 2 (SphKl y SphK2) y además se refiere a procedimientos de tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por la actividad de esfingosina 1 fosfato, que comprenden administrar una cantidad eficaz de inhibidores de esfingosina cinasa. El documento WO2009/156041 divulga compuestos de fórmula (I), donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R9, R10, R11, Q y W son como se definen en la reivindicación 1 del documento WO2009/156041 y sus precursores son inhibidores de esfingosina cinasa y pueden usarse, por ejemplo, para el tratamiento de tumores. El documento US2006/270630 divulga procesos principalmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, aterosclerosis, asma, alergia, enfermedad renal inflamatoria, choque circulatorio, esclerosis múltiple, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, inflamación de la piel, enfermedad periodontal, psoriasis y enfermedades de la inmunidad mediadas por linfocitos T, que incluyen encefalomielitis alérgica, neuritis alérgica, rechazo de aloinjerto de trasplante, enfermedad de injerto contra huésped, miocarditis, tiroiditis, nefritis, lupus eritematoso sistémico y diabetes mellitus insulinodependiente. Los procesos implican tratar a un paciente con una composición farmacéutica que contiene un ingrediente activo que inhibe la actividad de la esfingosina cinasa .El documento US2007/032531 divulga compuestos, composiciones farmacéuticas de los mismos y procedimientos para inhibir la esfingosina cinasa y para tratar o prevenir una enfermedad hiperproliferativa, una enfermedad inflamatoria o una enfermedad angiogénica.Teruaki Nishiuma y col. (American Journal of Physiology -Lung Cellular and Molecular Physiology, 294, 2008) divulga que la inhalación del inhibidor de esfingosina cinasa atenúa la inflamación de las vías respiratorias en un modelo en ratón asmático.Neil MacRitchie y col (Cellular Signaling, Elsevier Science, 28, 2016) divulga el efecto del inhibidor selectivo de esfingosina cinasa 1, PF-543, sobre la remodelación arterial y cardíaca en un modelo hipóxico de hipertensión arterial pulmonar. El documento WO2010/078247 divulga compuestos de fórmula: (1) y sus sales farmacéuticamente aceptables, donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son como se definen en esta invención. También se divulgan procedimientos para preparar los compuestos de fórmula como se ha indicado anteriormente, su uso para inhibir la esfingosina cinasa y su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y/o afecciones asociadas con actividad indeseable de ceramidasa o esfingosina cinasa, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, metástasis de cáncer, aterosclerosis, estenosis, inflamación, trastornos inmunológicos, asma, dermatitis atópica, cicatrización de heridas y otras enfermedades proliferativas.

Resumen de la Invención

Esta invención proporciona un inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar en un sujeto, comprendiendo el uso administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz del inhibidor de SphKl para prevenir o tratar la enfermedad o afección pulmonar del sujeto, donde el inhibidor de SphKl es permeable en las células, tiene un valor de CI50 de menos de 10 pM, tiene una Ki de menos de 10 pM, exhibe al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que para SphK2. En una realización, la enfermedad o afección pulmonar comprende hipertensión pulmonar, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquiectasia, bronquiolectasia, bronquiolitis, bronquitis, enfisema, una enfermedad pulmonar intersticial o infiltrativa difusa, pleuritis serofibrinosa, pleuritis supurativa, pleuritis hemorrágica, un derrame pleural, fibrosis pulmonar idiopática, hiperoxia o lesión pulmonar inducida por oxígeno, lesión debida a toxicidad farmacológica o quimioterapéutica, lesión inducida por radiación o lesión química. El inhibidor de SphKl comprende [(2R)-1-[[4-[[3-(bencenosulfonilmetil)-5-metilfenoxi]metil]fenil]metil] pirrolidin-2-il] metanol (PF-543) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, una sal de ácido cítrico. En determinadas realizaciones, el inhibidor de SphKl se administra a los pulmones del sujeto.

La invención también proporciona un inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de la lesión pulmonar inducida por oxígeno en un sujeto administrando a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de PF-543, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar la lesión pulmonar inducida por oxígeno del sujeto.

Esta invención proporciona además una composición farmacéutica para administración en aerosol, que incluye uno o más propelentes y PF-543 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona en un inhalador dosificador para administración en aerosol. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran que el inhibidor de la esfingosina cinasa 1 (SphKl), PF-543 (PF, 5 mg/kg/dosis), disminuye el infiltrado de células inflamatorias (lavado broncoalveolar (BAL) recuento de glóbulos blancos (WBC), figura 1A) y el contenido de proteínas. (mg/ml, figura 1B) en el líquido pulmonar broncoalveolar en pulmones de ratones adultos después de hiperoxia (HO) en comparación con ratones expuestos al aire ambiente (RA).

Las figuras 2A-2C muestran que PF-543 protege los pulmones cuando se administra a ratones recién nacidos antes y durante la exposición a la hiperoxia. Los ratones recién nacidos expuestos al aire ambiente (figura 2A) se compararon con ratones recién nacidos expuestos a hiperoxia (75%) (figura 2B) o expuestos a hiperoxia (75%) y con administración de PF-543 (20 mg/kg/día) (figura 2C). La estructura pulmonar está bien conservada en el grupo de tratamiento con PF-543 (figura 2C).

Las figuras 3A-3C demuestran protocolos para determinar la dosis óptima (figura 3A) y la eficacia del fármaco cuando se administra localmente (figura 3B) y en un modelo animal de EPOC (figura 3C). Figura 3A, se administran tres dosis diferentes de PF-543 durante 7 días a ratones recién nacidos o 3 días a ratones adultos para optimizar la dosis. Figura 3B, se administra PF-543 nebulizado durante 7 días a ratones recién nacidos o 3 días a ratones adultos para demostrar la eficacia del PF-543 inhalado frente a la lesión pulmonar hipóxica. Se administra PF-543 disuelto en tensioactivo a ratones recién nacidos en días alternos de PN3 a PN10. Figura 3C, se administra PF-543 nebulizado durante 7 días a ratones recién nacidos o 3 días a ratones adultos para demostrar la eficacia del PF-543 inhalado frente a la lesión pulmonar hiperóxica.

Las figuras 4A-4F muestran que la miriocina disminuye la inflamación pulmonar inducida por radiación, la fibrosis y la regulación positiva de la actividad y expresión de SphKl en ratones a los que se les administra una dosis torácica única (20 Gy) de irradiación. Figura 4A, la supervivencia de los grupos de control irradiados y tratados con miriocina de ratones C57Bl/6. La diferencia estadística se calculó usando una prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Los animales fueron tratados con 0,375 mg/kg de miriocina por vía oral 3x/semana en 10 g/l de glucosa en agua (pH 3,5). Los animales de control recibieron solo el disolvente. Figure 4B, inhibición de un aumento inducido por radiación en la actividad total de SphK por miriocina ("Myr," Pint = 0,0478). La actividad de SphK se expresa como pmol de S1P formado por minuto por mg de proteína de lisado celular total. Figuras 4C y 4D, la irradiación aumenta los niveles de ARNm de SphKl (figura 4C) y la expresión de la proteína SphKl (expresada como SphK1/GAPDH (relación de intensidad), figura 4D), que disminuyen con la miriocina (proteína SphKl Pnt = 0,0358). Figura 4E y Figura 4F, la irradiación no disminuye sustancialmente los niveles de ARNm de SphK2 (figura 4E) pero disminuye significativamente la expresión de su proteína (expresada como SphK2/GAPDH (relación de intensidad), figura 4F). Ninguno de los parámetros se ve afectado por el tratamiento con miriocina. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 frente a control no irradiado (n = 5). N.S., no significativo.

Las figuras 5A-5D muestran que SphKl está aumentada en los pulmones de pacientes y modelos animales de hipertensión arterial pulmonar (HAP). Figuras 5A-5B, la cuantificación de proteína normalizada por p-actina demuestra que la expresión de SphKl (figura 5A), pero no la expresión de SphK2 (figura 5B), aumenta significativamente en los pulmones de pacientes con HAP en comparación con sujetos de control. Los resultados se expresan como media ± SEM; n = 4 por grupo. *P, 0,05 frente a control. Figura 5C-5D, la cuantificación de proteína normalizada por p-actina demuestra que la expresión de SphKl aumenta significativamente en pulmones de ratón (figura 5C) y pulmones de rata (figura 5D) después de 4 semanas de exposición a hipoxia, mientras que no se demuestran cambios en la expresión de SphK2. (n = 5 por grupo). **P, 0,01; ***P, 0,001 frente a normoxia.

Las figuras 6A-6C muestran que la inhibición de SphK a través de SKI-II previene la hipertensión pulmonar mediada por hipoxia en ratas. Figura 6A, cambios en la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP). Figura 6B, cambios en RV/(LV S). Figura 6C, cambios en las relaciones entre el área de la pared y el área total del vaso de las arterias pulmonares de menos de 50 mm o 50-100 mm de diámetro en las secciones de pulmón de los grupos de control y tratados con SKI-II después de la exposición a normoxia o hipoxia. Los resultados se expresan como media ± SEM; n = 6 por grupo. *P, 0,05; **P, 0,01 frente a normoxia sin grupo SKI2.

Las figuras 7A-7D demuestran el papel de SphKl en la displasia broncopulmonar inducida por hiperoxia. Figuras 7A-7B, cuantificación normalizada con p-actina de transferencias de Western sondeada con anticuerpos anti-SphKl (figura 7A) o anti-SphK2 (figura 7B). Figura 7C, La deficiencia de SphKl protege la alveolarización de pulmones neonatales murinos bajo hiperoxia. Los ratones recién nacidos Tipo silvestre (C57BL/6J) o SphK1'/', junto con las madres lactantes, fueron expuestos a normoxia (NO; barras abiertas) o hiperoxia (HO; barras llenas; 75% de O2) desde el día 1 de PN durante 7 días. Una vez completada la exposición, se sacrificó a los ratones recién nacidos y se extrajeron los pulmones, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones (de 5 mm de grosor) para la tinción. La evaluación objetiva de la alveolarización de los pulmones neonatales se determinó mediante el procedimiento de intersección lineal media (Hasleton (1976) Patho. Eur. 11:211-8; Shaffer, y col. (1987) Pediatr. Res. 21: 14-20). Después de la exposición a HO, la intercepción lineal media (MLI) pulmonar en SphK1'/_ es significativamente menor en comparación con el tipo silvestre. *P < 0,05 (n=5 a 8 por grupo). Figura 7D, las células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HLMVEC) cultivadas hasta aproximadamente el 90% de confluencia se preincubaron con de 1 a 10 mmol/L SKI-II (inhibidor de SphK1/SphK2) en medios libres de suero o que contenían FBS al 1%, como se indica durante 24 horas antes de la estimulación con hiperoxia (95% O2 y 5% CO2) durante 3 horas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS a temperatura ambiente y se midió la producción total de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante fluorescencia DCFDA. SKI-II bloqueó la producción de ROS en HLMVEC bajo hiperoxia. Los datos se cuantificaron en función del número de píxeles DCFDA. Los valores para la producción de ROS son medias ± SD de tres experimentos independientes y normalizados al control porcentual.

Descripción detallada de la invención

Basándose en análisis de expresión y estudios de modelos animales, ahora se ha demostrado que SphKl es una nueva diana terapéutica para la prevención y el tratamiento de una serie de enfermedades y afecciones pulmonares. En particular, se ha demostrado que la exposición a la hiperoxia aumenta la expresión de SphKl y eleva los niveles de S1P en el tejido pulmonar neonatal. Además, los ratones SphKl-1' expuestos a hiperoxia muestran una mejor alveolarización y una disminución de la acumulación de ROS, expresión de proteínas de NOX2 y NOX4 y niveles de IL-6. Además, el siRNA de SphKl atenúa la generación de S1P inducida por hiperoxia y la formación de ROS en HLMVEC y la regulación negativa de NOX2 o NOX4. Además, PF-543, un potente inhibidor de SphKl, mejora la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, previene la lesión pulmonar inducida por oxígeno y atenúa la generación de ROS en HLMVEC. Este análisis demuestra una correlación entre el eje de señalización de SphK/S1P en lesiones y enfermedades pulmonares, y demuestra que SphKl es una diana terapéutica contra enfermedades y afecciones pulmonares y lesiones pulmonares inducidas por oxígeno.

Por lo tanto, esta invención proporciona un inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso en procedimientos para prevenir o tratar una enfermedad o afección pulmonar y/o una lesión pulmonar inducida por oxígeno en un sujeto. El uso implica administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz del inhibidor de SphKl para prevenir o tratar la enfermedad o afección pulmonar del sujeto o la lesión pulmonar inducida por oxígeno. Como se usa en esta invención, "tratar" o "tratamiento" significa mejorar, revertir, aliviar, ralentizar o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad o afección a la que se hace referencia, mientras que "prevenir" o "prevención" significa disminuir, retrasar, detener el desarrollo o mitigar al menos un síntoma del trastorno de referencia. Para los fines de esta invención, un sujeto puede ser un bebé, un niño o un adulto y puede incluir un animal humano o no humano tal como un animal de compañía, un animal de granja o un animal de rancho.

De acuerdo con la administración profiláctica de un inhibidor de SphKl, un sujeto que necesita tratamiento se refiere a un sujeto en riesgo de tener o en riesgo de desarrollar una enfermedad o afección pulmonar, por ejemplo, un sujeto que tiene uno o más factores de riesgo o que tiene una mayor susceptibilidad o una predisposición a desarrollar una enfermedad o afección pulmonar. Los factores de riesgo conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, antecedentes de tabaquismo; exposición a un suministro excesivo de oxígeno (es decir, hiperoxia); exposición a largo plazo a uno o más de polvo orgánico, polvo inorgánico, vapores químicos, humo; exposición a uno o más alérgenos o agentes infecciosos, así como antecedentes de sepsis, neumonía, traumatismo, contusión pulmonar, abuso de drogas o sobredosis. Una mayor susceptibilidad o una predisposición a desarrollar una enfermedad o afección pulmonar incluye, por ejemplo, antecedentes familiares o predisposición genética a desarrollar la enfermedad o afección a la que se hace referencia.

De acuerdo con la administración terapéutica de un inhibidor de SphKl, un sujeto que necesita tratamiento se refiere a un sujeto que presenta uno o más signos o síntomas de la enfermedad o afección o lesión inducida por oxígeno. Los signos o síntomas de enfermedades o afecciones pulmonares incluyen, pero no se limitan a, tos, disnea, esputo purulento, fiebre, sibilancias episódicas, dilatación de las vías respiratorias, cicatrización de las vías respiratorias, inflamación, exceso de moco, hiperplasia del músculo liso, constricción de las vías respiratorias, falta de aliento, cianosis, fatiga, angina de pecho, desmayo o síncope y/o edema periférico. Una enfermedad o afección pulmonar se puede diagnosticar mediante exámenes y/o pruebas convencionales que incluyen, pero sin limitarse a, gases en sangre arterial, análisis de sangre, cultivos de sangre y orina, broncoscopia, radiografía de tórax, cultivos y análisis de esputo, ecocardiograma y mediciones de presión.

Las afecciones, trastornos o enfermedades del sistema pulmonar que pueden prevenirse o tratarse de acuerdo con los presentes usos incluyen, pero no se limitan a, hipertensión pulmonar; síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA); enfermedad pulmonar restrictiva; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); bronquiectasia; bronquiolectasia; bronquiolitis; bronquitis; enfisema; enfermedades pulmonares intersticiales o infiltrativas difusas que incluyen, pero no se limitan a, neumoconiosis, neumonitis por hipersensibilidad, síndrome de Goodpasture, hemosiderosis pulmonar idiopática, enfermedades vasculares del colágeno o eosinofilia pulmonar; pleuritis serofibrinosa; pleuritis supurativa; pleuritis hemorrágica; derrames pleurales; fibrosis pulmonar idiopática; hiperoxia o lesión pulmonar inducida por oxígeno que incluye, pero no se limita a, displasia broncopulmonar; lesión debida a toxicidad farmacológica o quimioterapéutica (por ejemplo, toxicidad debida al tratamiento con bleomicina, ciclofosfamida, nitrofurantoína, metotrexato, terapia de combinación de 5-fluorouracilo y oxaliplatino o similar); lesión inducida por radiación; o lesión química, por ejemplo, una quemadura química, inhalación de humo, exposición a una sustancia tóxica o neumonía inducida químicamente. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección pulmonar es lesión pulmonar inducida por oxígeno, fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, fibrosis pulmonar inducida por radiación, fibrosis pulmonar idiopática o displasia broncopulmonar.

El tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar o una lesión inducida por oxígeno deseablemente da como resultado una mejora de uno o más parámetros de la función pulmonar que incluyen, por ejemplo, volumen espiratorio forzado en un segundo (FEVi); capacidad vital de volumen forzado (FVC); FEVi/FVC; flujo espiratorio máximo (PEF); flujo espiratorio forzado 25%-50 % o 25 %-75 % (flujo promedio de aire que sale del pulmón durante la parte media de la espiración); tiempo espiratorio forzado (FET); capacidad pulmonar total (TLC); capacidad de difusión, monóxido de carbono (DLCO); o máxima ventilación voluntaria. Opcionalmente, dicha administración da como resultado una mejora de uno o más de dichos parámetros de la función pulmonar (1) al 80 % o más de lo esperado; o (2) en al menos un 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 50 %. Opcionalmente, el uso implica identificar cualquiera de dichos parámetros que, antes de la administración, son inferiores al 80 % de los valores esperados para un individuo de la misma altura y peso, y evaluar dichos parámetros después de dicha administración, donde dicha administración da como resultado la mejora de uno o más de dichos parámetros de función pulmonar (1) al 80 % o más de lo esperado; o (2) en al menos un 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 50 %.

Los inhibidores de SphKl de uso en el procedimiento profiláctico o terapéutico y de la composición de esta invención incluyen inhibidores de SphKl que son permeable en las células o permeables en la membrana, tienen un valor de CI50 de menos de 10 j M, tienen una Ki de menos de 10 j M, y/o exhiben al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que para SphK2. Como se divulga en esta invención, el inhibidor de SphKl es permeable en las células, tiene un valor de CI50 de menos de 10 j M y una Ki de menos de 10 j M, pero no exhibe al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que para SphK2. Como se divulga en esta invención, el inhibidor de SphKl permeable en las células, tiene una Ki de menos de 10 ^j M, y tiene al menos una selectividad 20 mayor para SphKl que para SphK2, pero tiene un valor de CI50 mayor de 10 ^j M. Como se divulga en esta invención, el inhibidor de SphKl tiene al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que para SphK2, tiene un valor de CI50 de menos de 10 ^j M y una Ki de menos de 10 j M, pero no es permeable en las células. Como se divulga en esta invención, el inhibidor de SphKl permeable en las células, tiene un valor de CI50 de menos de 10 j M, tiene al menos una selectividad 20 mayor para SphKl que para SphK2, pero no tiene una Ki de menos de 10 j M. El inhibidor de SphKl es permeable en las células, tiene un valor de CI50 de menos de 10 j M, tiene una Ki de menos de 10 j M, y tiene al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que para SphK2.

Un inhibidor de SphKl es permeable en las células o permeable en la membrana cuando el inhibidor es capaz de penetrar o ser transportado activa o pasivamente a través de una membrana celular, es decir, transferirse de un lado de la membrana celular al otro lado, por ejemplo, entrar en una célula desde el exterior de la célula penetrando en la membrana celular. En particular, un inhibidor de SphKl permeable en las células puede atravesar una membrana celular in vitro o in vivo en ausencia de un portador o agente que facilite el transporte por la membrana. Opcionalmente, el inhibidor de SphKl es capaz de atravesar la membrana celular de una célula pulmonar. Alternativamente, el inhibidor de SphKl es capaz de penetrar en células intactas y conserva la actividad biológica después de penetrar en las células. La función de penetración celular de un inhibidor de SphKl se puede determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la administración del inhibidor de SphKl a un animal experimental y detectando la cantidad de inhibidor presente en las células pulmonares.

El inhibidor de SphKl para el uso de la invención tiene un valor de concentración inhibidora semimáxima (50 %) (CI50) de menos de 10 j M. Los valores de CI50 se pueden determinar usando técnicas que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, una curva de dosis-respuesta que correlaciona la concentración de un compuesto o sustancia con la respuesta deseada en una célula, en este caso la inhibición de SphKl. Opcionalmente, el inhibidor de SphKl tiene un valor de Cl50en el intervalo de 0,1 nM a 10 j M, en el intervalo de 0,1 nM a 100 nM, en el intervalo de 0,1 nM a 50 nM, o en el intervalo de 0,1 nM a 10 nM. Opcionalmente, el inhibidor de SphKl tiene un valor de CI50 de menos de o igual a 10 ^j M, 1 ^j M, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM o 2 nM.

El inhibidor de SphKl para el uso de la invención tiene una constante de inhibición (Ki) de menos de 10 ^j M. Como se sabe en la técnica, Ki es la concentración requerida para producir una inhibición semimáxima (Ki = [I]/(K'^m/K^m-1), donde Km de esfingosina en SphKl = 10 j M) y es una indicación de la potencia de un inhibidor. Opcionalmente, el inhibidor de SphKl tiene una Ki en el intervalo de 1 nM a 10 jm, en el intervalo de 1 nM a 100 nM, en el intervalo de 1 nM a 50 nM, o en el intervalo de 1 nM a 10 nM. Opcionalmente, el inhibidor de SphKl tiene una Ki de menos de o igual a 10 j M, 1 j M, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM o 2 nM.

El inhibidor de SphKl para el uso de esta invención exhibe al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que para SphK2. En particular, los compuestos útiles en esta invención pueden tener al menos una selectividad de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 o más veces mayor para SphKl en comparación con SphK2. Un inhibidor de SphKl es selectivo si inhibe SphKl pero no inhibe, o inhibe en un grado sustancialmente menor, SphK2. Los procedimientos para evaluar la selectividad de los inhibidores de SphK son conocidos en la técnica y pueden basarse en cualquier ensayo convencional incluyendo, pero sin limitarse a, las determinaciones de CI50, así como la determinación de la Ki y/o la concentración semimáxima efectiva (CE50) del inhibidor para SphKl en comparación con SphK2. A modo de ilustración, la selectividad se puede expresar como (Ki/KM)SphK2/(Ki/KM)SphK1. Además de la selectividad por SphKl respecto a SphK2, opcionalmente, el inhibidor también exhibe selectividad por SphKl respecto a otras enzimas metabolizadoras de esfingolípidos tales como ceramida sintasa y S1P liasa y selectividad respecto a uno o más de ERK2, PI3K, PKCa, PKC5, PKA, Akt1, ERK1, EGFR, CDK2, IKKp y CamKIip. A este respecto, el inhibidor selectivo de SphKl no exhibe efectos no intencionados, por ejemplo, no inhibe la síntesis de ADN.

Los inhibidores de SphKl de uso en esta invención comprenden [(2R)-1-[[4-[[3-(bencenosulfonilmetil)-5-metilfenoxi]metil]fenil]metil] pirrolidin-2-il] metanol (PF-543) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El PF-543 es un compuesto de hidroximetilpirrolidina permeable en las células que inhibe la fosforilación de esfingosina catalizada por esfingosina cinasa-1/SphK1 (CI50 = 2,0 nM; [esfingosina] = 3 M) de una manera reversible y competitiva con esfingosina (Kⁱ = 3,6 nM). El PF-543 no muestra ninguna afinidad por los receptores de S1P y tiene una selectividad aproximadamente 130 veces mayor para SphK1 respecto a SphK2 (CI50 = 356 nM). El PF-543 está dirigido directamente a SphKl (Kd = 5 nM) con estequiometría 1:1. Véase, por ejemplo, Schnute, y col. (2012) Biochem. J. 444: 79-88. El PF-543 está disponible en el mercado, por ejemplo, de ApexBio Technology (Boston, MA) y Selleck Chemicals (Houston, TX).

El término "análogo" se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro pero difiere ligeramente en composición (como en el reemplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, o el reemplazo de un grupo funcional por otro grupo funcional). Por tanto, un análogo es un compuesto que es similar o comparable en función y aspecto, pero no en estructura u origen, a un compuesto de referencia.

El término "derivado" se refiere a compuestos que tienen una estructura central común y están sustituidos con uno o más grupos funcionales. Los derivados y análogos no forman parte del tema que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a los derivados de los compuestos divulgados donde el compuesto original se modifica elaborando sales de ácido o de base de los mismos. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas, sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, dichas sales no tóxicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de ácidos orgánicos e inorgánicos seleccionados entre 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietanosulfónico, acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etanodisulfónico, 1, 2-etanosulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, laurilsulfónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicíclico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, toluenosulfónico, y los aminoácidos que se producen comúnmente, por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.

Otros ejemplos incluyen ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4- metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido mucónico y similares. La invención también abarca sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto originales reemplazado por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinotérreo o un ion de aluminio; o coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares.

Todas las referencias a sales farmacéuticamente aceptables incluyen formas de adición de disolventes (solvatos) o formas cristalinas (polimorfos) como se define en esta invención, de la misma sal. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden ser sintetizadas a partir de un compuesto original que contiene un resto básico o ácido a través de procedimientos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con la base o ácido adecuados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; se pueden usar medios no acuosos, como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se encuentran listas de sales adecuadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a ed. (Pharmaceutical Press, 2012). Por ejemplo, las sales pueden incluir, pero no se limitan a, las sales de clorhidrato y acetato de los compuestos que contienen amina alifática, que contienen hidroxilamina y que contienen imina de la presente invención. En realizaciones particulares, la sal es una sal de ácido cítrico.

"Solvato" significa formas de adición de disolvente que contienen cantidades estequiométricas o no estequiométricas de disolvente. Algunos compuestos tienden a atrapar una relación molar fija de moléculas de disolvente en el estado sólido cristalino, formando así un solvato. Si el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato; y si el disolvente es alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman por la combinación de una o más moléculas de agua con una molécula de la sustancia en la que el agua conserva su estado molecular como H2O.

Se conocen en la técnica inhibidores de uso adicionales de SphKl. Véase, por ejemplo, los documentos US 8.557.800, US 8.436.186 y US 8.372.888, y los documentos US 2012/0252815, US 2012/0214858, WO 2014/118556 y WO 2014/157382 así como las referencias citadas en ellos. Diversos análogos de esfingosina y dihidroesfingosina de cadena corta sintetizados químicamente sirven como inhibidores de SphK (Edsall, y col. (1998) Biochemistry 37: 12892-8; DeJonghe y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3175-3180; Johnson y col. (2004) J. Pharmacol. Exp. Ther. 309: 452-461; Niro, y col. (2004) Bioorg. Med. Chem. 12: 45-51). Se descubrió que el reemplazo de la cadena de alquilo con un anillo de fenilo o la sustitución del grupo 3-hidroxilo por flúor producía potentes inhibidores de SphK. Además, los análogos con un doble enlace 4,5-frans eran inhibidores generalmente superiores (DeJonghe, y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3175-3180). Además, se ha demostrado la importancia de un grupo 4-hidroxipiperidinilo en la inhibición selectiva de SphKl (Baek, y col. (2013) Chem. Commun.

49: 2136-2138; Gustin y col. (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23: 4608-4616).

Más específicamente, los inhibidores selectivos de SphKl incluyen, pero no se limitan a, SKI 5C (CI50 = 3,3 ^M), BML-258 (Ki = ~10 ^M), el Compuesto 1 (Ki = 0,2 ^M, una selectividad 5 veces mayor para SphKl respecto a SPHK2), el Compuesto 2 (Ki = 0,3 M, selectividad 40 veces mayor para SphKl respecto a SpHK2), el Compuesto 3 (Ki = 75 nM, selectividad 80 veces mayor para SphKl respecto a SphK2), el Compuesto 4 (Ki = 110 nM, selectividad 470 veces mayor para SphKl respecto a SphK2), el Compuesto 5 (Ki = 47 nM, selectividad 180 mayor para SphKl respecto a SphK2), RB-005 (CI50 = 3,6 ^M), VpC96091 (Ki = 0,1 ^M, selectividad 15 veces mayor para SphKl respecto a SphK2) y el Compuesto 55-21 (CI50 = 7,1 ^M, selectividad ~ 108 veces mayor para SphKl respecto SphK2). Véase, por ejemplo, Kennedy, y col. (2011) J. Med. Chem. 54: 3524-48; Baek y col. (2013) J. Med. Chem.

56: 9310-27; DeJonghe y col. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3175-3180; y Byun, y col. (2013) Med. Chem. Comun. 4: 1394.

Esta invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene uno o más de los inhibidores de SphKl descritos en esta invención, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. La expresión «Vehículo farmacéuticamente aceptable» se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el que se administra un inhibidor de la divulgación. Las expresiones “cantidad eficaz” o “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refieren a una cantidad no tóxica pero suficiente de un inhibidor para proporcionar el resultado biológico deseado, Ese resultado puede ser una reducción y/o alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando experimentación de rutina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a ed. (Pharmaceutical Press, 2012). Por ejemplo, se pueden utilizar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Además, se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.

Los expertos en la técnica también conocen excipientes adecuados para formulaciones no líquidas. Una discusión detallada de los excipientes y sales farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a ed. (Pharmaceutical Press, 2012).

Además, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes biológicas, tensioactivos y similares pueden estar presentes en dichos vehículos. Un tampón biológico puede ser cualquier solución que sea farmacológicamente aceptable y que proporcione a la formulación el pH deseado, es decir, un pH en el intervalo fisiológicamente aceptable. Los ejemplos de soluciones tampón incluyen solución salina, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con Tris, solución salina tamponada de Hank y similares.

Dependiendo de la vía de administración pretendida, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, pomadas o lociones, preferentemente una forma de dosificación unitaria adecuada para la administración única de una dosis precisa. Las composiciones incluirán una cantidad eficaz del inhibidor seleccionado en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, además, pueden incluir otros agentes farmacéuticos, adyuvantes, diluyentes, tampones y similares.

En general, las composiciones de la divulgación se administrarán en una cantidad terapéuticamente eficaz mediante cualquiera de las vías de administración aceptadas. Los intervalos de dosificación adecuados dependen de numerosos factores tales como la gravedad de la enfermedad a tratar, la edad y la salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto utilizado, la vía y forma de administración, la indicación hacia la que se dirige la administración, y las preferencias y la experiencia del médico implicado. Un experto en la técnica del tratamiento de dichas enfermedades podrá, sin experimentación indebida y basándose en el conocimiento personal y la divulgación de esta solicitud, determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones de la divulgación para una enfermedad determinada.

Por tanto, las composiciones de la divulgación se pueden administrar como formulaciones farmacéuticas incluyendo aquellas adecuadas para administración oral (incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica, pulmonar, vaginal o parenteral (incluyendo intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para la administración mediante inhalación o insuflación. Opcionalmente, la administración es mediante las vías intravenosa u oral usando una pauta posológica diaria conveniente, que se puede ajustar según el grado de aflicción.

Para composiciones sólidas, los portadores sólidos no tóxicos convencionales incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo o dispersando, y similares, un compuesto como se describe en esta invención y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un excipiente, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar de este modo una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, acetato de trietanolamina sódica, oleato de trietanolamina, y similares. Los procedimientos actuales de preparación de tales formas farmacéuticas son conocidos o serán evidentes para los expertos en la materia; por ejemplo, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, mencionado anteriormente.

Para compuestos impermeables en las células, se pueden usar potenciadores de la permeación que incluyen polímeros tales como policationes (quitosano y sus derivados de amonio cuaternario, poli-L-arginina, gelatina aminada); polianiones (N-carboximetilquitosano, ácido poliacrílico); y polímeros tiolados (carboximetilcelulosacisteína, policarbofilo-cisteína, quitosano-tiobutilamidina, quitosano-ácido tioglicólico, conjugados de quitosanoglutatión).

Para la administración oral, la composición generalmente asumirá la forma de un comprimido, cápsula, una cápsula de gelatina blanda o puede ser una solución, suspensión o jarabe acuoso o no acuoso. Los comprimidos y cápsulas son formas de administración por vía oral preferidas. Los comprimidos y cápsulas para uso oral pueden incluir uno o más portadores utilizados comúnmente tales como lactosa y almidón de maíz. También suelen añadirse agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio.

Normalmente, las composiciones de la divulgación se pueden combinar con un portador inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, manitol, sorbitol y similares. Además, cuando se desee o sea necesario, también se pueden incorporar a la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes utilizados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma xantana y similares.

Cuando se usan suspensiones líquidas, el agente activo se puede combinar con cualquier portador inerte oral, no tóxico y farmacéuticamente aceptable, tal como etanol, glicerol, agua y similares y con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir determinados agentes aromatizantes, colorantes y/o edulcorantes. Otros componentes opcionales para incorporación en una formulación oral en esta invención incluyen, pero no se limitan a, conservantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y similares.

Las formulaciones parenterales pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solubilización o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Preferiblemente, las suspensiones inyectables estériles se formulan según técnicas conocidas en la técnica que usan portadores, agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La formulación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la solución de Ringer y la solución de cloruro sódico isotónica. Además, los aceites, ácidos grasos o polioles estériles fijos se emplean convencionalmente como disolventes o medios de suspensión. Además, la administración parenteral puede implicar el uso de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida de modo que se mantenga un nivel de dosificación constante.

La administración parenteral incluye las vías intraarticular, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, e incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y estériles acuosas y no acuosas. suspensiones que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. La administración a través de determinadas vías parenterales puede implicar la introducción de las formulaciones de la divulgación en el cuerpo de un paciente a través de una aguja o un catéter, propulsadas por una jeringa estéril o algún otro dispositivo mecánico tal como un sistema de infusión continua. Una formulación proporcionada por la divulgación se puede administrar usando una jeringa, inyector, bomba o cualquier otro dispositivo reconocido en la técnica para administración parenteral.

Preferiblemente, las suspensiones inyectables estériles se formulan según técnicas conocidas en la técnica que usan portadores, agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La formulación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la solución de Ringer y la solución de cloruro sódico isotónica. Además, los aceites, ácidos grasos o polioles estériles fijos se emplean convencionalmente como disolventes o medios de suspensión. Además, la administración parenteral puede implicar el uso de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida de modo que se mantenga un nivel de dosificación constante.

Las preparaciones, según la divulgación, para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. El propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo son ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos. Dichas formas de dosificación también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. Pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando las composiciones o calentando las composiciones. También se pueden fabricar usando agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril, inmediatamente antes de su uso.

Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando uno o más de los compuestos de la divulgación en la cantidad requerida al disolvente apropiado con diversos otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Por tanto, por ejemplo, se prepara una composición parenteral adecuada para la administración por inyección agitando 1,5 % en peso de principio activo en 10 % en volumen de propilenglicol y agua. La solución se hace isotónica con cloruro de sodio y se esteriliza.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estos se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperatura ambiente, pero líquido a la temperatura rectal, y, por lo tanto, que se derrita en el recto para liberar el fármaco. Entre dichos materiales se incluyen la manteca de cacao, la cera de abeja y los polietilenglicoles.

Las formulaciones preferidas para la administración tópica de fármacos son pomadas y cremas. Las pomadas son preparaciones semisólidas que se basan normalmente en vaselina u otros derivados del petróleo. Las cremas que contienen el agente activo seleccionado son, como se conoce en la técnica, emulsiones líquidas viscosas o semisólidas, ya sea de aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son lavables con agua, y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa, a veces también llamada la fase "interna", está generalmente compuesta por vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico; la fase acuosa usualmente, aunque no necesariamente, excede la fase oleosa en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulación en crema es generalmente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero. La base de pomada o crema específica, como apreciarán los expertos en la técnica, es aquella que proporcionará una administración óptima del fármaco. Al igual que con otros portadores o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y sin sensibilidad.

Las formulaciones para administración bucal incluyen comprimidos, grageas, geles y similares. Alternativamente, la administración bucal se puede efectuar usando un sistema de administración transmucoso como conocen los expertos en la técnica. Los compuestos de la divulgación también se pueden administrar a través de la piel o el tejido mucoso utilizando sistemas de administración de fármacos transdérmicos convencionales, es decir, "parches" transdérmicos donde el agente está contenido normalmente dentro de una estructura laminada que sirve como un dispositivo de administración de fármacos que se fija a la superficie del cuerpo. En dicha estructura, la composición de fármaco está normalmente contenida en una capa, o "depósito", debajo de una capa de respaldo superior. El dispositivo laminado puede contener un solo depósito o puede contener varios depósitos. Opcionalmente, el depósito incluye una matriz polimérica de un material adhesivo de contacto farmacéuticamente aceptable que sirve para fijar el sistema a la piel durante la administración del fármaco. Los ejemplos de materiales adhesivos de contacto con la piel adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenos, polisiloxanos, poliisobutilenos, poliacrilatos, poliuretanos y similares. Alternativamente, el depósito que contiene el fármaco y el adhesivo de contacto con la piel están presentes como capas separadas y distintas, con el adhesivo debajo del depósito que, en este caso, puede ser una matriz polimérica como se describió anteriormente, o puede ser un depósito de líquido o gel, o puede asumir alguna otra forma. La capa de respaldo en estos laminados, que sirve como la superficie superior del dispositivo, funciona como el elemento estructural principal de la estructura laminada y proporciona al dispositivo gran parte de su flexibilidad. El material seleccionado para la capa de respaldo debe ser sustancialmente impermeable al agente activo y cualquier otro material que esté presente.

Opcionalmente, los inhibidores de SphKl de la divulgación se formulan para la administración en aerosol, particularmente en las vías respiratoria e incluyendo la administración intranasal. Para asegurar el tamaño de partícula adecuado en un aerosol líquido, las partículas pueden prepararse en tamaño respirable e incorporarse a continuación en una dispersión coloidal que contenga un propelente como un inhalador dosificador (m Di) o aire, como en el caso de un inhalador de polvo seco (DPI). El ingrediente activo se proporciona en un paquete presurizado con un propelente adecuado tal como un clorofluorocarbono (CFC) por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. La dosis del fármaco puede controlarse mediante una válvula dosificadora. Alternativamente, los ingredientes activos pueden proporcionarse en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto en una base en polvo adecuada tal como lactosa, almidón, derivados de almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona (PVP). El portador en polvo formará un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosis unitarias, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o paquetes de ampollas desde los cuales se puede administrar el polvo por medio de un inhalador. Alternativamente, las formulaciones se pueden preparar en forma de solución para evitar la preocupación por el tamaño de partícula adecuado en la formulación. No obstante, las formulaciones en solución deben dispensarse de manera que produzcan partículas o gotitas de tamaño respirable.

Para la aplicación de un MDI, se introduce una formulación en aerosol en un cartucho de aerosol equipado con una válvula dosificadora. En las manos del paciente o sujeto, la formulación se dispensa mediante un accionador adaptado para dirigir la dosis desde la válvula al paciente o sujeto.

Generalmente, las formulaciones para administración en aerosol se pueden preparar combinando (i) el fármaco o fármacos seleccionados en una cantidad suficiente para proporcionar una pluralidad de dosis terapéuticamente eficaces; (ii) el fluido, por ejemplo, propelente, en una cantidad suficiente para propulsar una pluralidad de dosis, por ejemplo, desde un cartucho de aerosol; (iii) opcionalmente, la adición de agua en una cantidad eficaz para estabilizar adicionalmente cada una de las formulaciones; y (iv) cualquier componente opcional adicional, por ejemplo, etanol como codisolvente; y dispersando los componentes. Los componentes se pueden dispersar usando un mezclador u homogeneizador convencional, por agitación o por energía ultrasónica, así como por el uso de un molino de bolas o un microfluidizador. Las formulaciones a granel se pueden transferir a viales de aerosol individuales más pequeños usando procedimientos de transferencia de válvula a válvula, llenado a presión o usando procedimientos convencionales de llenado en frío. No se requiere que un componente usado en una formulación de aerosol en suspensión sea soluble en el portador fluido, por ejemplo, propelente. Los componentes que no son suficientemente solubles pueden recubrirse o solidificarse con agentes poliméricos de control de la disolución en una cantidad apropiada y las partículas recubiertas pueden incorporarse, a continuación, en una formulación como se describió anteriormente. Los agentes poliméricos de control de la disolución adecuados para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, copolímero de poliláctido glicólido, ésteres acrílicos, poliamidoaminas, derivados de celulosa sustituidos o no sustituidos y otros productos de hidratos de carbono y polisacáridos de origen natural tales como zeína y quitosano.

Cuando se emplea un medicamento macromolecular, opcionalmente se selecciona un segundo estabilizante adecuado. Un segundo estabilizante adecuado es un coloide protector tal como glicina, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, leucilalanina, metionina, treonina, isovalina, fenilalanina, tirosina, serina, cisteína, N-acetil-L-cisteína, histidina, triptófano, prolina e hidroxiprolina, por ejemplo, trans-4-hidroxiprolina, ácido aspártico y ácido glutámico, arginina, glutamina, lisina, hidroxilisina, ornitina, asparagina, citrulina y similares.

Una formulación fluida o en aerosol incluye preferiblemente el estabilizante coloide protector en una cantidad eficaz para estabilizar la formulación en relación con una formulación idéntica que no contiene el estabilizante, de modo que el fármaco no sedimente, se acreme o flocule después de la agitación tan rápidamente como para evitar la dosificación reproducible del fármaco. Se puede lograr una dosificación reproducible si la formulación conserva una concentración de fármaco sustancialmente uniforme durante de aproximadamente quince segundos a aproximadamente cinco minutos después de la agitación.

Normalmente, para un rendimiento funcional y terapéutico óptimo de una formulación en aerosol, ya sea como un polvo seco o como una suspensión de aerosol, el estabilizante está presente como un portador grueso (por ejemplo, 20-90 |jm) o como un polvo finamente micronizado, ^ 10 jm de diámetro. En cualquier caso, se obtiene una dosimetría del fármaco reproducible sin necesidad de calificar la maniobra inspiratoria del paciente. En consecuencia, se obtiene una excelente uniformidad de dosis con flujos corrientes de hasta 2 litros, o con caudales inspiratorios tan bajos como 15 litros por minuto hasta aproximadamente 90 litros por minuto.

La cantidad particular de estabilizante que constituye una cantidad eficaz depende del estabilizante particular, el propelente particular y el fármaco particular usado en la formulación. Por lo tanto, no es práctico enumerar cantidades efectivas específicas para usar con formulaciones específicas de la invención, pero dichas cantidades pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la técnica con la debida consideración de los factores expuestos anteriormente. Generalmente, sin embargo, el estabilizante coloide protector puede estar presente en una formulación en una cantidad de aproximadamente 0,0001 partes por millón a aproximadamente 200.000 partes por millón, más preferiblemente de aproximadamente 1 parte por millón a aproximadamente 10.000 partes por millón, de la forma más preferible de aproximadamente 10 partes por millón a aproximadamente 5.000 partes por millón de la formulación total.

Pueden usarse cartuchos de aerosol equipados con válvulas convencionales, preferiblemente válvulas dosificadoras, para administrar las formulaciones de la invención. Sin embargo, se ha descubierto que la selección de conjuntos de válvula apropiados para su uso con formulaciones de aerosol depende del componente particular y otros adyuvantes usados (si los hay), del fluido, por ejemplo, propelente, y del fármaco particular que se usa. Los cauchos de válvula de neopreno y de buna convencionales usados en válvulas dosificadoras para administrar formulaciones de clorofluorocarbono convencionales a menudo tienen características de administración de válvula subóptimas y facilidad de operación cuando se usan con formulaciones que contienen propelente HFC-134a o HFC-227. Por lo tanto, ciertas formulaciones de la invención se dispensan preferiblemente a través de un conjunto de válvula donde el diafragma está hecho de un caucho de nitrilo tal como DB-218 (American Gasket and Rubber; Schiller Park, IL) o un caucho EPDM tal como VISTALON (Exxon), ROYALENE. (UniRoyal), BUNAEP (Bayer). También son adecuados los diafragmas fabricados por extrusión, inyección, moldeo o moldeo por compresión a partir de un material elastomérico termoplástico, tal como la poliolefina FLEXOMER GERS 1085 ⁿT (Union Carbide). Los cartuchos de aerosol convencionales, recubiertos o sin recubrir, anodizados o no anodizados, por ejemplo, los de aluminio, vidrio, acero inoxidable, polibutilo o tereftalato de polietileno, y cartuchos o botes recubiertos con epon, epoxi, etc., se pueden usar para contener una formulación de la invención.

Se administrará al sujeto una cantidad farmacéutica o terapéuticamente eficaz de la composición. La cantidad eficaz precisa variará de un sujeto a otro y dependerá de la especie, la edad, el tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y extensión de la afección que se está tratando, las recomendaciones del médico tratante y la terapia o combinación de terapias seleccionadas para administración. Por tanto, la cantidad eficaz para una situación dada se puede determinar mediante experimentación de rutina. Para los fines de la divulgación, generalmente una cantidad terapéutica estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, en al menos una dosis. En mamíferos más grandes, la dosis diaria indicada puede ser de aproximadamente 1 mg a 300 mg, una o más veces al día, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 mg a 200 mg. Al sujeto se le pueden administrar tantas dosis como sea necesario para reducir y/o aliviar los signos, síntomas o causas del trastorno en cuestión, o provocar cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Cuando se desee, se pueden preparar formulaciones con recubrimientos entéricos adaptados para la administración de liberación sostenida o controlada del ingrediente activo.

Las preparaciones farmacéuticas están preferiblemente en formas de dosificación unitarias. En esta forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada en un envase que contenga cantidades específicas de la preparación, por ejemplo, comprimidos, cápsulas y polvos en cartuchos o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, oblea o pastilla para chupar, o puede ser la cantidad adecuada de cualquiera de estos en forma envasada.

Se proporcionan los siguientes ejemplos no taxativos para ilustrar aun más la presente invención.

Ejemplo de referencia 1: implicación de SphKI en la fibrosis pulmonar

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad devastadora caracterizada por lesión de las células epiteliales alveolares, acumulación de fibroblastos/miofibroblastos y depósito de proteínas de la matriz extracelular. Se ha demostrado que los niveles de S1P están elevados en líquidos broncoalveolares y tejidos pulmonares de pacientes con FPI y modelos animales de fibrosis pulmonar. Se han utilizado análisis de micromatrices de células mononucleares sanguíneas de pacientes con IPF y ratones knockout para SphKl, SphK2 o S1PL e inhibidor de SphK, SKI-II (4-[[4-(4-clorofenil)-2-tiazolil]amino]-fenol) para evaluar el papel de S1P en la fibrogénesis. La expresión de SphKl se correlaciona negativamente con la función pulmonar y la supervivencia de los pacientes con FPI. Además, las expresiones de SphKl y S1PL aumentan en los tejidos pulmonares de pacientes con FPI y ratones expuestos a bleomicina. La eliminación genética de SphKl, pero no SphK2, mejora la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones mientras que la deleción de S1PL (SGPL1+/_) en ratones potencia la fibrosis posterior a la exposición a bleomicina. TGF-p aumenta la expresión de SphKl y S1PL en fibroblastos de pulmón humano y la eliminación de SphKl o el tratamiento con el inhibidor de SphK SKI-II atenúa la generación de S1P y la transducción de señales mediada por TGF-p. La sobreexpresión de S1PL atenúa la secreción de TGF-p inducida por bleomicina y la diferenciación mediada por S1P de fibroblastos de pulmón humano mediante la regulación de la autofagia. La administración del inhibidor de SphK SKI-II ocho días después de la exposición a bleomicina reduce la mortalidad inducida por bleomicina y la fibrosis pulmonar. Véase Huang, y col. (2013) FASEB J. 27: 1749-60; Huang y Natarajan (2015) Adv. Biol. Reg. 57: 55-63; Huang, y col. (2015) Thorax doi:10.1136/thoraxjnl-2014-206684.

Ejemplo 2: PF-543 mejora la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina

Estudios in vivo. En este análisis, ratones C57BL/6J de 8 semanas de edad, de tipo silvestre, fueron tratados con 1,5 U/kg de bleomicina. Posteriormente, a los ratones se les administró PF-543 (i.p., 5 mg/kg; dos veces por semana) desde el día 7 hasta los 21 días después de la exposición a bleomicina. Los resultados de este análisis indicaron que el PF-543 protegió parcialmente a los ratones contra la lesión pulmonar y la fibrosis pulmonar, como lo demuestra la disminución del depósito total de colágeno, los niveles de TGF-p en los fluidos de lavado broncoalveolar (BAL), la expresión de a-actina del músculo liso (a- SMA) y fibronectina en tejidos pulmonares en comparación con ratones expuestos a bleomicina sin PF-543.

En un estudio similar, se administró PF-543 (i.p., 5 mg/kg; dos veces por semana) desde el día 21 hasta los 42 días después de la exposición de bleomicina (ratones C57BL/6J de 8 semanas de edad, de tipo silvestre; 1,5 U/kg). Este análisis indicó una resolución mejorada de la fibrosis pulmonar como lo demuestra una disminución en el depósito de colágeno y la puntuación de Ashcroft en comparación con los ratones expuestos a bleomicina sin PF-543.

Estudios in vitro. Para analizar más los efectos de PF-543, se trataron fibroblastos de pulmón humano con PF-543 (1-5 |^j M) durante 1 hora y se evaluó la diferenciación mediada por TGF-p. Este análisis indicó que PF-543 atenuó la diferenciación de fibroblastos mediada por TGF-p a miofibroblastos como lo demuestra la expresión disminuida de fibronectina y a-SMA. Además, el pretratamiento de fibroblastos con PF-543 atenuó la expresión inducida por TGF-p de YAP1, un factor de transcripción asociado con la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos.

La implicación de SphKl en la regulación de la expresión de YAP1 inducida por TGF-p en fibroblastos de pulmón se analizó con más detalle en ratones SphK1'/_. Se administró TGF-p (5 ng/ml durante 48 horas) a ratones SphK1'/_ y se midió la expresión de YAP1. Este análisis indicó que la regulación positiva de la expresión de YAP1 mediada por TGF-p se redujo en fibroblastos de pulmón de ratón aislados de ratones SphK1'/_ en comparación con células de ratones de tipo silvestre. Estos resultados indican un papel de SphKl en la expresión de YAP1.

Los fibroblastos de pulmón humano normales, pretratados con PF-543 (1-5 ^j M en DMSO) o vehículo (DMSO) durante 1 hora, se trataron adicionalmente con TGF-p (5 ng/ml, 48 horas). Se caracterizó la diferenciación de fibroblastos inducida por TGF-p para analizar la expresión de fibronectina y a-SMA. Los datos indicaron que el pretratamiento con PF-543 (1, 5 j M) inhibió drásticamente la expresión de fibronectina y a-SMA inducida por TGF-p, así como la diferenciación celular de fibroblastos de pulmón humano. Curiosamente, TGF-p también aumentó la expresión de YAP1, la proteína clave en la ruta hippo/Yap; y el tratamiento de PF-543 también inhibió dramáticamente la expresión de YAP1 inducida por TGF-p en fibroblastos de pulmón humano. Además, en comparación con el fibroblasto de pulmón de ratón de control (de ratones de tipo silvestre), la diferenciación de fibroblastos inducida por TGF-p y la expresión de YAP1 fueron drásticamente menores en el fibroblasto de pulmón aislado de ratones SphK1~/-. Por consiguiente, la inhibición selectiva de SphKl es útil en la prevención y el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina.

Ejemplo 3: PF-543 en la prevención y el tratamiento de la lesión pulmonar inducida por oxígeno

Para demostrar el uso de PF-543 en la atenuación de la lesión pulmonar en adultos inducida por hiperoxia, se administró una dosis de 5 mg/kg/d de PF-543 x 2 días a ratones adultos antes de la exposición al oxígeno (75 %). Este análisis indicó que PF-543 atenuó la lesión pulmonar inducida por hiperoxia como se evidencia por los hallazgos de histología pulmonar y lavado broncoalveolar (BAL). La histología pulmonar mostró una infiltración reducida de líquido inflamatorio pulmonar después del tratamiento con PF-543. El fluido de BAL mostró una concentración de proteína total reducida y un infiltrado de células inflamatorias reducido. Véanse las figuras 1A y 1B. En análisis similares, se expuso a ratones recién nacidos al aire ambiente, hiperoxia (75 %) o hiperoxia (75 %) posterior a la administración de PF-543 (20 mg/kg/día). Este análisis indicó que los pulmones de ratones recién nacidos expuestos al oxígeno (75 %) exhibió un daño significativo similar al enfisema, mientras que la estructura pulmonar de aquellos animales tratados previamente con PF-543 y expuestos al oxígeno (75 %) estaba bien conservada (figuras 2A-2C). Por lo tanto, PF-543 protegió los pulmones de los ratones recién nacidos de la lesión por oxígeno.

Para demostrar el uso de PF-543 en el tratamiento de la lesión pulmonar por agresión hiperóxica, se administra PF-543 24 horas o 12 horas después del inicio de la exposición de crías de ratón neonatales o ratones adultos, respectivamente, a hiperoxia.

Para determinar la dosis eficaz más baja, el PF-543 se administra sistémicamente mediante inyección o localmente a los pulmones. Para la administración sistémica (figura 3A), tres dosis bajas diferentes de PF-543 (es decir, 1 mg/kg, 5 mg/kg y 10 mg/kg) se utilizan en ratones adultos y recién nacidos (PN3) para identificar la dosis más eficaz contra la lesión pulmonar hiperóxica. El PF-543 se administra durante 7 días a ratones recién nacidos y 3 días a adultos mediante inyecciones en días alternos. El daño pulmonar se evalúa según la histología, los niveles de proteínas y citocinas y los recuentos celulares diferenciales en los fluidos de lavado broncoalveolar.

Para la administración local (figura 3B), el PF-543 se aerosoliza a través de un nebulizador o se administra por vía intranasal tres veces al día durante la duración del tratamiento, es decir, 7 días para ratones recién nacidos y 3 días para ratones adultos. En ratones recién nacidos, el PF-543 se administra tanto en forma nebulizada como como complemento con una preparación comercial de tensioactivo pulmonar. El tensioactivo se administra de forma rutinaria a los recién nacidos prematuros como tratamiento para el síndrome de dificultad respiratoria. El tensioactivo es en gran parte una mezcla de lípidos sintéticos que imita al tensioactivo natural del pulmón. El PF-543, que es soluble en lípidos, se puede administrar fácilmente a recién nacidos prematuros. El PF-543 disuelto en tensioactivo se administra por vía intranasal todos los días durante 7 días a crías de ratón de 3 días que están expuestas a hiperoxia al mismo tiempo. Se espera que el PF-543 administrado localmente aumente drásticamente la disponibilidad y la potencia del PF-543 reduciendo así la dosis requerida para obtener el efecto deseado.

La inhalación de humo de cigarrillo es un modelo animal bien establecido para la EPOC. Por consiguiente, para demostrar el efecto protector de PF-543 en la EPOC, se exponen ratones adultos al humo del cigarrillo y se administra PF-543 sistémica o localmente a una dosis eficaz (figura 3C). El daño pulmonar se evalúa según la histología, los niveles de proteínas y citocinas y/o los recuentos celulares diferenciales en los fluidos de lavado broncoalveolar. Se espera que el PF-543 proteja a los animales contra la lesión pulmonar en este modelo de EPOC. Por consiguiente, basándose en estos resultados experimentales y esperados, la inhibición selectiva de SphKl es útil en la prevención y el tratamiento de la lesión pulmonar inducida por oxígeno.

Ejemplo 4: PF-543 atenúa la generación de ROS en HLMVEC

Se ha demostrado que la producción de ROS inducida por hiperoxia está regulada por la fosforilación de tirosina dependiente de Src de p47phox en HPAEC (Chowdhury, y col. (2005) J. Biol. Chem. 280: 20700-11). Sin embargo, no se mostró el papel de la señalización de SphK1/S1P en la activación de NADPH oxidasa y la producción de ROS. Para demostrar el papel de SphKl, las HLMVEC se trataron previamente con PF-543 antes de la exposición a la hiperoxia. Los resultados de este análisis indicaron que PF-543 atenuó la generación de [32P]S1P mediada por hiperoxia (>80 %) en comparación con las células no tratadas con PF-543, lo que confirma la potencia del inhibidor. Posteriormente, se investigó el efecto de PF-543 sobre la translocación de p47phox inducida por hiperoxia a la periferia celular y la producción de ROS. Este análisis indicó que la translocación de p47phox inducida por hiperoxia a la periferia celular y la generación de ROS fue inhibida por PF-543 en comparación con las células no tratadas. En contraste con la hiperoxia, la translocación mediada por S1P exógena de p47phox a la periferia celular no se vio afectada por PF-543.

Para confirmar aún más el papel de SphKl en la activación de p47phox mediada por hiperoxia, se tomaron imágenes de células vivas utilizando el biosensor p47phox, una proteína sensible a redox formada por la fusión de GFP sensible a redox con p47phox (p47-roGFP). Las HLMVEC se transfectaron con p47-roGFP antes de la exposición a hiperoxia. Este análisis indicó que la hiperoxia provocó la agregación de vesículas p47 marcadas con GFP en HLMVEC en comparación con la normoxia, y PF-543 suprimió la agregación inducida por hiperoxia y la estimulación de la proteína biosensora p47phox. Estos resultados muestran la dependencia de SphKl en la activación inducida por hiperoxia de p47phox y la generación de ROS en HLMVEC. Además, el inhibidor específico de SphKl (PF-543) y el siRNA de Spns2, S1P1 y S1P2 atenuaron la activación inducida por hiperoxia de p47phox en HLMVEC; y la inhibición de SphKl, usando PF-543, no afectó a la activación de p47phox inducida por ^s 1^p exógena.

Ejemplo de referencia 5: implicación de SphK1 en la fibrosis pulmonar inducida por radiación

En contraste con el período post-irradiación temprano, se ha demostrado que SphKl post-irradiación tardío y fosfatos de base 1 esfingoide están asociados con la fibrosis pulmonar inducida por radiación (FIR). Utilizando un modelo en ratón, se ha demostrado que FIR se caracteriza por una marcada regulación positiva de los niveles de esfingosina-1-fosfato (S1P) y dihidroesfingosina-1-fosfato (DHS1P) en el tejido pulmonar y en la circulación, acompañado de un aumento de la expresión y actividad de SphKl pulmonar. La inhibición de la biosíntesis de novo de esfingolípidos al dirigirse a la serina palmitoiltransferasa (SPT) con miriocina reduce la inflamación pulmonar inducida por radiación y retrasa la aparición de FIR como lo demuestra el aumento de la esperanza de vida del animal (figura 4A) y la disminución de la expresión de marcadores de fibrogénesis, tales como colágeno y a-SMA, en el pulmón. Véase Gorshkova, y col. (2012) J. Lipid Res. 53: 1553-1568.

También se ha demostrado el efecto de la miriocina sobre la expresión de SphKl y SphK2. La evaluación de la actividad SphK total en las muestras de tejido pulmonar indica un aumento sustancial (2 veces) por irradiación y la capacidad de la miriocina de obstaculizar este efecto inducido por radiación (figura 4B). El efecto de la miriocina sobre la actividad de SphK inducida por radiación se refleja en su efecto sobre la expresión de SphKl (figuras 4C y 4D) pero no la expresión de SphK2 (figuras 4E y 4F). Véase Gorshkova, y col. (2012) J. Lipid Res. 53: 1553-1568. Por lo tanto, la disminución observada en la inflamación pulmonar inducida por radiación y el retraso en la aparición de FIR observado en respuesta a la miriocina se correlaciona con una disminución en la expresión y actividad de SphKl, pero no de SphK2. Por consiguiente, la inhibición selectiva de SphKl es útil en la prevención y el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por radiación.

Ejemplo de referencia 6: implicación de SphK1 en la hipertensión arterial pulmonar (HAP)

Se ha demostrado que los niveles de proteína de SphKl, pero no de SphK2, están significativamente elevados en los pulmones (figuras 5A-5B) y en las células del músculo liso de la arteria pulmonar (PASMC) de los pacientes con HAP en comparación con los sujetos de control. Se ha observado un patrón similar en modelos experimentales en roedores de hipertensión pulmonar mediada por hipoxia (HPH), en los que la expresión de proteínas de SphKl, pero no de SphK2, estaba significativamente elevada en los pulmones de ratones y ratas expuestos a hipoxia (10 % de O2). durante 4 semanas (figuras 5C-5D, respectivamente). Véase Chen, y col. (2014) Am. J. Resp. Crit. Care Med.

190: 1032-43.

Para examinar más a fondo el papel de las SphK en la hipertensión pulmonar, se inhibieron tanto SphKl como SphK2 en ratas expuestas a hipoxia utilizando el inhibidor no selectivo SKI-II. En comparación con las ratas tratadas con vehículo, el tratamiento con SKI-II (10 mg/kg de peso corporal, por vía intraperitoneal, una vez cada dos días durante 3,5 semanas) impidió el desarrollo de HPH, según lo evaluado por RVSP, RVH y remodelación vascular pulmonar (figuras 6A-6C, respectivamente). Véase Chen, y col. (2014) Am. J. Resp. Crit. Care Med. 190: 1032-43. Por consiguiente, la inhibición selectiva de SphKl es útil en la prevención y el tratamiento de la HAP.

Ejemplo de referencia 7: implicación de SphKl en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica

Se ha demostrado que los macrófagos alveolares de pacientes con EPOC tienen una capacidad deficiente para fagocitar células apoptóticas a pesar de dejar de fumar (eferocitosis defectuosa). Además, se ha demostrado que los macrófagos alveolares de pacientes con EPOC exhiben una expresión de ARNm significativamente mayor de SphKl y SphK2 (aumento de 3,5 y 2,1 veces, respectivamente). Además, en comparación con los individuos no fumadores, se encuentra una expresión de ARNm relativa significativamente mayor de SphKl en los fumadores sanos actuales (aumento de 6 veces) y en los pacientes con EPOC fumadores actuales (aumento de 4,8 veces) en comparación con los sujetos de control. Véase Barnawi, y col. (2015) PLoS One 10:e0122771. Por consiguiente, la inhibición selectiva de SphKl es útil en la prevención y el tratamiento de la EPOC.

Ejemplo de referencia 8: implicación de SphK1 en la displasia broncopulmonar

La displasia broncopulmonar del recién nacido prematuro se caracteriza por una lesión pulmonar, lo que da como resultado una simplificación alveolar y una función pulmonar reducida. Se ha demostrado que el eje de señalización de S1P alterado, en parte, es responsable de la lesión pulmonar neonatal que conduce a la displasia broncopulmonar. En particular, se ha demostrado que la hiperoxia aumenta los niveles de S1P y altera la expresión de SphKl, pero no de SphK2 (figura 7A-7B). Además, cuando ratones recién nacidos de tipo silvestre, deficientes en esfingosina cinasa 1 (SphK1'/_), deficientes en esfingosina cinasa 2 (Sphk2'/_) y deficientes en S1P liasa (Sgpl1+/_) fueron expuestos a hiperoxia (75 %) desde el día postnatal 1 al 7, los ratones SphK1'/', pero no Sphk2'/_ o Sgpl 1 /-, ofrecen protección contra la lesión pulmonar inducida por hiperoxia, con una mejor alveolarización (figura 7C) e integridad alveolar en comparación con el tipo silvestre. Además, la deficiencia de SphKl atenúa la acumulación de IL-6 inducida por hiperoxia en los fluidos de lavado broncoalveolar y la expresión de la proteína NADPH oxidasa (NOX) 2 y NOX4 en el tejido pulmonar. Los experimentos in vitro que utilizan células endoteliales microvasculares de pulmón humano muestran que la S1P exógena estimula la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares, mientras que el siRNA de SphKl, o el inhibidor SKI-II contra SphKl (figura 7D), atenúa la generación de S1P inducida por hiperoxia. La eliminación de NOX2 y NOX4, mediante el uso de siRNA específico, reduce la formación de ROS tanto basal como inducida por S1P. Véase Harijith, y col. (2013) Am. J. Pathol. 183: 1169-1182. Por consiguiente, la inhibición selectiva de SphKl es útil en la prevención y el tratamiento de la lesión pulmonar inducida por hiperoxia, en particular la displasia broncopulmonar.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar en un sujeto, comprendiendo el uso administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz del inhibidor de SphKl para prevenir o tratar la enfermedad o afección pulmonar del sujeto, donde el inhibidor de SphKl es permeable en las células, tiene un valor de CI50 de menos de 10 |jM, tiene una Ki de menos de 10 jM, y exhibe al menos una selectividad 20 veces mayor para SphKl que SphK2; donde el inhibidor de SphKl comprende [(2R)-1-[[4-[[3-(bencenosulfonilmetil)-5-metilfenoxi]metil]fenil]metil] pirrolidin-2-il]metanol (PF-543) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para el uso según la reivindicación 1, donde la enfermedad o afección pulmonar comprende hipertensión pulmonar, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar restrictiva, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquiectasia, bronquiolectasia, bronquiolitis, bronquitis, enfisema, una enfermedad pulmonar intersticial o infiltrativa difusa, pleuritis serofibrinosa, pleuritis supurativa, pleuritis hemorrágica, un derrame pleural, fibrosis pulmonar idiopática, displasia broncopulmonar, hiperoxia o lesión pulmonar inducida por oxígeno, lesión debida a toxicidad farmacológica o quimioterapéutica, lesión inducida por radiación o lesión química.

3. El inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso según la reivindicación 2, donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de ácido cítrico.

4. El inhibidor de SphKl, o una combinación del mismo, para su uso según la reivindicación 1, donde dicho inhibidor de SphKl se administra a los pulmones del sujeto.

5. El inhibidor de SphKl para su uso según la reivindicación 1, donde la enfermedad o afección pulmonar es una lesión pulmonar inducida por oxígeno.

6. El inhibidor de SphKl para su uso según la reivindicación 5, donde la sal farmacéuticamente aceptable es una sal de ácido cítrico.

7. El inhibidor de SphKl para su uso según la reivindicación 5, donde el PF-543, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra a los pulmones del sujeto.

8. Una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad o afección pulmonar en un sujeto, siendo la composición farmacéutica para administración en aerosol y comprendiendo uno o más propelentes y [(2R)-1-[[4-[[3-(bencenosulfonilmetil)-5-metilfenoxi]metil]fenil]metil]pirrolidin-2-il]metanol (PF-543) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9. Un inhalador dosificador para la administración de aerosol que comprende un cartucho de aerosol equipado con una válvula dosificadora, donde el cartucho de aerosol está lleno con la composición farmacéutica según la reivindicación 8.