JPWO2010013525A1 - 複合体の測定方法およびそれに用いるキット - Google Patents

Abstract

物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢを含む可能性のある試料中の複合体ＡＢのレベルを測定する際に、試薬として、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣを含む試薬、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤを含む試薬、物質Ａ又はその類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子を含む試薬、および、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤとを含む試薬を用いて、競合的均一系凝集測定法により複合体を測定することにより、試料中の複合体を簡単に測定でき、また、汎用型の生化学自動分析装置に適用できる。

Description

本発明は、試料中の複合体の測定方法およびそれに用いるキットに関する。更に詳細には、本発明は、試料中の複合体の競合的均一系凝集測定法による測定法であって、試料中に存在するＩｇＡ−アルブミン複合体のような２つの異なる物質の複合体の測定に適した複合体の測定方法およびそれに用いるキットに関する。

血液試料には、２つの異なる物質が結合された複合体として存在しているものが数多くある。そのような複合体としては、トランスフェリン−トランスフェリンレセプター複合体、トロンビン−アンチトロンビン複合体、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体、酸化ＬＤＬ−ＣＲＰ複合体、ＰＳＡ−α２−マクログロブリン複合体、ＰＳＡ−アンチキモトリプシン複合体、酸化ＬＤＬ−α１−アンチトリプシン複合体、プロテインＣインヒビター−プロテアーゼ複合体、プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体、ＰＳＡ−プロテインＣインヒビター複合体、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−組織プラスミノーゲンアクチベーター複合体、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体、トランスサイレチン−レチノールバインディングプロテイン複合体等が知られている。

これらの複合体、すなわち、物質Ａと物質Ｂとの複合体を判別もしくは、レベルを測定する方法としては、例えば、以下のような方法が知られている。第一の方法は、電気泳動を用いる方法である（特許文献１）。第二の方法は、物質Ａに対する抗体と物質Ｂに対する抗体のいずれか一方の抗体を固相に結合させた固相抗体に、試料中のその複合体を接触させ、同時に固相に固定されていない他方の抗体を用いた標識抗体を作用させて、その複合体を測定する方法である（特許文献２）。第三の方法は、その複合体に対する特異的な抗体でその個々の遊離成分には親和性の少ない抗体を用いて種々の免疫測定法により複合体を測定する方法である（特許文献３）。しかし、第一の方法は、感度と定量性が低く測定操作も煩雑であるという欠点がある。第二の方法は、固相を用いる方法のため汎用型の生化学自動分析装置では測定できず、洗浄操作、反応時間等に時間がかかるという問題がある。第三の方法は、その複合体に抗体を作成するための抗原や特異性のある抗体が入手しにくい場合もあり、また、特異性の問題から正確に複合体を測定しにくいという問題があった。したがって、均一系において、試薬が入手しやすく、生化学自動分析装置に適用する簡便な複合体の測定方法の開発が望まれている。
一方、最近、複合体としてＩｇＡ−アルブミン複合体が５人のＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の患者から単離され、その複合体をウェスタンブロットにて存在を確認したという報告がある（非特許文献１）が、そのレベルを簡単に測定する方法は知られていない。

特開平２−１１４１８１号公報 特開平２−１９３０７１号公報 特開平５−２０７８９３号公報

Ｆｕｊｉｔａら、Ｊ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，５０巻，１９頁，２００６年

したがって、本発明の目的は、特に均一系において、試薬が入手しやすく、生化学自動分析装置に適用できる簡便な複合体の測定方法およびそれに用いるキットを提供することである。また、本発明の目的は、複合体としてＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを簡単に測定できる方法を提供することである。

そのような状況下、これらの問題を解決するため、本発明者らは、ＩｇＡ−アルブミン複合体等の物質Ａと物質Ｂとの複合体のレベルを簡単に測定できる方法を検討した。その結果、２種類の物質を担持させたラテックス試薬を開発し、それを用いて、さらに物質Ａに対する抗体等の特異的結合パートナーを含む試薬、物質Ｂに対する抗体等の特異的結合パートナーを含む試薬、物質Ａに対する特異的結合パートナーと物質Ｂに対する特異的結合パートナーとを含む試薬の３種類の試薬を組み合わせて３回の競合的均一系凝集測定法を行い、３回の測定で得られる値から、目的の複合体のレベルを自動分析装置で測定できることを発見した。同時にこの方法により、複合体のＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを簡単に測定できることを見出した。本発明はかかる経過により達成されたものである。

すなわち、本発明は、物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢを含む可能性のある試料中の複合体ＡＢのレベルを測定する方法であって、
ｉ）該試料と、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ａ又はその類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＣと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質Ａおよび該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＣと該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との凝集の度合いから、該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質ＡのレベルＰを測定し、かつ、
ｉｉ）該試料と、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤと、物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＤと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質Ｂおよび該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＤと該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との凝集の度合いから、該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質ＢのレベルＱを測定し、かつ、
ｉｉｉ）該試料と、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤと、物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＣと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質Ａおよび該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との間、かつ、該特異的結合パートナーＤと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質Ｂおよび該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＣと該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との凝集の度合と、該特異的結合パートナーＤと該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との凝集の度合の和からレベルＲを測定し、かつ、
ｉｖ）α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒにより複合体ＡＢのレベルαを求めることを特徴とする試料中の複合体ＡＢの測定方法である。

さらに本発明は、試料中の物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢのレベルを測定するためのキットであって、
ｉ）物質Ａ又はその類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子を含む試薬、
ｉｉ−Ａ）物質Ａに対する特異的結合パートナーＣを含む試薬、
ｉｉ−Ｂ）物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤを含む試薬、及び
ｉｉ−Ｃ）物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤとを含む試薬、
から構成される、試料中の複合体ＡＢのレベルを測定するためのキットである。

さらに本発明は、物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢを含む可能性のある試料中の複合体ＡＢのレベルを測定する方法であって、
ｉ）該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質ＡのレベルＰを測定し、かつ
ｉｉ）該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質ＢのレベルＱを測定し、かつ
ｉｉｉ）該試料と、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤと、物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＣと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質Ａおよび該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との間、かつ、該特異的結合パートナーＤと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質Ｂおよび該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＣと該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との凝集の度合と、該特異的結合パートナーＤと該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との凝集の度合との和からレベルＲを測定し、かつ、
ｉｖ）α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒにより複合体ＡＢのレベルαを求める、
ことを特徴とする試料中の複合体ＡＢの測定方法である。

さらに本発明は、試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体をＩｇＡに対する抗体とアルブミンに対する抗体を用いて免疫測定法により測定することを特徴とする、ＩｇＡ−アルブミン複合体の測定方法である。

本発明の方法およびキットにより、入手しやすい試薬を用いて簡便に試料中の複合体を測定できる。また、この方法およびキットは、汎用型の生化学自動分析装置に適用できるので、多試料中の目的の複合体を短時間で簡便に測定できる。また、複合体としてＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを簡単に測定できる。

実施例１において、第一試薬および第二試薬−Ａを用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量を示す。 実施例１において、第一試薬および第二試薬−Ｂを用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量を示す。 実施例１において、第一試薬および第二試薬−Ｃを用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量を示す。 実施例１において、第一試薬および第二試薬−Ａを用いて、試料中のＩｇＡを測定した結果と、従来の免疫比濁法（ＴＩＡ法）を用いて試料中のＩｇＡを測定した結果との相関性を示す。 実施例１において、第一試薬および第二試薬−Ｂを用いて、試料中のアルブミンを測定した結果と、従来の免疫比濁法（ＴＩＡ法）を用いて試料中のアルブミンを測定した結果との相関性を示す。 実施例１において、ＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない血清、及びＩｇＡ−アルブミン複合体を含む検体について、［第二試薬−Ａから算出された値＋第二試薬−Ｂから算出された値］（Ｘ）と[第二試薬−Ｃから算出された値]（Ｙ）の相関性を示す。 実施例１において、ＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない血清について、［第二試薬−Ａから算出された値＋第二試薬−Ｂから算出された値］（Ｘ）と[第二試薬−Ｃから算出された値]（Ｙ）の相関性を示す。

本発明は、競合的均一系免疫凝集測定法等の競合的均一系凝集測定法で、反応試薬および生成物のうちの、１個のみが濁りを有し、他の成分が水に溶解するということに基づいて試料中の物質を測定できるということを応用している。
本明細書において、競合的均一系免疫凝集測定法とは、測定すべき抗原を含む試料と、該抗原に対する抗体と、その抗体と結合可能な抗原を担持してある微細粒子とを混合し、該抗体と、試料中の抗原および微細粒子が担持した抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、微細粒子が担持した抗原と抗体との抗原抗体反応による凝集の度合いから、測定すべき抗原のレベルを定量する方法である。
本明細書において、競合的均一系凝集測定法とは、測定すべき物質を含む試料と、該物質に対する特異的結合パートナーと、その特異的結合パートナーと結合可能な物質を担持してある微細粒子とを混合し、該特異的結合パートナーと、試料中の物質および微細粒子が担持した物質との間で、特異的結合反応を競合させて、微細粒子が担持した物質と特異的結合パートナーとの特異的結合反応による凝集の度合いから、測定すべき物質のレベルを定量する方法である。

この競合的均一系凝集測定法の一般的な原理を、以下に例示して説明する。
まず、試料と試薬とを混合して反応させるものとして、（ｉ）試料中の測定しようとする物質、（ｉｉ）試薬としての、測定しようとする物質と同じ物質またはその類似物と微細粒子との結合体、（ｉｉｉ）試薬としての、測定しようとする物質に対する特異的結合パートナーを用いるが、これら（ｉ）−（ｉｉｉ）の物質および試薬は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。次いで、これらを混合して抗原抗体反応等の特異的結合反応をさせると、（ｉｖ）（ｉｉ）の結合体と（ｉｉｉ）の特異的結合パートナーとの結合物、および（ｖ）（ｉ）の物質と（ｉｉｉ）の特異的結合パートナーとの結合物の２つの特異的結合反応物が競合して生成する。（ｉｖ）の結合物は水に不溶性で濁りが生じるのに対し、（ｖ）の結合物は水に可溶性である。従って、（ｉｖ）の結合物が多く形成されればされるほど、反応液の濁度（凝集の度合い）が増加する。
この競争反応では、（ｉ）の物質は、（ｉｉ）の結合体と、限定量の（ｉｉｉ）の特異的結合パートナーに対して競争反応し、それによって、生じる不溶性の（ｉｖ）の結合物の量を減少させると同時に、反応溶液中の濁度を低下させる。そのため、試料中の測定しようとする物質が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが小さくなる。従って、濁りの度合いから試料中の物質を測定することができる。

この本発明に用いる競合的均一系免疫凝集測定法等の競合的均一系凝集測定法は、検量線が減衰曲線なので、通常の免疫凝集法等の均一系凝集測定法の弱点であるプロゾーン現象が起こらないという長所を有する。

本発明の複合体の測定法においては、例えば、上記原理中の（ｉｉ）の「試薬としての、測定しようとする物質と同じ物質またはその類似物と微細粒子との結合体」として「試薬としての、物質Ａまたはその類似物、及び物質Ｂまたはその類似物が微細粒子に担持された結合体」を用いたことに特徴がある。本発明においては、好ましくは３度の競合的均一系凝集測定法を実施し、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質ＡのレベルＰ、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質ＢのレベルＱ、また、レベルＲを求める。この場合、３度の測定においては、上記原理中の（ｉｉｉ）の「試薬としての、測定しようとする物質に対する特異的結合パートナー」としては、それぞれ、「試薬としての、物質Ａに対する特異的結合パートナー」、「試薬としての、物質Ｂに対する特異的結合パートナー」、「試薬としての、物質Ａに対する特異的結合パートナーと物質Ｂに対する特異的結合パートナーの両方」を用いて行い、それぞれの凝集の度合いとしてレベルＰ、Ｑ、Ｒを求める。最終的に、α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒにより複合体ＡＢのレベルαを求めて試料中の複合体ＡＢのレベルを測定することができる。

なお、本発明においては、物質ＡのレベルＰ、物質ＢのレベルＱは、既知の方法により測定しても構わない。既知の方法としては、免疫比濁法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫比濁法等を例示できる。

本発明は、物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢを含む可能性のある試料中の複合体ＡＢのレベルを測定する方法である。
本発明において、複合体ＡＢは、２つの異なる物質Ａと物質Ｂとの複合体であれば特に限定しない。複合体としては、例えば、トランスフェリン−トランスフェリンレセプター複合体、トロンビン−アンチトロンビン複合体、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体、酸化ＬＤＬ−ＣＲＰ複合体、ＰＳＡ−α２−マクログロブリン複合体、ＰＳＡ−アンチキモトリプシン複合体、酸化ＬＤＬ−α１−アンチトリプシン複合体、プロテインＣインヒビター−プロテアーゼ複合体、プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体、ＰＳＡ−プロテインＣインヒビター複合体、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−組織プラスミノーゲンアクチベーター複合体、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体、トランスサイレチン−レチノールバインディングプロテイン複合体、ＩｇＡ−アルブミン複合体等が好適である。本発明においては、複合体を構成する２つの物質Ａ、物質Ｂのうちのいずれかまたは両方がその複合体とは別な形、例えば、結合されていない遊離物質として試料中に存在していても構わない。

試料としては、複合体ＡＢが含む可能性のある試料であれば限定しないが、生体試料が好ましく、そのような試料として、血漿、血清、尿などが例示できる。

本明細書において、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣ、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤとは、それぞれ、複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離物質としての物質Ａと特異的結合反応しうるもの、複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離物質としての物質Ｂと特異的結合反応しうるものであれば特に限定しないが、特異性と汎用性の点から、それぞれ、物質Ａ、物質Ｂに対する抗体が好適である。このような抗体とは、抗原、すなわち測定すべき物質に対する抗体であり、そのような抗体であれば抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれをも用いることができる。
物質がアビジン、ビオチン、ホルモン、ホルモンレセプターの場合、抗体以外の特異的結合パートナーとして、それぞれ、ビオチン、アビジン、ホルモンレセプター、ホルモン等を例示できる。
本明細書において、「物質Ａ又はその類似物」における「類似物」とは、物質Ａに対する特異的結合パートナーと特異的結合反応しうる物質であって物質Ａ以外の物質であれば特に限定しないが、一般的には、物質Ａと構造が類似しているものである。物質Ａが蛋白質の場合、その蛋白質の構造中の一部のアミノ酸が欠損したり、付加したりした類似物で特異的結合パートナーと特異的結合反応しうるもの等を例示できる。
本明細書において、「物質Ｂ又はその類似物」における「類似物」とは、物質Ｂに対する特異的結合パートナーと特異的結合反応しうる物質であって物質Ｂ以外の物質であれば特に限定しないが、一般的には、物質Ｂと構造が類似しているものである。物質Ｂが蛋白質の場合、その蛋白質の構造中の一部のアミノ酸が欠損したり、付加したりした類似物で特異的結合パートナーと特異的結合反応しうるもの等を例示できる。

本明細書において、特異的結合反応とは、特異的結合パートナーが抗体であるときは、抗原抗体反応であるが、その他としてアビジン−ビオチン結合反応、ホルモン−ホルモンレセプター結合反応を例示できる。
本明細書において、微細粒子とは、臨床検査の分野で用いられている免疫凝集反応に通常使用される微細粒子をそのまま使用することができる。最も一般的な微細粒子は、ラテックス粒子である。微細粒子は、例えば、粒径１０〜５００ ｎｍのものが使用される。
本発明において、物質またはその類似物を微細粒子に担持しておく場合、担持の方法は、疎水性相互作用による物理的吸着法や共有結合法等の通常の担持する方法等の公知の担持法を用いることができる。
本発明においては、凝集の度合いを測定する方法としては、通常、生成する濁りを吸光度、好ましくは波長３４０〜９４０ ｎｍのいずれかの吸光度で測定するのが好ましい。また、凝集の度合いを測定する方法としては、凝集塊を肉眼で観察したり、凝集をしなかった微細粒子を計数したりすることによっても実施することができる。それにより、該試料中の物質のレベルを測定できる。

本明細書において、自動分析装置とは、試料に少なくとも１以上の液状試薬を自動的に加えて均一系で試料中の成分を凝集の度合いから測定できる装置であれば限定しないが、臨床検査分野で用いられる汎用型の生化学自動分析装置が好ましい。そのような装置として、例えば、日立７１８０型自動分析装置、７１７０Ｓ型自動分析装置、７６００型自動分析装置、日本電子ＢＭ２２５０型自動分析装置、東芝ＴＢＡ−２００ＦＲ型自動分析装置、オリンパスＡＵ６４０型自動分析装置、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＩＭＭＡＧＥ８００等を例示することができる。

本発明において、試料中の複合体ＡＢのレベルを測定するためには、例えば、ｉ）物質Ａ又はその類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子を含む試薬、ｉｉ−Ａ）物質Ａに対する特異的結合パートナーＣを含む試薬、ｉｉ−Ｂ）物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤを含む試薬、ｉｉ−Ｃ）物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤとを含む試薬から構成される、試料中の複合体ＡＢのレベルを測定するためのキットを用いることができる。

本発明の複合体ＡＢの測定法を実施するには、特異的結合パートナーとして抗体を用いることができる点から、物質Ａと物質Ｂは、ともに蛋白質が好適である。その場合の具体的な方法として、例として、３種類の競合的均一系免疫比濁測定法を用いたＩｇＡ−アルブミン複合体の測定方法に関してさらに詳細に具体例を説明する（この場合に、物質Ａと物質Ｂが、ともに蛋白質の場合は、以下のＩｇＡ、アルブミンをそれぞれ、物質Ａ、物質Ｂとすればより一般的に説明になる）。
ｉ）ＩｇＡとアルブミンが感作されたラテックス粒子を含む試薬（物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子を含む試薬）：
３〜２０％濃度とした、表面にカルボキシル基を有する粒径１０〜５００ｎｍのラテックス粒子溶液に、緩衝液で溶解した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）溶液１ｍＬを添加し、ＥＤＣ添加ラテックス溶液を調製する。
次いで、ＩｇＡ溶液をＥＤＣ添加ラテックス溶液に加え、０〜４０℃にて５分〜１０時間攪拌しラテックス粒子のカルボキシル基と、ＩｇＡのアミノ基の縮合反応により結合させた後、アルブミン溶液を加えて反応を停止させる。その後、３，０００〜３０，０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収する。この沈殿物に、アルブミン溶液を加え沈殿物を懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させた後、０〜４０℃で攪拌する。次いで、３，０００〜３０，０００ｒｐｍで遠心分離を行い、得られた沈殿物に、緩衝液を加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させＩｇＡ・アルブミン感作ラテックス粒子を得、これを緩衝液で希釈し第一試薬として用いる。

ｉｉ−Ａ）抗ＩｇＡ抗体含有試薬（物質Ａに対する特異的結合パートナーＣを含む試薬）：
抗ヒトＩｇＡヤギ血清等の抗ＩｇＡ抗体に緩衝液を加え抗ＩｇＡ抗体含有試薬溶液とし、それを第二試薬−Ａとして用いる。この抗ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ−アルブミン複合体におけるＩｇＡおよび遊離の形態にあるＩｇＡの両者に対して特異的結合反応しうるものである。
ｉｉ−Ｂ）抗アルブミン抗体含有試薬（物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤを含む試薬）：
抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション等の抗アルブミン抗体に緩衝液を加え抗アルブミン抗体含有試薬とし、それを第二試薬−Ｂとして用いる。この抗アルブミン抗体は、ＩｇＡ−アルブミン複合体におけるアルブミンおよび遊離の形態にあるアルブミンの両者に対して特異的結合反応しうるものである。
ｉｉ−Ｃ）抗ＩｇＡ抗体と抗アルブミン抗体を含む試薬（物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤとを含む試薬）：
上記した、抗ヒトＩｇＡヤギ血清等の抗ＩｇＡ抗体と、抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション等の抗アルブミン抗体とを緩衝液で希釈し、混合抗血清溶液等の抗ＩｇＡ抗体と抗アルブミン抗体を含む試薬とし、それを第二試薬−Ｃとして用いる。

ＩｇＡ−アルブミン複合体の測定：
ＩｇＡ−アルブミン複合体の測定をするため、日立７１８０形等の汎用型の生化学自動分析装置を用い、試料２〜２０μＬに対し第一試薬５０〜２００μＬ、第二試薬（−Ａ、Ｂ、及びＣのいずれか）５０〜２００μＬを反応させ、波長３４０〜８００ｎｍにて、例えば、１６−３４測光ポイント間(第二試薬添加直後から５分後に相当)における２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定する。
試料を第一試薬と第二試薬−Ａ（抗ＩｇＡ抗体）の組み合わせで反応させると、競合的均一系凝集測定法にて試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体におけるＩｇＡおよび遊離の形態にあるＩｇＡのレベル（Ｐ値）を測定できる。試料を第一試薬と第二試薬−Ｂ（抗アルブミン抗体）の組み合わせで反応させると、競合的均一系免疫凝集測定法にて試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体におけるアルブミンおよび遊離の形態にあるアルブミンのレベル（Ｑ値）を測定できる。また、試料を第一試薬と第二試薬−Ｃ（抗ＩｇＡ抗体と抗アルブミン抗体）の組み合わせで反応させ、競合的均一系免疫凝集測定法にて測定できる値をＲ値として求める。
Ｐ値、Ｑ値、Ｒ値の単位は、例えば、３者が同一の単位であればよく、吸光度変化量そのものでもよく、検量線でｍｇ／ｄＬ等の重量濃度、ｍｍｏｌ／Ｌ等のモル濃度に換算したものを用いてもよい。この値から、Ｐ＋Ｑ−Ｒをα値として求め、得られる値αをＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルとする。

なお、ＩｇＡ−アルブミン複合体は、上記のように３種類の競合的均一系免疫比濁測定法を用いて測定することが最も好ましいが、それ以外に、例えば、試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体をＩｇＡに対する抗体とアルブミンに対する抗体を用いた免疫測定法により測定できる。例えば、ＩｇＡに対する抗体とアルブミンに対する抗体のいずれか一方を固相に結合させた固相抗体に、試料中のその複合体を接触させ、同時に固相に固定されていない方の抗体を用いた標識抗体を作用させて、その複合体を測定する方法によっても測定できる。これらのような方法にてＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを測定し、ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の判定をすることができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
ヒト血清中ＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルの測定
１）ヒトＩｇＡとヒトアルブミンが感作されたラテックス粒子（以下、ＩｇＡ・アルブミン感作ラテックス粒子と記載することもある）の調製
ラテックス粒子へのヒトＩｇＡおよびヒトアルブミンの結合は以下のように行った。
２−モルホリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）緩衝液で１１．７６％濃度とした、表面にカルボキシル基を有する粒径１０８ｎｍのラテックス粒子溶液８．５ｍＬに、ＭＥＳ緩衝液で４００ｍｇ／ｍＬに調製した１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）溶液１ｍＬを添加しＥＤＣ添加ラテックス溶液を調製した。
次いで、それとは別に、正常ヒト血清より粗精製された、ヒトＩｇＡ（３３ｍｇ／ｍＬ）をトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液−１で０．３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。この溶液１００ｍＬをＥＤＣ添加ラテックス溶液に加え、室温にて１時間攪拌しラテックス粒子のカルボキシル基と、ＩｇＡのアミノ基の縮合反応により結合させた後、ヒトアルブミン溶液を５０ｍＬ加えて反応を停止させた。その後、２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物に、ヒトアルブミン溶液を５０ｍＬ加え沈殿物を懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させた後、室温で１時間攪拌した。次いで、２０，０００ｒｐｍ遠心分離を行い得られた沈殿物に、Ｔｒｉｓ緩衝液−２ １００ｍＬ加えて懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させ１％濃度ＩｇＡ・アルブミン感作ラテックス粒子を得た。

２）ヒトＩｇＡ−アルブミン複合体測定用第一試薬の調製
ＩｇＡ・アルブミン感作ラテックス粒子を用いて、第一試薬を調製した。
第一試薬は、１％濃度ＩｇＡ・アルブミン感作ラテックス粒子１０ｍＬにＴｒｉｓ緩衝液−２を９０ｍＬを加えてラテックス０．１％濃度の溶液として用いた。

３）ヒトＩｇＡ−アルブミン複合体測定用第二試薬の調製
抗ヒトＩｇＡヤギ血清、抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション、及びこれら２つの血清を混合したものを用いて、３種類の第二試薬を調製した。
第二試薬−Ａ（抗ＩｇＡ抗体）は、抗ヒトＩｇＡヤギ血清０．１５ｍＬにＴｒｉｓ緩衝液−２ ９９．８５ｍＬを加え抗ヒトＩｇＡヤギ血清０．１５％濃度の溶液として用いた。
第二試薬−Ｂ（抗アルブミン抗体）は、抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション１．１ｍＬにＴｒｉｓ緩衝液−２を９８．９ｍＬ加え抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション１．１％濃度の溶液として用いた。
第二試薬−Ｃ（抗ＩｇＡ抗体と抗アルブミン抗体）は、抗ヒトＩｇＡヤギ血清０．１５ｍＬ、抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション１．１ｍＬにＴｒｉｓ緩衝液−２ ９８．７５ｍＬを加え抗ヒトＩｇＡヤギ血清０．１５％濃度、抗ヒトアルブミンヤギ血清γ−フラクション１．１％濃度の混合抗血清溶液として用いた。

これら調製した３種類の第二試薬に対して、おのおのの第一試薬は、前述したラテックス溶液を共通して用いた。
試料を第一試薬と第二試薬−Ａ（抗ＩｇＡ抗体）の組み合わせで反応させると、競合的均一系凝集測定法にて試料中のＩｇＡ（Ｐ値）を測定できる。試料を第一試薬と第二試薬−Ｂ（抗アルブミン抗体）の組み合わせで反応させると、競合的均一系免疫凝集測定法にて試料中のアルブミン（Ｑ値）を測定できる。また、試料を第一試薬と第二試薬−Ｃ（抗ＩｇＡ抗体と抗アルブミン抗体）の組み合わせで反応させ、競合的均一系免疫凝集測定法にて測定できる値をＲ値として求める。

各試薬の組成は以下の通りである。
Ｔｒｉｓ緩衝液−１
Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
塩化ナトリウム １００ｍＭ
ヒトアルブミン溶液
Ｔｒｉｓ １２．４ｍＭ ｐＨ７．５
尿素 ２０ｍＭ
ヒトアルブミン（ＳＣＲＩＰＰＳ社製） １０％
Ｔｒｉｓ緩衝液−２
Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．４
塩化ナトリウム １００ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ０．１％

４）検量線の作成
標準試料は、ヒトＩｇＡ及びヒトアルブミン濃度既知の血清を、Ｔｒｉｓ緩衝液−２を用いて適宜希釈して使用した。また、第二試薬−Ｃの標準試料濃度は、単一血清中で、濃度既知のＩｇＡ濃度とアルブミン濃度を加えたものとした。
ヒトＩｇＡ・アルブミン複合体の測定をするため、日立７１８０形自動分析装置を用い、試料１２μＬに対し第一試薬１２０μＬ、第二試薬（−Ａ、Ｂ、及びＣのいずれか）１２０μＬを反応させ、波長５７０ｎｍにて１６−３４測光ポイント間(第二試薬添加直後から５分後に相当)における２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
第一試薬は共通で用い、第二試薬−Ａ、Ｂ、及びＣ試薬を用いて、標準試料を測定した際の吸光度変化量をそれぞれ表１、２、３及び図１、２、３に示した。

表１、２、３及び図１、２、３に示したように、いずれの試薬においても、標準液中のヒトＩｇＡ及びヒトアルブミンが増すにつれて競合反応により吸光度変化量が減少した。
このことは、第一試薬と第二試薬−Ａ，Ｂ，Ｃとの組み合わせにて、各吸光度変化量を求めることによりＩｇＡ、アルブミン、Ｒ値を濃度としても求められることを示している。

５）第二試薬−Ａ、Ｂを用いたＩｇＡ、アルブミンの測定の確認
第二試薬−Ａ、Ｂを用いた試薬で、試料中のＩｇＡ、アルブミンを正確に測定できるかどうかを確認するため、これらの試薬と、免疫比濁法（ＴＩＡ法）を用いた血清ＩｇＡ、及び血清アルブミン測定試薬との相関性の有無を検討した。
試料は、ウエスタンブロット法にて確認されたＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない血清を、Ｔｒｉｓ緩衝液−２にて適宜希釈して使用した。測定値は、前述の標準試料を用い、日立７１８０形自動分析装置の多点検量線作成機能により求められた検量線から算出させた。測定試薬は本発明試薬の第一試薬、第二試薬−Ａ、Ｂを用い、また対照試薬として市販ＴＩＡ法の「Ｎ−アッセイ ＴＩＡ ＩｇＡ−ＲＣ」、「Ｎ−アッセイ ＴＩＡ ＭｉｃｒｏＡｌｂ」（日東紡績）を用いた。
本発明試薬の測定パラメーターは前述した条件を使用し、ＴＩＡ法は指定されたパラメーター及び標準液を用いた。
本発明試薬との相関性の結果を図４、図５に示す。ただし、試料は適宜希釈し測定しているため、値は希釈倍数を掛け直し表した。

図４、図５に示すように、ＴＩＡ法をＸ、本発明試薬をＹとして相関性を確認した結果、第二試薬−Ａでは、Ｙ＝１．００６Ｘ＋１０．６５相関係数０．９９６２、第二試薬−Ｂでは、Ｙ＝０．９４８１Ｘ＋１４４．９相関係数０．９９８１と共に良好な結果が得られた。ＴＩＡ法との相関性が確認されたことから、第二試薬−Ａ、Ｂを用いた試薬では、血清ＩｇＡ及び血清アルブミンを、共に正確に測定できていると言える。

６）ヒト血清中ＩｇＡ−アルブミン複合体のレベル
測定試薬は、第一試薬及び、第二試薬−Ａ、Ｂ、Ｃを用い、前述と同一の測定条件にて測定した。
試料は前述のものに加え、ウエスタンブロット法にて確認されたＩｇＡ−アルブミン複合体を含む血清もＴｒｉｓ緩衝液−２にて適宜希釈して使用した。
本発明試薬において、［第二試薬−Ａから算出された値＋第二試薬−Ｂから算出された値］（Ｘ）と[第二試薬−Ｃから算出された値]（Ｙ）の相関性を図６、図７に示す。
図６はＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない血清、及びＩｇＡ−アルブミン複合体を含む検体の全てを含む結果であり、図７はＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない血清のみの相関図である。

相関性を確認したところ、ＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない血清のみ（図７）においてはＹ＝０．９９６２Ｘ−２９．９１相関係数０．９９６３と良好な結果が得られた。しかし、図６に示したようにＩｇＡ−アルブミン複合体を含む血清は、複合体を含まない血清から得られた相関式から大きく乖離した結果となった。これは、ＩｇＡ−アルブミン複合体を含む血清に、特異的に現れる傾向である。
ここで、［第二試薬−Ａから測定された値］ＩｇＡのレベルをＰ、［第二試薬−Ｂから測定された値］アルブミンのレベルをＱ、［第二試薬−Ｃから測定された値］をＲとすると、ＩｇＡ−アルブミン複合体を含まない場合は、α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒ≒０の関係が成り立つ。一方、ＩｇＡ−アルブミン複合体を含む場合は、α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒ＞０の関係となる。表４に示したように、実際の血清を測定した結果から、複合体を含まない検体のαよりも、複合体を含む検体のαが有意に高くなっており、この関係式が成り立っていることが証明できる。

したがって、以上のことより本発明試薬は、共通の第一試薬と３種類の第二試薬を用いることで、網羅的かつ特異的にヒト血清中ＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを測定できることが判明した。また、ＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを求めることにより、ＩｇＡ型Ｍ蛋白血症の患者を判定できることが判明した。

本発明の競合的均一系凝集測定法による複合体の測定法方法およびキットにより、入手しやすい試薬を用いて簡便に試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体などの複合体のレベルを簡単に測定できる。また、この方法およびキットは、汎用型の生化学自動分析装置に適用できるので、多試料中の目的の複合体を短時間で簡便に測定できる。

Claims (12)

1. 物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢを含む可能性のある試料中の複合体ＡＢのレベルを測定する方法であって、
   ｉ）該試料と、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ａ又はその類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＣと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質Ａおよび該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＣと該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との凝集の度合いから、該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質ＡのレベルＰを測定し、かつ、
   ｉｉ）該試料と、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤと、物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＤと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質Ｂおよび該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＤと該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との凝集の度合いから、該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質ＢのレベルＱを測定し、かつ、
   ｉｉｉ）該試料と、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤと、物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＣと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質Ａおよび該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との間、かつ、該特異的結合パートナーＤと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質Ｂおよび該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＣと該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との凝集の度合と、該特異的結合パートナーＤと該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との凝集の度合の和からレベルＲを測定し、かつ、
   ｉｖ）α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒにより複合体ＡＢのレベルαを求めることを特徴とする試料中の複合体ＡＢの測定方法。
2. 特異的結合パートナーが抗体である、請求項１記載の測定方法。
3. 物質Ａと物質Ｂが互いに異なる蛋白質である、請求項２記載の測定方法。
4. 微細粒子がラテックス粒子である、請求項１から３に記載のいずれかの測定方法。
5. 凝集の度合いを波長３４０〜９４０ ｎｍのいずれかの吸光度で測定する、請求項４に記載の測定方法。
6. 試料が生体試料である、請求項１から５に記載のいずれかの測定方法。
7. 物質ＡがＩｇＡであり、物質Ｂがアルブミンであり、特異的結合パートナーＣがＩｇＡに対する抗体であり、特異的結合パートナーＤがアルブミンに対する抗体であり、複合体ＡＢがＩｇＡ−アルブミン複合体であり、かつ、特異的結合反応が抗原抗体反応である、請求項１から６に記載のいずれかの測定方法。
8. 試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体をＩｇＡに対する抗体とアルブミンに対する抗体を用いて免疫測定法により測定することを特徴とする、ＩｇＡ−アルブミン複合体の測定方法。
9. 請求項７または８に記載のＩｇＡ−アルブミン複合体の測定方法により、ヒト由来生体試料中のＩｇＡ−アルブミン複合体のレベルを測定し、そのレベルからＩｇＡ型Ｍ蛋白血症を判定する方法。
10. 試料中の物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢのレベルを測定するためのキットであって、
    ｉ）物質Ａ又はその類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子を含む試薬、
    ｉｉ−Ａ）物質Ａに対する特異的結合パートナーＣを含む試薬、
    ｉｉ−Ｂ）物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤを含む試薬、及び
    ｉｉ−Ｃ）物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤとを含む試薬、
    から構成される、試料中の複合体ＡＢのレベルを測定するためのキット。
11. 物質ＡがＩｇＡ、かつ、物質Ｂがアルブミン、かつ、複合体ＡＢがＩｇＡ−アルブミン複合体である、請求項１０記載のキット。
12. 物質Ａと物質Ｂとの複合体ＡＢを含む可能性のある試料中の複合体ＡＢのレベルを測定する方法であって、
    ｉ）該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質ＡのレベルＰを測定し、かつ
    ｉｉ）該試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質ＢのレベルＱを測定し、かつ
    ｉｉｉ）該試料と、物質Ａに対する特異的結合パートナーＣと、物質Ｂに対する特異的結合パートナーＤと、物質Ａ又その類似物と物質Ｂ又はその類似物とを担持した微細粒子とを、混合して、該特異的結合パートナーＣと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ａおよび遊離の形態にある物質Ａおよび該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との間、かつ、該特異的結合パートナーＤと、試料中の複合体ＡＢにおける物質Ｂおよび遊離の形態にある物質Ｂおよび該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との間で特異的結合反応を競合させて、該特異的結合パートナーＣと該微細粒子に担持された物質Ａ又はその類似物との凝集の度合と、該特異的結合パートナーＤと該微細粒子に担持された物質Ｂ又はその類似物との凝集の度合との和から得られるレベルＲを測定し、かつ、
    ｉｖ）α＝Ｐ＋Ｑ−Ｒにより複合体ＡＢのレベルαを求める、
    ことを特徴とする試料中の複合体ＡＢの測定方法。

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