CN105988001A - 一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法。该试剂盒包括(1)、试剂1:包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒;(2)、试剂2:包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。采用本发明的试剂盒进行检测非对称二甲基精氨酸,可以容易地增强免疫浊度,放大检测信号,具有无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉的优点,可实现临床快速、大流量的样本测试,使非对称二甲基精氨酸成为临床上常规检测项目成为可能,具有较高的经济价值。
Description
技术领域
本发明属于物质检验测定技术领域,具体涉及一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法。
背景技术
非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一种甲基化精氨酸,是内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide sythase,NOS)抑制剂,其可竞争性抑制一氧化氮(Nitric oxide,NO)的合成。非对称二甲基精氨酸由细胞内蛋白质在精氨酸甲基转移酶作用下发生甲基化,再经水解反应所生成。许多细胞,如人的内皮细胞均可产生ADMA。正常人体内每天产生约300μmol(约60mg),体内浓度远远高于其他同样可产生NOS抑制作用的内源性精氨酸,故被认为是最重要的NOS抑制剂。ADMA从细胞进入血液循环后,一部分被进一步分解代谢直接通过肾脏由尿液排出,但大部分(达250μmol)通过广泛分布于肾脏、肝脏和心血管系统的二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解。因此通过DDAH降解被认为是ADMD最为重要的代谢途径。
目前国内外多项研究证实在多种疾病,如动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症、心衰和中风等患者的血浆中ADMA水平呈显著性升高。因此,ADMA被公认为是一种新的心血管疾病危险因子。ADMA不仅参与心脏结构重塑,还与心脏功能异常有关,且还是肾功能和糖尿病诊断的重要指示因子。鉴于此,建立适用于临床的非对称二甲基精氨酸的测定方法有重大意义。
但目前临床应用中,非对称二甲基精氨酸的测定方法主要包括高压液相色谱法和酶联免疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器,操作复杂,试验耗时较长,不能应用于临床大流量的自动化分析,且价格昂贵。由于上述缺陷,目前非对称二甲基精氨酸尚未成为临床检测的常规项目。
目前尚未看到采用免疫比浊测定方法用于非对称二甲基精氨酸的检测试剂盒,原因在于,在常规的乳胶增强免疫比浊试剂盒方法中,若R1中加入抗ADMA单克隆抗体,在R2中加入包被ADMA-惰性蛋白偶联物的乳胶颗粒,并按照常规免疫浊测定,这种方法并不能改变单株单抗与小分子结合不能形成有效浊度的特征,这样实施操作不能完成检查。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服高压液相色谱法和酶联免疫法需要特别的测定仪器,操作复杂,试验耗时较长,不能应用于临床大流量的自动化分析,且价格昂贵;而若套用免疫比浊测定方法则非对称二甲基精氨酸的检测准确度低、抗干扰性能差的缺陷,提供了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法。采用本发明的试剂盒进行检测非对称二甲基精氨酸,可以容易地增强免疫浊度,放大检测信号,具有无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉的优点,可实现临床快速、大流量的样本测试,使非对称二甲基精氨酸成为临床上常规检测项目成为可能,具有极高的科学和经济价值。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:
本发明提供了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒,其包括:
试剂1:包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒;
试剂2:包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。
较佳地,所述的试剂1包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂;更佳地,所述的试剂1由包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂组成。
较佳地,所述的试剂2包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂;更佳地,所述的试剂2由包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂组成。
其中,所述的抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体一般可通过商业化公司获得,也可以通过将非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物免疫小鼠,制备单抗所得;所述的惰性载体较佳地包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种;所述的抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体更佳地为Acris Antibodies,Inc.公司的AP02005PU-N ADMA抗体。
其中,所述的非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物优选是将非对称二甲基精氨酸与惰性载体通过化学交联剂进行化学交联获得;较佳地,所述的惰性载体包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种;较佳地,所述的化学交联剂为EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和/或Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)。
其中,试剂1中,所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得:通过乳胶颗粒表面的化学基团,如羧基、氨基、巯基等,采用化学交联剂将抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体结合到乳胶颗粒表面。本发明中采用的化学交联方法,优选采用两步交联法,以确保悬浮缓冲液中没有残留的未结合的游离抗体,从而保证了试剂盒测定的准确性。更佳地,所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得:乳胶颗粒表面先经过EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化,然后加入抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体,此时抗体的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应,即可。最佳地,所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得:将乳胶颗粒加入到MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲溶液中,搅拌条件下加入EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺),室温反应,离心除去上清液,加入含有抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的pH 8.3硼酸缓冲液,室温包被,再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液,终止反应,离心清洗,超声分散,即得。
其中,试剂2中,所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得:通过乳胶颗粒表面的化学基团,如羧基、氨基、巯基等,采用化学交联剂将非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物结合到乳胶颗粒表面。本发明中采用的化学交联方法,优选采用两步交联法,以确保悬浮缓冲液中没有残留的未结合的游离抗原,从而保证了试剂盒测定的准确性。更佳地,所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制得:乳胶颗粒表面先经过EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化,然后加入非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物,此时偶联物的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应,即可。最佳地,所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制得:将乳胶颗粒加入到MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲溶液中,搅拌条件下加入EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺),室温反应,离心除去上清液,加入含有非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的pH 8.3硼酸缓冲液,室温包被,再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液,终止反应,离心清洗,超声分散,即得。
其中,所述的乳胶颗粒可为试剂盒检测领域常规使用的各种乳胶颗粒,所述的乳胶颗粒较佳地选自粒径为50~500nm(更佳地为100~300nm)、表面带有一种化学交联基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、酰肼基、氯甲基)的聚苯乙烯核壳结构的球状聚合物;所述的乳胶颗粒可为如PolyMicrospheres公司的型号为CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D或CB0267D羧基微球。
其中,所述的乳胶颗粒的质量体积浓度(w/v,g/ml)较佳地为0.01%~0.5%,更佳地为0.05%~0.3%。
其中,所述的缓冲液可为试剂盒检测领域常规使用的各种缓冲液,所述的缓冲液较佳地为3-(N-吗啉基)-丙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种;所述的缓冲液的浓度较佳地为10~300mmol/L,更佳地为30~100mmol/L;所述的缓冲液的pH较佳地为6~9。
其中,所述的免疫凝集促进剂可为试剂盒检测领域常规使用的各种免疫凝集促进剂,所述的免疫凝集促进剂较佳地包括聚乙二醇(PEG,分子量2000~20000)、硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种;所述免疫凝集促进剂的质量体积浓度(w/v,g/ml)较佳地为0.1~7%。
其中,所述的稳定剂可为试剂盒检测领域常规使用的各种稳定剂,所述的稳定剂选自20~300mmol/L甘氨酸、20~300mmol/L双甘氨肽、0.05~1%牛血清白蛋白、0.05~1%吐温-20、0.05~1% Triton X-100、10~300mmol/L蔗糖、10~300mmol/L海藻糖、10~300mmol/L甘露糖、0.2~20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)、0.5%~2%氯化钠和1%~10%甘油中的两种或两种以上;所述的百分比为质量百分比。
其中,所述的防腐剂可为试剂盒检测领域常规使用的各种防腐剂,所述的防腐剂选自叠氮钠、Proclin-300中的一种或两种,所述的防腐剂的质量百分比浓度为0.1%~1%。
较佳地,所述的试剂1的组成为:150mmol/L 3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液pH 6.90、0.01%包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、0.9%氯化钠、0.5%吐温-20、1% PEG-6000、2mmol/L EDTA、100mmol/L蔗糖、20mmol/L海藻糖和0.2%叠氮钠;所述的百分比为质量百分比。
较佳地,所述的试剂2的组成为:1.5%包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、30mmol/L甘氨酸缓冲液pH 7.6、0.3%吐温-20、0.15%Proclin-300、200mmol/L蔗糖和20mmol/L海藻糖;所述的百分比为质量百分比。
其中,所述的测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒优选还包括试剂盒校准品和试剂盒质控品,所述的试剂盒校准品和试剂盒质控品可为本领域常规使用的试剂盒校准品和试剂盒质控品。较佳地,所述的试剂盒校准品组成为:20μmol/L非对称二甲基精氨酸、50mmol/L Tris缓冲液pH 8.2、0.2%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA和0.15%Proclin-300;所述的试剂盒质控品组成为:1或5μmol/L非对称二甲基精氨酸、50mmol/LTris缓冲液pH 8.2、0.5%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA和0.15% Proclin-300;所述的百分比为质量百分比。
本发明中,所述的试剂盒质控品可以用于随时检测试剂盒反应体系的可靠性。
本发明还提供了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的方法,其包括下述步骤:将待测样品首先与试剂1混合,反应;再加入试剂2后,试剂1中包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒与试剂2中包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒的反应浊度下降;通过测定该反应浊度下降的程度,与试剂盒校准品的反应浊度对比,即可计算出待测样品中非对称二甲基精氨酸的浓度。
较佳地,所述的测定非对称二甲基精氨酸浓度的方法是以非疾病诊断或治疗目的的测定方法。
本发明的构思是在试剂1中采用单株单克隆抗体,将其化学交联在乳胶颗粒载体上,使该载体具有多点位结合抗原的能力,当与试剂2中同样交联在乳胶颗粒上的多个抗原结合时,能形成不断叠加的凝聚物,从而大大地提高了这种抗原抗体反应的浊度。当被测样品加入试剂1时,首先与试剂1乳胶颗粒载体上的单抗反应,掩蔽掉一定量的抗体结合能力,因此,加入试剂2后,形成的浊度相应降低,因此可以通过测定该反应浊度下降的程度,与试剂盒中校准品的反应浊度对比,即可计算出样品中非对称二甲基精氨酸的浓度。该浊度的检测能够应用于目前临床广泛使用的自动生化分析仪,从而达到广泛、快速、大批量规模应用的特点。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
(1)本发明的特点之一在于,提供了一种采用一株单克隆抗体进行多聚反应的免疫比浊试剂方案,为体内小分子抗原的全自动检测提供了一个实用方法,可以提高反应灵敏度。
(2)本发明优选采用两步交联法,不仅有效排除了非特异性交叉反应,而且确保悬浮液中没有残留的未结合的游离抗原或抗体,提高了检测的准确性。
(3)本发明的另一特点之一在于,提供了一种采用一株单克隆抗体包被在乳胶颗粒表面的免疫比浊试剂方案,从而大大提高了检测试剂的稳定性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
本发明所用试剂和原料均能很容易地从相关商业公司购得。
下述实施例中无特别说明,百分比均是指质量百分比。
实施例1
(1)非对称二甲基精氨酸-卵清蛋白偶联物的制备
在1.0mL 25mmol/L pH为6.1的MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液中加入10mg卵清蛋白,快速搅拌,加入非对称二甲基精氨酸,缓慢滴入60mmol/L EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液300μL,快速搅拌反应2小时,加入2.5mL 50mmol/L pH为8.2的Tris缓冲液终止反应30分钟。用pH为6.1的柠檬酸缓冲液4℃透析备用。
(2)试剂1的制备
取浓度为10%、表面带有羧基、直径250nm的Polymicrospheres公司CB0267D乳胶颗粒2mL,加入到5mL 20mM pH6.1的MES缓冲溶液中,边搅拌,边加入300mg Sulfo-NHS和30mg EDAC,室温反应20分钟,离心去上清,然后加入含有30mg抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的pH 8.3 50mM硼酸缓冲液35mL,室温包被6小时。加入5mL含50mM甘氨酸的上述硼酸缓冲液,作用30分钟终止反应。用R1缓冲液离心清洗3次,去除未包被的游离抗体,超声分散。最后用R1缓冲液重悬制成含0.2%抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体包被的乳胶颗粒R1试剂。R1缓冲液含150mM MOPSOpH6.90、0.9%氯化钠、0.5%吐温-20、1% PEG-6000、2mM EDTA、100mM蔗糖、20mM海藻糖、0.2%叠氮钠。
(3)试剂2的制备
取浓度为10%、表面带有羧基、直径250nm的Polymicrospheres公司CB0267D乳胶颗粒2mL,加入到5mL 20mM pH6.1的MES缓冲溶液中,边搅拌,边加入300mg Sulfo-NHS和30mg EDAC,室温反应20分钟,离心去上清,然后加入含有50mg步骤(1)制得的非对称二甲基精氨酸-卵清蛋白偶联物的pH8.3 50mM硼酸缓冲液35mL,室温包被6小时。加入5mL含50mM甘氨酸的上述硼酸缓冲液,作用30分钟终止反应。用R2缓冲液离心清洗3次,去除未包被的游离非对称二甲基精氨酸-卵清蛋白偶联物,超声分散。最后用R2缓冲液重悬制成含0.05%非对称二甲基精氨酸-卵清蛋白偶联物包被的乳胶颗粒R2试剂。R2缓冲液含30mM甘氨酸缓冲液pH7.3、0.3%吐温-20、0.15% Proclin-300、200mM蔗糖、20mM海藻糖。
(4)非对称二甲基精氨酸校准品的制备
在50mM Tris缓冲液中依次加入0.2%牛血清白蛋白、100mM甘露糖醇、2mM EDTA、0.15% Proclin-300和20μmol/L非对称二甲基精氨酸;用弱盐酸边搅拌、边调节pH至8.2。
(5)非对称二甲基精氨酸质控品的制备
在50mM Tris缓冲液中依次加入0.2%牛血清白蛋白、100mM甘露糖醇、2mM EDTA、0.15% Proclin-300和1μmol/L或5μmol/L非对称二甲基精氨酸;用弱盐酸边搅拌、边调节pH至8.2。
(6)试剂性能检测
1、在日立7180型全自动临床生化分析仪上,采用下表中的测定参数,检测试剂的准确度和精密度性能:
2、试剂质控品的检测及其准确度和精密度:
质控品配制浓度 | 1.0μmol/L | 5.0μmol/L |
1 | 0.95 | 5.13 |
2 | 0.89 | 5.08 |
3 | 1.04 | 4.98 |
4 | 0.87 | 5.15 |
5 | 0.89 | 5.12 |
6 | 1.13 | 5.11 |
7 | 0.91 | 4.99 |
8 | 0.83 | 5.03 |
9 | 0.92 | 5.19 |
10 | 1.07 | 5.17 |
均值 | 0.95 | 5.095 |
标准差 | 0.0974 | 0.0734 |
相对偏差 | 10.3% | 1.4% |
结果显示试剂盒反应体系的具有良好的准确性和精密度,可靠性较好;并且采用该试剂盒多次检测结果误差很小,说明该试剂盒检测具有良好的稳定性。
3、用于临床标本的检测结果如下,说明试剂盒具有应用价值:
样本编号 | 测定结果μmol/L |
1 | 0.02 |
2 | 0.07 |
3 | 1.05 |
4 | 13.14 |
5 | 3.07 |
6 | 1.14 |
7 | 0.34 |
8 | 7.59 |
9 | 0.79 |
10 | 0.56 |
实施例2
(1)非对称二甲基精氨酸-血蓝蛋白偶联物的制备
在1.0mL 20mmol/L pH为6.1的MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液中加入10mg血蓝蛋白,快速搅拌,加入非对称二甲基精氨酸,缓慢滴入50mmol/L EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液300μL,快速搅拌反应2小时,加入2.5mL 50mmol/L pH为8.2的Tris缓冲液终止反应30分钟。用pH为6.1的MES缓冲液4℃透析备用。
(2)试剂1的制备
取浓度为10%、表面带有羧基的Polymicrospheres公司CB0104D乳胶颗粒2mL,加入到5mL 25mM pH6.1的MES缓冲溶液中,边搅拌,边加入300mg Sulfo-NHS和30mg EDAC,室温反应30分钟,离心去上清,然后加入含有30mg抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的pH 8.1 100mM硼酸缓冲液35mL,室温包被6小时。加入5mL含50mM甘氨酸的上述硼酸缓冲液,作用30分钟终止反应。用R1缓冲液离心清洗3次,去除未包被的游离抗体,超声分散。最后用R1缓冲液重悬制成含0.2%抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体包被的乳胶颗粒R1试剂。R1缓冲液含150mM MOPSO pH6.90、0.9%氯化钠、0.5%吐温-20、1% PEG-6000、2mM EDTA、100mM蔗糖、20mM海藻糖、0.2%叠氮钠。
(3)试剂2的制备
取浓度为10%、表面带有羧基的Polymicrospheres公司CB0297C乳胶颗粒2mL,加入到5mL 25mM pH6.1的MES缓冲溶液中,边搅拌,边加入300mg Sulfo-NHS和30mg EDAC,室温反应20分钟,离心去上清,然后加入含有50mg步骤(1)制得的非对称二甲基精氨酸-血蓝蛋白偶联物的pH8.1100mM硼酸缓冲液35mL,室温包被2小时。加入5mL含50mM甘氨酸的上述硼酸缓冲液,作用30分钟终止反应。用R2缓冲液离心清洗3次,去除未包被的游离非对称二甲基精氨酸-血蓝蛋白偶联物,超声分散。最后用R2缓冲液重悬制成含0.05%非对称二甲基精氨酸-血蓝蛋白偶联物包被的乳胶颗粒R2试剂。R2缓冲液含30mM甘氨酸缓冲液pH7.3、0.3%吐温-20、0.15%Proclin-300、200mM蔗糖、20mM海藻糖。
(4)非对称二甲基精氨酸校准品的制备
在50mM Tris缓冲液中依次加入0.5%牛血清白蛋白、150mM甘露糖醇、5mM EDTA、0.10% Proclin-300和20μmol/L非对称二甲基精氨酸;用弱盐酸边搅拌、边调节pH至8.10。
(5)非对称二甲基精氨酸质控品的制备
在50mM Tris缓冲液中依次加入0.5%牛血清白蛋白、150mM甘露糖醇、5mM EDTA、0.10% Proclin-300和1μmol/L或5μmol/L非对称二甲基精氨酸;用弱盐酸边搅拌、边调节pH至8.10。
(6)试剂性能检测
1、在日立7180型全自动临床生化分析仪上,采用下表中的测定参数,检测试剂的准确度和精密度性能:
2、试剂质控品的检测及其准确度和精密度:
质控品配制浓度 | 1.0μmol/L | 5.0μmol/L |
1 | 1.11 | 4.93 |
2 | 1.06 | 4.98 |
3 | 0.92 | 5.12 |
4 | 0.99 | 5.08 |
5 | 0.93 | 4.89 |
6 | 1.04 | 5.25 |
7 | 1.07 | 4.91 |
8 | 1.13 | 5.07 |
9 | 1.03 | 4.90 |
10 | 0.95 | 5.05 |
均值 | 1.023 | 5.018 |
标准差 | 0.0735 | 0.1169 |
相对偏差 | 7.18% | 2.33% |
结果显示试剂盒反应体系的具有良好的准确性和精密度,可靠性较好;并且采用该试剂盒多次检测结果误差很小,说明该试剂盒检测具有良好的稳定性。
3、用于临床标本的检测结果如下,说明试剂盒具有应用价值:
样本编号 | 测定结果μmol/L |
1 | 0.73 |
2 | 1.04 |
3 | 0.81 |
4 | 0.37 |
5 | 4.61 |
6 | 11.29 |
7 | 0.46 |
8 | 2.35 |
9 | 4.76 |
10 | 2.75 |
Claims (10)
1.一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒,其包括:
试剂1:包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒;
试剂2:包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂1包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂;较佳地,所述的试剂1由包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂组成;
和/或,所述的试剂2包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂;较佳地,所述的试剂2由包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂组成。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体为Acris Antibodies,Inc.公司的AP02005PU-N ADMA抗体;
所述的非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物是将非对称二甲基精氨酸与惰性载体通过化学交联剂进行化学交联获得;所述的惰性载体包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种;所述的化学交联剂为EDAC和/或Sulfo-NHS。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,试剂1中,所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得:乳胶颗粒表面先经过EDAC和Sulfo-NHS活化,然后加入抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体,抗体的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应,即得;所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得:将乳胶颗粒加入到MES缓冲溶液中,搅拌条件下加入EDAC和Sulfo-NHS,室温反应,离心除去上清液,加入含有抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的pH 8.3硼酸缓冲液,室温包被,再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液,终止反应,离心清洗,超声分散,即得;
和/或,试剂2中,所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制得:乳胶颗粒表面先经过EDAC和Sulfo-NHS活化,然后加入非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物,偶联物的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应,即得;所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得:将乳胶颗粒加入到MES缓冲溶液中,搅拌条件下加入EDAC和Sulfo-NHS,室温反应,离心除去上清液,加入含有非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的pH 8.3硼酸缓冲液,室温包被,再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液,终止反应,离心清洗,超声分散,即得;
试剂1和试剂2中,所述的乳胶颗粒选自粒径为50~500nm、表面带有化学交联基团的聚苯乙烯核壳结构的球状聚合物;所述的乳胶颗粒较佳地为PolyMicrospheres公司的型号为CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D或CB0267D羧基微球;所述的乳胶颗粒的质量体积浓度较佳地为0.01%~0.5%,更佳地为0.05%~0.3%。
5.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,试剂1和试剂2中,所述的缓冲液为3-(N-吗啉基)-丙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种;所述的缓冲液的浓度为10~300mmol/L,较佳地为30~100mmol/L;所述的缓冲液的pH为6~9;
所述的免疫凝集促进剂包括聚乙二醇、硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种;所述免疫凝集促进剂的质量体积浓度为0.1~7%。
6.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,试剂1和试剂2中,所述的稳定剂选自20~300mmol/L甘氨酸、20~300mmol/L双甘氨肽、0.05~1%牛血清白蛋白、0.05~1%吐温-20、0.05~1%Triton X-100、10~300mmol/L蔗糖、10~300mmol/L海藻糖、10~300mmol/L甘露糖、0.2~20mmol/L EDTA、0.5%~2%氯化钠和1%~10%甘油中的两种或两种以上;所述的百分比为质量百分比;
试剂1和试剂2中,所述的防腐剂选自叠氮钠、Proclin-300中的一种或两种,所述的防腐剂的质量百分比浓度为0.1%~1%。
7.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂1的组成为:150mmol/L 3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液pH 6.90、0.01%包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、0.9%氯化钠、0.5%吐温-20、1%PEG-6000、2mmol/L EDTA、100mmol/L蔗糖、20mmol/L海藻糖和0.2%叠氮钠;所述的百分比为质量百分比。
8.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂2的组成为:1.5%包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、30mmol/L甘氨酸缓冲液pH 7.6、0.3%吐温-20、0.15%Proclin-300、200mmol/L蔗糖和20mmol/L海藻糖;所述的百分比为质量百分比。
9.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,所述的测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒还包括试剂盒校准品和试剂盒质控品,所述的试剂盒校准品组成为:20μmol/L非对称二甲基精氨酸、50mmol/L Tris缓冲液pH 8.2、0.2%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA和0.15%Proclin-300;所述的试剂盒质控品组成为:1或5μmol/L非对称二甲基精氨酸、50mmol/L Tris缓冲液pH 8.2、0.5%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA和0.15%Proclin-300;所述的百分比为质量百分比。
10.一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的方法,其包括下述步骤:将待测样品首先与权利要求1~9中任一项的试剂1混合,反应;再加入权利要求1~9中任一项的试剂2后,试剂1中包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒与试剂2中包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒的反应浊度下降;通过测定该反应浊度下降的程度,与试剂盒校准品的反应浊度对比,即可计算出待测样品中非对称二甲基精氨酸的浓度;较佳地,所述的测定非对称二甲基精氨酸浓度的方法是以非疾病诊断或治疗目的的测定方法。
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