CN109212239A - 一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用 - Google Patents

一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用，属于生物检测技术领域，包括胶条，所述胶条包括顺序搭接的样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜和吸水垫，所述胶体金垫上涂有覆盖有胶体金颗粒标记的鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液层，所述硝酸纤维素膜上包被有Protein A的质控线，以及包被有兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体的检测线，所述样品垫上还设置有点样孔。本发明制备的胶体金免疫层析试纸条储存方便，操作简单，检测速度快，适用于大熊猫尿液中LH的检测，可用于大熊猫发情配种季节现场使用，辅助判断大熊猫的排卵时机。

Description

一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用。
背景技术
大熊猫在一年中只有一次排卵机会，并且对于雌性个体来讲能接受自然交配的时间也非常短，最短的只有几个小时，如果在不恰当的时机将雌雄个体配对进行自然交配将会导致动物间激烈的打斗，引起动物的伤亡；而若采用人工授精，对人工授精时机的把握同样非常重要，由于大熊猫人工授精需要在麻醉状态下进行，已有的研究结果证明，若在排卵前对动物实施麻醉，可导致排卵抑制与延迟，而卵子维持授精能力的时间相对于精子而言要短得多，因此确定大熊猫确切排卵与配种以及人工授精时机是大熊猫成功繁育的关键技术。而目前对大熊猫排卵规律及其影响因素的了解还比较有限，对确切配种的时机国内外尚无一致意见，这也是导致目前大熊猫繁殖效率在年度间波动，繁殖效率不稳定的重要原因。目前对大熊猫排卵规律的认识上，主要通过监测发情期雌激素与孕激素水平变化情况以及发情行为观察加上经验进行综合判断，对配种时机(自然交配与人工授精)的把握目前国内外尚无统一认识。
促黄体素(LH)是脑垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素，由α和β两个亚基组成，β亚基决定激素的特异抗原性和特异功能，但需与α亚基结合才具有生物学活性，是一种可以直接诱发排卵的生殖激素，通常情况下动物LH峰值与排卵间隔时间相对固定，检测LH是确定适时人工授精与适时自然交配指标的有效手段。
胶体金技术是一种新型的免疫标记物，在很多领域都得到了广泛应用，具有使用方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在15分钟内完成；成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适应多种检测条件；标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，对人体无毒害。由于种属差异的原因，目前还没有大熊猫LH胶体金检测技术。
发明内容
本发明目的是提供一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用，通过获得抗大熊猫LH多克隆抗体和单克隆抗体，结合胶体金免疫层析技术制备成胶体金免疫层析试纸条，本发明的提出为大熊猫排卵监测提供了一种敏感，特异的检测方法，对大熊猫的繁育有重要的指导意义，解决了上述还没有大熊猫LH胶体金检测技术的缺陷。
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，包括胶条，所述胶条包括顺序搭接的样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜和吸水垫，所述胶体金垫上涂有覆盖有胶体金颗粒标记的鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液层，所述硝酸纤维素膜上包被有Protein A的质控线，以及包被有兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体的检测线，所述样品垫上还设置有点样孔。
使用时，在点样孔滴加测试尿液50ul，反应5-10min观察结果；
结果判定：
阳性结果：质控线和检测线都出现红色条带，其中检测线红色越深，LH含量越高；
阴性结果：仅质控线出现一条红色条带；
无效结果：如质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。
本发明制备的胶体金免疫层析试纸条储存方便，操作简单，检测速度快，适用于大熊猫尿液中LH的检测，可用于大熊猫发情配种季节现场使用，辅助判断大熊猫的排卵时机。
进一步的，所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
进一步的，所述胶体金垫为玻璃纤维膜。
进一步的，还包括底板，所述胶条设置在所述底板上。
更进一步的，所述底板为聚氯乙烯胶板。
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)点膜
将兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗作为检测线包被在硝酸纤维素膜上，将质控线包被protein-A用磷酸盐缓冲液稀释至0.25mg/ml作为质控线包被在硝酸纤维素膜上，室温下干燥；
(3)胶体金垫的制备
将鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液于离心管中经胶体金标记，并经牛血清白蛋白封闭后，在10000-12000r/min转速下离心15-25min，弃去上清，用500ul金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×150mm的金垫上干燥；
(4)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(5)试纸条的组装
在底板的一面从上至下依次粘贴吸水垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫，各相邻连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，用斩切机切成3.2-3.8mm宽的试纸条，即得大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条。
优选的，步骤(5)试纸条的组装中，所述试纸条的宽度为3.5mm。
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的应用：方法如下：
(1)收集雌性大熊猫发情高峰期时连续4个尿样，每个尿样间隔时间约为4小时，每个尿样吸取50ul，滴加在试纸条上反应，5-10min后判读结果；
(2)检测结果：
a阳性结果：质控线和检测线都出现红色条带，其中检测线红色越深，LH含量越高；
b阴性结果：仅质控线出现一条红色条带；
c无效结果：如质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。
检测结果可指导大熊猫人工授精的时间。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)通过获得抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体，结合胶体金免疫层析技术制备成胶体金免疫层析试纸条；(2)本发明制备的胶体金免疫层析试纸条储存方便，操作简单，检测速度快，适用于大熊猫尿液中LH的检测，可用于大熊猫发情配种季节现场使用，辅助判断大熊猫的排卵时机；(3)本发明利用细胞融合技术，建立分泌抗LHβ亚基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性LHβ亚基单克隆抗体。
保藏信息：本发明的抗大熊猫LHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株14081-1-9，于2018 年5月31日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，保藏编号：CCTCC NO：C2018128，地址：中国武汉武汉大学。
附图说明
图1为试纸条结构示意图；
图2为试纸条检测结果示意图；
图3为一例大熊猫发情期尿液检测结果图。
附图标记：1-样品垫，2-胶体金垫，3-检测线，4-质控线，5-吸水垫，6-底板，7-硝酸纤维素膜。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
实施例1
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，包括胶条，所述胶条包括顺序搭接的样品垫1，胶体金垫2，硝酸纤维素膜7和吸水垫5，所述胶体金垫2上涂有覆盖有胶体金颗粒标记的鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液层，所述硝酸纤维素膜7上包被有Protein A的质控线4，以及包被有兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体的检测线3，所述样品垫1上还设置有点样孔。
使用时，在点样孔滴加测试尿液50ul，反应5min观察结果；
结果判定：
阳性结果：质控线4和检测线3都出现红色条带，其中检测线3红色越深，LH含量越高；
阴性结果：仅质控线4出现一条红色条带；
无效结果：如质控线4无条带出现，不论检测线3是否出现红色条带结果均判定为无效。
本发明制备的胶体金免疫层析试纸条储存方便，操作简单，检测速度快，适用于大熊猫尿液中LH的检测，可用于大熊猫发情配种季节现场使用，辅助判断大熊猫的排卵时机。
实施例2
所述样品垫1为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
实施例3
所述胶体金垫2为玻璃纤维膜。
实施例4
还包括底板6，所述胶条设置在所述底板6上。
实施例5
所述底板6为聚氯乙烯胶板。
实施例6
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)吸水垫5的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫5；
(2)点膜
将兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗作为检测线3包被在硝酸纤维素膜7上，将质控线4包被protein-A用磷酸盐缓冲液稀释至0.25mg/ml作为质控线4包被在硝酸纤维素膜7 上，室温下干燥；
(3)胶体金垫2的制备
将鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液于离心管中经胶体金标记，并经牛血清白蛋白封闭后，在10000-12000r/min转速下离心 15-25min，弃去上清，用500ul金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×1 50mm的金垫上干燥；
(4)样品垫1的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫 1，然后置干燥器中室温保存；
(5)试纸条的组装
在底板6的一面从上至下依次粘贴吸水垫5、硝酸纤维素膜7、胶体金垫2、样品垫1，各相邻连接处交叠连接，交叠长度为1mm，用斩切机切成3.2mm宽的试纸条，即得大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条。
实施例7
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
其中步骤(5)试纸条的组装中，交叠长度为2mm，用斩切机切成3.5mm宽的试纸条，其他步骤如实施例6所述。
实施例8
其中步骤(5)试纸条的组装中，交叠长度为3mm，用斩切机切成3.8mm宽的试纸条，其他步骤如实施例6所述。
实施例9
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的应用：方法如下：
(1)收集雌性大熊猫发情高峰期时连续4个尿样，每个尿样间隔时间约为4小时，每个尿样吸取50ul，滴加在试纸条上反应，10min后判读结果；
(2)检测结果：
a阳性结果：质控线4和检测线3都出现红色条带，其中检测线3红色越深，LH含量越高；
b阴性结果：仅质控线4出现一条红色条带；
c无效结果：如质控线4无条带出现，不论检测线3是否出现红色条带结果均判定为无效。
检测结果可指导大熊猫人工授精的时间。
实施例10
一种鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体的制备方法，具体操作如下：
1.1特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库大熊猫LHβ亚基氨基酸序列，登录号：NP_001291788.1，序列为： MEMFQGLLLWLLLNTGGAWASRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVCITFTTTICAGYCPSM VRVLPAALPPVPQPVCTYHELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCRCGPCRLSNSDCGGPRAQPLACDRPPLPGLLFL，并参考其它物种序列分析，设计了大熊猫LHβ特异序列CGGPRAQPLACDRPPLPGLL(LHβ-1)，并通过人工合成，并与KLH(匙空血蓝蛋白)偶联，作文生产特异性抗体的免疫原(LHβ-KLH)。对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生产出多肽片段LH β-1以及免疫原LHβ-KLH
1.2抗原小鼠免疫：用佐剂∶抗原＝1∶1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和NaCl吸进注射器中(共 400ul，四只的量)，再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中(共400ul，四只的量)；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化(乳化大概10多分钟，至油包水状态即可)，最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
第1天：腹腔注射，200ul一只。(抗原量为100ug/只)
第14天：腹腔注射，200ul一只。(之后抗原都为50ug/只)
第21天：腹腔注射，200ul一只。
第27天：腹腔注射，200ul一只。
…………………
(第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000rmp，8min，取血清测定其效价，以LHβ-1，包被浓度为2ug/ml作为抗原，ELISA方法检测血清效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。)
1.3细胞融合：
1.3.1骨髓瘤细胞(SP2)的复苏：先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15ml的离心管中，再取大概5ml的PBS，混匀，1000rpm，5min，离心，弃上清，重复两次清洗SP2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
1.3.2 SP2细胞的传代：当培养瓶中的细胞长满瓶底80％左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15ml离心管内1000r/min，离心5分钟；弃上清，加 PBS 5ml，吹打混匀，再次离心弃上清，重复PBS洗涤步骤2次。洗涤完后加2ml 10％完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
1.3.3滋养层巨噬细胞的制备(融合前一天可准备)：
小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75％酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8ml的含双抗的不完全培养基注射入腹腔(双抗∶不完全培养液＝1∶100)，注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000 r/min离心5min，弃去上清。再用PBS洗涤四次。将细胞重悬于10％的完全培养液中。
将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100ul，最后将96孔板放入CO2的培养箱培养。
(巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。)
1.3.4免疫脾细胞制备：
(1)取小鼠脾脏
取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在 75％的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置(超净台中)，进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于PBS中洗涤。
(2)脾细胞悬液制备
先用PBS洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加PBS洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清；再用5mlPBS洗涤，1000r/min，离心5分钟；重复三次，洗涤完后加2ml不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
(3)SP2细胞悬液的制备：用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜(细胞均为悬浮或轻微帖壁生长)，再将细胞液用加样抢转移至15ml离心管内1000r/min，离心5 分钟；弃上清，再加PBS5ml，混匀，1000r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2ml不完全培养液(DMEM)重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
1.3.5 PEG作用下进行细胞融合
将SP2与脾细胞按1∶4(1∶10至1∶4之间)的比例混合在一起，离心，600rpm，3min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1min内缓慢加入37℃预热好的0.6ml 50％PEG溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1min。37℃预热好的不完全培养液 10ml以终止PEG作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2min。离心， 800rpm，5min，弃上清；再用PBS或不完全培养液洗涤2次，以去除PEG。
洗涤完后弃上清，用10mlHAT选择培养液重悬细胞。上述细胞加到已有饲养细胞层的 96孔板内(用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体)，每孔加100ul；将培养板置CO2培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含HAT的完全培养液(19.6ml10％完全培养液+0.4mlHAT)，每孔加100ul；将培养板置CO2培养箱中培养。
1.3.6选择培养
(1)融合培养的第四天半液法换HAT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100ul，弃掉，再加入新的每孔100ulHAT培养液(HAT培养液配制为：10％的完全培养液∶HAT＝1∶50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200ul 50×HAT。
(2)融合培养的第七天半液法换HT培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取 100ul，弃掉，再加入新的每孔100u1HT培养液(HT培养液的配制为：10％的完全培养液∶HT＝1∶50)，每块板子需要在10ml完全培养液中加入200ul 50×HT。
1.3.7阳性克隆筛选
在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时(大概在第12天左右)，可吸取培养液检测其有无分泌抗体。
(1)先将之前包被好的相应的ELISA(包被LHβ-1，包被浓度为2ug/m1)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100ul每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10％的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清(融合前小鼠眼眶采血的血清)。
(2)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。
(3)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
(4)加双抗：双抗稀释10000倍，50ul每孔。
(5)孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
(7)显色：每孔加显色剂TMB100ul，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10min。
(8)比色测定：每孔加终止液50ul(终止液＝21.5ml的浓硫酸定容至200ml)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450nm，测定各孔值。
选取阳性结果高者(至少为阴性对照的4倍)，作为阳性克隆孔。
1.3.8有限稀释法筛选抗大熊猫LHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株
(1)阳性孔细胞的计数：将筛选得到的阳性克隆孔孔可做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15ml的离心管中(边吹打边旋转，使细胞悬浮)，再补加10％的完全培养液至2ml；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验(由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞)。
(2)将细胞液加入200ml完全培养液中，混匀，96孔板加样，200ul/孔，共十块96孔板。
(3)最后将培养板置CO2培养箱中培养。
(4)培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。
(5)培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10％完全培养液100ul/孔。
(6)第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测(ELSIA检测)，阳性强的孔即为抗大熊猫LHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明最终筛选得到一株抗大熊猫LHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株14081-1-9。
1.3.9亚型鉴定
使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 37503试剂盒进行亚型鉴定。
准备工作：将试剂盒中TBS溶于500ml双蒸水中，用于稀释样品，870ml双蒸水与30ml 30X Wash Buffer混匀，用于洗板，根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450ul的样品磷酸盐缓冲液，吸取20ul的细胞培养液加入980ul的 TBS中混匀。
实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50ul/孔，每个样需加8孔即一条，加入50ul/孔的Goat Anti-Mouse IgG+IgA+IgM HRP，轻柔的晃动板子混匀盖上封板膜，室温孵育一个小时，洗板4次，扣干水分，加入75ul/孔的TMB显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色5-15min之后加入75ul/孔的终止液终止反应，液体由蓝色变为黄色。经鉴定筛选所得到的抗大熊猫LHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株14081-1-9所分泌的抗体亚型为IgG1型。
1.3.10单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。
批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中(边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移)培养，并加600ul的10％完全培养液培养。
观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养(先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10％的完全培养液7ml)。
观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养(细胞传代)。
可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，再拿培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为Pierce Protein G Agarose，并用10000kda超滤管浓缩纯化过的抗大熊猫LHβ单克隆抗体，-20度保存备用。
1.3.11单克隆抗体细胞株冻存
将鉴定的抗大熊猫LHβ亚基单克隆抗体杂交瘤细胞株14081-1-9培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中(细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长)，在将细胞转移至15ml的离心管中。离心，1000转/5分钟。用PBS洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加PBS，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液(冻存液＝5ml血清+4mlDMEM+1mlDMSO，颠倒混匀，过滤备用)，混匀。最后加入冻存管中，每管1ml细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将细胞株14081-1-9放入液氮中长期保存备用。
实施例11
一种兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体的制备方法，具体操作如下：
2.1特异多肽片段的设计与合成：根据NCBI数据库大熊猫LHβ亚基氨基酸序列，登录号：NP_001291788.1，序列为： MEMFQGLLLWLLLNTGGAWASRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVCITFTTTICAGYCPSM VRVLPAALPPVPQPVCTYHELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCRCGPCRLSNSDCGGPRAQPLACDRPPLPGLLFL，并参考其它物种序列分析，设计了大熊猫LHβ特异序列CGGPRAQPLACDRPPLPGLL(LHβ-1)，并通过人工合成，并与KLH(匙空血蓝蛋白)偶联，作文生产特异性抗体的免疫原(LHβ-KLH)。对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本申请公开的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生产出多肽片段LH β-1以及免疫原LHβ-KLH
2.2多克隆抗体的制备：采用常规的动物免疫方法，选取3只新西兰大白兔，分别标记为1-3号兔；免疫动物之前，预采取1-3号兔的血液，分离后得血清。将免疫原LHβ-KLH免疫1-3号兔。具体的免疫方法如下：
2.2.1首次免疫剂量为每只500ug偶联多肽，与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀，颈部皮下多点注射；两周后进行第一次加强免疫，免疫剂量减半为250ug，与等体积的复式不完全佐剂充分混匀。第一次加强免疫后一周进行第二次加强免疫，方法同前。在第三次加强免疫前，耳缘静脉少量采血，用于血清效价鉴定，待血清效价达1∶10000倍后，进行第三次加强免疫，第三次加强免疫3天后，对兔进行心脏采血，分离得血清，将血清冻存备用。
2.2.2抗体效价的鉴定：将多肽片段LHβ-1分别溶解于0.05mol/L、pH 9.6的碳酸氢钠包被缓冲液.肽片段的浓度为1ug/ml，按50ul每孔分别将多肽片段加入到96孔ELISA检测板中，4℃孵育过夜，使多肽抗原能稳定地吸附并包被在样品测定孔中，洗涤后在每个样品孔中加入含有2％牛血清白蛋白(牛血清白蛋白)的PBS封闭缓冲液，常温封闭5h，洗涤，每孔分别加入50ul梯度稀释的免疫前和免疫后的血清(血清的稀释倍数分别为：1∶100， 1∶500，1∶2000，1∶5000，1∶10000，1∶20000和1∶40000)，37℃孵育30min，洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗，37℃温育30min，洗涤，加入TMB显色底物，室温反应10min，加终止液终止反应，酶标仪检测450nm波长下吸光值。
由免疫原LHβ-KLH-1免疫兔生产的抗体的效价结果见表一
表一：血清效价检测结果1
由表一可以看出：利用本发明提供抗原(LHβ-KLH)免疫兔子后，均检测到效价达 1∶20000倍以上的高效价血清。
2.2.3抗体的纯化与浓缩：利用Pierce公司的纯化填料Protein-G Agarose，亲和层析纯化高免血清(方法按试剂说明书进行)，收集高浓度的纯化产物，以millipore超滤离心管浓缩收集Protein-G纯化的高免血清。本实施例最终得到兔抗大熊猫LHβ亚基多克隆抗体。
实施例12
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条制备及应用，具体操作如下：
按照实施例10和11中提供的制备方法得到的两种抗大熊猫促黄体素单克隆抗体和多克隆抗体应用到大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条制备中。
3.1抗体标记
取1支1.5ml离心管用超纯水清洗两遍，吸取1ml胶体金加入每管中，向管中加入2ul 0.2M碳酸钾后震荡离心管使其混合均匀，向管中加入10ug鼠抗大熊猫促黄体素单克隆抗体和3ug兔抗大熊猫促黄体素多克隆抗体混合溶液，混匀后反应15min，之后向每管中加入20ul10％牛血清白蛋白封闭反应15min，在11000r/min转速下离心20min，弃去上清，用500ul金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×150mm的金垫上干燥。
3.2吸水垫5的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫5；
3.3点膜
将兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗作为检测线3包被在硝酸纤维素膜7上，将质控线4包被protein-A用磷酸盐缓冲液稀释至0.25mg/ml作为质控线4包被在硝酸纤维素膜7 上，室温下干燥；
3.4样品垫1的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫 1，然后置干燥器中室温保存；
3.5试纸条的组装
在底板6的一面从上至下依次粘贴吸水垫5、硝酸纤维素膜7、胶体金垫2、样品垫1，各相邻连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，用斩切机切成3.2-3.8mm宽的试纸条，即得大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条。
3.6金标抗体的样品反应验证
将事先准备的大熊猫促黄体素含量的高阳性尿样、低阳性尿样、阴性尿样各50ul滴加在试纸条上反应，10min后判读结果，结果如图2。由图2中看出1、2、3号试纸条反应情况呈梯度性。
3.7大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的应用
收集某雌性大熊猫发情高峰期时连续4个尿样，每个尿样间隔时间约为4小时，每个尿样吸取50ul，滴加在试纸条上反应，10min后判读结果，结果如图3，检测结果表明3号尿样阳性最强，其所在的时间点与大熊猫的排卵时机最为接近，以此可指导大熊猫人工授精的时间。
实施例13
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条制备及应用，具体操作如下：
按照实施例10和11中提供的制备方法得到的两种抗大熊猫促黄体素单克隆抗体和多克隆抗体应用到大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条制备中。
3.1抗体标记
在10000r/min转速下离心25min，其他步骤如实施例12所述。
实施例14
一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条制备及应用，具体操作如下：
按照实施例10和11中提供的制备方法得到的两种抗大熊猫促黄体素单克隆抗体和多克隆抗体应用到大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条制备中。
3.1抗体标记
在12000r/min转速下离心15min，其他步骤如实施例12所述。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
。
序列表
<110> 成都大熊猫繁育研究基地
<120> 一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用
<130> AJ1844863
<141> 2018-10-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)
<400> 1
Cys Gly Gly Pro Arg Ala Gln Pro Leu Ala Cys Asp Arg Pro Pro Leu
1 5 10 15
Pro Gly Leu Leu
20

Claims (8)

1.一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：包括胶条，所述胶条包括顺序搭接的样品垫(1)，胶体金垫(2)，硝酸纤维素膜(7)和吸水垫(5)，所述胶体金垫(2)上涂有覆盖有胶体金颗粒标记的鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液层，所述硝酸纤维素膜(7)上包被有兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体的检测线(3)，以及包被有Protein A的质控线(4)，所述样品垫(1)上还设置有点样孔；所述的鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体由保藏在中国典型培养物保藏中心的，菌种保藏编号为CCTCC NO:C2018128的杂交瘤细胞株14081-1-9分泌产生。
2.根据权利要求1所述的一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫(1)为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
3.根据权利要求1所述的一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述胶体金垫(2)为玻璃纤维膜。
4.根据权利要求1所述的一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：还包括底板(6)，所述胶条设置在所述底板(6)上。
5.根据权利要求4所述的一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述底板(6)为聚氯乙烯胶板。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)吸水垫(5)的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫(5)；
(2)点膜
将兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗作为检测线(3)包被在硝酸纤维素膜(7)上，将质控线(4)包被protein-A用磷酸盐缓冲液稀释至0.25mg/ml作为质控线(4)包被在硝酸纤维素膜(7)上，室温下干燥；
(3)胶体金垫(2)的制备
将鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体和兔抗大熊猫促黄体素β亚基多克隆抗体混合液于离心管中经胶体金标记，并经牛血清白蛋白封闭后，在10000-12000r/min转速下离心15-25min，弃去上清，用500ul金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×1 50mm的金垫上干燥；所述的鼠抗大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体由保藏在中国典型培养物保藏中心的，菌种保藏编号为CCTCC NO:C2018128的杂交瘤细胞株14081-1-9分泌产生；
(4)样品垫(1)的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫(1)，然后置干燥器中室温保存；
(5)试纸条的组装
在底板(6)的一面从上至下依次粘贴吸水垫(5)、硝酸纤维素膜(7)、胶体金垫(2)、样品垫(1)，各相邻连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，用斩切机切成3.2-3.8mm宽的试纸条，即得大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条。
7.根据权利要求6所述的一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(5)试纸条的组装中，所述试纸条的宽度为3.5mm。
8.一种如权利要求1-5任一项所述的大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条的应用：其特征在于：方法如下：
(1)收集雌性大熊猫发情高峰期时连续4个尿样，每个尿样间隔时间约为4小时，每个尿样吸取50ul，滴加在试纸条上反应，5-10min后判读结果；
(2)检测结果：
a阳性结果：质控线(4)和检测线(3)都出现红色条带，其中检测线(3)红色越深，LH含量越高；
b阴性结果：仅质控线(4)出现一条红色条带；
c无效结果：如质控线(4)无条带出现，不论检测线(3)是否出现红色条带结果均判定为无效。
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