JP3194585B2 - 化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイ - Google Patents
化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は化学発光標識化合物を使用してサンプル中の
抗体を検出する方法に関する。
抗体を検出する方法に関する。
より詳細には本発明は、アフィニティー複合体を常磁
性粒子上で捕獲する２サイトイムノアッセイにおける、
アビジン又はストレプトアビジンに結合した化学発光ア
クリジニウムエステル化合物及びビオチンに結合したリ
ガンドの使用に関し、サンプル（例えば生物体液及び組
織サンプル、乳汁、食品サンプル、飲料、水又は工業廃
液等）中の免疫学的に活性な物質（例えば抗体）を迅速
に検出及び／又は定量することが可能である。
性粒子上で捕獲する２サイトイムノアッセイにおける、
アビジン又はストレプトアビジンに結合した化学発光ア
クリジニウムエステル化合物及びビオチンに結合したリ
ガンドの使用に関し、サンプル（例えば生物体液及び組
織サンプル、乳汁、食品サンプル、飲料、水又は工業廃
液等）中の免疫学的に活性な物質（例えば抗体）を迅速
に検出及び／又は定量することが可能である。
血清中の免疫グロブリンＥ抗体の検出及び定量方法
は、Ciba Corning Diagnostics Corp.and ALK Lab
oratoriesにより1990年９月に発行された小冊子“Speci
fic IgE,Magic（登録商標）Lite SQ（商標）”に開示
されている。この方法では、常磁性粒子に共有結合した
特異的アレルゲンを血清又は血漿サンプル中のアレルゲ
ン特異的IgE抗体と反応させる。最初のインキュベーシ
ョン期間後に結合しなかった非特異的IgEを洗い落とし
た後、化学発光アクリジニウムエステルで標識した抗Ig
Eモノクローナル抗体を加える。第２のインキュベーシ
ョン期間後、化学発光反応を開始する試薬を自動注入す
るMagic Lite（登録商標）Analyzer（カタログ番号472
733又は472270）で固相結合標識化抗体を測定する。こ
の方法を使用すると、化学発光を開始及び測定する最終
段階しか自動化することができない。化学発光アクリジ
ニウムエステル標識化合物は米国特許第4,745,181号に
記載されている。
は、Ciba Corning Diagnostics Corp.and ALK Lab
oratoriesにより1990年９月に発行された小冊子“Speci
fic IgE,Magic（登録商標）Lite SQ（商標）”に開示
されている。この方法では、常磁性粒子に共有結合した
特異的アレルゲンを血清又は血漿サンプル中のアレルゲ
ン特異的IgE抗体と反応させる。最初のインキュベーシ
ョン期間後に結合しなかった非特異的IgEを洗い落とし
た後、化学発光アクリジニウムエステルで標識した抗Ig
Eモノクローナル抗体を加える。第２のインキュベーシ
ョン期間後、化学発光反応を開始する試薬を自動注入す
るMagic Lite（登録商標）Analyzer（カタログ番号472
733又は472270）で固相結合標識化抗体を測定する。こ
の方法を使用すると、化学発光を開始及び測定する最終
段階しか自動化することができない。化学発光アクリジ
ニウムエステル標識化合物は米国特許第4,745,181号に
記載されている。
米国特許第4,946,958号はＮ−スクシンイミジル部分
に結合した化学発光アクリジニウムエステルを開示して
おり、該Ｎ−スクシンイミジル部分を更にタンパク質又
はポリペプチドと結合し、免疫学的に反応性の発光試薬
を提供することができる。該試薬は、固相抗体、抗原分
子及び標識化抗抗体を同時に結合し、固相を分離洗浄
し、固相の発光を定量する段階を含み得るイムノアッセ
イで使用することができる。
に結合した化学発光アクリジニウムエステルを開示して
おり、該Ｎ−スクシンイミジル部分を更にタンパク質又
はポリペプチドと結合し、免疫学的に反応性の発光試薬
を提供することができる。該試薬は、固相抗体、抗原分
子及び標識化抗抗体を同時に結合し、固相を分離洗浄
し、固相の発光を定量する段階を含み得るイムノアッセ
イで使用することができる。
Strasburgerらは、第２のビオチン標識抗体を介して
アビジンに結合した化学発光物質で標識され且つマイク
ロタイタープレートに固定された抗体によりhGH及びhCG
ホルモンを捕獲する２サイト化学発光イムノアッセイの
使用をEnzymology,184（1990）,481〜496頁に開示して
いる。この方法ではタンパクホルモン等の抗原性分析物
を血清サンプルから直接定量し、標準曲線と比較するこ
とができる。しかしながら、IgE等の免疫グロブリンの
濃度は患者依存性が高く、特異的IgEのアッセイを全IgE
の個体患者レベルと比較しなければならないので、Stra
sburgerらにより開示されているアッセイで得られるよ
りも広いダイナミックレンジを有するアッセイが必要で
ある。
アビジンに結合した化学発光物質で標識され且つマイク
ロタイタープレートに固定された抗体によりhGH及びhCG
ホルモンを捕獲する２サイト化学発光イムノアッセイの
使用をEnzymology,184（1990）,481〜496頁に開示して
いる。この方法ではタンパクホルモン等の抗原性分析物
を血清サンプルから直接定量し、標準曲線と比較するこ
とができる。しかしながら、IgE等の免疫グロブリンの
濃度は患者依存性が高く、特異的IgEのアッセイを全IgE
の個体患者レベルと比較しなければならないので、Stra
sburgerらにより開示されているアッセイで得られるよ
りも広いダイナミックレンジを有するアッセイが必要で
ある。
ヨーロッパ特許公開第0425217号は、常磁性粒子に結
合した第１の標識化ヌクレオチドプローブと、アビジン
−アクリジニウムエステルに結合した第２のビオチン標
識化ヌクレオチドプローブとにハイブリダイズした核酸
からなる化学発光複合体を形成するハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを開示している。しかしながら、完全に自
動化された抗体検出方法を提供するという問題に直面し
た当業者は、単一の反応容器中で好ましくは周囲反応条
件下で実施することが可能な方法を求めることになろ
う。この文献に提示されているアッセイは、特異的抗体
を誘発し得る抗原ではない特異的ヌクレオチド配列の検
出を使用しているので根本的に異なる。より詳細にはこ
のアッセイでは、ハイブリダイゼーションのための高温
と、イムノアッセイに必要でも望ましくもないハプテン
−オリゴヌクレオチドプローブとを使用することが必要
である。
合した第１の標識化ヌクレオチドプローブと、アビジン
−アクリジニウムエステルに結合した第２のビオチン標
識化ヌクレオチドプローブとにハイブリダイズした核酸
からなる化学発光複合体を形成するハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを開示している。しかしながら、完全に自
動化された抗体検出方法を提供するという問題に直面し
た当業者は、単一の反応容器中で好ましくは周囲反応条
件下で実施することが可能な方法を求めることになろ
う。この文献に提示されているアッセイは、特異的抗体
を誘発し得る抗原ではない特異的ヌクレオチド配列の検
出を使用しているので根本的に異なる。より詳細にはこ
のアッセイでは、ハイブリダイゼーションのための高温
と、イムノアッセイに必要でも望ましくもないハプテン
−オリゴヌクレオチドプローブとを使用することが必要
である。
血清等の生物体液中の免疫グロブリン（例えば特異的
免疫グロブリンＥ）のような免疫学的に活性な分子の定
量のためのイムノアッセイは現在までマニュアル（例え
ばELISA）又は半自動で行われている。半自動イムノア
ッセイ（例えば上記Magic（登録商標）Lite SQ（商
標）特異的IgEアッセイ）の典型的な所要時間は約２時
間である。
免疫グロブリンＥ）のような免疫学的に活性な分子の定
量のためのイムノアッセイは現在までマニュアル（例え
ばELISA）又は半自動で行われている。半自動イムノア
ッセイ（例えば上記Magic（登録商標）Lite SQ（商
標）特異的IgEアッセイ）の典型的な所要時間は約２時
間である。
更に、市販の特異的IgEアッセイ（Pharmacia,Uppsala
により市販されているCAP,RAST）及びMagic（登録商
標）Lite SQ（商標）特異的IgEアッセイは別のプロト
コルを有する全IgEリファレンスアッセイを使用するの
でデータが不正確である。同一の捕獲及び検出手順を使
用するアッセイのみが直接比較可能である。例えば、特
異的IgEの全近接応答曲線は全IgE応答曲線に平行でなけ
ればならない。その理由は、特異的（又は全？）IgEア
ッセイに必要なダイナミックレンジは２ディケードであ
り、全IgEアッセイに必要なダイナミックレンジは２〜
７ディケードであり、既存のイムノアッセイでは全範囲
に亙って濃度を測定することができないからである。従
って従来は、特異的免疫グロブリンアッセイと全免疫グ
ロブリンアッセイで試薬が異なる場合には異なるプロト
コルを使用することが必要であった。
により市販されているCAP,RAST）及びMagic（登録商
標）Lite SQ（商標）特異的IgEアッセイは別のプロト
コルを有する全IgEリファレンスアッセイを使用するの
でデータが不正確である。同一の捕獲及び検出手順を使
用するアッセイのみが直接比較可能である。例えば、特
異的IgEの全近接応答曲線は全IgE応答曲線に平行でなけ
ればならない。その理由は、特異的（又は全？）IgEア
ッセイに必要なダイナミックレンジは２ディケードであ
り、全IgEアッセイに必要なダイナミックレンジは２〜
７ディケードであり、既存のイムノアッセイでは全範囲
に亙って濃度を測定することができないからである。従
って従来は、特異的免疫グロブリンアッセイと全免疫グ
ロブリンアッセイで試薬が異なる場合には異なるプロト
コルを使用することが必要であった。
安全な実験室手順に関心が高まっていることから、生
物体液（例えばヒト血清、血漿、血液、乳汁、尿又は唾
液等）中で抗体等の物質を完全に自動的に検出し、危険
な流体との接触の危険を最小限にする方法が必要になっ
ている。また、診断法における実験室試験の使用が増加
しているため、所要時間が短く、好ましくは数分間しか
要さない方法が必要になっている。
物体液（例えばヒト血清、血漿、血液、乳汁、尿又は唾
液等）中で抗体等の物質を完全に自動的に検出し、危険
な流体との接触の危険を最小限にする方法が必要になっ
ている。また、診断法における実験室試験の使用が増加
しているため、所要時間が短く、好ましくは数分間しか
要さない方法が必要になっている。
従って、本発明の目的は安全、迅速且つ完全に自動化
可能な、サンプル中の抗体の検出方法を提供することで
ある。
可能な、サンプル中の抗体の検出方法を提供することで
ある。
この目的は、 ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗原、抗体又はハプテン；常磁性粒子に結合した被検出
抗体に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトア
ビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリ
ジニウム化合物をサンプルと混合し、固相結合複合体を
形成し、 ｂ）固相を液相から磁気的に分離し、 ｃ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複
合体が存在するか否かを分析し、化学発光の存在が検出
された場合には前記サンプル中に前記抗体が存在すると
判断する ことを特徴とする本発明の方法により達せられる。
抗原、抗体又はハプテン；常磁性粒子に結合した被検出
抗体に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトア
ビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリ
ジニウム化合物をサンプルと混合し、固相結合複合体を
形成し、 ｂ）固相を液相から磁気的に分離し、 ｃ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複
合体が存在するか否かを分析し、化学発光の存在が検出
された場合には前記サンプル中に前記抗体が存在すると
判断する ことを特徴とする本発明の方法により達せられる。
本発明の方法は上記段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に
より実施することができるが、標識用化合物を別段階で
加えたほうが好ましく、該方法は好ましくは、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗原、抗体又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被検
出抗体に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１
の固相複合体を形成する段階と、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加
え、第２の固相複合体を形成する段階と、 iii）固相を液相から磁気的に分離する段階と、 iv）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複
合体が存在するか否かを分析する段階と に従って実施される。
より実施することができるが、標識用化合物を別段階で
加えたほうが好ましく、該方法は好ましくは、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗原、抗体又はハプテンを、常磁性粒子に結合した被検
出抗体に対して向性の抗体及びサンプルと混合し、第１
の固相複合体を形成する段階と、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加
え、第２の固相複合体を形成する段階と、 iii）固相を液相から磁気的に分離する段階と、 iv）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複
合体が存在するか否かを分析する段階と に従って実施される。
本発明の特定の目的は、同一プロトコルを使用する真
にパラレルなリファレンスイムノアッセイをリファレン
スとして使用して、免疫グロブリン等の特異的抗体を定
量するための完全に自動化可能なイムノアッセイを提供
することである。
にパラレルなリファレンスイムノアッセイをリファレン
スとして使用して、免疫グロブリン等の特異的抗体を定
量するための完全に自動化可能なイムノアッセイを提供
することである。
真にパラレルなリファレンスイムノアッセイを使用し
て特異的抗体を定量するという目的は、液体サンプル中
の特異的抗体の濃度及び／又は相対含有量を測定する方
法により達せられ、該方法によると、化学発光ラベルに
結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値
と、前記特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総
含有量を測定するパラレルなリファレンスイムノアッセ
イで得られた発光測定値とを比較し、該方法は、 ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特
異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常
磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の
抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能
的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサ
ンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、 ｂ）前記第１の固相を液相から磁気的に分離する段階
と、 ｃ）化学発光反応を開始し、分離した第１の固相の発光
を測定する段階と、 ｄ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特
異的抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒
子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の
抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能
的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサ
ンプルと混合し、第２の固相複合体を形成する段階と、 ｅ）前記第２の固相を液相から磁気的に分離する段階
と、 ｆ）化学発光反応を開始し、分離した第２の固相発光を
測定する段階と、 ｇ）第１の分離固相の発光を第２の分離固相の発光と比
較する段階と を含む。
て特異的抗体を定量するという目的は、液体サンプル中
の特異的抗体の濃度及び／又は相対含有量を測定する方
法により達せられ、該方法によると、化学発光ラベルに
結合した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値
と、前記特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総
含有量を測定するパラレルなリファレンスイムノアッセ
イで得られた発光測定値とを比較し、該方法は、 ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特
異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常
磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の
抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能
的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサ
ンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、 ｂ）前記第１の固相を液相から磁気的に分離する段階
と、 ｃ）化学発光反応を開始し、分離した第１の固相の発光
を測定する段階と、 ｄ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特
異的抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒
子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の
抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能
的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサ
ンプルと混合し、第２の固相複合体を形成する段階と、 ｅ）前記第２の固相を液相から磁気的に分離する段階
と、 ｆ）化学発光反応を開始し、分離した第２の固相発光を
測定する段階と、 ｇ）第１の分離固相の発光を第２の分離固相の発光と比
較する段階と を含む。
上記方法の好適態様において段階ａ）は、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した抗体及びサ
ンプルと混合し、固相複合体を形成し、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前
記第１の固相複合体を形成する ことにより実施され、 段階ｄ）は、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗体を、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合
し、固相複合体を形成し、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加
え、前記第２の固相複合体を形成する ことにより実施される。
抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した抗体及びサ
ンプルと混合し、固相複合体を形成し、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前
記第１の固相複合体を形成する ことにより実施され、 段階ｄ）は、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗体を、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合
し、固相複合体を形成し、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加
え、前記第２の固相複合体を形成する ことにより実施される。
サンプル中の被測定特異的抗体は好ましくは、IgA、I
gD、IgE、IgG、IgM及びそのアイソタイプからなる群か
ら選択される特定免疫グロブリンであり、前記抗体の可
変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテンは
好ましくはアレルゲンであり、抗体クラスは好ましくは
全IgA、全IgD、全IgE、全IgG、全IgM及びそのアイソタ
イプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスで
あり、リガンド抗原、抗体又はハプテンは前記免疫グロ
ブリンクラスに対して向性の抗体である。
gD、IgE、IgG、IgM及びそのアイソタイプからなる群か
ら選択される特定免疫グロブリンであり、前記抗体の可
変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテンは
好ましくはアレルゲンであり、抗体クラスは好ましくは
全IgA、全IgD、全IgE、全IgG、全IgM及びそのアイソタ
イプからなる群から選択される免疫グロブリンクラスで
あり、リガンド抗原、抗体又はハプテンは前記免疫グロ
ブリンクラスに対して向性の抗体である。
より好ましくは、特異的免疫グロブリンは特異的IgE
であり、抗体クラスは全IgEである。
であり、抗体クラスは全IgEである。
常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して向性の抗体
は好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群
から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫
グロブリンである。
は好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群
から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫
グロブリンである。
本発明の利点を以下に述べる。
−全試薬を１つの反応容器で同時に混合することができ
るので、汚染の危険、過誤及び操作段階を最小限にし、
イムノアッセイの所要時間を大幅に短縮し、プロセスの
自動化を著しく助長すると共に、精度を改善する（実施
例６参照）。
るので、汚染の危険、過誤及び操作段階を最小限にし、
イムノアッセイの所要時間を大幅に短縮し、プロセスの
自動化を著しく助長すると共に、精度を改善する（実施
例６参照）。
−同一プロトコルを使用する真にパラレルな完全抗体ア
ッセイを参照して例えば血清サンプル中の特異的抗体の
定量を実施することができる（実施例３参照）。
ッセイを参照して例えば血清サンプル中の特異的抗体の
定量を実施することができる（実施例３参照）。
−高い能力及び感度が得られるため、非常に低濃度の免
疫グロブリン及び低濃度の特異免疫グロブリンを容易に
検出することができる（実施例１、２及び７参照）。
疫グロブリン及び低濃度の特異免疫グロブリンを容易に
検出することができる（実施例１、２及び７参照）。
本発明の好適態様は、サンプ（例えば血清又は唾液）
中の抗体、例えば特異的免疫グロブリン（IgA、IgE、Ig
G、IgM及びそのアイソタイプ）の検出のためのイムノア
ッセイである。
中の抗体、例えば特異的免疫グロブリン（IgA、IgE、Ig
G、IgM及びそのアイソタイプ）の検出のためのイムノア
ッセイである。
特に、本発明はサンプル中の特異的IgEの検出及び定
量のためのアッセイで使用することができる。サンプル
が液体、例えば血清又は血漿である場合には、好ましく
は懸濁常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗Ig
E抗体とビオチンに結合した特異的アレルゲン（リガン
ド）とを水性媒体中に含む反応容器にサンプルを直接加
えることができる。ビオチンは好ましくはビオチンアミ
ドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（Sigmaカタログ番号B2643）である。サンプルが非液体
（例えば組織サンプル）である場合には、均質化して水
性液体に懸濁するのが好ましい。サンプル中の特異的Ig
E、アレルゲン及びモノクローナル抗IgE抗体が水性媒体
中で同時に反応する結果、共役体が形成される。化学発
光標識用化合物、好ましくはストレプトアビジンに結合
したアクリジニウムエステル（Sigmaカタログ番号S476
2）（アビジン−DMAE）を反応容器に加え、共役体に結
合したビオチン及び共役しなかったアレルゲン結合ビオ
チンとアビジン−DMAEとの結合反応を生じる。反応混合
物を磁気的に分離し、上清をデカントすることにより、
共役体に結合したラベルを結合しなかったDMAE標識化抗
体から分離する。分離した共役体の化学発光は、Pazzag
li,M.ら（編）,Studies and applications in “Bi
ology ＆ Medicine",Journal of Bioluminescence
and Chemiluminescense ４（１）,1−646,1989に記
載されているように測定する。
量のためのアッセイで使用することができる。サンプル
が液体、例えば血清又は血漿である場合には、好ましく
は懸濁常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗Ig
E抗体とビオチンに結合した特異的アレルゲン（リガン
ド）とを水性媒体中に含む反応容器にサンプルを直接加
えることができる。ビオチンは好ましくはビオチンアミ
ドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（Sigmaカタログ番号B2643）である。サンプルが非液体
（例えば組織サンプル）である場合には、均質化して水
性液体に懸濁するのが好ましい。サンプル中の特異的Ig
E、アレルゲン及びモノクローナル抗IgE抗体が水性媒体
中で同時に反応する結果、共役体が形成される。化学発
光標識用化合物、好ましくはストレプトアビジンに結合
したアクリジニウムエステル（Sigmaカタログ番号S476
2）（アビジン−DMAE）を反応容器に加え、共役体に結
合したビオチン及び共役しなかったアレルゲン結合ビオ
チンとアビジン−DMAEとの結合反応を生じる。反応混合
物を磁気的に分離し、上清をデカントすることにより、
共役体に結合したラベルを結合しなかったDMAE標識化抗
体から分離する。分離した共役体の化学発光は、Pazzag
li,M.ら（編）,Studies and applications in “Bi
ology ＆ Medicine",Journal of Bioluminescence
and Chemiluminescense ４（１）,1−646,1989に記
載されているように測定する。
リファレンスとして、好ましくはビオチンに結合した
ポリクローナル抗IgE抗体をリガンドとして使用する点
のみが異なる真にパラレルな全IgEイムノアッセイを同
時に実施する。
ポリクローナル抗IgE抗体をリガンドとして使用する点
のみが異なる真にパラレルな全IgEイムノアッセイを同
時に実施する。
図１は本発明の特異的IgEアッセイとパラレルな全IgE
リファレンスアッセイを併記した説明図である。図中、
（１）は被検出特異的IgE抗体を示し、（２）はビオチ
ンに結合した特異的アレルゲンであり、（３）は常磁性
粒子に結合したモノクローナルマウス抗IgEであり、
（４）はアビジン−アクリジニウムエステルであり、
（５）は（１）、（２）、（３）及び（４）の間で形成
された固相標識化複合体を示し、任意インキュベーショ
ン、分離及び任意洗浄段階を含み、（６）は化学発光反
応を開始し、発光を測定する最終段階を示す。
リファレンスアッセイを併記した説明図である。図中、
（１）は被検出特異的IgE抗体を示し、（２）はビオチ
ンに結合した特異的アレルゲンであり、（３）は常磁性
粒子に結合したモノクローナルマウス抗IgEであり、
（４）はアビジン−アクリジニウムエステルであり、
（５）は（１）、（２）、（３）及び（４）の間で形成
された固相標識化複合体を示し、任意インキュベーショ
ン、分離及び任意洗浄段階を含み、（６）は化学発光反
応を開始し、発光を測定する最終段階を示す。
図１の全IgEリファレンスアッセイにおいて、（７）
はIgE（WHO 75/502 IU/ml）を示し、（８）はビオチ
ンに結合したポリクローナル抗IgEであり、（９）は懸
濁常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗IgEで
あり、（10）はアビジン−アクリジニウムエステルであ
り、（11）は（７）、（８）、（９）及び（10）の間で
形成された固相標識化複合体を示し、任意インキュベー
ション、分離及び任意洗浄段階を含み、（12）は化学発
光反応を開始し、発光を測定する最終段階である。
はIgE（WHO 75/502 IU/ml）を示し、（８）はビオチ
ンに結合したポリクローナル抗IgEであり、（９）は懸
濁常磁性粒子に結合したモノクローナルマウス抗IgEで
あり、（10）はアビジン−アクリジニウムエステルであ
り、（11）は（７）、（８）、（９）及び（10）の間で
形成された固相標識化複合体を示し、任意インキュベー
ション、分離及び任意洗浄段階を含み、（12）は化学発
光反応を開始し、発光を測定する最終段階である。
より詳細には、本発明の方法を使用するイムノアッセ
イは、Ciba Corning Diagnostics Corp.（Medfield,
Mass.,U.S.A.）製品ACS:180完全自動アナライザーで実
施することができる。
イは、Ciba Corning Diagnostics Corp.（Medfield,
Mass.,U.S.A.）製品ACS:180完全自動アナライザーで実
施することができる。
本発明の一好適態様において、検出すべき免疫学的に
活性な物質は例えばペニシリン又はその誘導体（例えば
ベンジルペニシリン、ペニシロイル等）に対する抗体で
あり、ビオチンに結合したリガンドはハプテン（倒えば
ペニシリン又はその誘導体）である。
活性な物質は例えばペニシリン又はその誘導体（例えば
ベンジルペニシリン、ペニシロイル等）に対する抗体で
あり、ビオチンに結合したリガンドはハプテン（倒えば
ペニシリン又はその誘導体）である。
定義 本発明の方法において、検出すべき抗体は特異的免疫
グロブリン、好ましくは特異的IgA、IgD、IgE、IgG、Ig
M及びそのアイソタイプであり、より好ましくは特異的I
gE、又は、例えば好ましくは全IgA、全IgD、全IgE、全I
gG、全IgM及びそのアイソタイプからなる群から選択さ
れる免疫グロブリン等の抗体クラス、最適には全IgEで
ある。
グロブリン、好ましくは特異的IgA、IgD、IgE、IgG、Ig
M及びそのアイソタイプであり、より好ましくは特異的I
gE、又は、例えば好ましくは全IgA、全IgD、全IgE、全I
gG、全IgM及びそのアイソタイプからなる群から選択さ
れる免疫グロブリン等の抗体クラス、最適には全IgEで
ある。
サンプルなる用語は、液体又は液化サンプルを意味
し、溶液、エマルジョン、分散液及び懸濁液を含む。
し、溶液、エマルジョン、分散液及び懸濁液を含む。
ビオチンに結合したリガンド抗原、抗体又はハプテン
は任意の免疫学的に活性な物質であり、例えばアレルゲ
ン、抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体（組換え抗体又は抗体フラグメントを含む）であ
り、好ましくはアレルゲン及び／又はポリクローナル抗
免疫グロブリン（例えばVentrex Laboratories,Inc.
（Portland,Maine）からカタログ番号77660で市販され
ているヤギ抗ヒトポリクローナル血清）である。リファ
レンスイムノアッセイにおいて、前記抗体は好ましくは
測定すべき抗体クラスの不変部に対して向性、即ちIgE
抗体に対して向性の抗体である。
は任意の免疫学的に活性な物質であり、例えばアレルゲ
ン、抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体（組換え抗体又は抗体フラグメントを含む）であ
り、好ましくはアレルゲン及び／又はポリクローナル抗
免疫グロブリン（例えばVentrex Laboratories,Inc.
（Portland,Maine）からカタログ番号77660で市販され
ているヤギ抗ヒトポリクローナル血清）である。リファ
レンスイムノアッセイにおいて、前記抗体は好ましくは
測定すべき抗体クラスの不変部に対して向性、即ちIgE
抗体に対して向性の抗体である。
生物体液なる用語は、血液、血漿、血清、尿又は唾液
等の任意の臨床サンプルを意味し、更に、生物体内で排
泄、分泌又は輸送される任意の生物体液を含む。
等の任意の臨床サンプルを意味し、更に、生物体内で排
泄、分泌又は輸送される任意の生物体液を含む。
常磁性粒子（PMP）なる用語は、液体媒体に分散又は
懸濁可能な粒子を意味する。全実施例でMagnetics In
c.（Cambridge,Massachusetts）から市販されているBio
Mag粒子（アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子）を使
用した。PMPに結合した抗体は好ましくは検出又は測定
すべき抗体の不変部に対して向性であり、ポリクローナ
ル抗体でもモノクローナル抗体（組換え抗体又は抗体フ
ラグメントを含む）でもよく、好ましくはBioInvent I
nternational AB（Lund,Sweden）から市販されている
モノクローナル抗体MAb Ａ 5697−1A3（920325）であ
る。
懸濁可能な粒子を意味する。全実施例でMagnetics In
c.（Cambridge,Massachusetts）から市販されているBio
Mag粒子（アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子）を使
用した。PMPに結合した抗体は好ましくは検出又は測定
すべき抗体の不変部に対して向性であり、ポリクローナ
ル抗体でもモノクローナル抗体（組換え抗体又は抗体フ
ラグメントを含む）でもよく、好ましくはBioInvent I
nternational AB（Lund,Sweden）から市販されている
モノクローナル抗体MAb Ａ 5697−1A3（920325）であ
る。
化学発光アクリジニウム化合物は好ましくはアビジン
又はストレプトアビジンに共有結合したＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドジメチルアクリジニウムエステル（アビ
ジン−DMAE）である。アビジンとDMAEの結合はWeeksら,
Clin.Chem.29/8,1474−1479（1983）の方法に従って実
施される。アビジン又はストレプトアビジンに結合可能
な他の発光標識化合物（例えばルミノール、ルシゲニン
又はロフィン）も本発明で使用し得る。
又はストレプトアビジンに共有結合したＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドジメチルアクリジニウムエステル（アビ
ジン−DMAE）である。アビジンとDMAEの結合はWeeksら,
Clin.Chem.29/8,1474−1479（1983）の方法に従って実
施される。アビジン又はストレプトアビジンに結合可能
な他の発光標識化合物（例えばルミノール、ルシゲニン
又はロフィン）も本発明で使用し得る。
ビオチン化抗体の調製 ビオチン化抗IgE及びチモシー（Phleum pratense）： ミエローマIgE（OEM concept,USA）をリガンドとし
て使用してCNBr活性化セファロース4B（Pharmacia,Upps
ala,Sweden）上でアフィニティークロマトグラフィーに
よりヤギ抗ヒトポリクローナル血清（Ventrex Laborab
ories,Inc.MA,USA）を精製した。抗IgEをビオチン：抗I
gEモル比＝41:1でビオチン化した。
て使用してCNBr活性化セファロース4B（Pharmacia,Upps
ala,Sweden）上でアフィニティークロマトグラフィーに
よりヤギ抗ヒトポリクローナル血清（Ventrex Laborab
ories,Inc.MA,USA）を精製した。抗IgEをビオチン：抗I
gEモル比＝41:1でビオチン化した。
ジメチルホルムアミド（Merck）中25mg/mlのビオチン
（ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（Sigma））９μｌを0.1M NaHCO3（Mer
ck）中4.5mg/mlの抗IgE 0.4mlに加えた。試薬を「エン
ドオーバーエンド」混合機で25℃で２時間インキュベー
トした。リジン（Sigma）の20mg/ml NaHCO3溶液0.9ml
を加えた。溶液を濾過し、ビオチン化抗体をsuperdex
75 Hiload 16/60（Pharmacia,Uppsala,Sweden）上で
サイズクロマトグラフィーにより精製した。プールした
フラクションを、0.1％ヒト血清アルブミン（Sigma）、
0.1％NaN3（Sigma）を含有するリン酸緩衝液PBS（pH7.
2）で希釈した。
（ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（Sigma））９μｌを0.1M NaHCO3（Mer
ck）中4.5mg/mlの抗IgE 0.4mlに加えた。試薬を「エン
ドオーバーエンド」混合機で25℃で２時間インキュベー
トした。リジン（Sigma）の20mg/ml NaHCO3溶液0.9ml
を加えた。溶液を濾過し、ビオチン化抗体をsuperdex
75 Hiload 16/60（Pharmacia,Uppsala,Sweden）上で
サイズクロマトグラフィーにより精製した。プールした
フラクションを、0.1％ヒト血清アルブミン（Sigma）、
0.1％NaN3（Sigma）を含有するリン酸緩衝液PBS（pH7.
2）で希釈した。
チモシー抽出物（ALK Laboratories A/S,Hrshol
m,Denmark）を10:1のモル比でビオチン化し、10mg/mlビ
オチンの0.65mlを0.1M NaHCO3中10mg/mlチモシー0.43m
lに加えた。試薬を「エンドオーバーエンド」混合機で2
5℃で２時間インキュベートし、インキュベーション
後、50mg/mlリジン（Sigma）溶液40μｌを加えた。溶液
を濾過し、ビオチン化抗体をsuperdex 75 Hiload 16
/60（Pharmacia）上でサイズ排除クロマトグラフィーに
より過剰のビオチンから精製した。アレルゲンを含有す
るフラクションをプールした。0.1％ヒト血清アルブミ
ン（Sigma）及び0.1％NaN3（Sigma）を含有するPBS（pH
7.2）でビオチン化チモシーを希釈した。
m,Denmark）を10:1のモル比でビオチン化し、10mg/mlビ
オチンの0.65mlを0.1M NaHCO3中10mg/mlチモシー0.43m
lに加えた。試薬を「エンドオーバーエンド」混合機で2
5℃で２時間インキュベートし、インキュベーション
後、50mg/mlリジン（Sigma）溶液40μｌを加えた。溶液
を濾過し、ビオチン化抗体をsuperdex 75 Hiload 16
/60（Pharmacia）上でサイズ排除クロマトグラフィーに
より過剰のビオチンから精製した。アレルゲンを含有す
るフラクションをプールした。0.1％ヒト血清アルブミ
ン（Sigma）及び0.1％NaN3（Sigma）を含有するPBS（pH
7.2）でビオチン化チモシーを希釈した。
ストレプトアビジン−アクリジニウムエステルラベルの
調製： Weeksら,Clin.Chem.29/8,1474−1479（1983）の方法
を使用してストレプトアビジンをDMAE−NHS［２′,6′
−ジメチル−４′−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカル
ボニル）フェニル−10−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボキシレートメトスルフェート］と共役した。
調製： Weeksら,Clin.Chem.29/8,1474−1479（1983）の方法
を使用してストレプトアビジンをDMAE−NHS［２′,6′
−ジメチル−４′−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカル
ボニル）フェニル−10−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボキシレートメトスルフェート］と共役した。
ストレプトアビジン−アクリジニウムエステルラベルの
調製： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウ
ムエステルDMAE（Ciba Corning Diagnostics Corp.,
Medfield,MA,USA）0.96mgをジメチルホルムアミド1.92m
lで希釈した。この溶液250μｌを0.1Mリン酸二水素ナト
リウム、0.15M NaCl（pH8.15）中の1mg/mlストレプト
アビジン（Sigma）2.5mlにピペットで移した。
調製： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジニウ
ムエステルDMAE（Ciba Corning Diagnostics Corp.,
Medfield,MA,USA）0.96mgをジメチルホルムアミド1.92m
lで希釈した。この溶液250μｌを0.1Mリン酸二水素ナト
リウム、0.15M NaCl（pH8.15）中の1mg/mlストレプト
アビジン（Sigma）2.5mlにピペットで移した。
バイアル中の溶液の上方の空気を窒素（AGA）と交換
した。試薬を30分間25℃で撹拌下にインキュベートし、
インキュベーション後、10mg/mlリジン、0.1Mリン酸二
水素ナトリウム（Merck）、0.15M NaCl（Merck）（pH
8.15）2250μｌを加えた。結合しなかったDMAEを除去す
るために、溶液をPD−10カラム（Pharmacia,Uppsala,Sw
eden）に充填した。溶出液を集め、セルロースMinitan
−Ｓ濾紙10.000NMWL（Millipore）を使用して限外濾過
により精製した。濾過はリン酸緩衝液PBS（pH7.2）1.5
リットルで実施した。濾渣を25mlまで濃縮し、0.5％HSA
（Sigma）及び0.1％NaN3（Sigma）を含有するPBS（pH7.
2）25mlを加えた。
した。試薬を30分間25℃で撹拌下にインキュベートし、
インキュベーション後、10mg/mlリジン、0.1Mリン酸二
水素ナトリウム（Merck）、0.15M NaCl（Merck）（pH
8.15）2250μｌを加えた。結合しなかったDMAEを除去す
るために、溶液をPD−10カラム（Pharmacia,Uppsala,Sw
eden）に充填した。溶出液を集め、セルロースMinitan
−Ｓ濾紙10.000NMWL（Millipore）を使用して限外濾過
により精製した。濾過はリン酸緩衝液PBS（pH7.2）1.5
リットルで実施した。濾渣を25mlまで濃縮し、0.5％HSA
（Sigma）及び0.1％NaN3（Sigma）を含有するPBS（pH7.
2）25mlを加えた。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
常磁性粒子への抗体の固定： 磁気分離を使用して常磁性粒子（Ciba Corning Dia
gnostics Corp.,MA,USA）6.5をメタノール（Merck）65
0mlで３回洗浄した。0.01M酢酸緩衝液（pH5.5）650mlで
２回洗浄した。粒子を6.25％グルタルアルデヒド（Merc
k）、0.01M酢酸緩衝液（pH5.5）で25℃で３時間活性化
した。粒子を0.01M酢酸緩衝液（pH5.5）650mlで３回洗
浄した。粒子をIgE Fcドメインに対して特異的なモノ
クローナル抗IgE抗体（ALK Laboratories,Hrsholm,D
enmark）1083mgと25℃で24時間結合した。粒子を0.01M
酢酸緩衝液（pH5.5）で２回洗浄した。10％IgEをストリ
ップした血清（ALK Laboratories,Hrsholm,Denmar
k）200mlで過剰の活性基を25℃で24時間ブロックした。
粒子を0.01Mリン酸緩衝液（Merck）650mlで洗浄した
後、1M NaCl（Merck）650mlで３回洗浄した。粒子を0.
01Mリン酸緩衝液で３回洗浄した。0.1％w/vウシ血清ア
ルブミン（Sigma）、0.001％ウシγグロブリン（Sigm
a）を含有するPBS（pH7.2）650mlに粒子を再懸濁し、18
時間50℃で熱処理した。0.1％w/vウシ血清アルブミン
（Sigma）、0.001％ウシγグロブリン（Sigma）を含有
するPBS（pH7.2）650mlで粒子を３回洗浄した。粒子を3
7℃で７日間熱処理した。粒子を0.01Mリン酸緩衝液で２
回洗浄した。0.5％ヒト血清アルブミン（Sigma）を含有
するPBS（pH7.2）で粒子を0.5g/まで希釈した。
gnostics Corp.,MA,USA）6.5をメタノール（Merck）65
0mlで３回洗浄した。0.01M酢酸緩衝液（pH5.5）650mlで
２回洗浄した。粒子を6.25％グルタルアルデヒド（Merc
k）、0.01M酢酸緩衝液（pH5.5）で25℃で３時間活性化
した。粒子を0.01M酢酸緩衝液（pH5.5）650mlで３回洗
浄した。粒子をIgE Fcドメインに対して特異的なモノ
クローナル抗IgE抗体（ALK Laboratories,Hrsholm,D
enmark）1083mgと25℃で24時間結合した。粒子を0.01M
酢酸緩衝液（pH5.5）で２回洗浄した。10％IgEをストリ
ップした血清（ALK Laboratories,Hrsholm,Denmar
k）200mlで過剰の活性基を25℃で24時間ブロックした。
粒子を0.01Mリン酸緩衝液（Merck）650mlで洗浄した
後、1M NaCl（Merck）650mlで３回洗浄した。粒子を0.
01Mリン酸緩衝液で３回洗浄した。0.1％w/vウシ血清ア
ルブミン（Sigma）、0.001％ウシγグロブリン（Sigm
a）を含有するPBS（pH7.2）650mlに粒子を再懸濁し、18
時間50℃で熱処理した。0.1％w/vウシ血清アルブミン
（Sigma）、0.001％ウシγグロブリン（Sigma）を含有
するPBS（pH7.2）650mlで粒子を３回洗浄した。粒子を3
7℃で７日間熱処理した。粒子を0.01Mリン酸緩衝液で２
回洗浄した。0.5％ヒト血清アルブミン（Sigma）を含有
するPBS（pH7.2）で粒子を0.5g/まで希釈した。
実施例１ 抗原（全IgE）の検出及び定量 Clinical Chemistry,36/9,1598−1602（1990）に記
載されているCiba Corning ACS:180 Benchtop Immu
noassayアナライザーで以下のプロトコルを使用して本
発明による全IgE抗体の定量を実施した。
載されているCiba Corning ACS:180 Benchtop Immu
noassayアナライザーで以下のプロトコルを使用して本
発明による全IgE抗体の定量を実施した。
サンプル50μｌ及びビオチン化抗IgE50μｌをサンプ
ルプローブによりキュベットに分配した。キュベットが
第１の試薬プローブR1に達したら、IgE Fcドメインに
対して特異的なモノクローナル抗IgE抗体（ALK Labora
tories A/S,Hrsholm,Denmark）を固定した常磁性粒
子100μｌをストレプトアビジン−アクリジニウムエス
テルラベル（ALK Laboratories A/S,Hrsholm,Denma
rk）200μｌと共に分配した。キュベットは磁石及び洗
浄ステーションまで行路を降下した。脱イオン水750μ
ｌで２回洗浄した。洗浄サイクルの完了後、粒子を0.1M
HNO3中0.5g/ H2O2 300μｌに再懸濁した。キュベ
ットが光度計チャンバーに入ったら、フォトマルチプラ
イヤーの前で25mM NaOH溶液300μｌを加え、発光の光
子を測定及び定量し、相対光単位（RUL）として表し
た。RULの量はサンプル中のIgEの量に正比例する。サン
プル分配から最初の測定までの時間は15分間とし、20秒
毎に測定した。結果をRUL実験/RULバックグラウンド
（ここでRULバックグラウンドは全IgEの不在下で観察さ
れた化学発光反応である）として表した。
ルプローブによりキュベットに分配した。キュベットが
第１の試薬プローブR1に達したら、IgE Fcドメインに
対して特異的なモノクローナル抗IgE抗体（ALK Labora
tories A/S,Hrsholm,Denmark）を固定した常磁性粒
子100μｌをストレプトアビジン−アクリジニウムエス
テルラベル（ALK Laboratories A/S,Hrsholm,Denma
rk）200μｌと共に分配した。キュベットは磁石及び洗
浄ステーションまで行路を降下した。脱イオン水750μ
ｌで２回洗浄した。洗浄サイクルの完了後、粒子を0.1M
HNO3中0.5g/ H2O2 300μｌに再懸濁した。キュベ
ットが光度計チャンバーに入ったら、フォトマルチプラ
イヤーの前で25mM NaOH溶液300μｌを加え、発光の光
子を測定及び定量し、相対光単位（RUL）として表し
た。RULの量はサンプル中のIgEの量に正比例する。サン
プル分配から最初の測定までの時間は15分間とし、20秒
毎に測定した。結果をRUL実験/RULバックグラウンド
（ここでRULバックグラウンドは全IgEの不在下で観察さ
れた化学発光反応である）として表した。
Magic Lite Total IgE Kit（ALK Laboratories
A/S,Hrsholm,Denmark）でヒト血清IgEのWHO 2nd
IRP No.75/502に対して較正した９個の全IgE標準を上
記プロトコルでアッセイした処、全血清IgE0.1IU/ml
（バックグラウンド×10標準偏差により決定）を検出で
きることが判明した（図２参照）。
A/S,Hrsholm,Denmark）でヒト血清IgEのWHO 2nd
IRP No.75/502に対して較正した９個の全IgE標準を上
記プロトコルでアッセイした処、全血清IgE0.1IU/ml
（バックグラウンド×10標準偏差により決定）を検出で
きることが判明した（図２参照）。
実施例２ 特異的抗体（特異的IgE）の検出及び定量 Clinical Chemistry,36/9,1598−1602（1990）に記
載されているCiba Corning ACS:180 Benchtop Immu
noassayアナライザーで以下のプロトコルを使用して本
発明によるチモシー特異的IgE抗体（チモシー特異的Ig
E）の定量を実施した。
載されているCiba Corning ACS:180 Benchtop Immu
noassayアナライザーで以下のプロトコルを使用して本
発明によるチモシー特異的IgE抗体（チモシー特異的Ig
E）の定量を実施した。
サンプル50μｌ及びビオチン化チモシー50μｌをサン
プルプローブによりキュベットに分配した。キュベット
が第１の試薬プローブR1に達したら、IgE Fcドメイン
に対して特異的なモノクローナル抗IgE抗体（ALK Labo
ratories A/S,Hrsholm,Denmark）を固定した常磁性
粒子100μｌをストレプトアビジン−アクリジニウムエ
ステルラベル（ALK Laboratories A/S,Hrsholm,Den
mark）200μｌと共に分配した。キュベットは磁石及び
洗浄ステーションまで行路を降下した。脱イオン水750
μｌで２回洗浄した。洗浄サイクルの完了後、粒子を0.
1M HNO3中0.5g/ H2O2 300μｌに再懸濁した。キュ
ベットが光度計チャンバーに入ったら、フォトマルチプ
ライヤーの前で25Mm NaOH溶液300μｌを加え、発光の
光子を測定及び定量し、相対光単位（RUL）として表し
た。RULの量はサンプル中のIgEの量に正比例する。サン
プル分配から最初の測定までの時間は15分間とし、20秒
毎に測定した。結果をRUL実験/RULバックグラウンド
（ここでRULバックグラウンドは全IgEの不在下で観察さ
れた化学発光反応である）として表した。
プルプローブによりキュベットに分配した。キュベット
が第１の試薬プローブR1に達したら、IgE Fcドメイン
に対して特異的なモノクローナル抗IgE抗体（ALK Labo
ratories A/S,Hrsholm,Denmark）を固定した常磁性
粒子100μｌをストレプトアビジン−アクリジニウムエ
ステルラベル（ALK Laboratories A/S,Hrsholm,Den
mark）200μｌと共に分配した。キュベットは磁石及び
洗浄ステーションまで行路を降下した。脱イオン水750
μｌで２回洗浄した。洗浄サイクルの完了後、粒子を0.
1M HNO3中0.5g/ H2O2 300μｌに再懸濁した。キュ
ベットが光度計チャンバーに入ったら、フォトマルチプ
ライヤーの前で25Mm NaOH溶液300μｌを加え、発光の
光子を測定及び定量し、相対光単位（RUL）として表し
た。RULの量はサンプル中のIgEの量に正比例する。サン
プル分配から最初の測定までの時間は15分間とし、20秒
毎に測定した。結果をRUL実験/RULバックグラウンド
（ここでRULバックグラウンドは全IgEの不在下で観察さ
れた化学発光反応である）として表した。
臨床的に特徴付けられたチモシーアレルギー患者サン
プルに対してMagic Lite SQ Specific IgE Kit（A
LK Laboratories A/S,Hrsholm,Denmark）で較正し
たチモシー特異的IgE標準を上記プロトコルに従ってア
ッセイした処、1.43〜800標準単位（SU）/mlのチモシー
特異的IgEをMagic Lite SQ Specific IgEアッセイ
で検出できることが判明した（図３参照）。
プルに対してMagic Lite SQ Specific IgE Kit（A
LK Laboratories A/S,Hrsholm,Denmark）で較正し
たチモシー特異的IgE標準を上記プロトコルに従ってア
ッセイした処、1.43〜800標準単位（SU）/mlのチモシー
特異的IgEをMagic Lite SQ Specific IgEアッセイ
で検出できることが判明した（図３参照）。
実施例３ WHO全IgEリファレンスに対する特異的IgEの定量 夫々実施例１及び２に記載したと同一のアッセイプロ
トコルを使用して全IgE抗体又は特異的IgE抗体について
血清サンプル中の特異的IgE抗体の定量を実施した。
トコルを使用して全IgE抗体又は特異的IgE抗体について
血清サンプル中の特異的IgE抗体の定量を実施した。
臨床的に特徴付けられたチモシーアレルギー患者サン
プルに対してMagic Lite SQ Specific IgE Kit（A
LK Laboratories A/S,Hrsholm,Denmark）で較正し
た10個のチモシー特異的IgE標準と共に35人の患者サン
プルのチモシー特異的IgEをアッセイし、SU/mlとして表
した（実施例２に記載のプロトコル）。
プルに対してMagic Lite SQ Specific IgE Kit（A
LK Laboratories A/S,Hrsholm,Denmark）で較正し
た10個のチモシー特異的IgE標準と共に35人の患者サン
プルのチモシー特異的IgEをアッセイし、SU/mlとして表
した（実施例２に記載のプロトコル）。
IgE WHO 2nd IRP No.75/502（国立生物学標準委
員会）の９個の標準を全IgEに対して同一アッセイでア
ッセイした（実施例１に記載のプロトコル）。
員会）の９個の標準を全IgEに対して同一アッセイでア
ッセイした（実施例１に記載のプロトコル）。
図４は夫々全IgEアッセイ及びチモシー特異的IgEアッ
セイの２種の用量反応曲線を比較したものである。平行
線試験によると、２種の用量反応曲線の傾きはさほど変
わらないことが判明したので、患者サンプル中の特異的
IgEをWHO全IgE標準に対して較正し、IU/mlで表すことが
できると考えられる。
セイの２種の用量反応曲線を比較したものである。平行
線試験によると、２種の用量反応曲線の傾きはさほど変
わらないことが判明したので、患者サンプル中の特異的
IgEをWHO全IgE標準に対して較正し、IU/mlで表すことが
できると考えられる。
図５は、WHO全IgE標準（IU/mlで表す）又はチモシー
特異的IgE標準（SU/mlで表す）に対して較正した35人の
患者サンプルからの結果を比較したものであり、２種の
単位間に非常に良好な相関を示している。
特異的IgE標準（SU/mlで表す）に対して較正した35人の
患者サンプルからの結果を比較したものであり、２種の
単位間に非常に良好な相関を示している。
夫々シグナル／バックグラウンド及び濃度（用量）の
対数−対数変換後に三次を含まないスプライン補間を用
いて未知サンプルの濃度（用量）を計算した。
対数−対数変換後に三次を含まないスプライン補間を用
いて未知サンプルの濃度（用量）を計算した。
線形回帰線から、1SU（標準化単位）は0.14国際単位
（IU）に対応すると計算された。
（IU）に対応すると計算された。
要約すると、本発明の態様を使用してアレルゲン特異
的IgEを計算することができ、WHO 1gE較正標準曲線の
全IgEアッセイから直接較正することができる。
的IgEを計算することができ、WHO 1gE較正標準曲線の
全IgEアッセイから直接較正することができる。
実施例４ 全IgE法比較 Magic Lite Total IgEキット（ALK Laboratories
A/S,Hornsholm,Denmark）で33人の患者のサンプル
の全血清IgEを測定した。アッセイは製造業者の指示に
従って実施した。実施例１に記載したプロトコルに従っ
てACS:180で同一サンプルの全血清IgEを測定した。
A/S,Hornsholm,Denmark）で33人の患者のサンプル
の全血清IgEを測定した。アッセイは製造業者の指示に
従って実施した。実施例１に記載したプロトコルに従っ
てACS:180で同一サンプルの全血清IgEを測定した。
図６は全血清IgEを測定するための方法を比較する撒
布図である。ｒ＝0.90で相関が確認された。
布図である。ｒ＝0.90で相関が確認された。
実施例５ 特異的IgE法比較 Magic Lite SQ Specific IgEキット（ALK Labor
atories A/S,Hrsholm,Denmark）で35人の患者のサン
プルのチモシー特異的IgEを測定した。アッセイハ製造
業者の指示に従って実施した。同一サンプルのチモシー
特異的IgEを実施例２に記載のプロトコルに従ってACS:1
80で測定した。
atories A/S,Hrsholm,Denmark）で35人の患者のサン
プルのチモシー特異的IgEを測定した。アッセイハ製造
業者の指示に従って実施した。同一サンプルのチモシー
特異的IgEを実施例２に記載のプロトコルに従ってACS:1
80で測定した。
図７はチモシー特異的IgEを測定するための方法を比
較する撒布図である。ｒ＝0.80で相関が確認された。
較する撒布図である。ｒ＝0.80で相関が確認された。
実施例６ アッセイ精度の比較 実施例１に記載のプロトコルを使用したACS全IgEの同
一アッセイ内不正確度をMagic Lite Total IgEの不
正確度と比較した。患者サンプルを実施例４に記載した
アッセイで３回反復実験した。Krouwer及びRabinowitz,
Clinical.Chemistry,30,290（1984）に従って同一アッ
セイ内の変動係数のプール値（CVpwr）を計算した。以
下の結果を得た。
一アッセイ内不正確度をMagic Lite Total IgEの不
正確度と比較した。患者サンプルを実施例４に記載した
アッセイで３回反復実験した。Krouwer及びRabinowitz,
Clinical.Chemistry,30,290（1984）に従って同一アッ
セイ内の変動係数のプール値（CVpwr）を計算した。以
下の結果を得た。
Magic Lite ACS ％CVpwr 4.69 2.75 Min％CV 0.80 0.70 Max％CV 11.70 8.40 結果から明らかなように、操作段階を自動化及び最小
限にすることにより、分析精度を著しく改善することか
できる（Ｆ検定によるとＦ＝1.72,p＝0.049）。
限にすることにより、分析精度を著しく改善することか
できる（Ｆ検定によるとＦ＝1.72,p＝0.049）。
実施例７ 患者サンプル中の全及び特異的IgEの比較： 実施例２に記載したプロトコルに従ってACS:180でチ
モシー特異的IgEについて測定し、実施例３に記載した
ように全IgEリファレンス（WHO 75/502）に対して較正
したサンプルを、更に実施例１に記載したように全IgE
について分析した。特異的IgEと全IgEの測定値の比を各
サンプルで計算し、％比として表した（特異的IU/完全I
U＊100）。
モシー特異的IgEについて測定し、実施例３に記載した
ように全IgEリファレンス（WHO 75/502）に対して較正
したサンプルを、更に実施例１に記載したように全IgE
について分析した。特異的IgEと全IgEの測定値の比を各
サンプルで計算し、％比として表した（特異的IU/完全I
U＊100）。
以下の結果を得た。
実施例７（続き） 結果から明らかなように、チモシー特異的IgEアッセ
イは全IgEからチモシー特異的IgEを0.05％まで測定する
ことができた。チモシー特異的IgEの相対量が低いの
は、サンプル中に他のアレルゲン特異性が存在すること
を示す。１人の患者サンプルでは全IgEの44％までがチ
モシーに対して特異的であることが判明した。図８から
明らかなように、全IgE濃度とチモシー特異的IgE濃度と
の間に相関は認められなかった。
イは全IgEからチモシー特異的IgEを0.05％まで測定する
ことができた。チモシー特異的IgEの相対量が低いの
は、サンプル中に他のアレルゲン特異性が存在すること
を示す。１人の患者サンプルでは全IgEの44％までがチ
モシーに対して特異的であることが判明した。図８から
明らかなように、全IgE濃度とチモシー特異的IgE濃度と
の間に相関は認められなかった。
実施例８ 常磁性粒子及びアビジン−アクリジニウムエステルラベ
ルを使用した血清全IgA抗体の定量 下記プロトコルを使用して全IgA抗体の定量をアッセ
イした。
ルを使用した血清全IgA抗体の定量 下記プロトコルを使用して全IgA抗体の定量をアッセ
イした。
患者サンプル又はカリブレーター25μｌをピペットで
12×75mm試験管に移した。0.1％ナトリウムアジド、0.0
1％Tween（登録商標）20及び0.1％ヒト血清アルブミン
を含有する0.05Mリン酸緩衝液（pH7.4）中のビオチン化
ポリクローナル抗IgA抗体DAKO E484（DAKO,Glostrup,D
enmark製品）50μｌを各試験管に加え、周囲温度で15分
間反応させた。常磁性粒子のスラリー400μＬにポリク
ローナル抗IgA抗体DAKO Ａ 262（DAKO,Glostrup,Denm
ark製品）を固定して各試験管に加え、５分間インキュ
ベートした。この２回目のインキュベーション後、上記
と同一緩衝液で希釈したストレプトアビジン−アクリジ
ニウムエステルラベル50μｌを各試験管に加え、周囲温
度で更に５分間インキュベートした。常磁性粒子を磁気
ペースセパレーターにより液体から分離し、分離した粒
子を上記洗浄用緩衝液と共に渦形成後、0.1％ Tween
（登録商標）20を含有する0.2Mリン酸緩衝液（pH7.4）
で２回洗浄した。最後に試験管の内容を光度計で測定
し、426nmでの発光を計量し、相対光単位（RUL）として
表した。
12×75mm試験管に移した。0.1％ナトリウムアジド、0.0
1％Tween（登録商標）20及び0.1％ヒト血清アルブミン
を含有する0.05Mリン酸緩衝液（pH7.4）中のビオチン化
ポリクローナル抗IgA抗体DAKO E484（DAKO,Glostrup,D
enmark製品）50μｌを各試験管に加え、周囲温度で15分
間反応させた。常磁性粒子のスラリー400μＬにポリク
ローナル抗IgA抗体DAKO Ａ 262（DAKO,Glostrup,Denm
ark製品）を固定して各試験管に加え、５分間インキュ
ベートした。この２回目のインキュベーション後、上記
と同一緩衝液で希釈したストレプトアビジン−アクリジ
ニウムエステルラベル50μｌを各試験管に加え、周囲温
度で更に５分間インキュベートした。常磁性粒子を磁気
ペースセパレーターにより液体から分離し、分離した粒
子を上記洗浄用緩衝液と共に渦形成後、0.1％ Tween
（登録商標）20を含有する0.2Mリン酸緩衝液（pH7.4）
で２回洗浄した。最後に試験管の内容を光度計で測定
し、426nmでの発光を計量し、相対光単位（RUL）として
表した。
ヒト血清IgA DAKO X908（DAKO,Glostrup,Denmark製
品）についてWHO No.67/86に対して較正した全IgA標準
を上記プロトコルに従ってアッセイした。
品）についてWHO No.67/86に対して較正した全IgA標準
を上記プロトコルに従ってアッセイした。
標準：濃度（μg/ml） RLU 0 370937 0.02 417000 0.23 557563 2.32 1252260 23.2 1872357 発明の趣旨及び範囲内で多数の変形が可能であること
は当業者に自明である。
は当業者に自明である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 （１）ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＮＤ Ｅ ＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＡＬＬＥＲＧ Ｙ，Ｖｏ．22，（1992），Ｊ．Ｋｌｅｉ ｎｅ−Ｔｅｂｂｌｅ ｅｔ ａｌ．”Ｃ ｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＡＧＩＣ ＬＩＴＥ −ａｎｄ ＣＡ Ｐ−ｓｙｓｔｅｍ：ｔｗｏ ａｕｔｏｍ ａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓｓａｙｓ．”, ｐ．475−484 （２）アレルギー「酵素免疫測定法に よる総ＩｇＥおよび特定的ＩｇＥ抗体の 測定」第30巻，第11号，（1981），Ｐ. 1052−1059 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 575 G01N 33/543 501 G01N 33/53 G01N 33/553 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】化学発光標識化合物を使用してサンプル中
の抗体を検出する方法であって、 ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗原、抗体又はハプテン；常磁性粒子に結合した被検出
抗体に対して向性の抗体；及びアビジン、ストレプトア
ビジン又はその機能的誘導体に結合した化学発光アクリ
ジニウム化合物をサンプルと混合し、固相結合複合体を
形成する段階と、 ｂ）固相を液相から磁気的に分離する段階と、 ｃ）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複
合体が存在するか否かを分析し、化学発光の存在が検出
された場合には前記サンプル中に前記抗体が存在すると
判断する段階と を含む方法。 - 【請求項２】ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合
したリガンド抗原、抗体又はハプテンを、常磁性粒子に
結合した被検出抗体に対して向性の抗体及びサンプルと
混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加
え、第２の固相複合体を形成する段階と、 iii）固相を液相から磁気的に分離する段階と、 iv）化学発光反応を開始し、分離した固相に化学発光複
合体が存在するか否かを分析する段階と を含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】サンプル中の抗体がIgA、IgD、IgE、IgG、
IgM及びそのアイソタイプからなる群から選択される特
異的免疫グロブリンであり、リガンド抗原、抗体又はハ
プテンが特異的アレルゲンである請求項１又は２に記載
の方法。 - 【請求項４】特異的免疫グロブリンが特異的IgEである
請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】サンプル中の抗体が全IgA、全IgD、全Ig
E、全IgG、全IgM及びそのアイソタイプからなる群から
選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗
原、抗体又はハプテンが前記免疫グロブリンクラスに対
して向性の抗体である請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項６】免疫グロブリンクラスが全IgEである請求
項５に記載の方法。 - 【請求項７】常磁性粒子に結合した被測定抗体に対して
向性の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる群
から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免疫
グロブリンである請求項１から６のいずれか一項に記載
の方法。 - 【請求項８】化学発光アクリジニウム化合物がアビジ
ン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結
合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジ
ニウムエステルである請求項１から７のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項９】サンプル中の特異的抗体の濃度及び／又は
相対含有量の測定方法であって、化学発光ラベルに結合
した捕獲特異的抗体を含む分離固相の発光測定値と、該
特異的抗体が属する抗体クラスのサンプル中総含有量を
測定する真にパラレルなリファレンスイムノアッセイで
得られた発光の測定値とを比較し、 ａ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特
異的抗体に対して向性のリガンド抗原又はハプテン；常
磁性粒子に結合した被測定抗体の不変部に対して向性の
抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能
的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサ
ンプルと混合し、第１の固相複合体を形成する段階と、 ｂ）前記第１の固相を液相から磁気的に分離する段階
と、 ｃ）化学発光反応を開始し、分離した第１の固相発光を
測定する段階と、 ｄ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合した被測定特
異的抗体クラスに対して向性のリガンド抗体；常磁性粒
子に結合した被測定抗体クラスの不変部に対して向性の
抗体；及びアビジン、ストレプトアビジン又はその機能
的誘導体に結合した化学発光アクリジニウム化合物をサ
ンプルと混合し、第２の固相複合体を形成する段階と、 ｅ）前記第２の固相を液相から磁気的に分離する段階
と、 ｆ）化学発光反応を開始し、分離した第２の固相の発光
を測定する段階と、 ｇ）第１の分離固相の発光を第２の分離固相の発光と比
較する段階と を含む方法。 - 【請求項１０】段階ａ）が、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗原又はハプテンを、常磁性粒子に結合した抗体及びサ
ンプルと混合し、固相複合体を形成し、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に結合した化学発光アクリジニウム化合物を加え、前
記第１の固相複合体を形成する ことにより実施され、 段階ｄ）が、 ｉ）ビオチン又はその機能的誘導体に結合したリガンド
抗体を、常磁性粒子に結合した抗体及びサンプルと混合
し、固相複合体を形成し、 ii）アビジン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導
体に共有結合した化学発光アクリジニウム化合物を加
え、前記第２の固相複合体を形成する ことにより実施される請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】サンプル中の被測定特異的抗体がIgA、I
gD、IgE、IgG、IgM及びそのアイソタイプからなる群か
ら選択される特異的免疫グロブリンであり、前記抗体の
可変部に対して向性のリガンド抗原、抗体又はハプテン
がアレルゲンであり、抗体クラスが全IgA、全IgD、全Ig
E、全IgG、全IgM及びそのアイソタイプからなる群から
選択される免疫グロブリンクラスであり、リガンド抗
原、抗体又はハプテンが前記免疫グロブリンクラスに対
して向性の抗体である請求項９又は10に記載の方法。 - 【請求項１２】特異的免疫グロブリンが特異的IgEであ
り、抗体クラスが全IgEである請求項11に記載の方法。 - 【請求項１３】常磁性粒子に結合した被測定抗体に対し
て向性の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体（組換え抗体、抗体フラグメントを含む）からなる
群から選択され、好ましくはモノクローナルマウス抗免
疫グロブリンである請求項９又は10に記載の方法。 - 【請求項１４】化学発光アクリジニウム化合物がアビジ
ン、ストレプトアビジン又はその機能的誘導体に共有結
合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドジメチルアクリジ
ニウムエステルである請求項１から13のいずれか一項に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DK1379/92 | 1992-11-13 | ||
| DK921379A DK137992D0 (da) | 1992-11-13 | 1992-11-13 | Fremgangsmaade til paavisning af et immunologisk aktivt stof i en proeve under anvendelse af et maerkningsstof |
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|---|---|
| JPH08503071A JPH08503071A (ja) | 1996-04-02 |
| JP3194585B2 true JP3194585B2 (ja) | 2001-07-30 |
Family
ID=8104222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51161794A Expired - Fee Related JP3194585B2 (ja) | 1992-11-13 | 1993-11-15 | 化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイ |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3194585B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2149340C (ja) |
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| DK (2) | DK137992D0 (ja) |
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| PL (2) | PL173033B1 (ja) |
| RU (1) | RU2132070C1 (ja) |
| WO (1) | WO1994011734A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6288803B1 (en) | 1997-10-27 | 2001-09-11 | Denso Corporation | Hologram display |
| KR102164513B1 (ko) * | 2018-05-14 | 2020-10-12 | (주)상지엔지니어링건축사사무소 | 무동력 친환경 환풍구 구조 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB9526599D0 (en) * | 1995-12-28 | 1996-02-28 | Sandoz Ltd | Elisa test system |
| DE69939260D1 (de) * | 1998-06-24 | 2008-09-18 | Alk Abello As | Verfahren zum nachweis von antikörpern in flüssigen proben |
| US6379909B1 (en) | 1998-06-24 | 2002-04-30 | Alk-Abello A/S | Method of detecting an antibody in a liquid sample |
| US7759133B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-07-20 | Alk-Abello A/S | Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample |
| US7732157B1 (en) | 1999-09-30 | 2010-06-08 | Tumor Biology Investment Group | Soluble epidermal growth factor receptor-like proteins and their uses in cancer detection methods |
| GB0029154D0 (en) | 2000-11-30 | 2001-01-17 | Lee Helen | Signal enhancement with multiple labelled-antibodies |
| US7867715B2 (en) | 2003-08-05 | 2011-01-11 | Alk-Abello A/S | Method of evaluating the immunological activity of a vaccine |
| DE202008006598U1 (de) | 2008-04-11 | 2008-10-02 | Alk-Abelló A/S | Allergie-Impfstoff-Formulierung zur mucosalen Verabreichung |
| WO2022256568A1 (en) * | 2021-06-02 | 2022-12-08 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Methods and compositions for localization of growth factors |
-
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- 1992-11-13 DK DK921379A patent/DK137992D0/da not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-11-15 HU HU9501413A patent/HU216876B/hu not_active IP Right Cessation
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- 1993-11-15 DE DE69310537T patent/DE69310537T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-15 PL PL93309004A patent/PL173033B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-11-15 PL PL93315871A patent/PL173049B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-11-15 AT AT94900067T patent/ATE152834T1/de not_active IP Right Cessation
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