CN105622752A - 降钙素原单克隆抗体对及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对降钙素原单克隆抗体对，其检测抗体重链可变区核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，轻链可变区核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示；捕获抗体重链可变区核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示，轻链可变区核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示。本发明还公开了上述抗体对的制备方法及在PCT检测中的应用。本发明通过建立ELISA检测平台筛选PCT最佳配对抗体，不仅减少了后期纯化工作，而且提高了PCT体外诊断试剂的质量和细菌感染诊断的准确性。

Description

降钙素原单克隆抗体对及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及降钙素原(PCT)单克隆抗体对、其制备方法及其在降钙素原检测中的应用。

背景技术

降钙素原(PCT)是由116个氨基酸组成的激素原，是一种分子量约为13KD的糖蛋白，在正常生理情况下，由甲状腺C细胞分泌产生，在体内半衰期为25～30个小时。PCT由神经内分泌细胞(包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞)表达，经酶切分解为(未成熟)降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血液中的PCT浓度非常低，小于0.05ng/ml。在炎症刺激特别是细菌感染/脓毒血症状态下，机体各个组织、多种细胞类型均可产生PCT，并释放进入血液循环系统。因此通过测量人体血清中PCT的含量，可以鉴别细菌感染程度。

动物模型试验显示机体发生脓毒血症时，多组织均能表达PCT。脓毒血症患者体内的PCT只含有114个氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro。PCT水平升高见于细菌性脓毒血症，尤其是重症脓毒血症和感染性休克。PCT可作为脓毒血症的预后指标，也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标。2012年9月发表的《降钙素原PCT急诊临床应用的专家共识》指出：脓毒症患者的PCT水平明显高于非脓毒症患者。且PCT升高对细菌感染导致的脓毒症特异性很高，可作为诊断脓毒症和鉴别严重细菌感染的生物标志物。同时，与单纯的临床检测标准相比，PCT检测可显著提高SIRS/脓毒症诊断的敏感性(97％)和特异性(78％)。把PCT加入诊断标准后，诊断准确率从0.77提高到0.94。

对于社区获得性呼吸道感染和空调诱导性肺炎患者，PCT可作为抗生素选择以及疗效判断的指标，因此发明降钙素原(PCT)体外诊断试剂配对抗体原料对于临床诊断具有重大的社会价值和经济价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一对降钙素原单克隆抗体对，它可以提高降钙素原体外检测的准确性。

为解决上述技术问题，本发明的降钙素原单克隆抗体对，包括检测抗体和捕获抗体；所述检测抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述捕获抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。

本发明要解决的技术问题之二是提供上述降钙素原单克隆抗体对的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的降钙素原单克隆抗体对制备方法，步骤包括：

1)制备降钙素原重组抗原；

2)制备小鼠降钙素原单克隆抗体；

3)高通量筛选降钙素原单克隆检测抗体和捕获抗体对。

较佳的，步骤1)，采用293F真核表达系统获得降钙素原重组抗原。

较佳的，步骤3)，采用酶联免疫化学发光检测方法筛选降钙素原单克隆抗体对。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述单克隆抗体对在降钙素原检测中的应用。

较佳的，可以采用酶联免疫化学发光检测方法进行降钙素原的检测。

本发明通过建立酶联免疫化学发光检测(ELISA)平台，筛选降钙素原最佳配对抗体，这种筛选方法不仅减少了后期纯化工作，而且提高了PCT体外诊断试剂的产品质量，用筛选得到的降钙素原最佳配对抗体对可以有效地体外检测人体血清或血浆中的PCT含量，提高细菌感染诊断的准确性。

附图说明

图1是蛋白纯化结果图。

图2是3只小鼠免疫血清检测结果图。

图3是阳性血清检测二次亚克隆结果。其中，第一次稀释倍数5倍，第二次稀释倍数10000倍，暴露时间3分钟。孔板A-E排5个阳性PCT血清的浓度分别为：A：18.41ng/ml，B：6.99ng/ml，C：19.66ng/ml，D：0.829ng/ml，E：1.5ng/ml。孔板F排为浓度0.82mg/ml的重组PCT蛋白，G排为浓度100ng/ml的重组PCT蛋白，孔板H排为PBS(磷酸盐缓冲液)。

图4是l-d(l作为捕获抗体，d作为检测抗体)配对检测结果。最低检测限0.1ng/ml。

图5是使用最佳配对抗体对的酶联免疫ELISA检测方法的标准曲线。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明详述如下：

实施例1

一、PCT抗原设计和表达

1.PCT抗原氨基酸序列(SEQIDNO.1)：

APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQNYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKRDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN

碱基序列(SEQIDNO.2)：

GCTCCTTTCCGCAGCGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCTGGCCGCCCTGGTGCAGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCCTCGACTCTCCTAGATCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAGTTCCACACATTCCCTCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAGAGACCACCGGCCTCACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAAC

2.表达系统

采用293F真核系统表达。

HEK293细胞表达的重组蛋白具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然蛋白分子。293F现已可采用无血清悬浮培养，无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量。

3.质粒构建

合成基因序列：包括5’端EcoRI，3’端XhoI酶切位点，N端添加Kozak(GCCGCCACC)以及CD33信号肽序列(ATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCT)，C端添加HisTag序列(CATCATCACCATCACCAT)以及终止密码(TGATAG)。并将此序列构建至pcDNA4.0TomycHisA载体。合成的基因序列如下(SEQIDNO.3)：

gaattcGCCGCCACCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCTGCTCCTTTCCGCAGCGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCTGGCCGCCCTGGTGCAGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCCTCGACTCTCCTAGATCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAGTTCCACACATTCCCTCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAGAGACCACCGGCCTCACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAACCATCATCACCATCACCATTGATAGctcgag

4.质粒提取、蛋白表达、蛋白纯化与检测

用真核表达载体大量提取无内毒素质粒(MaxExtract)。将所提取的无内毒素质粒进行细胞转染。收集细胞上清及细胞裂解液，采用Ni柱亲和层析，收集样品进行SDS-PAGEWesternblot检验，浓度检测，将合格样品(纯度>90％)透析至PBS(磷酸盐缓冲液)，并将蛋白浓缩至>1.0mg/ml，蛋白纯化结果如图1所示。

二、免疫与采血

1)选取3只BALB/c小鼠(雌性，6周龄以上)进行免疫。

2)第0周：免疫前，小鼠眼眶静脉采血50μl/只，37℃放置1h后，以5000rpm离心5min，制备阴性血清，-20℃保存。进行小鼠第一次免疫，抗原剂量为100μg/只，弗氏完全佐剂(Sigma-F5881)，分多点皮下注射。

3)第2周：小鼠第二次免疫，抗原剂量为50μg/只，不完全佐剂(Sigma-F5506)，注射方式与剂量同初次免疫。

4)第4周：小鼠第三次免疫，免疫剂量和免疫方法同第二次免疫。

5)第5周：小鼠眼眶静脉采血50μl/只，37℃放置1h后，以5000rpm离心5min，制备血清，进行ELISA检测，检测结果如图2所示。剩余血清-20℃保存。取血清转阳后滴度不再变化的小鼠(第2只小鼠，1/4000稀释时，ELISA值大于1)停止免疫，隔日加强免疫，抗原剂量50μg/只，3日后进行细胞融合。

三、杂交瘤融合筛选

1.融合前饲养层细胞制备(包括巨噬细胞和胸腺细胞，制备在无菌环境中进行)

1)采用脱颈法处死5周龄小鼠，浸入75％乙醇中。撕开小鼠腹部皮肤，用5ml注射器吸取20％IMDMHT5ml，灌洗小鼠腹腔(针头平刺，不可伤及内脏)。提住两腿上下摇晃小鼠，将含有巨噬细胞的培养液抽回，置于50ml离心管中，尽量将腹腔中的液体全部吸出。

2)处死两周龄小鼠，75％乙醇浸润。沿胸骨两侧呈倒三角形打开小鼠胸腔，取出胸腺，放入BD公司的一次性筛网中，用2ml注射器的内管研磨研磨，将细胞匀浆吸入20％IMDMHT中。

3)将含有腹腔巨噬细胞和胸腺细胞的混合培养液加入加样槽内，加入适量碳酸缓冲液，混匀，以1.0×10⁴/孔的密度铺96孔板，100ul/孔，8块。铺好细胞的96孔细胞培养板放入37℃、5％CO₂的培养箱内，观擦，如无污染，则放置培养箱内备用。

2.融合前骨髓瘤细胞制备

1)融合前5-7天，解冻骨髓瘤细胞，进行细胞维护扩大培养，调整细胞状态，使其达到对数生长期，细胞活率在95％以上。

2)将对数生长期的骨髓瘤细胞从培养箱中取出，倒掉细胞培养液，加入3-5mlIMDM培养液到培养皿中，轻摇培养皿，倒掉培养液。加入3ml新鲜IMDM培养液，用移液器将细胞从培养皿上吹下，收集细胞悬液于50ml离心管，1000rpm离心5min，弃去培养液，再加入20ml新鲜IMDM培养液重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清。

3)用新鲜的IMDM培养液10ml重悬细胞，放置在超净台内备用。

3.提取免疫成功的脾脏细胞

1)融合前，将小鼠摘眼球取血，37℃1h后，以1000rpm5min离心制备血清作为阳性对照，-20℃保存，处死的小鼠浸入75％乙醇中5-10min。

2)将小鼠置入一个无菌培养皿中，腹部向上，无菌操作剪开并撕开皮肤，使后腹肌肉层充分与皮肤剥离。换用新剪刀剪开腹腔膜，取出脾脏。

3)在培养皿中用10ml已预热的IMDM培养液清洗脾脏2次，剔除脾脏表面黏连的脂肪和结缔组织，然后转入另一含10mlIMDM培养液的无菌培养皿中。

4)用1ml注射器吸取培养液后选取不同的点注射到脾脏内部，使脾脏鼓起，利于细胞释放。用1ml注射器柄在培养皿中挤压脾，使细胞尽可能的分离出来。

5)将挤压混合脾细胞的培养液用一次性无菌巴氏吸管吸取后，通过细胞筛网至50ml离心管中，用新鲜的IMDM培养液冲洗筛网后，1000rpm离心10min，弃上清。加入新鲜的IMDM培养液重悬脾细胞，1000rpm离心10min，弃上清。将脾细胞轻轻敲散，加入IMDM培养液重悬脾细胞，再将骨髓瘤细胞悬液加入至脾细胞悬液中，定容至30ml，混匀，1000rpm离心10min，弃上清，用移液器将残留的液体吸尽，待下一步融合用。

4.细胞融合

1)轻轻敲散细胞，用2ml移液管缓慢加入1ml37℃预热的浓度为50％的PEG1500，轻柔吹吸细胞100s，使PEG(聚乙二醇)与细胞充分接触。

2)迅速加入15ml37℃预热的IMDM培养液，混匀，终止PEG的反应，将细胞重悬，离心管置于37℃水浴10min。

3)1000rpm离心10min，弃上清。

4)取10mlIMDMHAT培养液重悬细胞，将细胞液转入加样槽中，加入80mlIMDMHAT培养液重悬细胞，将细胞悬液混合均匀，加入已铺饲养层的96孔板，铺板8块，100μl/孔，然后将细胞板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。

5)融合2-3天后观察是否污染，若无污染，用移液器小心悬空吸取96孔板内培养液丢弃，换取新鲜20％IMDMHT培养液进行培养，5-6天后观察克隆长势，进行ELISA检测。

5.ELISA检测

1)将PCT抗原按适当浓度溶解于包被液中；

2)在对应的孔中加入100μl抗原，4℃过夜；

3)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；

4)每孔加200μl封闭液，37℃孵育1小时或者4℃过夜；

5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

6)每孔加100μl一抗，37℃孵育1小时；

7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗7次；

8)每孔加100μl二抗，37℃孵育1小时；

9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗7次；

10)拍干孔中残留液体，每孔加100μl显色液，37℃避光显色10min；

11)每孔加50μl2MH₂SO₄终止显色，并立即读取450nmOD值。挑选ELISA阳性、细胞健康的克隆转至24孔板扩大培养(ELISA阳性挑选标准：ELISAOD值大于1.0，或大于阴性1000倍稀释值的3倍)。

6.亚克隆筛选

1)挑选10-20个多克隆，细胞活率90％以上、细胞密度60％-80％；

2)每个克隆进行细胞计数。将细胞按照梯度稀释法稀释，克隆前准备好1块24孔培养板，每孔加入900μl的IMDMHT培养液，将克隆细胞在原孔中混合均匀，吸取100μl的细胞悬液至准备好的24孔板相应的克隆孔中，同时在克隆原液中取微量的细胞悬液至细胞计数板上进行细胞计数，记录好每个克隆的细胞密度；

3)根据稀释细胞的个数(3个细胞/孔)和克隆的板数，取一定量的细胞进行稀释，直至稀释到需要的细胞个数，加入到加样槽中，加入12ml的IMDMHT培养液，混合均匀。A和B排吸取200μl/孔，在加样槽中加入6mlIMDMHT培养液，混合均匀，取200μl/孔加入至C、D、E排。加样槽中加入6mlIMDMHT液，混合均匀，取200μl/孔加入至F、G、H排，并在克隆板上做好标记(克隆号、板号、日期、操作人、克隆次数)后放入二氧化碳培养箱内培养；

4)克隆后要适时观察克隆的长势，一般在7-14天送样检测ELISA；

5)将挑选的克隆转入24孔板中培养，进行第二次亚克隆筛选，克隆的操作方法同第一次亚克隆筛选，克隆后适时做ELISA、WesternBlot检测及亚型鉴定，在第二次亚克隆筛选过程中，筛到9个克隆。将9个克隆用5个阳性PCT血清做DB检测，结果如图3所示，并将其9个克隆生产抗体。

四、抗体配对检测

1)需配对抗体HRP(辣根过氧化物酶)或biotin(生物素)标记

HRP标记采用过碘酸钠法，生物素标记选用EZ-Link^TMSulfo-NHS-LC-BiotinylationKit进行抗体标记。利用间接ELISA检测所标记抗体。将EZ-Link^TMSulfo-NHS-LC-Biotinylation与12株抗PCT的mcAb进行偶联，得到生物素-抗体(Biotin-IgG)，于-20℃保存。

2)配对抗体筛选

按照棋盘滴定法进行抗体配对，取一系列浓度值(0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、0.75ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、100ng/ml)重组抗原PCT筛选最佳配对生物素标记抗体。以经验浓度(200ng/孔、400ng/孔、500ng/孔、1000ng/孔1200ng/孔)包被12种酶标抗体4℃过夜，PBST(抗体稀释液)洗涤3遍，加入封闭液350μl/孔，37℃封闭2h，PBST洗涤3遍，加入定值重组抗原，温育2h后PBST洗涤3遍；再加入1:1000、1:1200倍稀释的12种生物素抗体，37℃温育1h，PBST洗涤5遍；加入Streptavidin-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素)，37℃温育30min，PBST洗涤5遍；加底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)37℃显色10-15min后，终止液终止，双波长读取光密度值，结果如表1-4所示，分析最佳配对结果。

表1HRP酶标记PCT抗体检测结果

表2生物素标记PCT抗体检测结果

表3生物素标记PCT抗体检测结果

表4棋盘滴定法筛选的最优两对配对抗体检测结果

3)配对抗体的优化

获取最佳配对抗体后，在包被缓冲液(碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、pH7.4的磷酸缓冲液)、捕获抗体包被浓度(1000ng/孔、1200ng/孔)、检测抗体稀释度方面(1:1000、1:1200)作系列优化，优化结果如图4所示，最终筛选得到最佳配对抗体l-d，l作为检测抗体，d作为捕获抗体。

五、最佳配对抗体测序

1.检测抗体

1)重链可变区

核苷酸序列(SEQIDNO.4)：

GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCACTACCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAGGGGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTACTAGTAGTGGCACCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTTTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACTCGGCCATGTATTACTGTTCAAGAGGGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

氨基酸序列(SEQIDNO.5)：

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFTTYAMSWVRQTPERGLEWVASITSSGTTYYPDSVKGRFIISRDNARNILYLQMNSLRSEDSAMYYCSRGTYWGQGTLVTVSA

2)轻链可变区

核苷酸序列(SEQIDNO.6)：

GATGTTTTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTAGATACTAATGGAAACTCCTTTTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACG

氨基酸序列(SEQIDNO.7)：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVDTNGNSFLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKR

2.捕获抗体

1)重链可变区

核苷酸序列(SEQIDNO.8)：

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTTTATACACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACTGGGCCTGGATTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATATTATATATGACCCGAGGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCACCCTGACATCTGCGGACACTGCCGTCTATTTCTGTGCTAGGGTCGGGGATGCTTCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCCAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

氨基酸序列(SEQIDNO.9)：

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCAASGFNIKDTFIHWVKQRPELGLDWIGRIDPANGNIIYDPRFQGKATITADTSSNTAYLQLSTLTSADTAVYFCARVGDASLYFDYWGPGTTLTVSS

2)轻链可变区

核苷酸序列(SEQIDNO.10)：

GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACATTAATGGAAACACCTATGTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGACTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC

氨基酸序列(SEQIDNO.11)：

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHINGNTYVHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK

六、使用最佳配对抗体检测血清样本

使用酶联免疫ELISA检测方法检测血清样本，具体步骤如下：

1)将重组抗原按适当浓度溶解于稀释液中；

2)在对应的孔中加入100μl捕获抗体包被，4℃过夜；

3)倒空液体并拍干残留液体，1×洗涤液冲洗4次；

4)每孔加200μl封闭液，37℃孵育2小时；

5)倒空液体并拍干残留液体，1×洗涤液冲洗3次；

6)在96孔板中，取10孔加入100μl标准品(标准品取0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、0.75ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、100ng/ml一系列值)，取24孔加入100μl临床血清样本(血清样本按照原始浓度进行2倍、10倍梯度稀释)，37℃孵育2小时；

7)倒空液体并拍干残留液体，1×洗涤液清洗4次；

8)每孔加100μl捕获抗体，37℃孵育1小时；

9)倒空液体并拍干残留液体，1×洗涤液冲洗4次；

10)每孔加100μlStreptavidin-HRP，37℃孵育45min；

11)倒空液体并拍干残留液体，1×洗涤液冲洗5次；

12)拍干孔中残留液体，每孔加100μl显色液，37℃避光显色10min；

13)每孔加50μl2MH₂SO₄终止显色，并立即读取450nmOD值。

使用上述筛选得到的最佳配对抗体对能成功检测出临床血清样本的浓度，利用标准曲线(图5)得到血清样本浓度如表5所示：

表5使用最佳配对抗体检测临床血清样本浓度的结果

Claims (6)

1.降钙素原单克隆抗体对，其特征在于，包括检测抗体和捕获抗体；所述检测抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述捕获抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。

2.降钙素原单克隆抗体对的制备方法，其特征在于，步骤包括：

1)制备降钙素原重组抗原；

2)制备小鼠降钙素原单克隆抗体；

3)高通量筛选降钙素原单克隆检测抗体和捕获抗体对。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)，采用293F真核表达系统获得降钙素原重组抗原。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)，采用酶联免疫化学发光检测方法筛选降钙素原单克隆抗体对。

5.权利要求1所述单克隆抗体对在降钙素原检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用酶联免疫化学发光检测方法进行降钙素原的检测。