WO2013097607A1 - 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 - Google Patents

检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 Download PDF

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WO2013097607A1
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asymmetric dimethylarginine
latex
buffer
adma
determining
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PCT/CN2012/086510
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周建平
高爱民
刘瑶
蔡华雅
刘希
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北京九强生物技术股份有限公司
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex

Definitions

  • the invention provides a kit for determining the content of asymmetric dimethylarginine in human serum and plasma samples by using an immunoturbidimetric method, and particularly relates to utilizing asymmetric dimethylarginine and cross-linking in human serum and plasma samples.
  • a latex suspension with an asymmetric dimethylarginine-human serum albumin complex competes with a murine anti-symmetric dimethylarginine monoclonal antibody to achieve a high sensitivity by detecting a decrease in immune turbidity And a wide range of detection, belongs to the field of medical immune in vitro diagnostics. Background technique
  • ADMA Asymmetric diethylarginine
  • NOS nitric oxide synthase
  • NO nitric oxide
  • Changes in plasma ADMA concentration are closely related to the severity of vascular lesions such as vascular endothelial dysfunction, atherosclerosis, cerebral infarction, hypertension, hyperlipoprotein abnormalities, diabetes, renal failure, etc., and are currently the focus of clinical research.
  • concentration of plasma ADMA is a risk factor for endothelial dysfunction and cardiovascular disease.
  • ADMA is produced in vivo by arginine methyltransferase.
  • arginine methyltransferase There are two types of arginine methyltransferase: type I methylated histone and nuclear RNA-binding protein to produce NG-monomethyl-L-spermine Acid (NG-monomethyl-L-arginine, L-NMMA) and ADMA; Type II methylated myelin-based protein produces L-NMMA and symmetric dimethylarginine (SDMA).
  • L-NMMA and ADMA can reduce the activity of NOS, but the plasma concentration of the former is about 1/20 of that of ADMA. Therefore, most studies are directed to the detection of ADMA.
  • the concentration of SDMA in plasma is similar to that of ADMA, but has no effect on NOS.
  • the determination of ADMA in biological samples is cumbersome because of the presence of arginine and the cross-reactivity of SDMA and ADMA in the assay.
  • ADMA differs from arginine only in the two methyl groups on one sulfhydryl nitrogen.
  • the concentration of arginine in normal human serum is approximately 100 times the concentration of ADMA.
  • SDMA is closer to ADMA than arginine, no The only thing is the location of a methyl group. In normal human serum, the concentration of SDMA is comparable to the concentration of ADMA, which is approximately luM.
  • the technical object of the present invention is to provide an asymmetric dimethylarginine detection kit which can be applied to a fully automated biochemical analysis instrument, which can quickly and accurately detect asymmetric dimethyl essence in human plasma samples. Amino acid content.
  • a first aspect of the invention relates to a latex-enhanced immunoturbidimetric kit for determining an asymmetric dimethylarginine content, comprising:
  • the asymmetric dimethylarginine R1 reagent comprises an asymmetric dimethylarginine-specific monoclonal antibody, a buffer, a stabilizer, a coagulant, and a preservative;
  • the asymmetric dimethylarginine R2 reagent comprises an asymmetric dimethylarginine-inert protein complex coated latex granule, a buffer, a stabilizer and a preservative;
  • the asymmetric dimethylarginine calibrator consists of an asymmetric dimethylarginine, a buffer, a stabilizer, and a preservative.
  • the asymmetric dimethylarginine-inert protein complex is obtained by coupling an asymmetric dimethylarginine and an inert protein with a coupling agent.
  • the coupling agent is selected from the group consisting of carbodiimide (EDAC), glutaraldehyde, a diisocyanate compound, and a dihalogenated dinitrobenzene.
  • the inert protein is selected from one of human serum albumin, bovine serum albumin, bovine transferrin, and hemocyanin.
  • the latex particles are a core-shell structure
  • the core is a polystyrene polymer
  • the milk shell is composed of styrene, n-butyl acrylate and a methacrylic acid copolymer.
  • the latex particles may be selected from the group consisting of a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a hydrazide group, and a chloromethyl group, depending on the chemical group carried on the surface thereof.
  • the latex particles have a diameter ranging from 50 to 250 nm and a use concentration selected from 0.05 to 0.5%.
  • the asymmetric dimethylarginine-inert protein complex can be chemically bonded to the surface of the latex particles by a chemical group carried by the latex particles themselves.
  • Common chemical groups include a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, and an acyl group. Sulfhydryl, chloromethyl, etc., the present invention specifically binds an asymmetric dimethylarginine-inert protein complex to a carboxyl group on the surface of a latex particle by an optimized chemical crosslinking method, the optimized chemical crosslinking method Can be summarized as the "one step double pH" method.
  • the buffer is selected from the group consisting of 3-[N,N-bis(hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid-sodium hydroxide buffer, 4-(2-hydroxyethyl)-1- One or more of piperazine propanesulfonic acid-sodium hydroxide buffer, trishydroxymethylaminocarbamidine-HC1 buffer, phosphate buffer, glycine buffer, and barbital buffer, using concentration From 10-200 mM.
  • the stabilizer is selected from the group consisting of bovine serum albumin in a concentration range of 0.1-5%, sodium chloride in a concentration range of 0.5-1%, EDTA in the range of 2-50 mM, Tween-20 in a concentration range of 0.1-1%, One or two or more kinds of glycerol in a concentration range of 1-10%.
  • the preservative is selected from one or more selected from the group consisting of sodium azide, thimerosal, phenol and sodium thiomercurate, and the use concentration is selected from 0.02% to 0.1%.
  • the coagulant is selected from the group consisting of PEG-4000, PEG-6000, PEG-8000, sodium dextran sulfate, and the concentration range used is selected from 1-6%.
  • the latex-enhanced immunoturbidimetric kit for determining the asymmetric dimethylarginine content consists of the following components:
  • Rl 0.2 mg/mL ADMA monoclonal antibody, 0.9% sodium chloride, 5% PEG-6000, 0.2% BSA, 20 mM EDTA, 0.1% sodium azide, 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.2 ;
  • R2 Asymmetric dimethylarginine-human serum albumin complex coated polystyrene latex particles 0.25%, 50 mM glycine buffer pH 8.0, 0.9% sodium chloride, 0.8% BSA, 20 mM EDTA, 0.1 % Tween 20, 0.1% sodium azide, wherein the polystyrene latex particles have a carboxyl group on the surface and a diameter of 150 nm ;
  • Asymmetric dimethylarginine calibrator asymmetric dimethylarginine, 0.9% sodium chloride, 1% BSA, 50 mM EDTA at concentrations of 0, 0.5, 2, 5, 10, 20umol/L, respectively 0.1% sodium azide, 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.2.
  • the present invention is based on a monoclonal antibody specific for ADMA and a latex particle suspension cross-linked with ADMA-human serum albumin, which reacts in a specific reaction system to form a certain turbidity, which can be based on spectrometry.
  • the photometric biochemical analyzer detected it.
  • ADMA is quantitatively analyzed by measuring the degree of decrease in turbidity of the system after the reaction.
  • the invention simultaneously solves the problem of low specificity and low degree of automation of ADMA detection, and can be widely applied.
  • the present invention adopts a technical scheme of: preparing an R2 reagent by coating latex particles with ADMA coupled to an inert protein and suspending it in a specific buffer.
  • the latex particles used for coating have a diameter ranging from 100 to 200 nm and a concentration of from 1 to 5 mg/mL. Since the molecular weight of ADMA is very small, it is difficult to bind to the latex particles. Therefore, the ADMA used for coating in the present invention is first coupled to the inert macromolecular protein by a chemical bond, and the larger molecular weight inert protein can be better combined with the latex particle, and the concentration of the inert protein coupled with ADMA is 0.1-lmg/ mL.
  • the inert protein coupled with ADMA is further coated on the surface of the latex particles by an optimized chemical crosslinking method.
  • the chemical crosslinking method used is a "one-step double pH" method, that is, the latex particles are first activated by the activator at a low pH. It is then mixed with the ADMA-inert protein complex in a high pH solution. The pH of the mixed solution is neutral. This method allows the inert protein coupled with ADMA to bind efficiently and specifically to the surface of the latex particles.
  • the suspension buffer used was a glycine-NaOH buffer containing a stabilizer and a preservative at a concentration of 20-100 mM and a pH range of 7-9.
  • the stabilizer used is 0.1-1% of bovine serum albumin, 0.7-0.9% of sodium chloride, 5-50 mM of ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.1-1% of Tween 20 concentration.
  • the preservative used was sodium azide 0.05-0.1%.
  • the R1 reagent is prepared by adding a monoclonal antibody specific for ADMA to a specific buffer, and an inorganic salt, a coagulant, a protein, and a preservative are added to the specific buffer.
  • the monoclonal antibody selected therein is an antibody specific for ADMA, and can be produced by a well-recognized hybridoma method, or a commercially available product such as Abcam, Mlilipore or the like can be purchased.
  • the selected ADMA monoclonal antibody was first tested by indirect ELISA and confirmed to not cross-react with SDMA, L-NMMA and arginine.
  • the buffering capacity of the buffer is required to adjust the pH range between 7-9, and various buffers can be selected, preferably HEPES, glycine, Tris, etc., and have buffer energy compared with other buffers. Strong, high solubility, good biocompatibility and inert reaction. Among them, Tris-HCl can control a constant pH range for a long time, and therefore Tirs-HCl is more preferable, and its concentration ranges from 10 to 100 mM, and the pH ranges from 7 to 8. The choice of PEG-6000 for coagulant can speed up the immune response and shorten the detection time. The final concentration is 2-6%.
  • the protein is selected from bovine serum albumin at a final concentration of 0.1-1%. The sodium chloride concentration is 0.7-0.9%, and the sodium azide concentration is 0.05-0.1%.
  • a multi-point calibrator is prepared by adding ADMA concentrations of 0, 0.5, 2, 5, 10, 20 umol/L to a specific buffer, wherein the buffering capacity of the buffer is required to adjust the pH range between 7-9, which can be selected.
  • Various buffers preferably HEPES, glycine, Tris, etc., have higher buffering capacity, higher solubility, good biocompatibility and reaction inertness than other buffers.
  • Tris-HCl can control a constant pH range for a long time, so Tirs-HCl is more preferred, and its concentration range is 10-200 mM, and the pH range is 7-8.
  • a specific protein stabilizer such as bovine serum albumin at a concentration of 0.1-1%
  • a specific preservative such as sodium azide at a concentration of 0.05-0.1%
  • a specific antioxidant such as ethylenediaminetetraacetic acid at a concentration of 5- 50mM o
  • the present invention provides a method for measuring an asymmetric dimethylarginine immunoturbidimetric assay in human plasma or serum samples, which comprises administering human plasma, serum samples containing asymmetric dimethylarginine, Competition with latex particle-coated asymmetric dimethylarginine to bind to a monoclonal antibody specific for ADMA, resulting in a decrease in turbidity, the extent of which is related to the amount of asymmetric dimethylarginine in human plasma and serum.
  • the content of asymmetric dimethylarginine in human plasma and serum samples can be calculated using an automatic biochemical analyzer.
  • the invention has the following characteristics:
  • Figure 1 is a line graph of the kit prepared in accordance with the present invention.
  • Figure 2 is a correlation between the kit prepared by the present invention and the HPLC method kit for detecting clinical samples. detailed description
  • Example 1 Preparation of human serum albumin coupled with asymmetric dimethylarginine 10 mg of human serum albumin was diluted with 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.8), and then asymmetric dimethyl arginine was added. The acid was further added with 50 mg of ED AC, reacted at 4 ° C for 24 hours, and dialyzed against 0.1 M phosphate buffer (pH 7.8) at 4 ° C for 24 hours to prepare ADMA-conjugated human serum albumin ( Asymmetric dimethylarginine-human serum albumin complex).
  • Example 2 Preparation of asymmetric dimethylarginine R2 reagent
  • a polystyrene latex solution with a carboxyl group and a diameter of 150 nm (concentration 10%) (purchased from Merck) 0.5 mL was added, 4.5 mL of 0.05 M MES buffer (pH 6.0) was added, and then 5 mg of ED AC was added at 37°. C reacted for 1 hour. Further, 0.5 mg of ADMA-conjugated human serum albumin was diluted with 5 mL of 0.05 M borate buffer (pH 9.2), and immediately added to the above latex solution, and reacted at 37 ° C for 6 hours. Finally, add 1 mL of 0.1 M glycine buffer (pH 8.5) and stir for 1 h to terminate the reaction.
  • test kit 1. Usage of the test kit:
  • the human serum samples were diluted with physiological saline to prepare samples with concentrations of 0.1, 0.5, 1, 2 umol/L, respectively, using the above asymmetric dimethylarginine R1, asymmetric dimethylarginine R2 and asymmetric dimethyl
  • the kit consisting of a arginine calibrator was compared with the ELISA reagent h box of Company A.
  • the basic analysis principle of the company's reagents is to first acylate the ADMA in the sample with an acylating reagent, then add the ELISA plate, and competitively bind the ADMA polyclonal antibody to the ADMA bound to the solid phase, using different levels of standards.
  • the kit of the present invention is more reproducible than the ELISA kit of Company A, and is more advantageous for clinical diagnosis.

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Abstract

一种胶乳增强免疫比浊法测定血液样品中非对称二甲基精氨酸（ADMA）含量的试剂盒，其由鼠抗人ADMA单克隆抗体溶液、交联有ADMA-人血清白蛋白复合体的胶乳颗粒悬浮液和ADMA校准品组成。利用血液中游离ADMA与交联在胶乳颗粒表面的ADMA竞争结合ADMA单克隆抗体，使得交联ADMA的胶乳颗粒与ADMA单抗反应形成的浊度下降，通过浊度下降的程度来检测ADMA的含量。

Description

检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 技术领域
本发明提供了一种利用免疫比浊方法测定人血清、 血浆样本中非 对称二甲基精氨酸含量的试剂盒， 具体涉及利用人血清、 血浆样本中 非对称二甲基精氨酸和交联有非对称二甲基精氨酸-人血清白蛋白复合 体的胶乳悬浮液竞争结合鼠抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体， 通过 检测免疫浊度的下降， 达到较高的灵敏度和较宽的检测范围， 属于医 学免疫体外诊断领域。 背景技术
非对称二甲基精氨酸 （asymmetric diethylarginine, ADMA) 是一种 天然氨基酸， 广泛存在于组织和细胞中。 它能抑制一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase, NOS ) 的合成及由此而产生的生物学效应， 阻 止内皮细胞一氧化氮 （NO ) 的合成， 导致血管内皮功能降低。 血浆 ADMA浓度的变化与血管内皮功能损害、 动脉粥样硬化、 脑梗死、 高 血压、 高脂蛋白异常、 糖尿病、 肾功能衰竭等血管性病变的严重程度 密切相关， 是目前临床研究的重点课题之一。 可以说， 血浆 ADMA的 浓度是内皮功能不全和心血管疾病的危险因子。
ADMA在体内由精氨酸甲基转移酶生成， 精氨酸甲基转移酶有两 种类型： I 型甲基化组蛋白和核内 RNA-结合蛋白生成 NG-单甲基 -L- 精氨酸（NG-monomethyl-L-arginine， L-NMMA)和 ADMA; II型仅甲 基化髓磷脂主要蛋白产生 L-NMMA和对称性二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine, SDMA)。 L-NMMA和 ADMA均能降低 NOS的活性， 但前者血浆浓度大约是 ADMA的 1/20,因此，大多数研究都针对 ADMA 的检测。 SDMA在血浆中的浓度与 ADMA相似， 但对 NOS没有效应。
测定血浆中 ADMA的方法包括高效液相色谱、酶联免疫和免疫荧 光等。 但是生物样品中 ADMA 的测定比较烦琐， 因为存在精氨酸和 SDMA与 ADMA在检测中表现交叉反应性。 ADMA与精氨酸的不同 仅在于一个胍基氮上的两个甲基。 此外， 正常人血清中精氨酸的浓度 大约是 ADMA浓度的 100倍。 SDMA比精氨酸更接近于 ADMA, 不 同之处仅在于一个甲基的位置。 在正常人血清中， SDMA 的浓度与 ADMA的浓度相当， 大约为 luM。
不仅如此， 上述检测 ADMA的方法， 都存在样品处理烦琐、 手工 操作、耗时间长的特点。 因此， 发明一种特异性检测人血浆中 ADMA, 同时能够应用到自动化仪器上的试剂盒成为非常之需。 发明内容
因此， 本发明的技术目的在于提供一种能够应用到全自动化生化 分析仪器上的非对称二甲基精氨酸检测试剂盒， 能够快速、 准确的检 测人血浆样本中的非对称二甲基精氨酸含量。
因此， 本发明的第一方面涉及一种测定非对称二甲基精氨酸含量 的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 包括：
1 ) 非对称二甲基精氨酸 R1试剂；
2) 非对称二甲基精氨酸 R2试剂；
3 ) 非对称二甲基精氨酸校准品；
所述非对称二甲基精氨酸 R1 试剂包括非对称二甲基精氨酸特异 性单克隆抗体、 缓冲液、 稳定剂、 促凝剂和防腐剂；
所述非对称二甲基精氨酸 R2试剂包括非对称二甲基精氨酸 -惰性 蛋白复合体包被的胶乳颗粒、 缓冲液、 稳定剂和防腐剂；
所述非对称二甲基精氨酸校准品是由非对称二甲基精氨酸、 缓冲 液、 稳定剂和防腐剂组成。
优选地， 所述非对称二甲基精氨酸-惰性蛋白复合体是通过偶联剂 将非对称二甲基精氨酸和惰性蛋白偶联后而获得。 优选地， 所述偶联 剂选自碳化二亚胺 （EDAC)、 戊二醛、 二异氰酸化合物和二卤化二硝 基苯中的一种。
优选地， 所述的惰性蛋白选自人血清白蛋白、 牛血清白蛋白、 牛 转铁蛋白、 血蓝蛋白中的一种。
优选地， 所述胶乳颗粒是一种核壳结构， 乳核是聚苯乙烯聚合物， 乳壳由苯乙烯、 丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物组成。
优选地， 所述胶乳颗粒根据其表面所带的化学基团不同可以选自 羧基、 氨基、 羟基、 酰肼基、 氯甲基修饰的一种。 优选地， 所述胶乳颗粒直径范围为 50-250nm， 使用浓度选自 0.05-0.5%。
优选地， 所述非对称二甲基精氨酸-惰性蛋白复合体可以通过与胶 乳颗粒本身携带的化学基团通过化学键结合在胶乳颗粒表面， 常用的 化学基团包括羧基、 氨基、 羟基、 酰肼基、 氯甲基等， 本发明通过优 化的化学交联方法将非对称二甲基精氨酸-惰性蛋白复合特异性的结合 在胶乳颗粒表面的羧基上， 所述优化的化学交联方法可以概括为 "一 步双 pH"法。
优选地， 所述缓冲液选自 3-[N,N-二 （羟乙基） 氨基] -2-羟基丙磺 酸 -氢氧化钠缓冲液、 4- (2-羟乙基） -1-哌嗪丙磺酸 -氢氧化钠缓冲液、 三羟甲基氨基甲垸 -HC1缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 甘氨酸缓冲液和巴比 妥缓冲液中的一种或两种以上， 使用浓度选自 10-200mM。
优选地，所述稳定剂选自 0.1-5%浓度范围的牛血清白蛋白、 0.5-1% 浓度范围的氯化钠、 2-50mM 的 EDTA、 0.1-1%浓度范围的吐温 -20、 1-10%浓度范围的丙三醇一种或两种以上。
优选地， 所述防腐剂选自叠氮钠、 硫柳汞、 苯酚和乙基汞硫代硫 酸钠中的一种或两种以上， 使用浓度选自 0.02%-0.1%。
优选地， 所述促凝剂选自 PEG-4000、 PEG-6000, PEG-8000, 硫 酸葡聚糖钠中的一种， 使用浓度范围选自 1-6%。
最优选地， 所述的测定非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫 比浊法试剂盒由如下组分组成：
Rl : 0.2mg/mLADMA单克隆抗体、 0.9%氯化钠、 5% PEG-6000、 0.2% BSA、 20mM EDTA、 0.1% 叠氮化钠、 50 mM Tris-HCl缓冲液 pH7.2;
R2: 非对称二甲基精氨酸 -人血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶 乳颗粒 0.25%、 50mM甘氨酸缓冲液 pH8.0、 0.9%氯化钠、 0.8% BSA、 20mM EDTA、 0.1% 吐温 20、 0.1% 叠氮化钠， 其中所述聚苯乙烯胶 乳颗粒表面带有羧基、 直径为 150nm;
非对称二甲基精氨酸校准品：浓度分别为 0、 0.5、 2、 5、 10、 20umol/L 的非对称二甲基精氨酸、 0.9%氯化钠、 1% BSA、 50mM EDTA、 0.1% 叠 氮化钠、 50 mM Tris-HCl缓冲液 pH7.2。 换言之， 本发明基于一个特异性针对 ADMA的单克隆抗体和交联 有 ADMA-人血清白蛋白的胶乳颗粒悬浮液，在特定的反应体系中发生 抗原抗体反应形成一定的浊度， 能够被基于分光光度计的生化分析仪 检测到。 而人血浆中如果有游离状态的 ADMA存在， 会与固定在胶乳 颗粒表面的 ADMA竞争结合单克隆抗体， 使浊度下降， 通过测定反应 后体系浊度的降低程度来对 ADMA进行定量分析。
本发明同时解决了 ADMA检测的特异性和自动化程度低的问题， 可以广泛推广应用。
具体而言， 为了实现上述目的， 本发明采取的技术方案是： 通过 用偶联在惰性蛋白上的 ADMA包被胶乳颗粒并悬浮在特定缓冲液中制 作 R2试剂。 其中用作包被的胶乳颗粒直径范围为 100-200nm， 浓度为 l-5mg/mLo 由于 ADMA分子量非常小， 很难与胶乳颗粒结合。 因此本 发明中用作包被的 ADMA首先通过化学键偶联在惰性大分子蛋白上， 分子量较大的惰性蛋白可以更好的与胶乳颗粒结合， 偶联有 ADMA的 惰性蛋白浓度为 0.1-lmg/mL。偶联有 ADMA的惰性蛋白进一步通过优 化的化学交联方法包被在胶乳颗粒表面， 所用的化学交联方法为 "一 步双 pH"法， 即胶乳颗粒首先在低 pH条件下被活化剂激活， 再与高 pH溶液中的 ADMA-惰性蛋白复合体混合， 混合后的溶液 pH为中性， 这种方法可以使得偶联有 ADMA的惰性蛋白高效、特异的与胶乳颗粒 表面结合。 所用作的悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的甘氨酸 -NaOH缓冲液， 浓度为 20-100mM， pH范围为 7-9。 所用作的稳定剂 为牛血清白蛋白 0.1-1%、 氯化钠浓度为 0.7-0.9%、 乙二胺四乙酸浓度 为 5-50mM、 吐温 20浓度为 0.1-1%。 所用防腐剂为叠氮钠 0.05-0.1%。
通过在特定缓冲液中加入特异性针对 ADMA的单克隆抗体来制作 R1试剂， 特定缓冲液中要添加无机盐、 促凝剂、 蛋白质和防腐剂。 其 中所选择的单克隆抗体为特异性针对 ADMA的抗体， 可以通过本领域 公认的杂交瘤方法制备， 也可以购买商品化的产品， 例如 Abcam、 Mlilipore等。 所选择的 ADMA单克隆抗体首先要通过间接 ELISA方 法检测， 确认不会与 SDMA、 L-NMMA和精氨酸产生交叉反应。 其中 要求缓冲液的缓冲能力为调节 pH范围在 7-9之间， 可以选择各种缓冲 液， 优选 HEPES、 甘氨酸、 Tris等， 与其他缓冲液相比， 具有缓冲能 力强、 溶解度高、 很好的生物适应性和反应惰性。 其中 Tris-HCl能较 长时间控制恒定的 pH 范围， 因此更优选 Tirs-HCl, 其浓度范围为 10-lOOmM, pH范围为 7-8。 促凝剂选择 PEG-6000, 可以加快免疫反 应速度， 缩短检测时间， 其终浓度为 2-6%。蛋白质选择牛血清白蛋白， 终浓度为 0.1-1%。 氯化钠浓度为 0.7-0.9%, 叠氮钠浓度为 0.05-0.1%。
通过在特定缓冲液中添加 ADMA浓度分别为 0、 0.5、 2、 5、 10、 20umol/L制作多点校准品， 其中要求缓冲液的缓冲能力为调节 pH范 围在 7-9之间， 可以选择各种缓冲液， 优选 HEPES、 甘氨酸、 Tris等， 与其他缓冲液相比， 具有缓冲能力强、 溶解度高、 很好的生物适应性 和反应惰性。其中 Tris-HCl能较长时间控制恒定的 pH范围， 因此更优 选 Tirs-HCl, 其浓度范围为 10-200mM， pH范围为 7-8。 其中含有特定 的蛋白稳定剂如牛血清白蛋白浓度为 0.1-1%, 含有特定的防腐剂如叠 氮钠浓度为 0.05-0.1% , 含有特定的抗氧化剂如乙二胺四乙酸浓度为 5-50mM o
本发明提供用于测量在人血浆、 血清样品中的非对称二甲基精氨 酸免疫比浊测定方法， 其特征在于， 通过将含有非对称二甲基精氨酸 的人血浆、 血清样本， 与胶乳颗粒包被的非对称二甲基精氨酸竞争结 合特异性针对 ADMA的单克隆抗体， 导致浊度下降， 下降的程度与人 血浆、 血清中的非对称二甲基精氨酸含量成正比， 采用全自动生化分 析仪器可以计算出人血浆、 血清样本中非对称二甲基精氨酸的含量。
本发明与现有技术相比， 具有如下特点：
1 ) 能够应用在自动生化分析仪器上， 检测速度快；
2) 检测特异性强， 不与 L-NMMA、 SDMA和精氨酸产生交叉反 应， 与 HPLC方法具有很高的相关性；
3 )检测灵敏度和检测范围达到其他正在临床应用的试剂盒同等水 平， 能够满足临床应用需要。 附图说明
图 1为本发明所制备试剂盒的线性图。
图 2为本发明所制备试剂盒与 HPLC方法试剂盒检测临床样本比 对的相关性。 具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明， 本领域技术 人员公知， 在不背离本发明精神的情况下， 可以对本发明做出许多修 改， 这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明， 均为常规方法， 所使用的实验材料 如无特别说明， 均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例 1 : 制备偶联非对称二甲基精氨酸的人血清白蛋白 将 10mg人血清白蛋白用 lmL 0.1M磷酸盐缓冲液 （pH7.8 ) 稀释 后， 加入非对称二甲基精氨酸， 再加入 50mg ED AC, 在 4°C反应 24 小时， 再用 0.1M磷酸盐缓冲液 （pH7.8 ) 在 4°C条件下透析 24小时， 制作成偶联 ADMA 的人血清白蛋白 （非对称二甲基精氨酸-人血清白 蛋白复合体）。 实施例 2: 制备非对称二甲基精氨酸 R2试剂
表面带有羧基、直径 150nm的聚苯乙烯胶乳溶液（浓度 10% ) (购 自 Merck) 0.5mL， 加入 4.5mL的 0.05M MES缓冲液 （pH6.0)， 然后 加入 5mg ED AC,在 37°C反应 1小时。再将 0.5mg偶联有 ADMA的人 血清白蛋白用 5mL 0.05M硼酸盐缓冲液（pH9.2)稀释后， 立即加入到 上述胶乳溶液中， 在 37°C反应 6小时。 最后加入 lmL 0.1M的甘氨酸 缓冲液 （pH8.5 ) 搅拌 lh来终止反应， 离心去掉上清， 用 20mL 50mM 的甘氨酸缓冲液（pH8.0)洗涤 3次， 50mM的甘氨酸缓冲液中含有 0.9% 氯化钠、 20mM EDTA、 0.8%BSA、 0.1%吐温 20、 0.1%叠氮化钠， 最 后再以同样 20mL的甘氨酸缓冲液分散成乳白色胶乳悬浮液， 为 R2试 剂， 最终 R2试剂中非对称二甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体包被的 聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为 0.25%。 实施例 3 : 制备非对称二甲基精氨酸 R1试剂
在 50mM pH7.2的 Tris-HCl缓冲液中， 添加 0.2mg/mL的 ADMA 单克隆抗体 （购自 Abeam) , 同时添加氯化钠 0.9%、 PEG-6000 5%、 BSA 0.2%、 EDTA 20mM、 叠氮化钠 0.1%, 搅拌均匀为 Rl试剂。 实施例 4: 制备非对称二甲基精氨酸校准品
在 50mM pH7.2的 Tris-HCl缓冲液中， 加入浓度分别为 0、 0.5、 2、 5、 10、 20umol/L的非对称二甲基精氨酸， 另外添加氯化钠 0.9%、 BSA 1%、 EDTA 50mM、 叠氮化钠 0.1%, 搅拌均匀为非对称二甲基精氨酸 多点校准品。 实施例 5: 非对称二甲基精氨酸剂盒的性能检测
1. 检测试剂盒的用法：
以曰立 7180生化分析仪为例： 测定波长 570nm， 首先加入 Rl试 剂 150uL， 37°C反应 30秒后加入 ADMA校准品 10uL， 再反应 60秒后 加入 R2试剂 50uL， 测定反应第 10秒、 70秒的吸光度值 （Al、 A2)， 计算吸光度差值 ΔΑ=Α2-Α1， 每管重复测定 2次， 将各校准品管 2次 测得的吸光度差值 ΔΑ为纵坐标， 对应的浓度为横坐标， 制作 "浓度- 吸光度差值"校准曲线， 取待测样本， 同法测定样本的吸光度差值， 代入校准曲线， 即可计算出待测样本中 ADMA的含量。 2. 重复性检测：
以生理盐水稀释人血清样本，配制浓度分别为 0.1、 0.5、 1、 2umol/L 的样本， 用上述非对称二甲基精氨酸 Rl、 非对称二甲基精氨酸 R2和 非对称二甲基精氨酸校准品组成的试剂盒， 与 A公司的 ELISA试剂 h 盒比较重复性能。 A 公司的试剂基本分析原理是， 先使用酰基化试剂 将样本中的 ADMA 酰基化， 然后加入酶标板， 与结合在固相上的 ADMA竞争性结合 ADMA多克隆抗体，采用不同水平的标准品与酶标 记抗体竞争结合， 然后显色读出吸光度， 制作标准曲线。 样品与标准 品同样步骤操作后， 在标准曲线上得到相应 ADMA浓度。 本发明试剂 盒按照 1所述的方法测定 10次， 计算不同 ADMA含量样本检测的变 异系数，与 A公司商品化的 ELISA试剂盒比较结果如下表 1和 2所示： 表 1 本发明试剂盒的检测重复性： O.luM 0.5uM luM 2uM
1 0.14 0.52 1.01 2.12
2 0.13 0.47 1.02 2.18
3 0.18 0.48 1.11 2.07
4 0.14 0.49 1.07 2.09
5 0.15 0.45 1.08 2.08
6 0.12 0.46 1.04 2.1
7 0.17 0.49 0.98 2.12
8 0.19 0.55 1.01 2.04
9 0.12 0.58 1.02 2.08
10 0.17 0.47 1.07 2.09
平均值 0.151 0.496 1.041 2.097
SD 0.025144 0.0416867 0.0401248 0.0374314
CV 16.7% 8.4% 3.9% 1.8% 表 2、 A公司的 ELISA试剂盒的检测重复性:
Figure imgf000010_0001
从上表 1和 2可以看出，本发明试剂盒的重复性比 A公司的 ELISA 试剂盒好， 更有利于临床诊断的应用。
3. 线性检测：
筛选非对称二甲基精氨酸浓度约为 20umol/L的样本， 用生理盐水 做 10个不同比例的稀释， 按照 1所述的方法检测各浓度， 每浓度重复 测定 3 次， 将测定浓度的平均值与理论浓度进行回收率分析， 结果偏 差均小于 10%, 证明线性能达到 20umol/L， 结果见表 3和图 1。 表 3 本发明试剂盒的线性
Figure imgf000011_0001
4. 本发明试剂盒与 HPLC检测临床样本的相关性比较
用本发明的试剂盒与 HPLC对 34例病人样本同时进行检测， 检测 结果见图 2， 以 HPLC方法检测的样本 ADMA结果为横坐标， 以本发 明试剂盒检测的结果为纵坐标作回归分析， 相关方程为 Y=0.9965X+0.018， 相关系数 r=0.999， 经过统计学处理结果表明， 本 发明方法同 HPLC方法检测临床样本测值相关性良好， 表明本发明试 剂盒的检测特异性强。

Claims

权利要求书：
1、 一种测定非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂 盒， 其特征在于， 包括：
1 ) 非对称二甲基精氨酸 R1试剂；
2) 非对称二甲基精氨酸 R2试剂；
3 ) 非对称二甲基精氨酸校准品；
所述非对称二甲基精氨酸 R1 试剂包括非对称二甲基精氨酸特异 性单克隆抗体、 缓冲液、 稳定剂、 促凝剂和防腐剂；
所述非对称二甲基精氨酸 R2试剂包括非对称二甲基精氨酸 -惰性 蛋白复合体包被的胶乳颗粒、 缓冲液、 稳定剂和防腐剂；
所述非对称二甲基精氨酸校准品是由非对称二甲基精氨酸、 缓冲 液、 稳定剂和防腐剂组成。
2、 根据权利要求 1所述的测定非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增 强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述非对称二甲基精氨酸-惰性蛋 白复合体是通过偶联剂将非对称二甲基精氨酸和惰性蛋白偶联后而获 得。
3、 根据权利要求 1或 2所述的测定非对称二甲基精氨酸含量的胶 乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述的惰性蛋白选自人血清 白蛋白、 牛血清白蛋白、 牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的一种。
4、 根据权利要求 1至 3任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸含 量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述胶乳颗粒是一种 核壳结构， 乳核是聚苯乙烯聚合物， 乳壳由苯乙烯、 丙烯酸正丁酯和 甲基丙烯酸共聚物组成。
5、 根据权利要求 1至 4任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸含 量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述胶乳颗粒直径范 围为 50-250nm， 使用浓度选自 0.05-0.5%。
6、 根据权利要求 1至 5任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸含 量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述非对称二甲基精 氨酸-惰性蛋白复合体可以通过与胶乳颗粒本身携带的化学基团通过化 学键结合在胶乳颗粒表面， 常用的化学基团包括羧基、 氨基、 羟基、 酰肼基、 氯甲基等， 本发明通过优化的化学交联方法将非对称二甲基 精氨酸-惰性蛋白复合特异性的结合在胶乳颗粒表面的羧基上， 所述优 化的化学交联方法概括为 "一步双 pH"法。
7、 根据权利要求 1至 6任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸含 量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自 3-[N,N- 二 （羟乙基）氨基] -2-羟基丙磺酸 -氢氧化钠缓冲液、 4- (2-羟乙基） -1- 哌嗪丙磺酸 -氢氧化钠缓冲液、 三羟甲基氨基甲垸 -HC1缓冲液、 磷酸盐 缓冲液、 甘氨酸缓冲液和巴比妥缓冲液中的一种或两种以上， 使用浓 度选自 10-200mM。
8、 根据权利要求 1至 7任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸含 量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述稳定剂选自 0.1-5% 浓度范围的牛血清白蛋白、 0.5-1%浓度范围的氯化钠、 2-50mM 的 EDTA、 0.1-1%浓度范围的吐温 -20和 1-10%浓度范围的丙三醇一种或 两种以上。
9、 根据权利要求 1至 8任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸含 量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述防腐剂选自叠氮 钠、 硫柳汞、 苯酚和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或两种以上， 使用浓 度选自 0.02%-0.1%。
10、 根据权利要求 1至 9任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸 含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于， 所述促凝剂选自 PEG-4000、 PEG-6000、 PEG-8000 和硫酸葡聚糖钠中的一种， 使用浓 度范围选自 1-6%。
11、 根据权利要求 1至 10任一项所述的测定非对称二甲基精氨酸 含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒， 其特征在于其由如下组分组成：
Rl : 0.2mg/mLADMA单克隆抗体、 0.9%氯化钠、 5% PEG-6000、 0.2% BSA、 20mM EDTA、 0.1% 叠氮化钠、 50 mM Tris-HCl缓冲液 pH7.2;
R2: 非对称二甲基精氨酸 -人血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶 乳颗粒 0.25%、 50mM的甘氨酸缓冲液 pH8.0、 0.9%氯化钠、 0.8% BSA、 20mM EDTA、 0.1% 吐温 20、 0.1% 叠氮化钠， 其中所述聚苯乙烯胶 乳颗粒表面带有羧基、 直径为 150nm;
非对称二甲基精氨酸校准品：浓度分别为 0、0.5、2、5、 10、20umol/L 的非对称二甲基精氨酸、 0.9%氯化钠、 l% BSA、50mM EDTA、0.1% 叠 氮化钠、 50 mM Tris-HCl缓冲液 pH7.2。
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