CN111766381B - 一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用，属于免疫分析医学技术领域，所述试剂盒由R1试剂和R2试剂组成，所述R2试剂中含有偶联有抗体的胶乳试剂，所述胶乳试剂由小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂组成，其中所述小粒径胶乳试剂中，小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.08‑0.12：0.04‑0.06；所述大粒径胶乳试剂的制备过程中，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.02‑0.04：0.005‑0.01。本发明针对不同粒径的胶乳微球，分别选取了最适宜的活化剂和抗体用量，以最大限度发挥不同粒径胶乳微球的作用，使最终制备得到的试剂盒的功能灵敏度和线性均显著提高，以充分满足临床上的不同需求，同时试剂盒的其他性能不会受到影响。

Description

一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫分析医学技术领域，具体涉及一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用。
背景技术
免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法，其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应且比例合适时，形成的可溶性免疫复合物在促聚剂的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。而胶乳免疫比浊法是将待测抗原相对应的抗体包被在胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的灵敏度。
在临床检验应用上，通常对检测试剂的灵敏度和线性范围均有较高的要求，如β2-微球蛋白(β2-MG)项目，临床上发现在急性肾小管损伤或坏死、慢性间质性肾炎、慢性肾衰等情况下，血液中的β2-MG含量显著升高，浓度可高达40-80mg/L，而目前市场上的β2-MG测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)的线性只能达到20mg/L左右，遇到临床高值会出现hook效应，影响结果的准确性，因此不能满足临床需要；同时在临床上，尿液中β2-MG含量可以综合反应肾小球或肾小管功能异常，但尿液中β2-MG的含量很低，一般为0.1-0.3mg/L，因此，高灵敏度和高线性的β2-MG测定试剂才能更好的满足临床需要。再比如C反应蛋白(CRP)项目，其中超敏CRP检测可对患心血管疾病的危险性进行评估，当含量<1.0mg/L为低危险性，1.0-3.0mg/L为中度危险性，>3.0mg/L为高度危险性；而常规CRP检测作为感染性指标，其含量为50-100mg/L时常为细菌感染，病毒感染不常见，>100mg/L，提示细菌感染，可排除病毒感染。因此市面上用于检测CRP的试剂一般分两种，常规CRP测量范围是5-160mg/L，超敏CRP测量范围为0.5-5.0mg/L，因此，高灵敏度和高线性的CRP测定试剂才能更好的满足临床需要。诸如此类的项目还有很多，因此临床上对于胶乳检测试剂的高灵敏度和宽线性范围的需求比较强烈。
基于上述需求，目前市场上采用大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球混合，并优化大、小微粒的平均直径和浓度，以同时达到提高试剂灵敏度和线性的目的，如中国专利CN110133247A公开了一种用于检测目的抗原的免疫胶乳比浊法测定试剂盒，通过将两种平均粒径相差50nm以上的微球按照一定比例混合制备试剂以提高试剂盒的灵敏度和线性宽度，然而该专利中大纳米微球和小纳米微球的制备工艺相同，即大小纳米微球中添加的活化剂和抗体含量相同，然而不同粒径的微球其所需的活化剂含量和所能结合的抗体含量不同，且体系中活化剂和抗体含量不足或过量均会对试剂的灵敏度和线性宽度产生负面影响。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种提高胶乳免疫比浊法灵敏度和线性的方法，即根据不同粒径大小的微球，选取最适宜的活化剂和抗体用量，以最大限度发挥不同粒径微球的作用，使灵敏度和线性宽度均显著提高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成，所述试剂盒的R2试剂中包含小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂，其中所述小粒径胶乳试剂中，小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.08-0.12：0.04-0.06；所述大粒径胶乳试剂的制备过程中，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.02-0.04：0.005-0.01。
优选地，所述小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.1：0.05；所述大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.03：0.008。
优选地，所述小粒径胶乳试剂和所述大粒径胶乳试剂的浓度比为1：0.8-1.2。
优选地，所述小粒径胶乳试剂和所述大粒径胶乳试剂的浓度比为1：1。
优选地，所述活化剂为EDC和NHS按浓度比为1：1混合得到的混合物。
优选地，所述小粒径胶乳微球的粒径为60-90nm；所述大粒径胶乳微球的粒径为200-250nm。
优选的，所述小粒径胶乳微球的粒径为80nm，所述大粒径胶乳微球的粒径为230nm。
本发明的技术方案还包括所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒在检测目的抗原或抗体中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在R2试剂的制备过程中，针对不同粒径的胶乳微球，分别创造性地选取了最适宜的抗体和活化剂用量，以最大限度发挥不同粒径胶乳微球的作用，使最终制备得到的试剂盒的功能灵敏度和线性均显著提高，以充分满足临床上的不同需求，同时试剂盒的其他性能不会受到影响。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1-3的线性范围曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，所述试剂盒的R2试剂中包含小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂，其中所述小粒径胶乳试剂中，小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.08-0.12：0.04-0.06；所述大粒径胶乳试剂的制备过程中，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.02-0.04：0.005-0.01
胶乳微球粒径对胶乳试剂的灵敏度和线性具有重要影响，其中大粒径胶乳微球由于粒径较大，因此在待测物中抗原浓度较低时，增大抗原抗体结合物的体积和浊度，从而增强了胶乳试剂的灵敏度，而小粒径胶乳微球具有较大的比表面积，有更多的基团以连接更多的抗体，可避免在待测物中抗原浓度较高时出现hook效应影响测量结果的准确性，即可提高胶乳试剂的线性，因此将大小粒径微球混合时，可在一定程度上提高检测试剂盒的灵敏度和线性。然而不同粒径的微球其所需的活化剂含量和所能结合的抗体含量不同，在胶乳试剂的制备过程中，若加入的活化剂和抗体的含量偏低会导致微球结合的抗体少从而影响检测试剂盒的灵敏度、线性等性能，若加入的活化剂和抗体含量过量不仅会增加生产成本，而且残留在体系中多余的活化剂和抗体也会影响检测试剂盒的灵敏度和线性等性能。本发明创造性地针对不同粒径的微球，分别选取了最适宜的活化剂和抗体用量，以最大限度发挥不同粒径微球的作用，使试剂盒的灵敏度和线性宽度均显著提高。
进一步地，所述小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.1：0.05；所述大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.03：0.008。按此比例得到的R2试剂，使试剂盒的功能灵敏度和线性宽度最高。
进一步地，所述小粒径胶乳试剂和所述大粒径胶乳试剂的浓度比为1：0.8-1.2。本发明还对不同粒径的胶乳试剂的配比进行了优化，以获得灵敏度和线性宽度最优异的试剂盒。
进一步地，所述小粒径胶乳试剂和所述大粒径胶乳试剂的浓度比为1：1。
进一步地，所述活化剂为EDC和NHS按浓度比为1：1混合得到的混合物。其中EDC为(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，NHS为N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将EDC和NHS混合制备得到的活化剂可用于活化胶乳微粒，以利于后续胶乳微粒和抗体的偶联。
进一步地，所述小粒径胶乳微球的粒径为60-90nm；所述大粒径胶乳微球的粒径为200-250nm。
进一步地，所述小粒径胶乳微球的粒径为80nm，所述大粒径胶乳微球的粒径为230nm
本发明的技术方案还包括所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒在检测目的抗原或抗体中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种基于胶乳免疫比浊法检测样本中β2微球蛋白(β2-MG)含量的检测试剂盒，其中R1试剂的组分包括：Tris缓冲液：50-100mmol/L；EDTA-2Na：0.5g/L；NaCl：5％-15％；叠氮化钠：0.1％；表面活性剂：0.1％-1％，pH值为7.5。
R2试剂的组分包括：浓度比为1:1的小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂，其中小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂的制备方法具体如下：
(1)溶液配制：a.活化缓冲液：50mmol/L硼酸缓冲液，pH值5.5；b.偶联缓冲液：50mmol/L硼酸缓冲液，pH值7.4；c.活化剂：10mg/mL(其中EDC和NHS的浓度比为1:1)；d.封闭液：10％BSA；e.R2缓冲液：25mmol/L HEPES，0.5g/L的EDTA-2Na，5％蔗糖，0.1％PC-300，pH值7.4；f.β2-MG抗体：为兔多抗，纯度＞95％，浓度＞5mg/mL，并用偶联缓冲液稀释至1mg/mL；
(2)小粒径胶乳试剂的制备：小粒径胶乳微球的粒径为80nm，向小粒径胶乳微球中依次加入活化缓冲液和活化剂，置于恒温摇床中，30℃反应30min；然后加入β2-MG抗体混合均匀并置于恒温摇床中，30℃反应2.5h；继续加入封闭液，混匀后置于恒温摇床中，30℃反应1h；最后加入R2缓冲液混匀，即得到小粒径胶乳试剂，其中小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.1：0.05。
(3)大粒径胶乳试剂的制备：与小粒径胶乳试剂的制备工艺相同，其中大粒径胶乳微球的粒径为230nm，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.03：0.008。
(4)R2试剂的制备：将上述制备好的小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂按浓度比为1：1的比例混合，即得R2试剂。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：(1)小粒径胶乳试剂的制备过程中，小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.12：0.06。(2)大粒径胶乳试剂的制备过程中，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.04：0.005。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：(1)小粒径胶乳试剂的制备过程中，小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.08：0.04。(2)大粒径胶乳试剂的制备过程中，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.02：0.01。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于：在R2试剂的制备过程中，小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂按浓度比为1：1.2的比例混合。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于：在R2试剂的制备过程中，小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂按浓度比为1：0.8的比例混合。
实施例6
本实施例提供了一种基于胶乳免疫比浊法检测样本中CRP含量的测定试剂盒，其R1试剂和R2试剂的制备方法与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1中的β2-MG抗体替换为CRP抗体。
实施例7
本实施例提供了一种基于胶乳免疫比浊法检测样本中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量的测定试剂盒，其R1试剂和R2试剂的制备方法与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1中的β2-MG抗体替换为cTnI抗体。
实施例8
本实施例提供了一种基于胶乳免疫比浊法检测样本中铁蛋白(Fer)含量的测定试剂盒，其R1试剂和R2试剂的制备方法与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1中的β2-MG抗体替换为Fer抗体。
对比例1
本对比例提供了一种如专利CN110133247A所示的，利用胶乳免疫比浊法检测样本中β2-MG含量的测定试剂盒，其中R1和R2试剂的制备方法，具体为：
R1试剂配方：促凝剂(PEG，分子量100，浓度1％(m/v))、缓冲剂(磷酸缓冲液，浓度100nM，pH 7.4)、NaCl 0.15M、NaN3 0.09％(m/v)、BSA 0.2％(m/v)。
R2试剂配方：将平均粒径为50nm的聚苯乙烯微球(小纳米微球)和平均粒径为350nm的聚苯乙烯微球(大纳米微球)分别用磷酸缓冲液(100nM，pH 7.4)稀释至浓度为1％(m/v)，加入适量的EDC溶液，在4℃条件下进行活化反应2h，12000rmp离心30min，去上清，向沉淀中加入活化缓冲液，超声分散分别得到活化的纳米微球悬浊液；向活化的纳米微球悬浊液中加入过量的β2-MG抗体，于4℃反应3h，加入足量的甘氨酸溶液作为封闭剂进行封闭，在12000rmp离心20min，去上清，用活化缓冲液清洗1-4次，并用R2缓冲液及稳定性、防腐剂的储存液重悬纳米微球，超声分散，分别得到小纳米微球胶乳和大纳米微球胶乳；将小纳米微球胶乳和大纳米微球胶乳按1:1的浓度比混合，即得R2试剂。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：大粒径胶乳试剂的制备方法与小粒径胶乳试剂的制备方法完全相同，即大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比以及为1：0.1：0.05。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于：小粒径胶乳试剂的制备方法与大粒径胶乳试剂的制备方法完全相同，即小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.03：0.008。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于：在R2试剂的制备过程中，小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂按浓度比为1：0.5。
对比例5
本对比例与实施例1的不同之处在于：在R2试剂的制备过程中，小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂按浓度比为1：1.5。
应用例
本发明实施例1-8和对比例1-5中各检测试剂盒的使用方法与常规试剂盒的使用方法相同，对各检测试剂盒进行性能评价，评价方法具体如下：
(1)功能灵敏度：针对不同的待测抗原，分别测定空白样本，梯度变化的低浓度抗原样本(其中β2-MG的浓度梯度为0.025mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L；CRP的浓度梯度为0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L；cTnI的浓度梯度为0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L；Fer的浓度梯度为0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L)，其中每个样本重复测定10次，然后计算均值、偏差((均值-理论值)/理论值)、标准差和变异系数(CV)，其中变异系数小于10％且偏差小于10％，即满足使用需求。
(2)线性范围：测定一定浓度范围内的样本(其中β2-MG的浓度范围为0-82mg/L；CRP的浓度范围为0-255mg/L；cTnI的浓度范围为0-25μg/L，Fer的浓度范围为0-1000μg/L)，每个浓度重复测定3次，计算平均值、相关系数r和相对偏差(根据理论浓度和测定的平均值得到线性关系，将理论浓度代入线性关系计算对应的估计值yi值，相对偏差值即为(平均值-yi值)/yi值)。
(3)准确度：以Bio-rad公司生产的相关检测试剂盒作为第三方质控品，将其测量值作为靶值，并计算各试剂测定均值与靶值的偏差Bias＝(测定均值-靶值)/靶值，其中偏差≤10％视作满足要求
(4)精密度：采用各试剂盒重复测定同一样本10次，计算变异系数(CV，％)，其中CV≤5％视作满足要求。
测定结果如表1-4所示：
表1功能灵敏度测定
Figure BDA0002534594040000081
Figure BDA0002534594040000091
由表1的测定结果可知，对于低浓度β2-MG样本，对比例1-5的测定结果值偏低、精密度差，偏差值和CV值均大于10％，不满足功能灵敏度的要求，并且相比于对比例1-3，对比例4-5的偏差值和CV值相对较低，说明小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂的浓度比对功能灵敏度的影响相对较小。实施例1-4在样本浓度较低时，在样本浓度为0.05mg/L时，测量结果的偏差值和CV值小于10％，满足测定要求，即该检测试剂盒的功能灵敏度可以达到0.05mg/L，功能灵敏度显著提高。将低浓度β2-MG样本更换为低浓度CRP样本(实施例6)或低浓度cTnI样本(实施例7)或低浓度Fer样本(实施例8)时，其功能灵敏度也均满足测定要求，其中对CRP的功能灵敏度可达0.5mg/L，对cTnI的功能灵敏度可达0.4μg/L，对Fer的功能灵敏度可达0.4μg/L。
表2线性范围测定
Figure BDA0002534594040000101
Figure BDA0002534594040000111
Figure BDA0002534594040000121
Figure BDA0002534594040000131
表2中实施例1-6和对比例1-3中理论浓度和测定值的单位为mg/L，实施例7-8中理论浓度和测定值单位为μg/L。
根据上述表2的测定结果可知，对于β2-MG抗原样本，实施例1-5的相关系数均大于0.99，即线性相关性好，对比例1-5的线性相关系数均小于0.99，即线性相关性差，其中对比例4-5的线性相关系数与0.99相差不大，说明小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂的浓度比对线性范围的影响相对较小。在理论浓度为82mg/L时，对比例1-3的测量值分别为35.845mg/L、56.793mg/L和17.228mg/L，该测量值对应对比例1-3的线性高值，而实施例1-5的线性高值均高达82mg/L，并且实施例1的相关系数最大，即其线性相关性最优。将实施例1和对比例1-3的测量均值作为纵坐标，将理论浓度值作为横坐标，绘制线性范围曲线，结果如附图1所示。根据线性范围曲线可知，对比例1-3均出现了明显的hook效应，导致测定结果的准确性偏低，无法满足临床需求，对比例2的线性高值虽然可达到56mg/L，但在某些浓度下其相对偏差超过10％，即线性相关性较差。将β2-MG抗原样本更换为CRP样本(实施例6)、cTnI样本(实施例7)和Fer样本(实施例8)时，其相关系数和相对偏差值也均满足测定要求，其中对CRP样本的线性高值可达255mg/L，对cTnI样本的线性高值可达25μg/L，对Fer样本的线性高值可达1000μg/L。
综合上述灵敏度和线性范围数据，其中对比例1得到的试剂的功能灵敏度低，无法检测0.1mg/L及以下的浓度，并且线性高值仅为35mg/L左右，难以满足临床需求；对比例2测得的线性高值虽然可达到56mg/L左右，但是其线性相关性差，并且由于大粒径胶乳试剂的制备过程中添加的活化剂和抗体过量，影响了试剂的灵敏度，使其功能灵敏度降低，无法满足临床需求；对比例3的功能灵敏度有所提高，但是由于小粒径胶乳试剂的制备过程中添加的活化剂和抗体含量降低，影响了试剂的线性，导致线性高值过低，即高浓度样本的测量结果偏低，无法满足临床需求。对比例4-5得到的试剂盒的功能灵敏度和线性范围虽然相比于实施例1-5有所降低，但降低程度较小，说明小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂的浓度比对功能灵敏度和线性的的影响相对较小。根据实施例1-5的测量结果可知，按照本发明所述的试剂的制备方法得到的试剂盒，其灵敏度和线性均有显著提高，可有效满足临床使用需求。
表3准确度测定
Figure BDA0002534594040000141
Figure BDA0002534594040000151
表4精密度测定
均值 标准差 CV
实施例1 1.93 0.04 1.95％
实施例2 1.89 0.05 2.79％
实施例3 1.9 0.05 2.76％
实施例4 1.88 0.05 2.63％
实施例5 1.85 0.04 2.37％
实施例6 1.93 0.06 2.97％
实施例7 1.92 0.05 2.60％
实施例8 1.93 0.04 2.13％
根据表3-4的测定结果可知，按照实施例1-8所述的制备方法得到的试剂盒，在准确度测定时，偏差值均小于10％；在精密度测定时，CV值均小于5％，即实施例1-8得到的试剂盒的准确度和精密度性能未受到影响，仍满足临床使用需求。
综上所述，按照本发明所述的制备方法得到的胶乳免疫比浊法测定试剂盒在检测样品中抗原含量时，不仅显著提高了检测试剂的灵敏度和线性，并且准确度和精密度等性能未受到影响，可充分满足临床使用需求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成，所述R2试剂中含有偶联有抗体的胶乳试剂，其特征在于，所述胶乳试剂由小粒径胶乳试剂和大粒径胶乳试剂组成，其中所述小粒径胶乳试剂中，小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.08-0.12：0.04-0.06；所述大粒径胶乳试剂的制备过程中，大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.02-0.04：0.005-0.01。
2.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，其特征在于，所述小粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.1：0.05；所述大粒径胶乳微球、活化剂和抗体的质量比为1：0.03：0.008。
3.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，其特征在于，所述小粒径胶乳试剂和所述大粒径胶乳试剂的浓度比为1：0.8-1.2。
4.根据权利要求3所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，其特征在于，所述小粒径胶乳试剂和所述大粒径胶乳试剂的浓度比为1：1。
5.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，其特征在于，所述活化剂为EDC和NHS按浓度比为1：1混合得到的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，其特征在于，所述小粒径胶乳微球的粒径为60-90nm；所述大粒径胶乳微球的粒径为200-250nm。
7.根据权利要求6所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒，其特征在于，所述小粒径胶乳微球的粒径为80nm，所述大粒径胶乳微球的粒径为230nm。
8.权利要求1所述的一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒在检测目的抗原或抗体中的应用。
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