KR100306433B1 - 화학발광성표지물과비오틴결합된리간드를이용한항체의이-부위면역분석방법 - Google Patents

화학발광성표지물과비오틴결합된리간드를이용한항체의이-부위면역분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 리간드 항원, 항체 또는 비오틴에 결합된 불완전 항원; 상자성 입자에 결합된 검출될 항체에 대한 항체; 및 아비딘, 스트렙타비딘에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 샘플과 혼합하여 고체상이 결합된 복합체를 생성하고; 액체상에서 고체상을 분리하고; 화학발광성 복합체 존재에 대하여 분리된 고체상을 분석하는 단계로 이루어진, 화학발광성 표지 화합물을 이용한 샘플에서 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
화학발광성 표지물과 비오틴 결합된 리간드를 이용한 항체의 이-부위 면역분석
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 화학발광성 표지 화합물을 이용한 샘플에서 항체를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이-부위(二部位) 면역분석에서 아비딘 또는 스트렙타비딘에 결합된 화학발광성 아크리디늄 에스테르 화합물과 비오틴에 결합된 리간드의 이용에 관한 것으로, 상기에서 친화성 복합체는 생물학적 유동액, 조직 샘플, 우유, 식품 샘플, 음료, 물 또는 산업폐수 등의 샘플에서 항체와 같은 면역학적으로 활성인 물질을 신속하게 검출 및/또는 정량하게 할수 있는 상자성 입자에 포획된다.
혈청에서 면역글로부린 E-항체를 검출하고 정량하는 방법은 시바 코닝 다이아그노스틱스 코포레이션과 알크(ALK) 라보라토리스의 소책자 “Specific IgE, MagicLite SQTM” (1990년 9월)에 기재되어 있다. 상기 방법에서 상자성 입자에 공유결합된 특이성 알레르겐은 혈청 또는 혈장 샘플 내의 알레르겐-특이성 IgE-항체와 반응한다. 1차 인큐베이트하고 결합되지 않은 비특이성 IgE를 세척한후, IgE에 대한 화학발광성 아크리디늄 에스테르-표지 모노클로날 항체를 첨가한다. 2차로 인큐베이트한후, 화학발광성 반응을 개시하는 샘플을 자동적으로 주입하는 Magic Lite분석기(Cat. No.472733 또는 Cat. No.472270)로 고체상과 표지된 항체를 측정한다. 이 방법을 이용하는 경우에는, 화학발광을 개시하고 측정하는 최종 단계만이 자동화될 수 있다. 화학발광성 아크리디늄 에스테르 표지 화합물은 미국특허 제4,745,181호에 기재되어 있다.
미국특허 제 4,946,958호에는 면역학적으로 반응성이 있는 발광성 시약을 제조하기 위하여 단백질 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 N-숙시니미딜기에 결합된 화학발광성 아크리디늄 에스테르가 기재되어 있다. 상기 시약은 고체상 항체, 항원 분자 및 표지화된 안티-항체에 동시에 결합하고, 분리하여 고체상을 세척하고 고체상의 발광성을 정량하는 것으로 이루어진 면역분석에 이용될 수 있다.
methods in Enzymology, 184(1990), 481 내지 496에는 Strasburger 등의 이-부위 화학발광성 면역분석 방법이 기재되어 있는데, 상기에서는 hGH와 hCG 호르몬을 미세적정 플레이트에 부동화된 항체로 포획하고 비오틴 표지화된 제2 항체에 의해 아비딘에 결합된 화학발광성 물질로 표지화한다. 단백질 호르몬 등의 항원성 분석물은 혈청 샘플로부터 직접 분석되어 표준물곡선과 비교할 수 있다. 그러나, IgE 등의 면역글로부린의 농도는 환자에 따라 매우 다르고, 특이성 IgE의 분석은 각 환자의 총 IgE 농도를 비교하여야 하므로 Strasburger 등에 기재된 분석에서 얻어질 수 있는 것보다 더 큰 역동적 범위를 가지는 분석이 요구된다.
유럽특허 제A 0425217호에는 혼성화 분석 방법이 기재되어 있는데, 상기에서 화학발광성 복합체는 상자성 입자와 결합된 제1 표지화된 뉴클레오티드프로브와, 비오틴으로 표지화되고 아비딘-아크리디늄 에스테르에 결합된 제2 뉴클레오티드 프로브로 혼성화된 헥산으로 이루어진다. 그러나, 항체를 검출하기 위한 완전 자동화 방법을 제공하는 문제와 직면한 이 분야의 사람들은 하나의 반응기에서 바람직하게는 주위 조건하에 실시할 수 있는 방법을 모색할 것이다. 상기에 기재된 방법은 특이성 항체가 발생할 수 있는 항원이 아닌 특이성 서열의 검출에 적용되므로 근본적으로 다르다. 구체적으로는 상기한 분석 방법은 혼성화를 위한 고온과 면역분석에서 바람직하지 않거나 불필요한 헵텐-올리고뉴클리오티드 프로브를 이용하여야 한다.
이제까지 혈청 등의 생물학적 유동액에서 면역글로부린(예를들면, 특이성 면역글로부린-E) 등의 면역학적으로 활성인 분자들의 정량을 위한 면역분석 방법은 예를들면 효소결합항체법(ELISA)과 같은 수동, 또는 반자동 이었다. 상기한 Magic Lite SQTM특이성 IgE 분석은 일치하지 않는 프로토콜로의 전체 IgE 비교분석을 이용하여 부정확한 자료를 얻게 된다. 동일한 포획 및 검출 과정을 이용하는 분석만이 직접 비교될 수 있다. 예를들면 특이성 IgE 정밀 반응곡선은 모두 전체 IgE 반응곡선과 평행하여야 한다. 그 이유는 특이성(또는 전체) IgE 분석에 대한 역동학적 요구범위는 20이고 전체 IgE 분석에 대한 역동학적 요구범위는 20 내지 70인데 현재의 면역분석 방법은 전체 범위에 대한 집중적인 측정을 하지 못하기 때문이다. 그러므로, 서로 다른 시약을 가지는 특이성 및 전체 면역 글로부린 분석을 위한 상이한 프로토콜을 이용하여야 하였다.
안전한 시험방법에 대한 관심이 높아지고 있으므로 사람의 혈청, 혈장, 혈액, 우유, 뇨 또는 타액 등의 생체 유동액에서 항체 등의 물질을 검출하는 완전 자동화된 방법이 요구되며, 이 방법은 위험한 유동액과의 접촉을 최소화할 수 있어야 한다. 진단에 있어서 실험실 테스트의 이용 증가 또는 지속기간이 짧은, 바람직하게는 단 몇분인 방법을 요구하고 있다.
본 발명의 목적은 안전하고, 신속하며 완전히 자동화할 수 있는 샘플에서 항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 다음 단계들로 이루어진 방법에 의하여 얻어진다:
a) 비오틴이나 그것의 기능성 유도체에 결합된 리간드 항원, 항체 또는 헵텐; 상자성 입자들에 결합도니 검출될 항체에 대한 항체; 및 아비딘, 스트렙 타비딘 또는 이들의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 샘플과 혼합하여 고체상에 결합된 복합체를 형성하는 단계, b) 액체상으로부터 고체상을 자기적으로 분리하는 단계, c) 화학발광성 반응을 개시하고 화학발광성 복합체 존재에 대하여 분리된 고체상을 분석하는 단계, 여기에서 화학발광물의 존재는 상기 샘플에 상기한 항체의 존재를 나타낸다.
본 발명의 방법은 상기한 단계 (a), (b) 및 (c)에 의하여 실시될 수 있지만, 표지화 화합물은 분리단계에서 첨가하는 것이 바람직하고, 그 방법은 다음 단계에 따라 실시하는 것이 바람직하다 :
i) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 리간드 항원, 항체 또는 헵텐을 샘플 및 상자성 입자들에 결합된 검출될 항체에 대한 항체와 혼합하여 제1 고체상 복합체를 형성하는 단계, ii) 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 기능성 유도체에 공유결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 첨가하여 제2 고체상 복합체를 형성하는 단계, iii) 액체상으로부터 고체상을 자기적으로 분리하는 단계, iv) 화학발광성 반응을 개시하여 화학발광성 복합체의 존재에 대하여 분리된 고체상을 분석하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 면역글로부린 등의 특이성 항체의 정량을 위한 완전 자동화할 수 있는 면역분석 방법을 제공하는 것으로, 이 방법에서는 동일한 프로토콜을 이용하는 실제로 유사(parallel) 참조 면역분석이 참조로 이용된다.
실제로 유사 참조 면역분석을 이용하는 특이성 항체를 정량하는 목적은 액체 샘플에서 특이성 항체의 농도 및/또는 상대적인 함량을 측정하는 방법에 의하여 달성되며, 상기에서 화학발광 표지물에 결합된 포획된 특이성 항체를 포함하는 분리된 고체상의 측정된 광(光) 방출량은 상기한 특이성 항체가 속하는 샘플 내의 항체들의 총량이 측정되는 유사 참조 면역분석에서 얻어진 측정된 광 방출량과 비교된다. 상기 방법은 하기의 단계들로 이루어진다:
a) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 측정될 특이성 항체에 대한 리간드 항원 또는 헵텐; 상자성 입자에 결합된 측정될 항체의 불변부에 대한 항체; 및 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 샘플과 혼합하여 제1 고체상 복합체를 형성하는 단계, b) 액체상으로부터 제1 고체상을 자기적으로 분리하는 단계, c) 화학발광성 반응을 개시하고 분리된 제1 고체상의 광 방출량을 측정하는 단계, d) 비오틴 또는 그것의 작용성 유도체에 결합된 측정될 상기 항체의 부류(class)에 대한 리간드 항체; 상자성 입자에 결합된 측정될 항체의 부류의 불변부에 대한 항체; 및 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 샘플과 혼합하여 제2 고체상 복합체를 형성하는 단계, e) 액체상으로부터 상기 제2 고체상을 자기적으로 분리하는 단계, f) 화학발광성 반응을 개시하고 분리된 제2 고체상의 광 방출량을 측정하는 단계, 및 g) 분리된 제1 고체상의 광 방출량과 분리된 제2 고체상의 광 방출량을 비교하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 언급된 상기 단계 a)는 (i) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 리간드 항원 또는 헵텐을 샘플 및 상자성 입자들에 결합된 항체를 혼합하여 고체상 복합체를 형성하고, (ii) 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 첨가하여 상기 제1 고체상 복합체를 생성하는 것으로 이루어지고, 단계 d)는 (i) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 리간드 항체를 샘플 및 상자성 입자들에 결합된 항체와 혼합하여 고체상 복합체를 형성하고, (ii) 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 기능성 유도체에 공유결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물을 첨가하여 상기 제2 고체상 복합체를 형성하는 것으로 이루어진다.
샘플내에서 측정될 특이성 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 이들의 아이소타입으로 구성되는 군에서 선택되는 특이성 면역글로부린이 바람직 하고, 리간드 항원, 항체 또는 상기 항체의 가변부에 대한 헵텐은 알레르겐이고, 항체의 부류는 총 IgA, 총 IgD, 총 IgE, 총 IgG, 총 IgM, 및 이들의 아이소타입으로 구성되는 군에서 선택되는 면역글로부린 부류가 바람직하고, 리간드 항원, 항체 또는 헵텐은 면역글로부린의 상기 부류에 대한 항체이다.
더욱 바람직하기로는 특이성 면역글로부린은 특이성 IgE이고, 항체의 부류는 총 IgE이다.
상자성 입자에 결합된 측정될 항차에 대한 항체는 폴리클로날 항체와, 재조합 항체, 단편화된 항체를 포함하는 모노클로날 항체로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하기로는 모노클로날 마우스 항-면역글로부린이다.
본 발명의 이점은 다음과 같다:
-. 모든 시약이 한 반응기에서 동시에 혼합할 수 있어서, 오염, 오차 및 작동단계를 최소화하였고, 면역분석의 지속기간을 상당히 감소시켰으며 프로세스의 자동화를 촉진하였고 정확도를 개선하였다 (실시예 6 참조).
-. 혈청 샘플 등에서 특이성 항체의 정량화가 동일한 프로토콜을 이용하여 실제로 유사 총 항체 분석에 관하여 수행할 수 있다 (실시예 3).
-. 얻어진 더 증가된 용량과 감수성은 매우 낮은 농도의 면역글로부린과 낮은 농도의 특이성 면역글로부린이 검출되는 것을 용이하게 한다 (실시예 1, 2, 7 참조).
본 발명의 바람직한 구현예는 혈청 또는 타액 등의 샘플에서 특이성 면역 글로부린(IgA, IgE, IgG, IgM 및 이들의 아이소타입) 등의 항체를 검출하기 위한 면역 분석이다.
구체적으로, 본 발명은 샘플에서 특이성 IgE를 검출하여 정량화하는 분석에 이용될 수 있다. 샘플이 혈청 또는 혈장 등의 액체일 경우, 샘플은 바람직하기로는 수성 배지중의 현탁된 상자성 입자에 결합된 모노클로날 마우스항-IgE 항체와 비오틴에 결합된 특이성 알레르겐(리간드)를 포함하는 반응기에 직접 첨가될 수 있다. 상기 비오틴은 비오틴 아미도카프로에이트 N-히드록시숙신이미드 에스테르(시그마 카탈로그 No. B2643)가 바람직하다. 샘플이 조직 샘플 등과 같이 액체가 아닐 경우에, 샘플은 수성액중에서 균질화되어 현탁되는것이 바람직하다. 샘플 내의 특이성 IgE, 알레르겐과 수성 배지 내의 모노클로날 항-IgE 항체 간의 동시 반응은 컨쥬게이트체의 형성을 초래한다. 화학발광성 표지화 화합물, 바람직하기로는 스트렙타비딘에 결합된 아크리디늄 에스테르(시그마 카탈로그 No. S4762) (아비딘-DMAE)는 반응기에 첨가되고 그리고 아비딘-DMAE와 컨쥬게이트체에 결합된 비오틴 및 컨쥬게이트되지 않은 알레르겐에 결합된 비오틴 사이에서 결합반응이 일어난다. 표지물이 결합된 컨쥬게이트체는 자기적으로 반응 혼합물을 분리하고 상징액을 따라내어 결합되지 않은 DMAE-표지화된 항체에서 분리된다. 분리된 컨쥬게이트의 화학발광성은 Pazzagli, M. 등, “Biology ＆ Medicine”, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 4(1), 1-646, (1989)에 기재된 방법에 의하여 측정된다.
참조로, 리간드로써 비오틴에 결합된 바람직한 폴리클로날 항-IgE 항체가 이용되는 경우에만 상이한 실제로 유사 총-IgE 면역분석이 동시에 수행된다.
제1도는 본 발명에 따른 특이성 IgE 분석 및 유사 총 IgE 참조 분석을 포함하는 다이아그램을 나타낸 것이다. 제1도에서 (1)은 검출될 특이성 IgE-항체이고, (2)는 비오틴에 결합된 특이성 알레르겐을 나타내며, (3)은 상자성 입자에 결합된 모노클로날 마우스 항-IgE이고, (4)는 아비딘-아크리디늄 에스테르이며, (5)는 (1), (2), (3), (4) 사이에 형성된 고체상의 표지화된 복합체이고, 그리고 임의의 인큐베이트 단계, 분리단계 및 임의의 세척단계를 포함하며, 그리고 (6)은 화학발광성 반응을 개시하고 광 방출량을 측정하는 최종단계를 나타낸다.
제1도의 총 IgE 참조 분석에 있어서, (7)은 IgE(WHO 75/502 IU/㎖)을 나타내고, (8)은 비오틴에 결합된 폴리클로날 항-IgE이고, (9)는 현탁된 상자성 입자에 결합된 모노클로날 마우스 항-IgE이고, (10)은 아비딘-아크리디늄 에스테르이고, (11)은 (7), (8), (9), (10) 사이에서 형성된 고체상의 표지화된 복합체를 나타내고, 그리고 임의의 인큐베이트 단계, 분리단계 및 임의의 세척단계를 포함하고, 그리고 (12)는 화학발광성 반응의 개시와 광 방출량을 측정하는 최종단계이다.
더 구체적으로는, 본 발명의 방법을 이용한 면역-분석은 시바 코닝 다이아그노스틱스사 (미국)의 ACS:180 전자동 분석기에서 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 한 구현예에 있어서, 검출될 면역학적으로 활성인 물질은 예를들면 벤질페니실린, 페니실로일 등의 페니실린 또는 그의 유도체에 대한 항체이고 비오틴에 결합된 리간드는 페니실린 또는 이들의 유도체 등의 헵텐이다.
[정의]
본 발명의 방법에 있어서, 검출될 항체는 특이성 면역글로부린, 바람직하게는 특이성 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 이들의 아이소타입, 더욱 바람직하기로는 특이성 IgE이거나, 또는 바람직하기로는 총 IgA, 총 IgD, 총 IgE, 총 IgG, 총 IgM 및 이들의 아이소타입으로 구성된 군에서 선택되는 면역글로부린 등의 항체의 부류이고, 가장 바람직하기로는 총 IgE이다.
샘플이란 액체 또는, 용액, 에멀젼, 분산액 및 현탁액 등의 액체화된 샘플을 의미한다.
비오틴에 결합된 리간드 항원, 항체 또는 헵텐은, 예를들면 알레르겐, 또는 폴리클로날 항체, 재조합 항체 또는 단편화된 항체 등의 모노클로날 항체와 같은 항체 등의 면역적으로 활성인 물질이며, 바람직하기로는 알레르겐 및/또는 Ventrex Laboratories사(미국, 메인주, 포틀랜드)의 염소 항-인간 폴리클로날 혈청(카탈로그 No. 77660) 등의 폴리클로날 항-면역글로부린이다. 참조 면역분석에 있어서, 상기 항체는 측정된 항체 부류의 불변부에 대한 것, 즉 IgE-항체에 대한 항체가 바람직하다.
본 발명에서 생물학적 유동액이란 혈액, 혈장, 혈청, 뇨 또는 타액 등의 모든 임상 샘플을 의미하는데, 유기체에서 내부적으로 배설, 분비 또는 이동되는 모든 생물학적 유동액을 포함한다.
상자성 입자(PMP)란 액체 매질에서 분산 또는 현탁될 수 있는 입자를 의미한다. 본 발명의 실시예에 있어서는 advanced Magnetics사(미국, 메사추세츠주, 캠브리지)의 BioMag 입자(아민 말단기로 피복된 산화철 입자)가 이용되었다. PMP와 결합된 항체는 검출되거나 측정될 항체의 가변부에 대한 것이 바람직하고 폴리클로날, 또는 재조합 항체 또는 단편화된 항체 등의 모노클로날 항체일 수 있으며 바람직하기로는 Bio-Invent International AB(스웨덴, 룬트)의 모노클로날 항체, MAb A 5697-1A3 (920325)이다.
화학발광성 아크리디늄 화합물은 아비딘 또는 스트렙타비딘(아비딘-DMAE)에 공유결합된 N-히드록시 숙신이미드 디메틸아크리디늄 에스테르가 바람직하다. 아비딘과 DMAE는 Weeks 등, Clin. Chem. 29/8, 1474-1479 (1983)에 기재된 방법에 따라 결합된다. 아비딘 또는 스트렙타비딘에 결합할 수 있는, 예를들면 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin) 또는 로핀 (lophine) 등의 기타 화학발광성 표지 화합물도 본 발명에 이용될 수 있다.
[비오틴화된 항체의 제조]
[비오틴화된 항-IgE와 플로임 프레이텐스 (Phleum pratense):]
염소 항-인간 폴리클로날 혈청(Ventrex Laboratories, 미국)을 리간드로 골수종 IgE를 포함하는 CNBR-활성화된 세파로스 4B(파마시아, 스웨덴)의 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 항-IgE는 비오틴의 몰:항-IgE의 몰=41:1로 비오틴화되었다.
디메틸포름아미드(머크사 제품)에 25㎎/㎖의 농도로 용해된 비오틴 (비오틴 아미도카프로에이트 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 시그마) 9㎕를 0.1 M NaHCO3(머크)에 4.5㎎/㎖의 농도로 용해된 항-IgE 0.4㎖에 첨가하였다. 이 시약을 25℃의 “엔드 오버 엔드” 혼합기에서 2시간동안 인큐베이트하였다. NaHCO3에 20㎎/㎖의 농도로 용해된 리신(시그마사 제품) 용액 0.9㎖를 첨가하였다. 이 용액을 여과하고 비오틴화된 항체를 수퍼덱스 75 Hiload 16/60 (파마시아사, 웁살라, 스웨덴) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 모아진 분획을 0.1% 사람 혈청 알부민(시그마사 제품) 및 0.1% NaN3(시그마사 제품)를 함유하는 인산염 완충 식염용액(PBS), pH 7.2으로 희석하였다.
플로임 프레이텐스 추출물(알크 러버로토리스 A/S사 제품, 덴마크)을 10:1의 몰비로 비오틴화하였다. 10㎎/㎖ 농도의 비오틴 0.65㎖를 0.1M NaHCO3에 10㎎/㎖의 농도로 용해된 플로임 프레이텐스 0.43㎖에 첨가하였다. 상기 시약들을 25℃의 “엔드 오버 엔드” 혼합기에서 2시간 동안 인큐베이트한 후, 50㎎/㎖ 농도의 리신(시그마사 제품) 용액 40㎕를 첨가하였다. 이 용액을 여과하여 수퍼덱스 75 Hiload 16/60(파마시아사 제품, 스웨덴) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 비오틴으로부터 비오틴화된 항체를 정제하고 알레르겐을 함유하는 분획을 모았다. 비오틴화된 플로임 프레이텐스를 0.1% 사람 혈청 알부민(시그마사 제품)과 0.1% NaN3(시그마사 제품)을 함유하는 PBS(pH 7.2)로 희석하였다.
[스트렙타비딘-아크리디늄 에스테르 표지물의 제조]
Weeks등, Clin.Chem. 29/8, 1474-1479(1983)의 방법을 이용하여 스크렙타비딘을 DMAE-NHS, [2′, 6′-디메틸-4′-(N-숙신이미딜옥시카르보닐) 페닐-10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트 메토설페이트]와 컨쥬게이트시켰다.
[스트렙타비딘-아크리디늄 에스테르 표지물의 제조]
N-히드록시숙신이미드 디메틸아크리디늄 에스테르 DMAE (미국, 메사추세츠주, 메드필드, 시바 코닝 다이아그노스틱스 코포레이션 제품) 0.96㎎을 디메틸포름아미드 1.92㎖로 희석시켰다. 이 용액 250㎕를 0.1M 인산이수소나트륨과 0.15M 염화나트륨(pH 8.15)에 1㎎/㎖의 농도로 용해된 스트렙타비딘(시그마사 제품) 2.5㎖에 피펫으로 옮겼다.
바일내의 상기 용액의 상부 공기를 질소(AGA)로 교환하였다. 상기 시약들을 교반시키면서 25℃에서 30분동안 인큐베이트한 후, 0.1M 인산이수소나트륨 (머크사 제품), 0.15M의 염화나트륨(pH 8.5)에 10㎎/㎖로 용해된 리신 2250㎕을 첨가하였다. 결합되지 않은 DMAE를 제거하기 위해, 이 용액을 PD-10 컬럼(스웨덴, 파마시아 제품)에 로딩하였다. 용리액을 모아서 셀룰로오스-미니탄-S 필터 시트 10,000 NMWL(Millipore)를 이용하여 환외여과로 정제하였다. 상기 여과는 인산염 완충 식염용액 PBS(pH 7.2) 1.5ℓ로 실시하였다. 리텐테이트(retentate 또는 retanate)를 25㎖로 농축하였고, 0.5% HSA (시그마사 제품)와 0.1% NaN3(시그마사 제품)를 함유하는 PBS(pH가 7.2) 25㎖가 첨가되었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 자세하게 기재하였다.
[상자성 입자들에 항체의 고정]
상자성 입자(미국, 시바 코닝 다이아그노스틱스 코포레이션 제품) 6.5g을 마그네틱 분리를 이용하여 메탄올(머크사 제품) 650㎖로 3회 세척하였다. 0.01M 아세테이트 완충액(pH가 5.5) 650㎖로 2회 세척하였다. 입자들을 6.25% 글루타르알데히드(머크사 제품), 0.01M 아세테이트 완충액(pH 5.5), 25℃에서 3시간 동안 활성화되었다. 입자들을 0.01M 아세테이트 완충액(pH 5.5) 650㎖로 3회 세척하였다. 상기 입자들을 IgE Fc 도메인에 대해 특이성인 모노클로날 항-IgE 항체(덴마크, 알크 러버로토리스 제품) 1083㎎과 25℃에서 24시간 동안 커플링시켰다. 상기 입자들을 0.01M 아세테이트 완충액(pH 5.5)로 2회 세척하였다. 활성기의 초과치의 블락킹은 10% IgE 스트립된 (stripped) 혈청(덴마크, 알크 러버로토리스 제품) 200㎖로 25℃에서 24시간 동안 실시하였다. 입자들을 1M 염화나트륨(머크사 제품) 650㎖으로 3번 세척하고, 0.01M 인산염 완충액(머크사 제품) 650㎖로 세척하였다. 입자들을 0.01M 인산염 완충액으로 3회 세척하였다. 입자들을 PBS(pH 7.2) 650㎖, 0.1% w/v 소 혈청 알부민 (시그마사 제품), 0.001% 소 감마 글로부린 (시그마사 제품) 650㎖에 재현탁시키고, 50℃로 18시간 동안 열처리하였다. 상기 입자들을 PBS(pH 7.2), 0.1% w/v 소 혈청 알부민(시그마사 제품), 0.001% 소 감마 글로부린(시그마사 제품) 650㎖로 3회 세척하였다. 입자들을 37℃에서 7일 동안 열처리하였다. 입자들을 0.01M 인산염 완충액으로 2회 세척하였다. 입자들을 PBS(pH 7.2), 0.5% 사람 혈청 알부민(시그마사 제품)에 ℓ당 0.5g으로 희석하였다.
[실시예 1]
[항원(총 IgE)의 검출 및 정량화]
본 발명에 따르는 총 IgE 항체의 측정은, 하기 프로토콜을 이용하여 Clinical Chemistry, 36/9, 1598-1602 (1990)에 기재된 시바 코닝 ACS:180 벤치탑 면역분석 분석기로 실시하였다:
샘플 50㎕와 비오틴화된 항-IgE 50㎕를 큐베트(cuvette) 내로 샘플 프로브(probe)를 사용하여 분배하였다. 상기 큐베트는 제1 시약 프로브 R1에 다다르고, 여기에서 IgE Fc 도메인에 대해 특이성인 고정된 모노클로날 항-IgE 항체 (덴마크, 알크 러버로토리스 제품)를 갖는 상자성 입자 100㎕가 스트렙타비딘-아크리디늄 에스테르 표지물 (덴마크, 알크 러버로토리스 제품)와 함께 분배되었다. 상기 큐베트는 마그네트 및 세척 단계로 트랙을 끌어내렸다. 탈염수 750㎕로 2회 세척하였다. 세척 사이클이 완결된 후, 입자들을 0.1M HNO3에 0.5g/ℓ의 농도로 용해된 H2O2300㎕에 재현탁하였다. 큐베트를 루미노미터 챔버에 넣고 그리고 광전배증관(photomultiplier) 앞에, 25mM NaOH 용액 300㎕을 첨가하고, 방출된 빛의 광자를 측정하고 정량화하고, 상대 광 단위(RLU)로 표시하였다. RLU의 양은 샘플내의 IgE의 양에 직접적으로 비례한다. 샘플 현탁으로부터 제1 결과까지의 시간은 15분이고 신규한 결과는 매 20초마다 측정되었다. 결과는 RLU 실험치/RLU 바탕값으로 표시하였고, 여기에서 RLU 바탕값은 총 IgE 없이 검출된 화학발광 반응이었다.
사람 혈청 IgE WHO 2nd IRP no 75/502에 대한 Migic Lite 총 IgE 키트(덴마크, 알크 러버로토리스 A/S사 제품)로 검정된 9개의 총 IgE 표준물은 상기 프로토콜을 이용하여 분석하였고, 0.1 IU/㎖농도의 총 혈청 IgE을 제2도에 나타난 것처럼 검출할 수 있었다 (바탕값 x 10 표준편차로 결정된 바와 같이).
[실시예 2]
[특이성 항체(특이성 IgE)의 검출 및 정량화]
본 발명에 따르는 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 항체(티모티 그래스 특이성 IgE)의 결정을, 하기 프로토콜을 이용하여 Clinical Chemistry, 36/9, 1598-1602 (1990)에 기재된 시바 코닝 ACS:180 벤치탑(Benchtop) 면역분석 분석기로 실시하였다:
샘플 50㎕와 비오틴화된 플로임 프레이텐스 50㎕를 큐베트 내로 샘플 프로브(probe)를 사용하여 분배하였다. 큐베트는 제1 시약 프로브 R1에 다다르고, 여기에서 IgE Fc 도메인에 대한 고정된 모노클로날 항-IgE 항체(덴마크, 알크 러버로토리스 제품)를 갖는 상자성 입자 100㎕를 200㎕의 스트렙타비딘-아크리디늄 에스테르 표지물 (덴마크, 알크 러버로토리스 제품)과 함께 분배하였다. 큐베트는 마그네트 및 세척 단계로 트랙을 끌어내렸다. 탈염수 750㎕로 2회 세척하였다. 세척 사이클이 완결된 후, 입자들을 0.1M HNO3에 0.5g/ℓ의 농도로 용해된 H2O2300㎕에 재현탁하였다. 큐베트를 루미노미터 챔버로 넣고 그리고 광전 배증관의 앞에, 25mM NaOH 용액 300㎕를 첨가하고, 그리고 방출된 빛의 광자를 측정하고 정량화하고 그리고 상대 광 단위(RLU)로 표시하였다. RLU의 양은 샘플내의 IgE의 양에 직접적으로 비례한다. 샘플 현탁으로부터 제1 결과까지의 시간은 15분이고 신규한 결과는 매 20초마다 측정하였다. 결과들을 RLU 실험치/RLU 바탕값으로 표시하였고, RLU 바탕값은 총 IgE 없이 검출된 화학발광 반응이었다.
SU/㎖(표준물화된 단위)로 표시된 임상적으로 특징지어진 플로임 프레이텐스 알레르기 환자 샘플에 대해 Migic Lite SQ 특이성 IgE 키트(덴마크, A/S 호르솔름, 알크 러버로토리스 A/S 제품)로 검정된, 10개의 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 표준물을 상기 프로토콜을 이용하여 분석하였고, 제3도에 나타난 것처럼, 플로임 프레이텐스 특이성 IgE의 1.43 내지 800 SU/㎖가 Migic Lite SQ 특이성 IgE 분석에서 측정될 수 있다는 것이 확인되었다.
[실시예 3]
[WHO 총 IgE 참조에 대한 특이성 IgE의 정량화]
혈청 샘플에서 특이성 IgE 항체의 정량화는, 각각 실시예 1과 2에 기재된 것과 동일한 분석 프로토콜을 이용하여 총 IgE 항체 또는 특이성 IgE 항체에 대하여 실시하였다.
35명의 환자 샘플을 SU/㎖로 표시된 임상적으로 특징지어진 플로임 프레이텐스 알레르기 환자 샘플에 대한 Migic Lite SQ 특이성 IgE 키트(덴마크, 알크 러버로토리스 A/S사 제품)로 검정된, 10개의 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 표준물에 따라 플로임 프레이텐스 특이성 IgE에 대해 분석하였다.
WHO 2nd IRP No 75/502(National biological standard board)의 IgE 9개의 표준물을 총 IgE에 대한 동일한 과정으로 분석하였다 (상기 실시예 1에 기재된 프로토콜).
제4도는 각각의 총 IgE 분석과 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 분석의 두개의 투여량 반응 곡선을 비교한 것이다. 평행선(parallel line) 테스트는 두개 투여량 반응 곡선의 기울기 사이에 큰 차이점을 나타내지 않았으며, 환자 샘플에서 특이성 IgE가 WHO 총 IgE 표준물에 대해 검정될 수 있고 IU/㎖로 표시될 수 있음을 나타내었다.
제5도는 WHO 총 IgE 표준물(IU/㎖로 표시) 또는 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 표준물(SU/㎖로 표시)에 대해 검정된 35명의 환자 샘플의 결과들을 비교한 것이고, 이것은 두 유니트 사이의 매우 우수한 상관관계를 나타낸다.
미지의 샘플의 농도(투여량)는, 각각 시그날/바탕값 및 농도 (투여량)를 log vs. log 변형한 후 큐빅-프리 스플라인 내삽법을 이용하여 계산하였다.
1 SU(표준물화된 단위)은 0.14 국제 단위(IU)에 상응한다는 것이 선형의 리그레션 라인으로부터 계산되었다.
결론적으로, 알레르겐 특이성 IgE는 본 발명의 구현예를 이용하여 측정될 수 있고, WHO IgE 검정된 표준 곡선의 총 IgE 분석으로부터 직접적으로 검정될 수 있다.
[실시예 4]
[총 IgE 방법 비교]
33명의 환자 샘플은 Migic Lite 총 IgE 기트(덴마크, 알크 러버로토리스 A/S사 제품)에서 총 혈청 IgE에 대해 측정하였다. 분석은 제조업자의 지시에 따라 실시하였다. 동일한 샘플들을 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 ACS:180에서 총 혈청 IgE에 대해 측정하였다.
제6도는 총 혈청 IgE의 측정 방법 비교를 위한 스캐터플롯(scatterplot)을 제공한다. r=0.09인 상관관계가 확인되었다.
[실시예 5]
[특이성 IgE 방법 비교]
35명의 환자 샘플을 Migic Lite SQ 특이성 IgE 키트(덴마크, 알크 러버로토리스 A/S사 제품)로 플로임 프레이텐스 특이성 IgE에 대해 측정하였다. 이 분석은 제조업자의 지시에 따라 실시하였다. 동일한 샘플들을 실시예 2에 기재된 프로토콜에 따라 ACS:180에서 플로임 프레이텐스 특이성 IgE에 대해 측정하였다.
제7도는 플로임 프레이텐스 특이성 IgE의 측정 방법 비교를 위한 스캐터 플롯을 제공한다. r=0.80인 상관관계가 확인되었다.
[실시예 6]
[분석 정확도의 비교]
실시예 1에 기재된 프로토콜을 이용하여 ACS 총 IgE의 과정내(within-run)의 부정확성을 Migic Lite 총 IgE의 것과 비교하였다. 환자의 샘플들을 실시예 4에 기재된 분석에서의 3개의 복제물로 실시하였다. 모아진 과정내의 변이계수(CVpwr)는 Krouwer Rabinowitz, Clinical Chemistry, 30, 290 (1984)에 따라 계산되었다. 결과는 하기에 기재되었다.
결과에 나타난 것처럼, 공정 단계의 자동화 및 최소화는 분석의 정확도를 상당히 개선시켰다(F-테스트에 의해 : F=1.71 p=0.049).
[실시예 7]
[환자 샘플들에서 총 및 특이성 IgE의 비교]
실시예 2에 기재된 프로토콜에 따라서 ACS:180에서 플로임 프레이텐스 특이성 IgE에 대해 측정된 그리고 실시예 3에 기재된 총 IgE 참조(WHO 75/502)에 대해 검정된 샘플들을 또한 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 총 IgE에 대해 분석하였다. 측정된 특이성 IgE와 총 IgE 사이의 비는 각 샘플에서 계산되었고 %비로서 표시하였다(spec. IU/총 IU*100).
다음과 같은 결과가 수득되었다:
결과에 나타난 것처럼, 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 분석은 총 IgE으로부터 플로임 프레이텐스 특이성 IgE의 0.05%정도로 낮게 측정될 수 있었다. 플로임 프레이텐스 특이성 IgE의 낮은 상대적인 양은 다른 알레르겐 특이성들이 샘플에 존재하는 것을 나타낸다. 총 IgE의 44% 이상이 플로임 프레이텐스에 대해 특이성을 갖는 하나의 환자 샘플에서 발견되었다. 제8도에 나타낸 것처럼, 총 IgE 농도와 플로임 프레이텐스 특이성 IgE 농도 사이에 상관관계는 발견되지 않았다.
[실시예 8]
[상자성 입자와 아비딘-아크리디늄 에스테르 표지물을 이용한 혈청 총 IgA 항체의 결정]
총 IgA 항체의 결정은 하기 프로토콜을 이용하여 분석하였다.
환자 샘플 25㎕ 또는 켈리브레이터(calibrator)를 12x75㎜ 테스트 튜브안으로 피펫으로 옮겨졌다. 각 튜브에, 0.1% 소디움 아자이드, 0.01% Tween20 및 0.1% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.05M 인산염 완충액(pH 7.4)중의 비오틴화된 폴리클로날 항-IgA 항체 DAKO E484(덴마크, DAKO에 의해 공급된 제품)을 첨가하여, 주위온도에서 15분동안 반응시켰다. 고정된 폴리클로날항-IgA 항체 DAKO A 262(덴마크, DAKO에 의해 공급된 제품)를 갖는 상자성 입자들의 슬러리 400㎕를 각 튜브에 첨가하였고 5분동안 인큐베이트하였다. 이렇게 두번 인큐베이트한 후, 상기와 동일한 완충액에 희석된 스트렙타비딘-아크리디늄 에스테르 표지물 50㎕를 각 튜브에 첨가하여 주위 온도에서 5분이상 인큐베이트하였다. 마그네틱 베이스 분리기를 사용하여 액체로부터 마그네틱 입자를 분리하고 하기에 기재된 바와 같은 세척 완충액으로 분리된 입자들을 소용돌이시킨 후에, 상자성 입자들을 0.1% Tween20을 함유하는 0.2M 인산염 완충액(pH 7.4)로 2회 세척하였다. 튜브의 함유량을 최종적으로 426㎚에서 광이 방출하는 루미노미터로 측정하였고, 정량화하였으며, 상대 광 유니트(RLUs)로 표시하였다.
사람 혈청 IgA DAKO X908(덴마크, DAKO에 의해 공급된 제품)의 WHO No. 67/86에 대해 검정된 총 IgA 표준물을 상기한 프로토콜을 이용하여 분석하였다.
표준물:
농도(㎍/㎖) RLUs
0 370937
0.02 417000
0.23 557563
2.32 1252260
23.2 1872357
이 분야에 일반적인 기술을 가진 사람에게 본 발명의 사상 및 범위에서 벋어나지 않게 다양한 변형이 가능하다는 것이 명백하다.

Claims (14)

  1. 하기의 반응물들을 포함하는 화학발광성 표지 화합물을 이용하여 샘플에서 항체를 검출하기 위한 반응물 키트: a) (I) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된, 항원, 항체 또는 헵텐인 리간드, (II) 검출될 항체에 대한 항체에 결합된 상자성 입자들, (III) 아비딘, 스트렙타비딘 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물, 여기서 반응물 (I) 내지 (III)은 샘플에서 검출될 항체와 함께 액체상으로부터 자기적으로 분리될 수 있는 고체상 결합 복합체를 형성할 수 있고, b) (IV) 화학발광성 복합체의 존재에 대하여 분리된 고체상을 분석하기 위하여 화학발광성 반응을 개시하기 위한 제제, 여기서 화학발광성 복합체의 존재는 상기 샘플에서 상기 항체의 존재를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 반응물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트: i) (I) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된, 항원, 항체 또는 헵텐인 리간드, (II) 검출될 항체에 대한 항체에 결합된 상자성 입자들, 여기서 반응물 (I) 및 (II)는 샘플에서 검출될 항체와 함께 제1 고체상 복합체를 형성할 수 있고, ii) (III) 액체상으로부터 자기적으로 분리될 수 있는 제2 고체상 복합체를 형성하기 위하여 제1 고체상 복합체에 결합할 수 있는, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 그것의 기능성 유도체에 공유결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물, iii) (IV) 화학발광성 복합체의 존재에 대하여 분리된 제2 고체상을 분석하기 위하여 화학발광성 반응을 개시하기 위한 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플중의 항체는 특이성 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 그것들의 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특이성 면역글로불린이고, 그리고 리간드 항원, 항체 또는 헵텐은 특이성 알레르겐인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제3항에 있어서, 특이성 면역글로불린은 특이성 IgE인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플에서 항체는 총 IgA, 총 IgD, 총 IgE, 총 IgG, 총 IgM 및 그것들의 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 부류이고, 그리고 리간드 항원, 항체 또는 헵텐은 상기 면역글로불린 부류에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제5항에 있어서, 면역글로불린 부류는 총 IgE인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상자성 입자들에 결합된 검출될 항체에 대한 항체는 폴리클로날 항체들과, 재조합 항체들, 단편화된 항체들을 포함하는 모노클로날 항체들로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하기로는 모노클로날 마우스 항-면역글로불린인 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학발광성 아크리디늄 화합물은 아비딘, 스트렙타비딘 또는 그것의 기능성 유도체에 공유결합된 N-히드록시숙신이미드 디메틸아크리디늄 에스테르인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 하기 반응물들을 포함하고, 특이성 항체의 수준 및 상기 특이성 항체가 속하는 항체들의 부류의 수준을 측정함에 의해 샘플에서 특이성 항체의 농도 및/또는 상대적인 함량을 측정하기 위한 반응물 키트: a) (I) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 측정될 특이성 항체에 대한 리간드 항원 또는 헵텐; (II) 상자성 입자드에 결합된 측정될 항체의 불변부에 대한 항체; 및 (III) 아비딘, 스트렙타비딘 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물, 여기서 반응물 (I) 내지 (III)은 샘플에서 검출될 특이성 항체와 함께 액체상으로부터 자기적으로 분리될 수 있는 제1 고체상 복합체를 형성할 수 있고, b) (IA) 비오틴 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 측정될 항체들의 부류에 대한 리간드 항체; (II) 상자성 입자들에 결합된 측정될 항체의 불변부에 대한 항체; 및 (III) 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 그것의 기능성 유도체에 결합된 화학발광성 아크리디늄 화합물, 여기서 반응물 (IA) 내지 (III)은 샘플에서 검출될 부류의 항체들과 함께 액체상으로부터 자기적으로 분리될 수 있는 제2 고체상 복합체를 형성할 수 있고, c) (IV) 분리된 제1 및 제2 고체상 복합체의 방출 수준을 측정하고 그리고 그 측정치들을 비교하기 위하여 화학발광성 반응을 개시하기 위한 제제.
  10. 제9항에 있어서, 반응물 (I), (II) 및 검출될 특이성 항체는 반응물 (III)이 결합할 수 있는 3-성분 고체상 복합체를 형성할 수 있고, 그리고 반응물 (IA), (II) 및 검출될 부류의 항체들은 반응물 (III)이 결합할 수 있는 3-성분 고체상 복합체를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 샘플에서 측정될 특이성 항체는 특이성 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 그것들의 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특이성 면역글로불린이고, 그리고 상기 항체의 가변부에 대한 리간드는 알레르겐이고, 그리고 항체의 부류는 총 IgA, 총 IgD, 총 IgE, 총 IgG, 총 IgM 및 그것들의 아이소타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 부류이고, 그리고 리간드는 상기 면역글로불린의 부류에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 제11항에 있어서, 특이성 면역글로불린은 특이성 IgE이고, 그리고 항체들의 부류는 총 IgE인 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상자성 입자들에 결합된 검출될 항체에 대한 항체는 폴리클로날 항체들과, 재조합 항체들, 단편화된 항체들을 포함하는 모노클로날 항체들로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하기로는 모노클로날 마우스 항-면역글로불린인 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 화학발광성 아크리디늄 화합물은 아비딘, 스트렙타비딘 또는 그것의 기능성 유도체에 공유결합된 N-히드록시숙신이미드 디메틸아크리디늄 에스테르인 것을 특징으로 하는 키트.
KR1019950701925A 1992-11-13 1993-11-15 화학발광성표지물과비오틴결합된리간드를이용한항체의이-부위면역분석방법 KR100306433B1 (ko)

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GB2289334B (en) * 1994-05-10 1998-08-26 Molecular Light Technology Lim Enzyme linked chemiluminescent assay
GB9526599D0 (en) * 1995-12-28 1996-02-28 Sandoz Ltd Elisa test system
US6288803B1 (en) 1997-10-27 2001-09-11 Denso Corporation Hologram display
HU228049B1 (en) * 1998-06-24 2012-09-28 Alk Abello As Method of detecting an antibody in a liquid sample
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KR102164513B1 (ko) * 2018-05-14 2020-10-12 (주)상지엔지니어링건축사사무소 무동력 친환경 환풍구 구조
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