BR112013019335B1 - Nova composição, método para aumentar o nível de camp em um célula e combinação terapêutica, para o tratamento da fibrose cística - Google Patents

Abstract

NOVA COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA AUMENTAR O NÍVEL DE cAMP EM UM CÉLU-LA E COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA, PARA O TRATAMENTO DA FIBROSE CÍSTICA. A presente invenção fornece uma composição compreendendo pelo menos uma prostaci-clina ou um análogo da prostaciclina ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado, e pelo menos uma inibidor da fosfodiesterase (PDE) 4 e ainda, opcionalmente, um inibidor da PDE para o uso na prevenção ou tratamento da fibrose cística, aumentando seletiva-mente os níveis de cAMP nas células broncoepiteliais.

Description

A presente invenção fornece composições compreendendo uma prostaciclina 5 ou um análogo da prostaciclina em combinação com um inibidor da fosfodiesterase 4 para uso na prevenção ou tratamento de fibrose cística, bem como composições específicas.

Prostaglandina I2 (prostaciclina; epoprostenol, PGI2) é um metabolite oxigenado do ácido araquidônico formado enzimaticamente pelas atividades 10 sequenciais das enzimas ciclooxigenase e PGI sintetase. É constitutivamente produzido pelas células vasculares endoteliais e do músculo liso e é induzida em condições inflamatórias nas células vasculares e macrófagos.

PGI2 é um potente agente vasodilatador e antítrombótico cujos efeitos resultam da ligação a um único receptor heptahelical acoplado à proteína G 15 denominado de receptor prostanóide I (IP) 4. Este receptor é acoplado a Gs- e ativa a adenilato ciclase, resultando em uma explosão aguda de cAMP intracelular. Como a expressão de CFTR e CFTR mutante são cAMP dependentes, as substâncias que aumentam os níveis intracelulares de cAMP são de interesse para o desenvolvimento de medicamentos para o tratamento de CF (= Fibrose Cística). A 20 maioria dessas substâncias, tais como a forskolina, entretanto, induzem uma elevação bastante inespecífica de cAMP, que também pode ter efeitos muito prejudiciais, tal como inflamação. Assim, há uma necessidade não atendida de potenciadores específicos de cAMP em células epiteliais do pulmão.

Treprostinila é um potente agonista do receptor IP, embora sua especificidade 25 para este receptor seja desconhecida. Sprague R.S. et aí., Microcirculation 2008 • Jul; 5:461-71, mostrou que os análogos da prostaciclina (UT-15, Remodulin) estimulam a síntese de cAMP mediada por receptor e a liberação de ATP de eritrócitos de coelho e humanos.

Fosfodiesterase nucleica (PDE) é uma enzima que catalisa a hidrólise de cAMP e monofosfato de 3',5-guanosina cíclico (cGMP) para inativar produtos de 5'-nucleotídeo. cAMP e cGMP apresentam muitos efeitos intracelulares, mediados amplamente através de seu efeito estimulante sobre as proteína quinases de multi substrato. Através da inibição de PDE, o nível de cAMP e cGMP é aumentado, resultando em relaxamento do músculo liso de vias aéreas respiratórias e inibição da ativação de células inflamatórias. PDE4, PDE7 e PDE8 são específicas para cAMP.

Inibidores da fosfodiesterase bloqueiam um ou mais dos subtipos da enzima fosfodiesterase (PDE) impedindo, portanto, a inativação dos segundos mensageiros intracelulares monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) e monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) pelos respectivos subtipo(s) de PDE. As isoenzimas PDE de 3',5'- nucleotídeo cíclico são um componente muito importante da via de sinalização do cAMP 7 proteína quinase A (PKA). Foram identificadas onze famílias de PDE. A superfamília das isoenzimas PDE consiste em pelo menos nove famílias de genes (tipos), PDE1 a PDE11. Algumas famílias PDE são muito diversas e consistem em vários subtipos e numerosas variantes de disformas de processamento (do inglês splicing).

São exemplos de inibidores ínespecíficos da PDE, teofilina e compostos relacionados a xantina, cafeína, aminofilina, etc. A Vinpocetina é um inibidor seletivo da PDE1. Inibidores seletivos da PDE2 conhecidos são EHNA ou Anagrelida, inibidores seletivos da PDE3 são Enoximona ou Milrinona.

PDE4 é a principal enzima de metabolização de cAMP encontrada em células inflamatórias e imunes. Inibidores da PDE4 revelaram-se como potentes drogas anti- inflamatórias, especialmente em doenças inflamatórias pulmonares, tais como asma, DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica) e rinite. Eles suprimem a liberação de citocinas e outros sinais inflamatórios, e inibem a produção de espécies reativas a oxigénio. Inibidores da PDE4 conhecidos são, por exemplo, Mesembrina, Rolipram, Ibudilast, etc.

Inibidores da PDE5 são primariamente metabolizados pela enzima CYP3A4 do citocromo P450. Existe o potencial para interações medicamentosas adversas com outras drogas que inibem ou induzem CYP3A4, incluindo inibidores da protease do HIV, cetoconazol, itraconazol, e outras drogas anti-hipertensivas tais como Nitro- spray. Exemplos de inibidores da PDE5 são Sildenafila, Tadalafil, Vardenafil ou Udenafil.

A Fibrose Cística (CF) é uma doença genética resultante de mutações em um 15 gene de 230 kb no cromossomo 7 codificando um polipeptídio de 1480 aminoácidos conhecido como regulador da condutância transmembrana na fibrose cística (CFTR), que serve como um canal de cloreto nas membranas epiteliais. Mais de 1000 alelos mutantes foram identificados até à data. A mutação mais-comum, ΔF508, é a deleção de um resíduo de fenilalanina no códon 508 no regulador da condutância transmembrana na fibrose cística (CFTR). Essa mutação resulta em uma redução severa na função do CFTR, e leva ao fenótipo clássico na fibrose cística caracterizado com anomalia nas funções da glândula exòcrina tais como cloretos no suor elevados, infecções respiratórias recorrentes com bronquiectasia, e ‘ insuficiência pancreática precoce.

Clinicamente, geralmente se suspeita de CF quando um ou mais características fenotípicas típicas de CF estão presentes em um indivíduo. Poderia ser uma doença pulmonar crônica apenas ou associada muito frequentemente a anormalidades gastrointestinais e nutricionais (por exemplo, insuficiência 5 pancreática e pancreatite recorrente), síndrome de perda de sal e anormalidades urogenitais masculinos (ou seja, azoospermia obstrutiva). No pulmão humano, secreções espessas tenazes obstruem as vias aéreas respiratórias distais e glândulas submucosas, que expressam CFTR. Dilatação dos duetos dessas glândulas (associada com obstrução por muco) e o revestimento das superfícies das vias aéreas respiratórias por resíduos mucopurulentos, espessos, viscosos, dominados por neutrófilos estão entre as características patológicas da doença. Inflamação pulmonar é outra das principais causas do declínio na função respiratória em indivíduos com fibrose cística e pode preceder o aparecimento de infecção crônica. Impactação mucinosa e concreções espessas dentro dos duetos 15 pancreáticos levam a fibrose crônica, substituição gordurosa da glândula, ou ambos, em um grande subgrupo de indivíduos com diagnóstico prévio de pancreatite idiopática ou alcoólica.

A fibrose cística é a doença hereditária fatal mais comum na população caucasiana, afetando cerca de 4 em 10.000 crianças. Nos Estados Unidos, a média 20 de idade na morte aumentou de 8,4 anos de idade em 1969 para 14,3 anos de idade em 1998. A média de idade de morte aumentou de 14 anos èm 1969 para 32,4 anos de idade em 2003 (Cystic Fibrosis Foundation). Para crianças nascidas nos anos 90, a sobrevida média é prevista para ser mais de 40 anos. Os principais contribuintes para o aumento significativo da esperança de vida é a melhora no tratamento de infecções crônicas do trato respiratório e da eliminação de muco nos indivíduos com CF, bem como nutrição melhorada e diagnóstico precoce.

Perdas na condutância dos ânions do regulador da condutância transmembrane na fibrose cística (CFTR) das membranas apicais do epitélio das 5 vias aéreas respiratórias interrompe a regulação da camada líquida superficial das vias aéreas respiratórias. Isto leva a uma depuração mucociliar prejudicada, infecção das vias aéreas respiratórias e inflamação característica da fibrose cística (CF). A mutação ΔF508 comum do CFTR está presente pelo menos um alelo em > 90% dos pacientes com CF, e > 50% dos pacientes são homozigotos para ΔF508, sendo o resto compostos heterozigotos. Uma questão central na doença CF é a incapacidade desta variante do CFTR comum em alcançar seu estado nativo, dobrado que sairá do retículo endopíasmático (ER) e trafegar para a membrana apical das células epiteliais.

Se a aquisição da conformação nativa for retardada, considera-se que o 15 CFTR mantém interações excessivas ou prolongadas com chaperonas moleculares, que, em seguida, visam a degradação da proteína através de mecanismos que controlam o ER (Retículo Endopíasmático) para proteínas complexadas mal dobradas ou incompletas. O sistema de degradação associado ao RE (ERAD) envolve a ubiquitinação de proteínas aberrantes e sua entrega ao proteassomá para 20 degradação. Se o ERAD está aquém da taxa de síntese proteica, ou durante o tratamento com inibidores do proteassoma, acumulam-se agregados da proteína mutante. CFTR foi a primeira proteína integral de membrana de mamíferos a ser identificada como substrato para a degradação mediada de ubiquitina-proteassoma, e tem servido como um modelo para a lista crescente de doenças de conformação 25 de proteínas, que representam um conjunto diversificado de etiologias patológicas.

Essencialmente todas as proteínas CFTR ΔF508 produzidas pela célula são destruídas pelo ERAD. Também, devido ao seu complexo padrão de dobramento, 60-70% da proteína tipo selvagem (wt) pode ser degradada do mesmo modo, embora isto possa variar entre os tipos de células. Os padrões de divagem proteolítica das formas imaturas wt e CFTR ΔF508 são semelhantes, considerando . que o padrão de digestão de CFTR madura wt é diferente. Esta descoberta apoia a ideia de que pelo menos uma porção de CFTR mutante retida no ER está presente em uma conformação intermediária que é formada ao longo da via dobramento normal de CFTR, em oposição à formação de uma estrutura de proteína variante.

Para CFTR ΔF508, esta conformação intermediária não pode prosseguir-além de uma etapa crítica no processo de dobramento, mas isto implica que CFTR ΔF508 poderia ser resgatada, se fosse possível facilitar esta etapa.

Uma variedade de condições experimentais, tais como temperatura reduzida, incubação com chaperonas químicas, ou corretores farmacológicos, podem promover a saída de CFTR ΔF508 do ER, rendendo um canal de ânion funcionais na superfície da célula. Além disso, investigadores relataram restauração da função CFTR ΔF508 por co-expressão de várias construções parciais ou subdomínios ' CFTR de CFTR wt. No entanto, um consenso sobre quais subdomínios CFTR são eficazes no resgate dé proteína mutante não é aparente, e o mecanismo deste efeito permanece obscuro. Além dísso, o resgate induzido do fragmento CFTR tem sido observado principalmente nas células exogenamente superexpressando tanto o fragmento CFTR e CFTR ΔF508 de comprimento total.

WO 08/098196 descreve o tratamento de fibrose pulmonar, usando Treprostinila. Fibrose pulmonar, no entanto, é uma doença intersticial de pulmão que 25 é causada pelo acúmulo de fibras de colágeno no pulmão; isso limita a capacidade do pulmão para inalar o ar: o pulmão perde sua conformidade e a resistência das vias aéreas respiratórias aumenta (conformidade = 1/resistência). A medida que a doença progride há também um aumento na resistência vascular. O local de ação da Treprostinila na fibrose pulmonar é a vascularização e o espaço intersticial no 5 alvéolo.

Tissieres et al. descrevem estudos utilizando lloprosta para o tratamento de um paciente com fibrose cística e hipertensão pulmonar secundária. É divulgado que lloprosta foi eficaz na redução da pressão da artéria pulmonar (The annals of thoracic surgery, vol, 78, no. 3, E48-E50).

US2001/006979 A1 descreve o uso de derivados da prostaciclina como lloprosta ou Cicaprosta para o tratamento de doenças fibróticas.

A fibrose cística está relacionada com a fibrose pulmonar, porque é uma doença que se origina no epitélio brônquico. Devido à ausência de CFTR, há muito pouca água no muco que cobre o epitélio brônquico; assim, os cílios nãò podem mover o muco espesso e a depuração mucociliar se interrompe (a depuração mucociliar funciona como uma esteira rolante, onde os cílios vibram ritmicamente de forma concentrada para mover o muco de volta à traqueia e à faringe, de onde pode ser depurado por deglutição ou tosse etc.). Se a mucociliaridade é interrompida, as bactérias não podem ser removidas dos brônquios, s brônquios são colonizados por bactérias e há crises repetidas de infecções pulmonares que destroem o pulmão. A situação pode ser remediada restaurando fluxos Cl para o epitélio brônquico. Assim, na fibrose cística, o local de ação é o epitélio das vias aéreas respiratórias dos brônquios. O local de ação é anatomicamente distinto (interstício pulmonar vs vias aéreas respiratórias brônquiças), envolve um conjunto diferente de células fibroblastos, células de músculo liso vascular, endotélio versus absorção e secreção das células epiteliais brônquicas) e presumivelmente também envolve diferentes receptores (receptor prostaciclina vs possivelmente receptor EP2). DE102005016345A1 e US2005101608A1 descrevem o uso de inibidores da • PDE5, para o tratamento da hipertensão pulmonar.

US2009325976A1 divulga novos derivados da prostaciclina que podem ser ' usados também em combinação com um inibidor da PDE 5 para uso no tratamento da hipertensão arterial pulmonar.

Clinicamente usados inibidores da PDE foram testados para ativar a secreção de cloreto no estabelecimento de baixos níveis de cAMP, conforme descrito por 10 Cobb B.R. et al., (Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Sep;29(3 Pt 1):410-418).

Inibidores da PDE 5, Sildenafila e Vardenafil e seu papel no transporte de cloreto na fibrose cística são descritos por Lubamba B. Et al. (Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):506-515).

Inibidores da PDE-5 e seu papel na função do canal CFTR ΔF508 são descritos por Clarke Lane L. (J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):469-70).

Em W02010106494A1 é divulgado o uso de HCI mesembrina, um conhecido inibidor fraco da PDE4 no tratamento de desordens .

US20070249668 descreve uma composição que contém um inibidor da PDE e um análogo da prostaciclina para aumentar o teor de ATP nas células vermelhas 20 do sangue.

Atualmente, nenhum tratamento da fibrose cística está disponível que melhore significativamente a qualidade de vida dos pacientes durante um período mais longo. Portanto, é um objeto da invenção fornecer composições para o tratamento que pode aumentar a expressão da função do canal CFTR ΔF508 e/ou 25 cloreto nas células epiteliais do pulmão.

Breve descrição da invenção:

O objeto da invenção é atingido fornecendo uma composição compreendendo pelo menos uma prostaciclina ou um análogo, um derivado ou um sal farmaceuticamente aceitável em combinação com pelo menos um inibidor da PDE 4 5 para uso na prevenção ou tratamento da fibrose cística. Como uma incorporação alternativa, dita composição ainda pode compreender pelo menos um inibidor da PDE5, e /ou PD7 e / ou PDE8.

Especificamente, o análogo da prostaciclina é selecionado do grupo de Treprostinila, lloprosta, Cicaprosta ou Beraprosta ou derivados, ou sais 10 farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em uma incorporação da presente invenção o derivado da Treprostinila é um derivado ácido, um pró-fármaco, um polimorfo ou um isômero da Treprostinila.

De acordo com a invenção, o inibidor da PDE4 pode ser especificamente selecionado do grupo de Ro 20-1724, Ibudilast, Roflumilast e seu N-óxido, 15 Cilomilast, BAY 19-8004, CC3, AWD 12-281, SCH-351591 i Ciclamilast, Piclamilast, CGH2466, Mesembrina, Rolipram, Luteolina e Drotaverina.

De acordo com a invenção, o inibidor da PDE5 pode ser selecionado especificamente de Avanafila, Lodenafila, Mirodenafila, citrato de Síídenafila, Tadalafil, Vardenafil e Udenafil; os inibidores da PDÈ7 e PDE8 podem ser 20 selecionados a partir de Dipiridamoí, BRL-50481 e PF-04957325.

De acordo com uma incorporação específica da invenção, a composição especificamente consiste em um tipo de análogo da prostaciclina e um tipo de inibidor da PDE4.

Como uma incorporação específica, a composição compreende Treprostinila 25 e um inibidor da PDE4 selecionado do grupo de RO 20-1724, Roflumilast e Ibudilast. 10/37 a

Uma outra incorporação da invenção, a composição compreende inibidores da PDE adicionais, selecionados a partir de inibidores da PDE5, PDE7 ou PDE8. Em outra incorporação, a invenção fornece uma composição livre de interferon.

Especificamente, a composição inventiva é formulada como uma composição farmacêutica. Qualquer forma de administração conhecida pode ser usada para administrar a combinação inventiva, por exemplo, pode ser administração intravenosa ou subcutânea ou administração por inalação, Ou disponível de forma oral selecionada 10 do grupo de formas de liberação sustentada, comprimidos e cápsulas.

De acordo com uma incorporação específica, a quantidade efetiva de Treprostinila ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é de preferência de cerca de 1,0 ng/kg de peso corporal, Ibudilast é preferencialmente até 5 x 30 mg, preferencialmente até 2 x 30 mg a quantidade efetiva do inibidor da PDE4 é aprox. 0,5 mg. Além disso, um ou mais inibidores do grupo dos inibidores da PDE5 e PDE7 podem estar contidos em uma quantidade efetiva de cerca de 0,5 mg de cada um dos inibidores.

A presente invenção também fornece um método in vitro para aumentar o nível de cAMP em uma célula em que dita a célula é contatada com pelo menos uma prostaciclina ou análogo da prostaciclina e pelo menos um inibidor da PDE4 ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado. Além disso, um inibidor da PDE5, PDE7 e/ou PDE8 pode ainda ser utilizado de acordo com o dito método.

Especificamente, a célula é uma célula epitelial, mais especificamente pode ser uma célula broncoepitelial. Também é fornecida uma combinação terapêutica, compreendendo pelo menos uma prostaciclina ou análogo da prostaciclina e pelo menos um inibidor da PDE4 ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado, onde o análogo da prostaciclina e o inibidor da PDE4 são providos em quantidades que juntos são suficientes para tratar e/ou prevenir pelo menos um sintoma associado à fibrose cística. Mais especificamente, o análogo da prostaciclina e o inibidor da PDE4 são formulados para administração por inalação.

Dita composição terapêutica pode, de acordo com uma incorporação alternativa, conter peló menos mais um inibidor selecionado do grupo dos inibidores da PDE5, PDE7 e PDE8. Figuras:

Fig. 1: Acúmulo do cAMP em células IB3-1 após incubação com Treprostinila apenas ou em combinação com os inibidores da PDE-4 Ibudilast (ÍOOpM) e Cilostazol (lOOμM).

Fig. 2: Acúmulo de cAMP em células IB3-1 após incubação com Treprostinila em combinação com os inibidores da PDE-4 RO-20-1724 (1Ó0pM) e Roflumílast (10μM).

Fig. 3: Ativação de uma corrente de Cl pela Treprostinila na linhagem de células epiteliais brônquicas humanas IB3-1 que expressam wt-CFTR 20 transientemente.

Fig. 4: Acúmulo de cAMP em células IB3-1 estimuladas por 10 μM de Treprostinila na ausência e na presença das concentrações indicadas de Dipiridámoi, Ibudilast, RO20-1724 ou Roflumílast. Células foram metabólicamente pré-marcadas com [3H]adenina por 4h e posteriormente incubadas com os compostos indicados por 30 min. A formação de [3H]cAMP foi determinada conforme descrito em materiais e métodos. Dados são médias ± s.e.m (n=3).

Fig. 5: Curva de concentração-resposta para acúmulo de cAMP induzido pela Treprostinila em células IB3-1. As células foram incubadas com concentrações 5 crescentes de Treprostinila na ausência e presença das concentrações indicadas de Ibudilast, RO20-1724 ou Roflumilast. As células foram metabolicamente pré- marcadas com [3H]adenina por 4 h, e posteriormente incubadas com os compostos indicados por 30 min. A formação de [3H]cAMP foi determinada conforme descrito em materiais e métodos. Dados são médias ± s.e.m. (n=3).

Fig. 6: Efeito dos inibidores da fosfodiesterase selecionados no acúmulo de cAMP basal em células IB3-1. As células foram metabolicamente pré-marcadas com [3H]adenina por 4h e posteriormente incubadas na ausência (basal) e na presença das concentrações indicadas de Dipiridamol, Ro-20-1724 ou Roflumilast por 30 min. Os níveis de [3H] cAMP foram determinados conforme descrito em materiais e 15 métodos. Dados são médias ± s.e.m (n=3).

Descrição detalhada da invenção

Foi surpreendentemente encontrado pelos inventores que prostaciclina ou análogos ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado em combinação com um inibidor da PDE4 pode ser usado para o tratamento da fibrose cística. Foi 20 demonstrado que uma combinação de prostaciclina ou análogos da prostaciclina e inibidores da PDE4 têm efeito sinérgico no aumento do cAMP, especificamente nas células epiteliais das vias aéreas respiratórias humanas afetadas, em comparação com o uso de substâncias únicas. Dito efeito ainda pode ser melhorado pela presença de outros inibidores da PDE selecionados de inibidores da PDE5, PDE7 e 25 PDE8.

Análogos sintéticos da prostaciclina podem ser, por exemplo, mas não estão limitados a, Treprostinila, lloprosta, Cicaprosta ou Beraprosta.

Treprostinila é comercializada como Remodulin™. Treprostinila é um sal monossódico de ácido (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-hexahidro-2-hidroxi-1-[(3S)- 5 3-hidroxioctil] [f]-1/-/-benz[f]inden-5-il]oxi]acético. lloprosta é comercializada como “llomedin” e é ácido 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7- hidroxi-6[(E)-(3S,4RS)-3-hidroxi-4-metil-1-octen-6-inil]-bi-ciclo[3.3.0]octan-3- ilidenojpentanóico. Beraprosta é ácido 2,3,3a,8b-tetrahidro-2-hidroxi-1-(3-hidroxi-4-metil-1-octen- 6-i n i I)-1 H-ciclopenta(b)benzofuran-5-butanoico.

Cicaprosta é ácido 2-[(2E) -2-[(3aS, 4S, 5R,6aS)-5-hidroxi-4-[(3S,4S)-3- hidroxi-4-metílnona-1,6-diinil]-3,3a,4,5,6,6a-hexahidro-1H-pentalen-2- ilideno]etoxi]acético.

Em referência à prostaciclina, inibidores da PDE4 e PDE5, PDE7 ou PDE8, 15 de acordo com a presente invenção, o termo "análogos da prostaciclina", "análogos do inibidor" ou “análogos do inibidor da PDE4, PDE5, PDE 7 óu PDE8” significa • derivados ou análogos das ditas substâncias. Os termos "análogo" ou "derivado" referem-se a uma molécula química que é similar a outra substância química em estrutura e função, muitas vezes diferindo estruturalmente por um único elemento ou 20 grupo, que pode diferir pela modificação de mais de um grupo (por exemplo, 2, 3 ou 4 grupos) se mantiver a mesma função que a substância química mãe. Tais modificações são rotina para pessoas versadas na arte e incluem, por exemplo, . partes químicas adicionais ou substituídas, tais como ésteres ou amidas de um ácido, grupos de proteção tais como um grupo benzil para álcool ou tiol, e grupos 25 terc-butoxilcarbonil para uma amina. Também estão incluídas modificações de cadeias laterais de alquila, tais como substituições alquil (por exemplo, metil, dimetil, etil, etc.), as modificações a nível de saturação ou insaturação de cadeias laterais, e a adição de grupos modificados tais como fenil e fenóxi substituídos. Derivados também podem incluir conjugados, tais como biotina ou partes avidina, enzimas tais como a peroxidase de rábano e similares, e partes rádio-rotuladas, bioluminescentes quimioluminescentes, ou fluorescentes. Além disso, podem ser adicionadas partes aos agentes descritos neste documento para alterar suas propriedades farmacocinéticas, tais como aumentar o a meia vida in vivo ou ex vivo, ou para aumentar suas propriedades de penetração celular, entre outras propriedades desejáveis. Também estão incluídos os pró-fármacos, que são conhecidas para melhorar inúmeras qualidades desejáveis dos fármacos (por exemplo, solubilidade, biodisponíbilidade, fabricação, etc.). O termo "derivado" inclui, também, dentro do escopo de suas alterações que foram feitas a uma sequência mãe incluindo adições, exclusões e/ou substituições que fornecem moléculas funcionalmente equivalentes ou funcionalmente melhoradas.

Prostacíclinas adequadas ou análogos da prostaciclina derivados incluem, mas não estão limitados, derivados de ácido, pró-fármacos, formas de liberação sustentada, formas para inalação e formas orais de Treprostinila, lloprosta, Cicaprosta ou Beraprosta.

De acordo com uma incorporação específica da invenção, o derivado da Treprostinila é selecionado do grupo dos derivados de ácido, pró-fármacos, polimorfos ou isômeros da Treprostinila.

Da mesma forma, derivados de lloprosta, Cicaprosta ou Beraprosta podem ser derivados de ácido, pró-fármacos, polimorfos ou isômeros destes. Ò termo 25 derivado da prostaciclina também abrange seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Um sal farmaceuticamente aceitável de uma prostaciclina ou um análogo de prostaciclina desta invenção pode ser formado entre um grupo ácido e um básico do composto, tal como um grupo funcional amino, ou um grupo base e um ácido do composto, tal como um grupo funcional carboxila.

Especificamente, os sais fisiologicamente aceitáveis de análogos da prostaciclina incluem sais derivados de bases. Sais de bases incluem sais de amónia (tais como sais de amónia quaternária), sais de metais alcalinos, tais como os de sódio e potássio, sais de metais alcalino terrosos tais como os de cálcio e magnésio, sais de bases orgânicas, tais como diciclohexilamina e N-metil-D- 10 glucamina e sais com aminoácidos tais como a arginina e lisina.

Especificamente, de acordo com a invenção o uso de Treprostinila è vantajoso. Treprostinila pode aumentar com sucesso a expressão de CFTR ΔF508 e/ou a função do canal de cloreto nas células epiteliais do pulmão dos pacientes com fibrose cística.

Surpreendentemente foi mostrado que um análogo da prostaciclina em combinação com um inibidor da PDE4 e, opcionalmente, em combinação com um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 leva à estimulação sinérgica da produção de cAMP e/ou aumento do conteúdo de cAMP nas células broncoepiteliais.

Curiosamente inibidores da PDE3, tais como Anagrelída e Cilostazol, não 20 induzem a qualquer acúmulo de cAMP em experimentos. Dada a essa capacidade de estimular a produção de cAMP através do receptor IP, e a presença limitada de receptores IP em um pequeno número de tipos de células (tal como células epiteliais do pulmão), a prostaciclina ou análogo derivado, por exemplo, a Treprostinila, pode induzir a expressão e abertura de CFTR 25 e mutCFTR de maneira específica, que podem ser usadas para o tratamento da CF, em especial, quando combinado com ditos inibidores da PDE4 para induzir um aumento duradouro nos níveis de cAMP no epitélio das vias aéreas respiratórias.

De acordo com outra incorporação, dito aumento de cAMP ainda pode ser induzido pela combinação de um inibidor da PDE4 com outros inibidores da PDE selecionados do grupo dos inibidores da PDE5, PDE7 e/ou PDE8.

Inibidores da PDE4 são aprovados para o tratamento da DPOC e asma; o alvo principal na DPOC e na asma é reduzir a hiper-reatividade das células do músculo liso que revestem as vias aéreas respiratórias. Níveis elevados de cAMP nas células do músculo liso são muito conhecidos por causarem o relaxamento do músculo liso, através da ação, da quinase de cadeia leve de miosina. Além disso, inibidores da PDE4 são considerados por reduzir a resposta imune que desencadeia a asma alérgica com alvo nos granulócitos eosinófilos e basófilos, monócitos, células B e T, por exemplo, das células inflamatórias. Nenhum desses dois mecanismos é relevante como um modo de ação na fibrose cística. Na fibrose cística, os níveis de cAMP devem ser elevados em um compartimento celular muito diferente, ou seja, no epitélio das vias aéreas respiratórias. Na verdade, no melhor de nosso conhecimento, não existem relatos científicos que mostram que PDE4 é a isoforma relevante que aumenta o acúmulo de cAMP mediada por receptor no epitélio das vias aéreas respiratórias. .

De acordo com a presente invenção, qualquer inibidor da PDE4 ou seu análogo pode ser usado com atividade inibitória para a enzima PDE4. Assim, não está excluído que o inibidor da PDE4 possa ainda inibir também outras enzimas PDE.

Especificamente, o inibidor da PDE4 pode ser um inibidor específico da PDE4. O inibidor da PDE4 da invenção pode ser, mas não está limitado a, Ro 20- 1724, Ibudilast, Roflumilast (3-(ciclopropylmetoxi)-N-(3,5-dicloropiridin-4-i)-4- (difluorometoxi)benzamida) e seu N-óxido, Cilomilast, BAY 19-8004, CC3, AWD 12- 281 (N-(3,5-dicloro-4-piridinil)-2-[1-(4-fluorobenzil)-5-hidroxi-1H-indol-3-il]-2- 5 oxoacetamida), SCH 351591 (N-(3,5-dicloro-1-oxido-4-piridinil)-8-metoxi-2- (trifluorometil)-5-quinolina carboxamida), Ciclamilast, Piclamilast, CGH2466, Mesembrina, Rolipram, Luteolina e Drotaverina ou análogos funcionais derivados.

Mais especificamente, a composição para uso na prevenção ou tratamento de CF, especificamente através da elevação dos níveis de cAMP nas células 10 broncoepiteliais de indivíduos que sofrem de CF pode especificamente incluir Treprostinila e Roflumilast ou Treprostinila e Ibudilast ou Treprostinila e Ro-20-1724. Inibidores da PDE5 são apontados por aumentar os níveis do segundo mensageiro nucleotídeo cíclico nas células do músculo liso.

De acordo com a presente invenção, qualquer inibidor da PDE5 ou seu 15 análogo pode ser usado tendo atividade inibitória para a enzima PDE5. Assim, não está excluído que o inibidor da PDE5 pode ainda inibir outras enzimas da PDE também.

De acordo com a invenção, o inibidor da PDE5 pode ser selecionado • especificamente de Avanafila (4-[(3-cloro-4-metoxibenzil) amino] -2-[2-(hidroximetil) - 20 1 -pirrolidinil] - N-(2-pirimidinilmetil) -5 - pirimidinocarboxamida), Lodenafila (bis-(2-{4- [4-etoxi-3-(1-metil-7-oxo-3-propil-6,7-dihidro-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)- benzenosulfonil]piperazin-1-il}-etil)carbonato), Mirodenafila (5-etil-3,5-dihidro-2-[5-([4- (2-hidroxyetil)-1-piperazinil]sulfonil)-2-propoxifenil]-7-propil-4H-pirrolo[3,2-d]pirimidin- 4-ona), Sildenafila citrato de (1-[4-etoxi-3-(6,7-dihidro-1-metil-7-oxo-3-propil-1 H- 25 pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il) fenilsulfonil] -4-metilpiperazina), Tadalafil (6R-trans)-6- (1,3-benzodioxol-5-il)-2,3,6,7,12, 12a-hexahidro-2-metil-pirazino [T,2':1,6] pirido [3,4 b] indol-1,4-diona), Vardenafil (4-[2-etoxi-5-(4-etilpiperazin-1-il)sulfonil-fenil]-9-metil-7- propil-3.568-tetrazabiciclo[4.3.0]nona-3,7,9-trien-2-one) ou Udenafil (3-(1-metil-7- oxo-3-propil-4,7-dihidro-1 H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)-N-[2-(1-metilpirrolidin-2- il)etil]-4-propoxibenzenesulfonamida) ou quaisquer análogos funcionais.

Em uma incorporação específica da invenção, a composição pode incluir • Treprostinila, Roflumílast e, opcionalmente, um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 ou Treprostinila, Ibudilast e, opcionalmente, inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 ou Treprostinila, Ro-20-1724 e opcionalmente inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8.

Em uma outra incorporação da invenção, a composição pode incluir Beraprosta, Roflumílast e, opcionalmente, um inibidor da PDÊ5, PDÉ7 óU PDE8 ou Beraprosta, Ibudilast e, opcionalmente, um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 ou . Beraprosta, Ro-20-1724 e opcionalmente um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8.

Em uma outra incorporação da invenção, a composição pode incluir lloprosta, Roflumílast e opcionalmente um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 ou lloprosta, Ibudilast e, opcionalmente, um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 ou lloprosta, Ro- 20-1724 e opcionalmente um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8. '

Em uma outra incorporação da invenção, a composição pode incluir Cicaprosta, Roflumílast e, opcíonalmente, um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 ou 20 Cicaprosta, Ibudilast e, opcionalmente, um inibidor da PDE5, PDE7 òu PDE8 ou Cicaprosta, Ro-20-1724 e opcionalmente um inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8.

De acordo com a presente invenção, qualquer inibidor da PDÉ7 ou PDE8 ou seu análogo pode ser utilizado tendo atividade inibitória para a enzima PDE7 ou PDE8. Assim, não está excluído que o inibidor da PDE7 ou PDE8 pode ainda inibir outras enzimas PDE também.

De acordo com a invenção, o inibidor da PDE7 pode ser selecionado especificamente de Dipiridamol e BRL 50481. De acordo com a invenção, o inibidor da PDE8 pode ser selecionado especificamente de amidas 1,5-substituídas do ácido nipecótico e PF-4957325.

Em uma incorporação alternativa da invenção, a composição pode incluir especificamente Treprostinila, Roflumilast e Dipiridamol ou Treprostinila, Ibudilast e Dipiridamol ou Treprostinila, Ro-20-1724 e Dipiridamol.

Em uma outra incorporação alternativa da invenção, a composição pode incluir especificamente Beraprosta, Roflumilast e Dipiridamol ou Beraprosta, Ibudilast e Dipiridamol ou Beraprosta, Ro-20-1724 e Dipiridamol.

Ainda em uma outra incorporação alternativa da invenção, a composição pode especificamente compreender lloprosta, Roflumilast e Dipiridamol ou lloprosta, Ibudilast e Dipiridamol ou lloprosta, Ro-20-1724 e Dipiridamol.

Em uma outra incorporação da invenção, a composição pode incluir 15 especificamente Cicaprosta, Roflumilast e Dipiridamol ou Cicaprosta, Ibudilast e Dipiridamol ou Cicaprosta, Ro-20-1724 e Dipiridamol.

Altemativamente, a composição pode incluir Treprostinila, Roflumilast e BRL 50481 ou Treprostinila, Ibudilast e BRL 50481 ou Treprostinila, Ro-20-1724 e BRL 50481.

Altemativamente, a composição pode incluir especificamente Treprostinila, Roflumilast e PF-4957325 ou Treprostinila, Ibudilast e PF-4957325 ou Treprostinila, Ro-20-1724 e PF-4957325.

De acordo com a invenção o termo "pelo menos um" ou "um" significa que um tipo de prostaciclina ou análogo da prostaciclina e üm tipo de inibidor da PDE4 e opcionalmente um ou mais dos inibidores da PDE5, PDE7 ou PDE8 estão presente para uso no tratamento ou prevenção da fibrose cística, especificamente para o uso no aumento do nível de cAMP em células broncoepiteliais. No entanto, como alternativa, a composição também pode incluir mais de um tipo de prostaciclina ou análogo da prostaciclina e mais de um tipo de inibidor daPDE4 e, opcionalmente, um ou mais inibidores da PDE5, PDE7 ou PDE8, especificamente, dois, três, quatro ou mais de quatro tipos ou quaisquer combinações das prostaciclinas ou análogos da prostaciclina e inibidores da PDE4 e, opcionalmente, da PDE5, PDE7 e/ou PDE8.

A invenção ainda fornece uma composição específica, compreendendo Treprostinila e um ou mais inibidores da PDE4 selecionados do grupo de RO 20- 1724, Roflumilast e Ibudilast.

A composição inventiva pode ser formulada como uma composição farmacêutica. A composição da invenção pode estar presente sob qualquer forma que possa ser usada para administração.

A dose específica de um composto administrado de acordo com esta invenção para obter efeitos terapêuticos ou profiláticos será, naturalmente, determinada pelas circunstâncias particulares do caso, incluindo, por exemplo, a via de administração, a idade, peso e resposta individual do paciente, a condição a ser tratado e a gravidade dos sintomas do paciente.

Em geral, os compostos da invenção são administrados, de modo mais desejável, em uma concentração que geralmente irá permitir resultados eficazes sem causar efeitos colaterais graves e podem ser administrados como uma dose de unidade única, ou se desejado, a dosagem pode ser dividida em subunidades Convenientes administradas nos momentos apropriados durante todo o dia.

A composição pode ser provida em uma variedade de formulações tópicas e sistêmicas. As formulações tópicas ou sistêmicas da invenção são selecionadas a partir do grupo de oral, intrabucal, intrapulmonar, retal, intrauterina, intradérmica, tópica, dérmica, parenteral, intra-tumor, intracraniana, intrapulmonar, bucal, 5 sublingual, nasal, subcutânea, intravascular, intratecal, inalável, respirável, intraarticular, intracavitária, implantável, transdérmica, iontoforética, intraocular, oftálmica, vaginal, óptica, endovenosa, intramuscular, intraglandular, intra-orgão, intralinfática, formulações de liberação lenta e revestimento entérico. A preparação e composição vigentes destas diferentes formulações são conhecidas na arte e não necessitam ser 10 detalhadas aqui. A composição pode ser administrada uma vez ou várias vezes ao dia.

Formulações adequadas para administração via respiratória, nasal, intrapulmonar, e inalação são preferidas, bem como são as formulações tópicas, orais e parenterais. Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e 15 intimamente trazendo o composto ativo em associação com um veiculo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e, então, se necessário, formulando o produto nas formulações desejadas.

Composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas em unidades discretas, tais como cápsulas, pílulas, pastilhas ou comprimidos, cada 20 um contendo a composição como um pó ou granulado; como uma solução ou suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão de óleo em água ou agua em óleo.

Composições adequadas para administração parenteral compreendem soluções esterilizadas para injeção aquosas e não aquosas do composto ativo, cujas 25 preparações são de preferência isotônicas com o sangue do indivíduo receptor.

Estas preparações podem conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e solutos que tornam as composições isotônicas com o sangue do destinatário. Suspensões estéreis aquosas e não aquosas podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As composições podem ser apresentadas em recipientes com dose unitária ou com multidoses, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição seca e desidratada ou liofilizada, exigindo apenas a adição de veículo líquido estéril, por exemplo, solução salina ou água para injeção imediatamente antes da utilização.

Formulações nasais e por instilação compreendem soluções aquosas purificadas do composto ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Tais formulações são preferencíalmente ajustadas a um pH e estado isotônico compatíveis com as mucosas nasais.

A composição divulgada.de acordo com a invenção pode ser administrada ao sistema respiratório tanto por inalação, respiração, administração nasal ou instilação intrapulmonar (nos pulmões), em um indivíduo através de qualquer meio apropriado, e são administradas preferencialmente pela geração de um aerossol ou spray composto do pó ou líquido nasal, intrapulmonar, partículas respiráveis ou inaláveis. As partículas respiráveis ou inaláveis, compreendendo o composto ativo são inaladas pelo indivíduo, por exemplo, por inalação ou por administração nasal ou por instilação no trato respiratório ou no próprio pulmão. A formulação pode incluir um líquido respirável ou inalável ou partículas sólidas do composto ativo que, de acordo com a presente invenção, incluem partículas respiráveis ou inaláveis de um tamanho suficientemente pequeno para passar através da boca e laringe após inalação e continuar pelos brônquios e alvéolos dos pulmões. Em geral, partículas variando cerca de 0,05, cerca d 0,1, cerca de 0,5, cerca de 1, cerca de 2 a cerca de 4, cerca de 6, cerca de 8, cerca de 10 micron de diâmetro. Mais particularmente, cerca de 0,5 a menos de cerca de 5 μm de diâmetro, são respiráveis ou inaláveis. Partículas de tamanho não respirável que estão incluídas em um aerossol ou spray tendem a depositar-se na garganta e ser engolidas. A quantidade de partículas não respiráveis 5 no aerossol é, assim, de preferência minimizada. Para administração nasal ou instilação intrapulmonar, um tamanho de partícula na faixa de cerca de 8, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 25 a cerca de 35, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 250, cerca de 500 μm de diâmetro é preferencial para garantir a retenção na cavidade nasal ou por instilação e deposição direta no pulmão. Formulações 10 líquidas podem ser esguichadas no trato respiratório ou nariz e pulmão, particularmente quando administradas em recém-nascidos e lactentes.

Aerossóis de partículas líquidas, compreendendo o composto ativo podem ser produzidos através de qualquer meio apropriado, tal como com um nebulizador. Nebulizadores são dispositivos comercialmente disponíveis que transformam 15 soluções ou suspensões do ingrediente ativo em uma névoa aerossol terapêutica tanto por meio da aceleração de um gás comprimido, geralmente ar ou oxigênio. Composições adequadas para utilização em nebulização consistem do princípio ativo em veículo líquido, o ingrediente ativo compreendendo até 40% p/p da composição, mas de preferência inferior a 20% p/p do veículo sendo geralmente 20 água ou uma solução alcoólica aquosa diluída, preferencialmente tornado isotônica com os fluidos corporais através da adição de, por exemplo, de cloreto de sódio. . Aditivos opcionais incluem conservantes se a composição não é preparada estéril, por exemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, agentes aromatizantes, óleos voláteis, agentes de tampão e surfactantes. Aerossóis de partículas sólidas, 25 compreendendo o composto ativo podem ser produzidos da mesma forma com qualquer gerador de aerossol de medicamento com partículas sólidas. Geradores de aerossol para administração de medicamento com partículas sólidas produzem partículas que são respiráveis, tal como explicado acima, e geram um volume de aerossol contendo uma dose calibrada pré-determinada de um medicamento a uma taxa adequada para a administração humana. Exemplos de tais geradores de aerossóis incluem inaladores e insufladores de dose calibrada.

Em uma incorporação, o dispositivo de fornecimento compreende um inalador de pó seco (DPI) que dispensa doses únicas ou múltiplas da composição. O inalador de dose única pode ser fornecido como kit descartável que é pré-carregado esterilmente com formulação suficiente para uma aplicação. O inalador pode ser fornecido como um inalador pressurizado, e a formulação em cápsula ou cartucho perfurável ou que abre. O kit opcionalmente pode também compreender, em um recipiente separado, um agente tais como outros compostos terapêuticos, excipientes, surfactantes (concebidos como agentes terapêuticos, bem como ingredientes de formulação), agentes antioxidantes, aromatizantes e corantes, . preenchedores, óleos voláteis, agentes de tampão, dispersantes, tensoativos (surfactantes), antioxidantes, agentes aromatizantes, agentes de volume, , propulsores e conservantes, entre outros aditivos adequados para as diferentes formulações.

Devido à alta estabilidade metabólica de alguns análogos da prostaciclina tal como Treprostinila, ou se fornecido como formas baseadas em lipídios ou peguiladas das prostaciclinas ou análogos da prostaciclina, as substâncias também podem ser administradas como medicamentos de depósito. Inibidores da PDE4, PDE5, PDE7 e PDE8 também são metabolicamente estáveis, portanto, a combinação entre a prostaciclina ou análogo da prostaciclina e o inibidor da PDE4, opcionalmente em conjunto com um ou mais dos inibidores da PDE5, PDE7 ou PDE8 também pode ser formulada como medicamento de depósito.

A entrega da composição via aerossol pode resultar em uma distribuição mais homogênea do agente em um pulmão, de modo que seja obtida uma administração profunda no pulmão. Assim, a dosagem de aplicação pode ser reduzida devido à presença constante do agente no local de ação no pulmão.

A composição pode, por exemplo, ser administrada através de um nebulizador. A vantagem do método de entrega através de nebulização é que menos substância atinge a circulação sistêmica. A composição pode ser administrada 10 várias vezes ao dia, por exemplo, cinco a 10 vezes por dia, no entanto, devido ao efeito sinérgico da prostaciclina ou análogo da prostaciclina e PDÉ4, opcionalmente, em combinação com um ou mais inibidores da PDE5, PDE7 e/ou PDE8, a frequência de dosagem geralmente pode ser reduzida.

A composição pode ser administrada com quaisquer substâncias 15 farmaceuticamente aceitáveis ou veículos ou excipientes conforme conhecido na arte. Estes podem ser, por exemplo, mas não são restritos a água, agentes de neutralização como NaOH, KOH, estabilizadores, DMSO, salina, betaína, taurina, etc.

O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência ‘ 20 reguladora do Governo Federal ou Estadual ou listado nos Ê.U.A O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual a composição farmacêutica é administrada. Soluções salinas e dextrose aqüosa e soluções de glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes 25 adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. A formulação deve ser selecionada de acordo com o modo de administração.

A quantidade de composição inventiva pode ser selecionada por qualquer pessoa versada, especificamente, a quantidade das prostaciclinas ou análogos da prostaciclina ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, especificamente a quantidade de Treprostinila é pelo menos de 1,0 ng/kg de peso corporal. A quantidade de inibidor da PDE4 ou PDE5 pode também ser facilmente selecionada por pessoas versadas. Especificamente, a quantidade de inibidor da PDE4 ou PDE5 ou PDÈ 7 ou PDE8 é cerca dè 0,5 mg para Roflumilast ou cerca de 30 mg de Ibudilast, pelo menos uma vez por dia, especificamente pelo menos duas vezes por dia. '

Além disso, a presente invenção fornece um método para aumentar o nível de cAMP em uma célula em que dita célula está em contato com pelo menos uma prostaciclina ou análogo da prostaciclina e pelo menos um PDE4 e, opcionalmente, pelo menos um dos inibidores da PDE5, PD7 ou PDE8. O aumento do cÀMP em ditas células pode ser pelo menos 10%, de preferência pelo menos 25%, de preferência pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 100% em relação ao tratamento apenas com uma prostaciclina ou um inibidor da PDE4 e/ou PDE5 ou PDÉ7 ou PDE8. Uma combinação terapêutica, compreendendo pelo menos um análogo da prostaciclina e pelo menos um PDE4 e, opcionalmente, pelo menos um inibidor da PDE5 e/ou PDE7 e/ou inibidor da PDE8, onde o análogo da prostaciclina e um inibidor da PDE4 e/ou PDE5 e/ou inibidor da PDE7 e/ou inibidor da PDE8 são fornecidos em quantidades que juntos são suficientes para tratar e/ou prevenir pelo menos um sintoma associado com a fibrose cística também é fornecido. Especificamente, um aumento do nível de cAMP nas células epiteliais do pulmão de pacientes com CF pode ser alcançado através da administração da preparação da combinação terapêutica inventiva. Pelo menos um análogo da prostaciclina e PDE4 e, opcionalmente, um ou mais inibidores da PDE5, PDE7 ou PDE8 são formulados . especificamente para administração por inalação.

Em uma incorporação específica da presente invenção, é divulgada uma combinação terapêutica para o tratamento da fibrose cística. De acordo com uma incorporação específica, os sintomas associados com níveis reduzidos de cAMP em células broncoepiteliais de pacientes com CF podem ser tratados ou prevenidos usando a combinação terapêutica inventiva. Possivelmente, um ou mais agentes adicionais também podem ser administrados.

A prostaciclina ou análogo da prostaciclina e PDE4 e, opcionalmente, o inibidor da PDE5, PDE7 ou PDE8 podem ser administrados juntos, por exemplo, em um único comprimido ou cápsula ou formulação para inalação ou PDE4 e, opcionalmente, outros inibidores da PDE da invenção bem como agentes opcionais adicionais podem ser administrados separadamente da prostaciclina ou análogo da prostaciclina.

A invenção mais fornece um kit e sua utilização no tratamento ou prevenção de uma condição associada à fibrose cística em um indivíduo, que compreende (i) uma quantidade efetiva de uma prostaciclina ou análogo da prostaciclina, (ii) um inibidor da PDE4, especificamente Roflumílast, Ro-20-1724 ou Ibudilast e, opcionalmente, um ou mais compostos selecionados do grupo dos inibidores da

PDE5, PDE7 e PDE8, (iii) uma ou mais veículos e/ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, e (iv) instruções para o uso no tratamento ou prevenção da fibrose cística em um indivíduo, de preferência um ser humano. Ditos componentes (i) e (ii) e (iii) podem ser em uma forma adequada para 5 administração intravenosa, por inalação ou para administração oral.

Os exemplos aqui descritos são ilustrativos da presente invenção e não se destinam a serem limitações desta. Diferentes incorporações da presente invenção foram descritas de acordo com a presente invenção. Muitas modificações e variações podem ser introduzidas às técnicas descritas e ilustradas aqui sem se 10 apartar do espírito e do escopo da invenção. Por conseguinte, deve ser entendido que os exemplos são apenas ilustrativos e não estão limitando o escopo da invenção.

Exemplos Exemplo 1:

Células IB3-1 foram incubadas em placas de 6 poços (0,2 * 106 células/poço na Fig. 1; 0,4 * 106 células na Fig. 2) em meio de cultura completo (LHC-8 + 5% FCS). No dia seguinte, o pool de nucleotídeos de adenina foi metabolicamente marcado por incubação com [3H]adenina (IpCi/poço) no meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) contendo adenosina deaminase (1 unidade/ml) por 4 horas.

Depois disso, o meio foi substituído por meio fresco; as células foram estimuladas por adição exclusiva de Treprostinila (em concentrações logaritmicamente espaçadas variando de 0,1 a 30 μM) ou de Treprostinila em combinação com as concentrações indicadas dos inibidores da PDE. Após uma incubação de 30 min, as células foram lizadas pela adição de ácido perclórico. e

A formação de [3H] cAMP foi determinada por cromatografia sequencial em Dowex 50WX-4 e colunas de alumina neutra, seguida pela contagem por cintilação líquida do eluído. O ensaio foi realizado em triplicata.

Os resultados são mostrados nas figuras 1 e 2. A diferença entre a resposta máxima na Fig. 1 e fig. 2 é principalmente devido ao fato de que o número de . células/poço na Fig. 2 é cerca de duas vezes tão alta quanto o empregado na fig. 1.

Exemplo 2:

Células IB3-1 expressam endogenamente apenas uma mutação CFTR ΔF508, que é mantida dentro das células. Usando manipulações apropriadas (e.g. fármaco-chaperonas ou baixa temperatura de incubação), é possível trarislocar o mutante CFTR ΔF508 do retículo endoplasmático para o ER; quando inserido na superfície da célula, uma condutância de Cl pode ser estimulada pela elevação de cAMP. A condutância de Cl resultante, no entanto, é pequena. A fim de provar inequivocamente que o acúmulo de cAMP induzido por Treprostinila, traduzida para uma ativação de CFTR, expressamos transientemente uma versão expressando GFP de CFTR tipo selvagem (a expressão GFP permitiu a identificação de células que expressam a proteína na superfície da célula). Conforme pode ser visto na fig. 3, a Treprostinila causou uma forte ativação da corrente induzida por uma despolarização de -4Ò mV mantendo potencial a +60 mV. Õ efeito máximo foi retardado, ou seja, observou-se apenas alguns segundos após lavagem do composto. Da mesma forma, houve também urna histerese na reação de desligamento; a corrente decaiu a basal apenas ~ 100 s após a lavagem. Estas respostas atrasadas refletem (i) intervénção na cascata de sinalização (isto é, a ativação de receptor dependente de Gs, Gas-dependente da ativação da formação de cAMP e a fosforilação dependente da proteína quinase A de CFTR que se seguiu e (ii) a desativação atrasada de cAMP aumentado por fosfodiesterases. Atrasos semelhantes também foram vistos, se as células foram estimuladas com forskolina, um ativador direto uma adenilato ciclase, que foi usado como controle positivo. Essas observações provam que a Treprostinila pode ativar CFTR nas células 5 epiteliais brônquicas. Métodos: Eletrofisiologia

A técnica whole cell patch clamp (técnica de patch clamp na configuração de célula inteira) foi usada para registros atuais, realizadas a 22 ± 1,5° C, usando um amplificador de patch clamp Axoclamp 200B (Axon Instruments). Pipetas tinham resistências entre 1 e 2 MQ quando preenchidas com a solução de registro da pipeta (composição: 110 mM CsCI, 5 mM EGTA, 2 mM MgCI2, 1 mM K2.ATP, 10 mM Hepes, pH ajustado a 7,2 com CsOH). Protocolos de voltage-clamp e aquisição de dados foram realizados com o software pclamp 6.0 (Axon Instruments). Dados foram filtrados por filtros de passagem baixa a 2 kHz (-3 dB) e digitalizado a 10-20 kHz. As células foram continuamente superfusionadas com solução externa (composição: NaCI 145 mM, KCI 4,5 mM, CaCI2 2 mM, MgCI2 1 mM, glicose 5 mM, Hepes 10 mM, pH ajustado a 7,4 com NaOH). Quando indicado, a solução externa continha Treprostinila (10 μM) ou forskolina (5 pM), a alternância entre soluções foi atingida por válvulas de pressão controlada eletronicamente. Com base nos resultados do exemplo 1, é esperada uma resposta sustentada, se Treprostinila é combinada com inibidores da PDE 4 ou 5, por exemplo, 10 pM de Roflumílast ou 100 pM de Ibudilast ou 10-100 pM de Tadalafil ou Sildenafila ou Vardenafil.

Cultura de células: Células IB3-1 foram cultivadas em placas (Nunc, 3,5 cm de diâmetro) cobertas com fibronectina (10 μ g/ml_), colágeno de rato I (30 μ g/mL) e BSA 10 μg/mL) em meio LHC-8 (G/bco) contendo 5% de soro fetal de vitela (FCS). As células foram transfectadas transientemente com um plasmídeo conduzindo a xpressão de CFTR tipo selvagem humana marcado com GFP utilizando Lipofectamine plus® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Amplitudes atuais representativas registradas na configuração patch clamp de célula inteira a +60 mV. Uma célula IB3-1 transfectada transientemente expressando CFTR tipo selvagem marcado com GFP foi selecionada sob luz fluorescente e mantida a um potencial inicial (holding potential) de -40 mV. Foi induzida a despolarização por uma etapa de tensão de +60 mV por 50 ms e a amplitude atual foi registrada^ Impregnação de Treprostinila (concentração final de 10 μM, TP) foi iniciada no ponto de tempo de 50 s e finalizada a 125 s. Forskolina foi impregnada em 275 s e foi removida em 375 s. Os resultados são mostrados na Figura 3.

Exemplo 3 Introdução Observações anteriores indicaram que, nas células epiteliais das vias aéreas respiratórias humanas, o acúmulo de cAMP induzido por Treprostinila foi especificamente melhorado através das isoformas dos inibidores da fosfodiesterase- 4 (PDE4). Materiais e métodos Linhagens celulares e cultura de células: As seguintes linhagens de célula epiteliais brônquicas humanas foram obtidas através de ATCC: BEAS-2B (ATCC CRL-9609), NuLi-1 (ATCC CRL-4011), IB3-1 (ATCC CRL-2777), CuFi-1 (ATCC CRL-4013). As células foram propagadas utilizando as condições de cultura descritas nas recomendações ATCC, por exemplo, as células I3B-1 foram mantidas em placas revestidas com fibronectina (10 μ g/ml), colágeno de rato I (30 μ g/ml) e BSA 10 μ g/mL) em meio LHC-8 (Gibco) contendo 5% de soro fetal de vitela (FCS) a 37° C em uma atmosfera umidificada de CO2 5%. Células BEAS-2B foram mantidas a 37° C em uma atmosfera umidificada de CO2 5% em placas revestidos com colágeno IV (60 μg/ml em ácido acético a 0,25%) em meio BEGM (Lonza); GA-1000 (mix de gentamicina-anfotericina B) fornecido com o kit BEGM não foi adicionado ao meio. O nível de expressão endógena de CFTR foi demasiado baixo para obter um sinal de confiança. Assim, células BEAS-2B foram transfectadas transientemente com um plasmídeo conduzindo a expressão de CFTR tipo selvagem humano marcado com GFP utilizando Lipofectamine plus® (Invitrogen) de acordo com as instruções do ) fabricante. Células expressando este CFTR marcado com GFP foram identificadas por microscopia de fluorescência e submetidas a registros patch clamp conforme descrito abaixo. Ensaio de acúmulo de cAMP: Células IB3-1 foram semeadas em poços revestidos com PDL de placas de 6- poços (2 a 2,5 * 105 células/poço) em meio de cultura completo (LHC-8 + FCS 5%). No dia seguinte, o pool de nucleotídeos de adenina celular foi metabolicamente rotulado por incubação com [3H]adenina (1 μCi/ poço) no meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) na presença de adenosina deaminase (5 μg/ml) por 4 horas. Posteriormente, o meio foi substituído por DMEM fresco e a formação de cAMP foi estimulada pela adição de 5 μM de forskolina, um ativador direto da adenilato cíclase ou 10 μM de Treprostinila na ausência e na presença de diferentes concentrações dos seguintes inibidores da fosfodiesterase (PDE): Ibudilast (0,3 - 1000 μM), Ro-20-1724 (0,03 - 300 μM), Roflumilast (1 nM -10 μM), Dipiridamol (0,01 - 100 μM), Amrinona (1, 10, 100 μM), Anagrelida (1, 10, 100 μM), Enoximona (1, 10, 100 μM), Milrinona (1, 10, 100 μM) e Cilostazol (0,1 a 100 μM) por 20 min a 37° C. Em alguns casos, o efeito destes inibidores no acúmulo de cAMP basal foi .5 examinado por incubação das células na ausência de qualquer estímulo adicional com concentrações crescentes dos inibidores da PDE (i.e., Dipiridamol, Ibudilast e Ro-20-1724 em 1, 10 e 100 μM; Roflumilast em 0,1, 1 e 10 μM de Roflumilast). Curvas de resposta a concentração para Treprostinila foram obtidas pela adição de Treprostinila (0,1 a 30 μM) apenas ou em combinação com 100 μM de Ro-20-1724, 10 . 100 μM de Ibudilast ou 5 μM de Roflumilast. A reação realizada em triplicado foi interrompida pela adição de ácido perclórico 2,5% em conjunto com 0,1 mM (não rotulado) de cAMP. [3H]cAMP foi isolado por cromatografia sequencial em Dówex 50W - X4 e colunas de alumina neutra. A formação de [3H]cÀMP foi quantificada pela contagem de cintilação líquida. Eletrofisiologia - registros “patch clamp:.

A técnica de patch clamp na configuração de célula inteira foi usada para registros atuais realizados a 22 ± 1,5° C, usando um amplificador de patch clamp Axoclamp 200B (Axon Instruments). Pipetas tinham resistências entre 1 e 2 MD quando preenchidas com a solução de registro da pipeta (composição: CsCI 110 mM, EGTA 5 mM, MgCI22 mM, K2.ATP 1 mM, Hepes 10 mM, pH ajustado a 7,2 com • CsOH). Protocolos de voltage-clamp (fixação de voltagem) e dados de aquisição foram realizados com o software pclamp 6.0 (Axon Instruments). Dados foram filtrados por filtros de passagem baixa de 2 kHz (-3 dB) e digitálízados em 10-20 kHz. As células foram continuamente superfusionadas com solução externa (composição:

NaCI 145 mM, KCI 4,5 mM, CaCI22 mM, MgCI2 1 mM, glicose 5 mM, Hepes 10 mM, pH ajustado a 7,4 com NaOH). Quando indicado, a solução externa continha Treprostinila (10 μM) ou forskolina (5 μM), a alternância entre as soluções foi atingida através de válvulas de pressão controlada eletronicamente.

Acúmulo de cAMP na linhagem de células IB3 na ausência e na presença de 5 inibidores das fosfodiesterases: O levantamento das isoformas de PDE prevê que inibidores da PDE devem ter um efeito pronunciado no acúmulo de cAMP nas células epiteliais brônquicas humanas. Além disso, esta análise forneceu evidências da presença de isoformas adicionais das fosfodiesterases. Nesse sentido, foram testados os inibidores seletivos da PDE-4, Roflumilast de e Ibudilast, e seu efeito foi comparado ao de vários inibidores da PDE adicionais: RO20-1724, um inibidor não-seletivo da PDE com PDÉ4-preferência; Dipiridamol, que bloqueia o transportador-i e -2 equilibrativo (ENT1 - e ENT2) de nucleosídeo e, além disso, inibe a PDÉ5, PDE7A, PDE8A, PDE10A e PDE11 (Soderling et al., 1998; Hetman et al., 2000a &b; Omori & Kotera, ■ 2007). Amrinona, Milrinona e Cilostazol, que são inibidores seletivos das isoformas da PDE3; Anagrelida, que inibe a PDE2 e PDE3. Ibudilast é menos seletivo do que Roflumilast e também inibe as isoformas da PDE10 e PDE11. A abordagem focou na regulamentação dos níveis de cAMP; portanto, as enzimas específicas para cGMP: PDE5, PDE6 e PDE9 não foram mais consideradas {Bender & Beavo, 2006; Omori & Kotera, 2007).

As células geralmente expressam muitas isoformas da adenilato ciclase. Em muitos casos, os receptores que são acoplados a Gs não têm acesso a todos os pools de células de adenilato ciclases. Em contraste, a forskolina estimula todas as isoformas de adenilato ciclase. Na ausência da inibição da fosfodiesterase, cAMP é rapidamente hidrolisado de tal modo que acumula apenas para níveis baixos no estado estacionário. Inibição da fosfodiesterase resulta no acúmulo de cAMP. Roflumílast, Ibudilast, Dipiridamol e RO20-1724 substancialmente melhoram o acúmulo de cAMP desencadeado por forskolina 5 μM. Roflumílast foi o inibidor mais potente e Dipiridamol foi o menos inibidor potente. Ibudilast e RO20-1724 foram mais eficazes do que Roflumílast. Tomados em conjunto esses dados sugeriam que isoformas da PDE4 contribuíram em grande extensão para a hidrólise do cAMP. Se o acúmulo do cAMP foi provocado por Treprostinila, a curva de concentração- resposta para todos os inibidores foi deslocado para a esquerda. Essa deslocamento para a esquerda indica que o cAMP gerado por meio da estimulação do receptor é mais prontamente acessível à degradação por fosfodiesterases. Uma explicação possível é a ancoragem das fosfodiesterases nas proximidades dos receptores {Francis et al., 2011). A maior eficácia de Dipiridamol também sugere uma possível contribuição para PDE8 ou PDE10. A principal ação dos inibidores da fosfodiesterase é aumentar o acúmulo de cAMP: enquanto Emax (isto é, o efeito máximo aumenta), a afinidade aparente do agonista (isto é, sua EC50) não é deslocada.

Na ausência de um agonista adicionado exogenamente (ou de forskolina), os inibidores da PDE não causam por se qualquer aumento apreciável no acúmulo de ' cAMP. É de se esperar; a atividade basal da adenilato ciclase é muito baixa e requer entrada através da ativação de receptores dependentes de Gs para catalisar a formação de cAMP. No entanto, em condições de cultura celular - ou seja, em meios definidos - não há quaisquer agonistas presentes.

Inibição da PDE melhora correntes de Cl induzidas por Treprostinila pelo CFTR: Devido a inibição das isoformas da PDE4 melhoraram o acúmulo de cAMP induzido por Treprostinila, esta manipulação foi prevista para melhorar o efeito de Treprostinila nas correntes de cloreto através do canal do regulador da condutância transmembrana na fibrose cística /Cl (CFTR). Este foi o caso: Treprostinila causou conforme sustentado a ativação do CFTR; a corrente externa resultante pode ser detectada pelos saltos de voltagem de -20 para -80 mV. A adição de Roflumilast (e outros inibidores da PDE4 tais como Ibudilast e RO20-1724) causou um aumento adicional da corrente. A corrente é conduzida pelo CFTR, porque é bloqueado de modo reversível pelo inibidor específico.

Conclusões 1) Células epiteliais das vias aéreas respiratórias humanas expressam vários receptores que podem ser alvo da Treprostinila para elevar o cAMP e assim ativar o • CFTR nas Células epiteliais das vias aéreas respiratórias humanas. 2) Isoformas da PDE4 estão presentes nas células epiteliais das vias aéreas respiratórias humanas e inibidores da PDE4 efetivamente aumentam a resposta a Treprostinila. Referências

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Claims (11)

1. COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DA FIBROSE CÍSTICA caracterizada por compreender Treprostinila ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado e pelo menos um inibidor da fosfodiesterase (PDE) 4 selecionado do grupo de RO 20-1724, Roflumilast e Ibudilast, para o uso na prevenção ou tratamento da fibrose cística.

2. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por estar contido um outro inibidor da PDE selecionado do grupo de inibidores da PDE5, PDE7 ou PDE8.

3. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por dito inibidor da PDE5 ser selecionado de Avanafila, Lodenafila, Mirodenafila, citrato de Sildenafila, Tadalafil, Vardenafil ou Udenafil.

4. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por ditos inibidores da PDE7 e PDE8 serem selecionados de Dipiridamol, BRL50481 e PF- 4957325.

5. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por ser uma composição farmacêutica.

6. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada para administração por inalação.

7. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada para administração por via intravenosa ou subcutânea, ou disponível na forma por via oral selecionada do grupo de formas de liberação sustentada, comprimidos e cápsulas.

8. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pela quantidade efetiva de Treprostinila ou um sal farmaceuticamente aceitável desta ser de pelo menos 1,0 ng/kg de peso corporal.

9. MÉTODO IN VITRO PARA AUMENTAR O NÍVEL DE cAMP EM UMA CÉLULA caracterizado por dita célula ser contatada com pelo menos uma prostaciclina ou análogo da prostaciclina e pelo menos um inibidor da PDE4 e, opcionalmente, por pelo menos um inibidor selecionado do grupo dos inibidores da PDE5, inibidores da PDE7 ou inibidores da PDE8 ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

10. COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA, caracterizada por compreender Treprostinila ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado e pelo menos um inibidor da PDE4 selecionado do grupo de RO 20-1724, Roflumilast e Ibudilast,, e opcionalmente, pelo menos um inibidor selecionado do grupo ou inibidores da PDE5, inibidores da PDE7 ou inibidores da PDE8, em que a prostaciclina ou análogo da prostaciclina e inibidor da PDE4 e, opcionalmente, pelo menos um inibidor selecionado do grupo dos inibidores da PDE5, inibidores das PDE7 e inibidores da PDE8 são providos em quantidades que em conjunto são suficientes para tratar e/ou prevenir pelo menos um sintoma associada com a fibrose cística.

11. COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pela Treprostinila ou um sal farmaceuticamente aceitável derivado e inibidor da PDE4 selecionado do grupo de RO 20-1724, Roflumilast e Ibudilast e, opcionalmente, pelo menos um inibidor selecionado do grupo dos inibidores da PDE5, inibidores da PDE7 e inibidores da PDE8 serem formulados para administração por inalação.

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