CN111830260A - 一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，本发明通过选择批间差异小的原料单抗、抗体与微球偶联过程的精确控制(反应温度、反应时间、搅拌速度、老化温度及时间、抗体加入速度)、分散过程选择均质仪的生产方法实现胶乳增强免疫比浊试剂产品批间差异小的目的。实验结果表明，本发明中的工艺制备的胶乳免疫比浊试剂3批试剂的批间差异偏差都在10％以内。

Description

一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺
技术领域
本发明属于医学诊断试剂技术领域，尤其涉及一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺。
背景技术
胶乳增强免疫比独法(Latex Nanoparticle-Enhanced TurbidimetricImmunoassay,LTIA)是70年代出现的能够动态测定抗原抗体结合的检测方法，其原理是将抗体与乳胶颗粒偶联，在液相环境中发生抗原抗体反应，胶乳微球的存在使得整个反应的浊度明显增加，极大提高了检测的灵敏度、准确性和精密度，减少了非特异性反应。其包括散射比浊法和透射比浊法。免疫散射比浊法需要特殊的散射比浊仪，难以在临床上应用，而免疫透射比浊法可以通过全自动生化分析仪进行检测，实现了检测的自动化，更加方便、快捷、节省时间，满足了临床大样本检测的需求。
传统的胶乳增强免疫比浊法是采用多克隆抗体包被胶乳粒子进行检测，但是由于多克隆抗体的产生是通过免疫动物取抗血清取得，而由于动物间的个体体质等不同，抗血清存在很大的差异，从而特别容易造成抗体的批间差异。最终导致胶乳试剂产品的批间差异大。此外，多克隆抗体可以识别任一抗原的多种表位，含有大量的非特异性结合抗体，这种交叉反应会产生较大的背景信号，影响检测的特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，本发明中的工艺明显的缩小最终制备的胶乳增强免疫比浊试剂不同批次间的产品差异。对于制备性质稳定、批次间差异很小的胶乳增强免疫比浊试剂具有很大的意义。
本发明提供一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，包括以下步骤：
A)在搅拌的条件下，将1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液加入胶乳微球溶液中，继续搅拌进行活化反应，得到活化的胶乳微球溶液；
所述步骤A)中搅拌的转速为450～550r/min，所述活化反应的温度为20～30℃；
B)将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中，在2～8℃、转速450～550r/min的条件下持续搅拌，进行偶联反应15.5～16.5小时，离心得到单克隆抗体-胶乳微球偶联物；
C)将所述单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中，进行均质分散，然后在37～43℃下老化15～17小时，得到胶乳增强免疫比浊试剂。
优选的，所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液由1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺和MES缓冲液配置得到；
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝5.0；
所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液中1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为1～10mg/mL。
优选的，所述胶乳微球溶液含有粒径为80～150nm的羧基胶乳微球，所述羧基胶乳微球的质量浓度为10～20mg/mL
优选的，所述胶乳微球溶液由羧基胶乳微球液和MES缓冲液配置得到；
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝5.0。
优选的，所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺与羧基胶乳微球的质量比为1:(100～200)。
优选的，所述单克隆抗体溶液由单克隆抗体和MES缓冲液配置得到，
所述单克隆抗体溶液中单克隆抗体的浓度为0.4～0.6mg/mL。
优选的，以25～100mL/min的速率将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中。
优选的，所述步骤B)中离心的转速为5000～6500rpm；所述步骤B)中离心的时间为5～20min。
优选的，所述步骤C)中的硼酸缓冲液的浓度为100mmol/L，pH＝8.0。
优选的，所述步骤C)中均质分散的压强为850～950bar，均质分散的温度为7～13℃。
本发明提供了一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，包括以下步骤：A)在搅拌的条件下，将1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液加入胶乳微球溶液中，继续搅拌进行活化反应，得到活化的胶乳微球溶液；所述步骤A)中搅拌的转速为450～550r/min，所述活化反应的温度为20～30℃；B)将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中，在2～8℃、转速450～550r/min的条件下持续搅拌，进行偶联反应15.5～16.5小时，离心得到单克隆抗体-胶乳微球偶联物；C)将所述单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中，进行均质分散，然后在37～43℃下老化15～17小时，得到胶乳增强免疫比浊试剂。本发明通过选择批间差异小的原料单抗、抗体与微球偶联过程的精确控制(反应温度、反应时间、搅拌速度、老化温度及时间、抗体加入速度)、分散过程选择均质仪的生产方法实现胶乳增强免疫比浊试剂产品批间差异小的目的。实验结果表明，本发明中的工艺制备的胶乳免疫比浊试剂3批试剂的批间差异偏差都在10％以内。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明比较例1制备的CRP胶乳免疫比浊试剂定标曲线；
图2为本发明实施例1制备的CRP胶乳免疫比浊试剂定标曲线；
图3为本发明比较例2制备的BMG胶乳免疫比浊试剂定标曲线；
图4为本发明实施例2制备的BMG胶乳免疫比浊试剂定标曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，包括以下步骤：
A)在搅拌的条件下，将1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液加入胶乳微球溶液中，继续搅拌进行活化反应，得到活化的胶乳微球溶液；
所述步骤A)中搅拌的转速为450～550r/min，所述活化反应的温度为20～30℃；
B)将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中，在2～8℃、转速450～550r/min的条件下持续搅拌，进行偶联反应15.5～16.5小时，离心得到单克隆抗体-胶乳微球偶联物；
C)将所述单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中，进行均质分散，然后在37～43℃下老化15～17小时，得到胶乳增强免疫比浊试剂。
胶乳微球的活化
本发明首先分别配制1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和胶乳微球溶液。
本发明称取一定量的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶于MES缓冲溶液中，得到EDC溶液。
在本发明中，所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝5.0；所述EDC溶液的质量浓度优选为1～10mg/mL，更优选为2～8mg/mL，最优选为2～5mg/mL。
本发明称取一定量的羧基胶乳微球溶液，溶于MES缓冲液中，得到胶乳微球溶液。
在本发明中，所述羧基胶乳微球溶液中含有羧基胶乳微球，所述羧基胶乳微球的粒径为80～150nm，更优选为90～130nm，最优选为100～120nm，具体的，在本发明的实施例中，可以是100nm。所述羧基胶乳微球溶液中羧基胶乳微球的质量含量优选为3～10％，更优选为5～8％，具体的，可以是5％。
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝5.0。
所述胶乳微球溶液中胶乳微球的质量含量优选为10～20mg/mL，更优选为12～18mg/mL，最优选为12～15mg/mL，具体的，可以是12.26mg/mL。
在本发明中，所述EDC溶液和胶乳微球溶液的配制部分先后顺序，得到上述两种溶液后，本发明优选在温度25±5℃、搅拌转速500±30r/min的条件下，将EDC溶液缓慢加入到所述胶乳微球溶液中，并持续搅拌，进行活化反应，得到活化的胶乳微球。
在本发明中，所述EDC和胶乳微球的质量比优选为1:(100～200)，更优选为1：(120～180)，最优选为1：(140～150)，具体的，可以是1:143。
在本发明中，所述活化反应的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃，最优选为25℃；所述活化反应的时间优选为10～60min，更优选为20～50min，最优选为30～40min；所述活化反应的搅拌转速优选为450～550r/min，更优选为470～530r/min，最优选为500r/min。
单克隆抗体与胶乳微球的偶联
完成所述胶乳微球的活化后，本发明将单克隆抗体与胶乳微球进行偶联，制备单克隆抗体-胶乳微球偶联物。
本发明优选将单克隆抗体使用MES缓冲液稀释，得到最终浓度为0.4～0.6mg/mL的单克隆抗体溶液，所述单克隆抗体溶液的浓度优选为0.5mg/mL。在本发明中，所述单克隆抗体可以是C反应蛋白单克隆抗体(CRP)，可以是β2-微球蛋白单克隆抗体(BMG)。
本发明所使用的的单克隆抗体是采用杂交瘤细胞技术制得，这样就形成了恒定的再生源，批次间差异小以确保实验结果的标准化和一致性；而且单克隆抗体的同质性非常高，使实验结果的重复性高，最终不会由于抗体的批间差异导致胶乳试剂的批间差异。此外，单克隆抗体仅能识别一个表位，特异性较高，所产生的背景信号较低，检测特异性较高。
将稀释好的单克隆抗体溶液在一定流速下加入活化的胶乳微球溶液中，然后搅拌条件下进行偶联反应，得到单克隆抗体-胶乳微球偶联物。
在本发明中，所述单克隆抗体溶液的加入速度优选为25～100mL/min，更优选为30～90mL/min，最优选为40～80mL/min，具体的，在本发明的实施例中，可以是30mL/min、40mL/min、50mL/min、60mL/min、70mL/min、80mL/min或90mL/min。所述偶联反应的温度优选为2～8℃，更优选为3～7℃，最优选为4～6℃，具体的，在本发明的实施例中，可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。所述偶联反应的时间优选为15.5～16.5小时，更优选为16小时。所述偶联反应时的搅拌转速优选为450～550r/min，更优选为470～530r/min，最优选为500r/min。
完成偶联反应后，本发明将得到的反应产物溶液进行离心，去除多余的EDC和游离抗体等，得到的沉淀物即为单克隆抗体-胶乳微球偶联物。
在本发明中，所述离心的转速优选为5000～6500rpm，更优选为5500～6000rpm；所述离心的时间优选为5～20min，更优选为10～15min。
单克隆抗体-胶乳微球偶联物的均质分散
本发明将将沉淀的单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中，进行均质分散。本发明优选将用硼酸缓冲液复溶的单克隆抗体-胶乳微球偶联物用可控温制冷的均质仪进行均质分散。所述均质分散的压强优选为850～950bar，更优选为870～930bar，最优选为900bar；所述均质分散的温度优选为7～13℃，更优选为8～12℃，最优选为9～11℃，具体的，可以是10℃；本发明优选将用硼酸缓冲液复溶的单克隆抗体-胶乳微球偶联物均质分散两次，得到的胶乳分散体更加均匀，也更有利于产品批次差异的缩小。
胶乳增强免疫比浊试剂的生产过程中胶乳微球与抗体偶联后会有少量的聚集，为了使试剂更加均一稳定，都会有一个分散过程。传统的生产工艺中主要是通过超声破碎仪等仪器对胶乳试剂进行分散。但是，由于超声功率及超声过程中溶液会发热的因素等会导致超声效率降低，最终影响试剂的分散均一性从而导致产品批间差异大。
单克隆抗体-胶乳微球偶联物的老化
将均质分散完的单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液进行老化稳定，以使得单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液更为稳定。
在本发明中，所述老化的温度优选为37～43℃，更优选为38～42℃，最优选为39～41℃，具体的，可以是40℃；所述老化的时间优选为15～17小时，更优选为15.5～16.5小时，最优选为16小时。
本发明提供了一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，包括以下步骤：A)在搅拌的条件下，将1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液加入胶乳微球溶液中，继续搅拌进行活化反应，得到活化的胶乳微球溶液；所述步骤A)中搅拌的转速为450～550r/min，所述活化反应的温度为20～30℃；B)将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中，在2～8℃、转速450～550r/min的条件下持续搅拌，进行偶联反应15.5～16.5小时，离心得到单克隆抗体-胶乳微球偶联物；C)将所述单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中，进行均质分散，然后在37～43℃下老化15～17小时，得到胶乳增强免疫比浊试剂。本发明通过选择批间差异小的原料单抗、抗体与微球偶联过程的精确控制(反应温度、反应时间、搅拌速度、老化温度及时间、抗体加入速度)、分散过程选择均质仪的生产方法实现胶乳增强免疫比浊试剂产品批间差异小的目的。实验结果表明，本发明中的工艺制备的胶乳免疫比浊试剂3批试剂的批间差异偏差都在10％以内。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1CRP单克隆抗体与胶乳微球的偶联
1.胶乳微球的活化
准确称取34mg 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶于17mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得EDC溶液；准确量取48.75mL胶乳微球溶液(羧基胶乳微球，粒径100nm，含量5％)，溶于150mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得胶乳微球溶液。在活化反应温度25±5℃，搅拌转速500±30r/min条件下，把EDC溶液缓慢加入到胶乳微球溶液中。加完之后持续搅拌反应30分钟(反应温度25±5℃，搅拌转速500±30r/min)，得活化的胶乳微球溶液。
2.抗体与胶乳微球的偶联
把CRP单克隆抗体用MES缓冲液(10mmol/L，pH＝5.0)进行稀释，使最终浓度为0.5mg/mL。在搅拌转速500±30r/min，反应温度4℃条件下，将稀释好的CRP单克隆抗体溶液用可控制流速的下口瓶在90mL/min条件下加入到活化的胶乳微球溶液中。加完之后在4℃，转速500±30r/min条件下持续搅拌反应16±0.5h。然后离心(6000rpm/min，10min)去除多余的EDC、游离抗体等，将沉淀的单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中(100mmol/L，pH＝8.0)即可进入下一步进行均质分散。
3.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的均质分散
将用硼酸缓冲液复溶的单克隆抗体-胶乳微球偶联物用可控温制冷的均质仪进行均质分散，均质仪参数为：均质压强900±30bar，均质仪的制冷温度设为10±3℃，均质两次。
4.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的老化
将均质分散完的单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液进行放入40±3℃的条件下老化稳定16±0.5h，以使得单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液更为稳定。
5.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的跟踪测试
在CRP单克隆抗体与胶乳微球的偶联过程中需要用紫外分光光度计及粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的吸光度(OD＝540nm)，并用粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的粒径，以便于观察跟踪其与参照标准的差异。
试剂的组成：
试剂1(R1)主要成分：
Tris缓冲液(pH8.0) 50mmol/L
氯化钠 10g/L
叠氮钠 1g/L
吐温20 0.55g/L
试剂2(R2)主要成分：
胶乳包被鼠抗人C反应蛋白IgG
硼酸缓冲液(pH8.0) 30mmol/L
蔗糖 60g/L
牛血清白蛋白 2g/L
叠氮钠 2g/L
检测参数见表1：
表1
Figure BDA0002603146450000081
比较例1
1.胶乳微球的活化
准确称取34mg 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶于17mLMES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得EDC溶液；准确量取48.75mL胶乳微球溶液(羧基胶乳微球，粒径100nm，含量5％)，溶于150mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得胶乳微球溶液。把EDC溶液缓慢加入到胶乳微球溶液中。加完之后持续搅拌反应30分钟(搅拌转速：650r/min，反应温度：室温)，得活化的胶乳微球溶液。
2.抗体与胶乳微球的偶联
把CRP单克隆抗体用MES缓冲液(10mmol/L，pH＝5.0)进行稀释，使最终浓度为0.5mg/mL。然后将稀释好的CRP单克隆抗体溶液缓慢加入到活化的胶乳微球溶液中(加入速度：150mL/min)。加完之后搅拌反应过夜(搅拌转速：650r/min，反应温度：室温)，然后离心(6000rpm/min 10min)去除多余的EDC、游离抗体等，将沉淀的CRP单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中(100mmol/L，pH＝8.0)即可进入下一步进行超声分散。
3.CRP单克隆抗体-胶乳微球偶联物的分散
将用硼酸缓冲液复溶的CRP单克隆抗体-胶乳微球偶联物超声分散破碎仪进行超声分散。
4.CRP单克隆抗体-胶乳微球偶联物的老化
将均质分散完的CRP单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液进行放入42℃的条件下老化过夜，以使得单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液更为稳定。
5.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的跟踪测试
在CRP单克隆抗体与胶乳微球的偶联过程中需要用紫外分光光度计及粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的吸光度(OD＝540nm)，并用粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的粒径，以便于观察跟踪其与参照标准的差异。
试剂的组成：
试剂1(R1)主要成分：
Tris缓冲液(pH8.0) 50mmol/L
氯化钠 10g/L
叠氮钠 1g/L
吐温20 0.55g/L
试剂2(R2)主要成分：
胶乳包被鼠抗人C反应蛋白IgG
硼酸缓冲液(pH8.0) 30mmol/L
蔗糖 60g/L
牛血清白蛋白 2g/L
叠氮钠 2g/L
检测参数见表2：
表2
Figure BDA0002603146450000101
实施例2BMG单克隆抗体与胶乳微球的偶联
1.胶乳微球的活化
准确称取56mg的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶于13.98mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得EDC溶液；准确量取63mL胶乳微球溶液(羧基胶乳微球，粒径100nm，含量5％)，溶于210mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得胶乳微球溶液。在活化反应温度25±5℃，搅拌转速500±30r/min条件下，把EDC溶液缓慢加入到胶乳微球溶液中。加完之后持续搅拌反应30分钟(反应温度25±5℃，搅拌转速500±30r/min)，得活化的胶乳微球溶液。
2.抗体与胶乳微球的偶联
把BMG单克隆抗体用MES缓冲液(10mmol/L，pH＝5.0)进行稀释，使最终浓度为0.5mg/mL。在搅拌转速500±30r/min，反应温度4℃条件下，将稀释好的BMG单克隆抗体溶液用可控制流速的下口瓶在90mL/min条件下加入到活化的胶乳微球溶液中。加完之后在4℃，转速500±30r/min条件下持续搅拌反应16±0.5h。然后向上述偶联反应后的溶液中加入硼酸缓冲液(100mmol/L，pH＝8.0)即可进入下一步进行均质分散。
3.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的均质分散
将硼酸缓冲液与单克隆抗体-胶乳微球偶联物的溶液混匀后用可控温制冷的均质仪进行均质分散，均质仪参数为：均质压强900±30bar，均质仪的制冷温度设为10±3℃，均质两次。
4.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的老化
将均质分散完的单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液进行放入40±3℃的条件下老化稳定16±0.5h，以使得单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液性质更为稳定。
5.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的跟踪测试
在BMG单克隆抗体与胶乳微球的偶联过程中需要用紫外分光光度计及粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的吸光度(OD＝540nm)，并用粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的粒径，以便于观察跟踪其与参照标准的差异。
试剂的组成：
试剂1(R1)主要成分：
Tris缓冲液(pH8.0) 50mmol/L
氯化钠 10g/L
叠氮钠 1g/L
吐温20 0.55g/L
试剂2(R2)主要成分：
胶乳包被鼠抗人β2-微球蛋白(BMG)IgG
硼酸缓冲液(pH8.0) 60mmol/L
蔗糖 120g/L
牛血清白蛋白 4g/L
叠氮钠 4g/L
检测参数见表3：
表3
Figure BDA0002603146450000111
Figure BDA0002603146450000121
比较例2
1.胶乳微球的活化
准确称取56mg的1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，溶于13.98mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得EDC溶液；准确量取63mL胶乳微球溶液(羧基胶乳微球，粒径100nm，含量5％)，溶于210mL MES缓冲液中(10mmol/L，pH＝5.0)，得胶乳微球溶液。把EDC溶液缓慢加入到胶乳微球溶液中。加完之后持续搅拌反应30分钟(搅拌转速：650r/min，反应温度：室温)，得活化的胶乳微球溶液。
2.抗体与胶乳微球的偶联
把BMG单克隆抗体用MES缓冲液(10mmol/L，pH＝5.0)进行稀释，使最终浓度为0.5mg/mL。将稀释好的BMG单克隆抗体溶液缓慢加入到活化的胶乳微球溶液中(加入速度：150mL/min)。加完之后持续搅拌反应过夜(搅拌转速650r/min，反应温度：室温)。然后向上述偶联反应后的溶液中加入硼酸缓冲液(100mmol/L，pH＝8.0)即可进入下一步进行超声分散。
3.BMG单克隆抗体-胶乳微球偶联物的超声分散
将硼酸缓冲液与BMG单克隆抗体-胶乳微球偶联物的溶液混匀后用超声破碎仪进行分散。
4.BMG单克隆抗体-胶乳微球偶联物的老化
将超声分散完的BMG单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液进行放入42℃的条件下老化稳定过夜，以使得BMG单克隆抗体-胶乳微球偶联物溶液性质更为稳定。
5.单克隆抗体-胶乳微球偶联物的跟踪测试
在BMG单克隆抗体与胶乳微球的偶联过程中需要用紫外分光光度计及粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的吸光度(OD＝540nm)，并用粒径仪测试胶乳微球-抗体偶联物的粒径，以便于观察跟踪其与参照标准的差异。
试剂的组成：
试剂1(R1)主要成分：
Tris缓冲液(pH8.0) 50mmol/L
氯化钠 10g/L
叠氮钠 1g/L
吐温20 0.55g/L
试剂2(R2)主要成分：
胶乳包被鼠抗人β2-微球蛋白(BMG)IgG
硼酸缓冲液(pH8.0) 60mmol/L
蔗糖 120g/L
牛血清白蛋白 4g/L
叠氮钠 4g/L
检测参数见表4：
表4
Figure BDA0002603146450000131
CRP传统胶乳免疫比浊法与发明方法制备的胶乳试剂对比批间差
用传统方法(比较例1)和本发明方法(实施例1)同时制备3批CRP胶乳免疫比浊试剂，分别对比3批试剂的批间差异。具体数据见表5～6。
表5比较例1制备的CRP胶乳免疫比浊试剂定标吸光度-CRP浓度关系
Figure BDA0002603146450000141
表6实施例1制备的CRP胶乳免疫比浊试剂定标吸光度-CRP浓度关系
Figure BDA0002603146450000142
以上CRP试剂定标吸光度的批间差异比较可以看出，该发明提出的工艺制备的胶乳免疫比浊试剂3批试剂的批间差异偏差都在10％以内，但传统工艺制备的胶乳免疫比浊试剂的批间差异偏差普遍超过10％，CRP抗原浓度高时差异尤其明显。由图1～2可以明显的看出差异，定标曲线的差异代表胶乳免疫比浊试剂中抗体-胶乳微球偶联物与抗原的结合能力不同，即造成浊度的不同，表现在宏观上即不同批次产品的吸光度差异较大。
BMG传统胶乳免疫比浊法与发明方法制备的胶乳试剂对比批间差
用本发明方法(实施例2)和传统的方法(比较例2)同时制备3批BMG胶乳免疫比浊试剂，分别对比3批试剂的批间差异。具体数据见表7～8。
表7比较例2制备的BMG胶乳免疫比浊试剂定标吸光度与BMG浓度关系
Figure BDA0002603146450000143
Figure BDA0002603146450000151
表8实施例2制备的BMG胶乳免疫比浊试剂定标吸光度与BMG浓度关系
Figure BDA0002603146450000152
以上试剂定标吸光度的批间差异比较可以看出，该发明提出的工艺制备的胶乳免疫比浊试剂3批试剂的批间差异偏差都在10％以内，但传统工艺制备的胶乳免疫比浊试剂的批间差异偏差普遍超过10％，BMG抗原浓度高时差异尤其明显。由图3～4可以明显的看出差异，定标曲线的差异代表胶乳免疫比浊试剂中抗体-胶乳微球偶联物与抗原的结合能力不同，即造成浊度的不同，表现在宏观上即不同批次产品的吸光度差异较大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种降低胶乳增强免疫比浊试剂生产批间差异的工艺，包括以下步骤：
A)在搅拌的条件下，将1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液加入胶乳微球溶液中，继续搅拌进行活化反应，得到活化的胶乳微球溶液；
所述步骤A)中搅拌的转速为450～550r/min，所述活化反应的温度为20～30℃；
B)将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中，在2～8℃、转速450～550r/min的条件下持续搅拌，进行偶联反应15.5～16.5小时，离心得到单克隆抗体-胶乳微球偶联物；
C)将所述单克隆抗体-胶乳微球偶联物加入硼酸缓冲液中，进行均质分散，然后在37～43℃下老化15～17小时，得到胶乳增强免疫比浊试剂。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液由1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺和MES缓冲液配置得到；
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝5.0；
所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液中1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺的浓度为1～10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述胶乳微球溶液含有粒径为80～150nm的羧基胶乳微球，所述羧基胶乳微球的质量浓度为10～20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述胶乳微球溶液由羧基胶乳微球液和MES缓冲液配置得到；
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L，pH＝5.0。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺与羧基胶乳微球的质量比为1:(100～200)。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述单克隆抗体溶液由单克隆抗体和MES缓冲液配置得到，
所述单克隆抗体溶液中单克隆抗体的浓度为0.4～0.6mg/mL。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，以25～100mL/min的速率将单克隆抗体溶液加入所述活化的胶乳微球溶液中。
8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤B)中离心的转速为5000～6500rpm；所述步骤B)中离心的时间为5～20min。
9.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤C)中的硼酸缓冲液的浓度为100mmol/L，pH＝8.0。
10.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤C)中均质分散的压强为850～950bar，均质分散的温度为7～13℃。
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