CN104714033A - 降钙素原检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种降钙素原检测试剂盒及检测方法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的降钙素原抗原表位的单克隆抗体细胞株，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点。

Description

降钙素原检测试剂盒及检测方法

技术领域

 本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种能够快速准确的对降钙素原进行定量分析的降钙素原检测试剂盒及检测方法。

背景技术

降钙素原(Procalcitonin，PCT)是一种由116个氨基酸组成的糖蛋白，分子量13KD，是降钙素(calcitonin，CT)的前体肽，可以以游离形式存在于正常人血清中。1993年，Lancet首次报道降钙素原水平在败血症时显著升高，血PCT浓度大于0.5ng/ml时提示败血症可能，大于2ng/ml提示败血症的存在，大于l0ng/ml则提示严重的脓毒败血症或休克，因此PCT可作为诊断脓毒败血症的特异性指标。近年，随着研究的深入，人们另外发现，细菌感染早期往往已经有PCT的低水平升高(0.1ng/ml～0.5ng/ml)，PCT升高水平与细菌性感染严重程度及范围有关，PCT水平大于0.25ng/ml时即建议使用抗生素治疗。PCT由N末端-降钙素-C末端三部分组成，不会降解为降钙素，不受体内激素水平影响，半衰期为25-30小时。鉴于PCT在体内外稳定性较好，与常规用于炎症诊断的指标如CRP相比，己被公认为最理想的诊断细菌感染的指标。PCT可广泛用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科和治疗实验室等。

PCT检测方法主要有定量方法和定性检测方法，定量检测方法有双抗夹心法(ELISA)、免疫发光法、高效液相色谱分析、放射免疫分析法，胶乳颗粒增强免疫比浊法等。定性方法主要有免疫层析法。其中，高效液相色谱分析费时且不易自动化；ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；放射免疫分析法灵敏度可达到4pg/ml，能检测正常人血清PCT，比双抗夹心法灵敏，缺点是所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比ELISA差，且存在放射性污染危险；胶乳颗粒增强免疫比浊法(PETIA)可以很方便的应用与全自动生化仪，但是灵敏度较低，对于降钙素原作为全身性感染（脓毒症）诊断的分界值0.5ng/ml无法准确检测；金标方法灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测；免疫发光法方法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。因此开发灵敏度更高、快捷方便的PCT产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的降钙素原检测试剂盒及检测方法。

本发明可以通过以下措施达到：

一种降钙素原检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的降钙素原抗原表位的单克隆抗体细胞株。

本发明所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu) 、钐( Sm) 、铒(Er) 、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对4个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

本发明所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中（含2.0% Triton X-100，3.0%BSA，pH7.5），4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。

本发明中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照降钙素原氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成18个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用于检测的降钙素原单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取2mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体的制备：将1mg用于检测的降钙素原单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液（200mM Tris-HCL，pH7.5，含3%BSA，5%蔗糖），4℃封闭过夜；然后用200mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的200mM Tris-HCL缓冲液中（含1.2%NaCL，0.5%BSA，0.3%Tween 20），4℃避光保存备用。

本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

步骤1：根据前述配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的降钙素原单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将降钙素原单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

本发明所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0%Triton X-100，3% BSA，0.2M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

本发明还提供了一种如上所述试剂盒实现的降钙素原检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：精确吸取25μl血清样本，样本为全血时吸取50μl样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μl样本稀释液，样本稀释液采用生理盐水或PBS，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对降钙素原的检测范围为0-40ng/ml。

本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的降钙素原快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于降钙素原定性胶体金试剂，能定量检测样本中的降钙素原含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

附图1是本发明中试纸卡的结构示意图。

附图2是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

附图3中的附表1是本发明中实施例3的精密度分析结果数据。

附图标记：PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

如附图1所示，本发明首先提出了一种降钙素原检测试剂盒，盒内设有试纸卡，所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中结合垫3上吸附有稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的降钙素原抗原表位的单克隆抗体细胞株；

所述结合垫3的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物；所述稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对4个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

实施例1：

降钙素原检测试剂盒中试纸卡的各组成部分可以通过以下措施制得：

1、样品垫2的制备：

    将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0%Triton X-100，3% BSA，0.2M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

2、吸附荧光微球标记抗体的结合垫3的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中（含2.0% Triton X-100，3.0%BSA，pH7.5），4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时，备用；

稀土荧光纳米微球的醛基化：取2mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

稀土荧光纳米微球标记降钙素原单克隆抗体的制备：将1mg用于检测的降钙素原单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液（200mM Tris-HCL，pH7.5，含3%BSA，5%蔗糖），4℃封闭过夜；然后用200mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的200mM Tris-HCL缓冲液中（含1.2%NaCL，0.5%BSA，0.3%Tween 20），4℃避光保存备用；

3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4的制备：

根据前述配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的降钙素原单克隆抗体，保存于-20℃备用；

分别用包被稀释液将降钙素原单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时；

试纸卡的组装：在PVC板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

上述各步骤中选用的设备及原料优选以下原料：

降钙素原特异性配对抗体；降钙素原质控品：英国朗道实验诊断有限公司；稀土荧光微球：上海甄准生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC) 膜：Millipore 公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma 产品，其它常用试剂均为分析纯试剂。

实施例2：准确度试验

    选用上述试纸卡以及荧光免疫层析分析仪（型号：NEO-007），

荧光免疫分析仪参数的设定：在荧光免疫分析仪上设定好试纸卡工艺参数后，取上述组装好的试纸卡，分别用0.1、0.25、1、2.5、10、20、40ng/ml的降钙素原校准品，用试纸卡进行测定，得到各校准品的荧光强度值，将结果输入到分析仪的参数中，完成分析仪的参数的设定。

主要检测材料：临床样本由相关医院获得，共200份电化学发光免疫法定值样本，其中血清样本100份，全血样本100份，降钙素原含量分布区间为0-40ng/mL 之间。

检测方法：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：精确吸取25μl血清样本，样本为全血时吸取50μl样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(生理盐水或PBS)，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。

试验结果分析：

临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

试验结果：

如附图2所示，以实验系统的检测值为Y轴，以对照系统的测验值为X轴，绘制散点图，并进行相关性分析。临床样本检测对200 份临床定值样本检测，样本平均偏差值小于10％，最大偏差小于20％，R2>0.98，一致性系数>0.90。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

实施例3：精密度试验

    采用实施例2的试纸卡和测量系统，对本发明的试纸卡和荧光免疫层析分析仪进行精密度实验。

主要检测材料：临床样本由相关医院获得，共2份化学发光免疫法定值血清样本，其中低值定值样本临床测量值为0.26ng/ml，高值定值样本临床测量值为2.28ng/ml。

检测方法：

采用实施例2的试纸卡和测量系统，对2份定值样本各进行重复测定20次。

试验结果分析：

临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对临床样本进行检测，并分析检测结果。

试验结果：

如附图3中表1所示，对临床测量值为0.26ng/ml的低值定值样本和临床测量值为2.28ng/ml的高值定值样本重复测定20次后计算平均值，标准差和CV，所得结果显示用本发明的实验系统测试低值定值样本CV为8.09%，测试高值定值样本CV为6.12%。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的降钙素原快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于降钙素原定性胶体金试剂，能定量检测样本中的降钙素原含量，具有更明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Claims (8)

1.一种降钙素原检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的降钙素原抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种降钙素原检测试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径是90-110nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素。

3.根据权利要求2所述的一种降钙素原检测试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对4个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种降钙素原质检测试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时。

5.根据权利要求4所述的一种降钙素原质检测试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照降钙素原氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成18个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用于检测的降钙素原单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取2mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的降钙素原单克隆抗体的制备：将1mg用于检测的降钙素原单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液，4℃封闭过夜；然后用200mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的200mM Tris-HCL缓冲液中，4℃避光保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种降钙素原质检测试剂盒，其特征在于所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

步骤1：根据前述配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的降钙素原单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将降钙素原单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

7.根据权利要求1所述的一种降钙素原质检测试剂盒，其特征在于所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0%Triton X-100，3% BSA，0.2M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

8.一种利用如权利要求1-7中任意一项所述试剂盒实现的降钙素原检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2： 精确吸取25μl血清样本，样本为全血时吸取50μl样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μl样本稀释液，样本稀释液采用生理盐水或PBS，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对降钙素原的检测范围为0-40ng/mL。