CN105044365B - 检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法。它包括化学方法合成药物人工抗原：以恩诺沙星为母核，通过化学方法合成人工免疫原；免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体；免疫时间分辨荧光的制备；恩诺沙星残留快速检测试纸条金标垫的制备、NC膜的包被、样品垫的制备及组装；本发明所制备的检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有结构简单、组装容易、耐腐蚀、重量轻、成本低、适用面广等特点，能够起到良好的堵水上色效果。

Description

检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体的说是涉及一种能够准确、快速、便捷地检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin)，简写为Enro,又名恩氟奎林羧酸，属于氟奎诺酮类(Fluoroquinolones)之化学合成抑菌剂，易溶于甲醇及氰甲烷等有机溶剂，是一类人畜通用的药物，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治。恩诺沙星近年来在食用动物饲养中的滥用越来越受到人们的重视，由于恩诺沙星药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后就在人体内残留蓄积，造成人体疾病对该药物的严重耐药性，影响人体疾病的治疗。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了恩诺沙星药物在动物组织中的最高残留限量。美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。

分析检测领域的研究者一直致力于研究开发恩诺沙星残留的快速、可靠、低成本的检测方法。目前检测恩诺沙星药物残留的方法有LC-UV、LC-MS、LC-MS-MS和LC-EIMS等，该类技术需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高流通量、快速检测的需要。ELISA等免疫分析具有样品处理简单、特异性高、成本低和操作简单等优点，但也存在假阳性高、重复性差、酶易失去活性等缺点。

时间分辨荧光免疫层析方法是一种快速有效的兽药残留分析方法，该方法具有操作简单、快速，高效、高灵敏度，不需要专业人员操作，成本低、易推广等优点。因此在食品安全这个全球关注的热点问题中，为了快速准确地检测各种违禁兽药的残留，建立特异、灵敏和快速的分析方法已经成为科研工作者的一项紧急任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，以解决检测食用动物体内恩诺沙星残留样品处理复杂，检测设备昂贵的问题。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为：

一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺沙星、N-羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7.2的磷酸盐缓冲液中,将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到磷酸盐缓冲液中，并于室温下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色粉末；

步骤二、抗恩诺沙星单克隆抗体的制备：用步骤一所制备的偶合物Enro-BSA免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG，以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体IgG；采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG；

步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时间分辨荧光Eu³⁺；

步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu³⁺作为标记物标记抗恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6.0，抗恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量为每毫升时间分辨荧光Eu³⁺添加32.5μg抗恩诺沙星单克隆抗体，制备出经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光；

步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星药物人工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG包被在质控线C线处，经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度为0.9~1.1mm，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸。

作为本发明的进一步改进，所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸100%抑制浓度为500ng/mL。

作为本发明的更进一步改进，所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸包括卡套、试纸条，试纸条包括依次重叠粘贴在PVC底板上的吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫，NC膜上设有两条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的兔抗鼠IgG作为质控线C线，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检测线T线；金标垫上包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧光作为示踪物。

作为本发明的更进一步改进，所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的卡套的外壁上设有观察孔、点样孔，观察孔位于所述质控线C线和检测线T线的上方。

作为本发明的更进一步改进，所述NC膜型号为Millipore135。

本发明采用时间分辨荧光免疫分析试纸分析方法来检测动物组织中恩诺沙星的残留，它包括特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体IgG；恩诺沙星残留快速检测试纸条的制备及组装。

本发明检测的基础是标记免疫反应，以分辨荧光Eu³⁺标记的抗恩诺沙星单克隆抗体作为示踪物，以恩诺沙星药物人工抗原包被在T线上作为恩诺沙星的竞争物，通过免疫层析过程选择中最佳条件的筛选，成功建立了恩诺沙星兽药残留的时间分辨荧光免疫层析试纸条快速检测方法，该方法能够对恩诺沙星残留进行定性检测。恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫层析试纸条100%抑制为500ng/mL，对其它恩诺沙星结构类似物的兽药没有明显的交叉反应。样品添加回收试验表明，可以用于动物源性食品中恩诺沙星残留的检测。

本发明的有益效果：本发明检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。

附图说明

图1是检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸条的结构示意图；

图2是检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的结构示意图；

图3是恩诺沙星药物人工抗原鉴定时所得的SDS-PAGE电泳图；

图4是时间分辨荧光紫外扫描图谱；

图中：1、样品垫，2、金标垫，3、检测线T线，4、质控线C线，5、吸水垫，6、PVC底板，7、NC膜，8、观察孔，9、点样孔，10、卡套。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案及有益效果作进一步详细的说明。

一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：

采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将20mg恩诺沙星(Enro),10mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），以及12.5mg碳二亚胺盐酸（EDC）充分溶解于1mL二甲基甲酰胺（DMF）中，于室温下搅拌24h，即可得到恩诺沙星（Enro）反应液，称取牛血清白蛋白（BSA）50mg，使之充分溶解在3mLpH=7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）中,将恩诺沙星（Enro）反应液逐滴缓慢滴加到磷酸盐缓冲液中，并于室温下搅拌3h，然后用pH=7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质。以200000r/min的速度离心30min，收集上清液，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色粉末。

检测抗原Enro-OVA的制备，同样采用N-羟基琥珀酰亚胺法，以70mg卵清蛋白（OVA）按照上述步骤代替牛血清白蛋白（BSA），制备所得偶合物为检测抗原Enro-OVA。

将免疫抗原Enro-BSA与检测抗原Enro-OVA进行紫外扫描光谱鉴定，在200～400nm紫外光区对2种偶合物进行扫描，以磷酸盐缓冲液（PBS）为空白对照,对牛血清蛋白（BSA）、过程BSA、Enro-BSA、恩诺沙星（Enro）与牛血清蛋白（BSA）在磷酸盐缓冲液（PBS）中的混合物、恩诺沙星（Enro）的磷酸盐缓冲液（PBS）进行紫外扫描,扫描波长范围为200～350nm。同样的方法，将卵清蛋白（OVA）、Enro-OVA、恩诺沙星（Enro）与卵清蛋白（OVA）在磷酸盐缓冲液（PBS）中的混合物、恩诺沙星（Enro）的磷酸盐溶液（PBS）进行紫外扫描，扫描的波长范围为230～400nm。紫外扫描光谱结果显示复合物与其前体物有不同的紫外吸收特征，表明与恩诺沙星（Enro）与牛血清蛋白（BSA）成功的实现偶联。

采用SDS-PAGE电泳进行人工抗原的鉴定：用浓缩胶5%，分离胶10%，向每个样品孔分别加入变性处理后的Enro-BSA偶合物和牛血清白蛋白（BSA）溶液10ul，样品在浓缩胶中恒流(I=15mA)浓缩20min，然后在分离胶中分离2.5h，得到图3所示的SDS-PAGE电泳图。

由图3可以看出，Enro-BSA的条带与牛血清白蛋白（BSA）蛋白条带比较，有明显的托尾现象，这是由于合成产物为混合物，其含有小分子半抗原与BSA的偶联合成物以及未反应的BSA。

步骤二、抗恩诺沙星单克隆抗体的制备：

（1）动物免疫：用步骤一所制备的偶合物Enro-BSA免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg/0.2mL。首次免疫，用无菌0.01mol/LpH值为7.4的磷酸盐溶液（PBS）溶解免疫原，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，在小鼠的颈背部皮下分2~3点注射；加强免疫，用0.01mol/LpH为7.4磷酸盐溶液（PBS）溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，在小鼠腹腔注射；每次间隔14~21d，第3次免疫后7~10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3~4d，在小鼠的腹腔注射恩诺沙星-BSA抗原100μg/0.2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。

（2）抗恩诺沙星单克隆抗体的制备：分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫睥细胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75%酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上用剪刀（操作时要换一套镊子和剪刀）剪一小口（在腹部中央），剪开腹膜（换1套镊子和剪刀），露出脾脏，用镊子夹住脾脏（再换1套器械），用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基(RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础培养基（RPMI-1640），静置2min，将上层细胞悬液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复上述操作1次。以1200r/min的速度离心10min，除去上清，取得小鼠免疫脾细胞。将10⁸个免疫脾细胞与1~2×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞按照1:10或1:5的比例加入50mL离心管中，进行混匀，然后于1500r/min的速度水平离心10min，弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37℃水浴锅中。在1min内缓慢将质量浓度为50%的聚乙二醇溶液（PEG）0.8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30sec后，静置1min，然后慢慢加入40mLRPMI-1640基础培养基(事先进行37℃预温)。加基础培养基方法为：第1min内逐滴滴入1mL，第2min内加2mL，第3min内加3mL，第4min内加其余的4mL，在每次加培养基时需缓慢加入，并轻轻地搅拌培养基，最后将剩余的RPMI-1640培养基慢慢加入离心管中；以1000r/min的速度离心5min，除去上清。然后用HAT培养基悬浮混合的细胞，再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，再将含有饲养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上，滴加量约为150μL/孔。将培养板置于37℃、体积浓度为5%的CO₂饱和湿度培养箱中，进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细胞克隆，选择强阳性集落生长的孔，用有限稀释法进行克隆，并对其他阳性孔，进行24孔扩大培养，用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测，对间接ELISA和间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测，并进行3次亚克隆后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。

进行杂交瘤细胞染色体的计数，将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞，进行细胞染色体条数的计数，再计算细胞染色体条数的平均值。小鼠脾细胞染色体数为40条，SP2/0细胞的染色体数目平均数为62~68条，而本试验获得的20株杂交瘤细胞染色体数目都在92~103条之间，平均为97.8条。本杂交瘤细胞染色体数目高于两亲本细胞的染色体数目，说明是两种细胞的杂交产物。

取所制备的杂交瘤细胞株细胞分泌物培养上清液，进行1:10稀释后，用夹心ELISA方法测定抗体亚型，该细胞株分泌的抗体亚型为IgG1。

（3）抗恩诺沙星单克隆抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化：取小鼠腹水10.0mL，加入等体积的巴比妥缓冲液，适量的二氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15min后，取上清于洁净离心管中，在4℃温度下以1,800r/min的速度离心20min；取上清液18.0mL，加入36.0mL0.06mol/L醋酸钠缓冲液，用HCL调节溶液pH值至4.5，充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297μL；继续搅拌10min，然后转入4℃冰箱静置2h，4℃，再以15,000r/min的速度离心30min，上清液经0.45μm滤膜过滤后体积为50mL；加入5.0mL0.1mol/L的磷酸缓冲液，用NaOH溶液调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL；4℃冰箱静置2h后，在4℃温度下以12,000r/min离心30min，弃上清；沉淀用5.0mL0.1mol/L的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5,000mL0.01mol/LpH值为7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）充分透析后，再用2,000mL蒸馏水透析，最后用3,000mL三蒸去离子水透析；然后在温度为4℃下以12,000r/min的速度离心30min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。

（4）用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG。

步骤三、时间分辨荧光的制备：

采用柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）还原法来制备时间分辨荧光，具体操作步骤为：

（1）从酸缸中取出浸泡24h以上的500mL锥形瓶和磁力搅拌子各一个，先用自来水冲洗10次，然后用双蒸水冲洗8次左右。

（2）取以前制备的时间分辨荧光溶液20mL左右，倒入锥形瓶，用保鲜膜封住瓶口，缓慢晃动锥形瓶，使时间分辨荧光溶液充分的接触锥形瓶的内壁，10min后弃去，用双蒸水冲洗三次。用蒸馏水冲洗时锥形瓶四壁应没有水珠，水面应是水平的，没有形成凹面，说明锥形瓶可以用来制备时间分辨荧光。

（3）用容量瓶准确量取100mL双蒸水倒入锥形瓶中，然后放入磁力搅拌子，调节磁力搅拌器到合适的转速，打开加热开关加热到溶液沸腾，5min后用移液枪准确吸取1mL1%HAuCl4溶液于锥形瓶中（形成0.01%HAuCl4的溶液）继续加热至沸腾5min。

（4）用移液枪吸取1%柠檬酸三钠加到溶液中并继续加热，当加入柠檬酸三钠的量为3mL时，制备出来的时间分辨荧光呈现出酒红色，等溶液颜色稳定后继续加热搅拌15min后，关掉加热开关，室温搅拌至冷却，定容到100mL，置4℃冰箱内保存备用。并在25℃放置10天之后，没有发生聚沉现象，此时制备的时间分辨荧光溶液为最佳质量。

（5）吸取适量时间分辨荧光溶液用紫外分光光度仪在可见光范围内（400~700nm）进行扫描，获得时间分辨荧光的可见光吸收光谱。

图4为时间分辨荧光紫外扫描图谱，从图4可以看出，制备的时间分辨荧光溶液最大吸收峰波长为523nm，最大吸收值为0.96，根据吸收峰波长与颗粒直径的关系公式Y=0.398X+516.17（其中Y代表吸收峰波长，X代表颗粒直径），计算出时间分辨荧光颗粒大小为17.16nm。

步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：

（1）时间分辨荧光标记抗恩诺沙星单克隆抗体最适pH值的测定：

取6个1.5mL离心管，1个为对照管，其他每个离心管准确吸取1.0mL时间分辨荧光溶液，用0.1mol/LK₂CO₃或0.5mol/LHCL调节时间分辨荧光的pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后在每种不同pH值的时间分辨荧光中分别加入1.0mg/mL的抗恩诺沙星单克隆抗体20μL，混匀后静置45min，然后再每个离心管中加入10%NaCl溶液15μL，静置2h，观察时间分辨荧光颜色的变化。发现在pH值为6.0的离心管中没有产生时间分辨荧光的沉淀，说明pH6.0的时间分辨荧光pH值为最佳标记pH值。时间分辨荧光最佳标记pH值为6.0，此时每1mL时间分辨荧光溶液添加20μLK₂CO₃溶液。

（2）时间分辨荧光Eu³⁺标记抗恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量的测定：

取6个1.5ml离心管，每个离心管中准确量取1.0ml时间分辨荧光溶液，用0.1mol/LK₂CO₃调节pH值到6.0，然后在每个离心管中加入35μg、25μg、15μg、10μg、5μg、1μg不同浓度的抗恩诺沙星单克隆抗体100.0μL，混匀后静置5min，再加入10%NaCl溶液100μL，静置5min，观察现象。发现加入25μg抗恩诺沙星单克隆抗体的离心管保持时间分辨荧光颜色不变，说明25μg抗体量达到或超过了稳定时间分辨荧光的最低蛋白量。因此，选择25μg的抗体用量为最低蛋白量，在此基础上再加入30%即为试剂抗体用量：

25μg/mL×(1+30%)=32.5μg/mL。

抗恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量为每毫升时间分辨荧光Eu³⁺添加32.5μg抗恩诺沙星单克隆抗体。

（3）时间分辨荧光标记抗恩诺沙星单克隆抗体

当时间分辨荧光Eu³⁺标记抗恩诺沙星单克隆抗体的各个条件确立以后便可用抗体与时间分辨荧光进行标记。在标记前，先对制备的时间分辨荧光以2000r/min的速度离心10min，以除去时间分辨荧光在存储过程中形成的聚合物，以减少它们在标记过程中影响抗恩诺沙星单克隆抗体对时间分辨荧光颗粒吸附的影响。

标记的具体操作步骤为：准确量取20mL的时间分辨荧光溶液于50mL锥形瓶中，加入0.1mol/L的K₂CO₃调pH值为6.0；在搅拌状态下缓慢滴加2.5mL浓度为0.1mg/mL抗恩诺沙星单克隆抗体，搅拌30min；在搅拌状态下缓慢加入5%BSA至时间分辨荧光溶液终浓度为1%，继续搅拌30min；放置于4℃静置2h。将时间分辨荧光溶液倒入离心管中以2000rpm离心15min，吸出上清，弃沉淀。以8000r/min的速度离心30min，弃去上清夜，加入标记洗涤保存液至原体积；第二次以12000r/min的速度离心30min，弃去上清夜，加入标记洗涤保存液至原体积；第三次以14000r/min的速度离心30min，弃去上清夜，沉淀用标记洗涤保存液溶解后，得到2.0mL浓缩物（为总体积的十分之一），置4℃冰箱备用。

步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星药物人工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG多克隆抗体包被在质控线C线处，经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度为0.9~1.1mm，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸；

（1）金标垫的制备

配制了5种不同的金标垫封闭液进行试验：

表1

注：“1”为对照；“—”表示未添加。

将金标垫浸泡在不同配方的封闭液中，待金标垫被完全浸透后，置于37℃恒温烘箱中烘干后备用；将兔抗鼠IgG抗体用磷酸盐（PBS）溶液配制成1mg/mL的溶液，用Bio-dot划膜仪滑膜，将免疫时间分辨荧光分别喷在经过不同处理的金标垫上后，于37℃干燥后，组装试纸条，根据实验结果观察3封闭液作为金标垫封闭液，试纸条C线的颜色是红色，宽度中等，条带清晰，因此选择3封闭液作为金标垫封闭液。

（2）质控线C线包被浓度的选择

质控线C线包被的是兔抗鼠IgG抗体。将浓度分别为2.5mg/mL、2mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL的兔抗鼠IgG抗体包被到经过选择的NC膜上，与所制备的金标垫一起组装试纸条，依据显色的条带来选取最佳的包被量。观察结果发现在金标垫的包被量为10μL/cm，NC膜为Millipore135及当质控线C线包被浓度时1.5mg/mL时，显色条带颜色为红色，颜色易于区分，边缘清晰。

（3）检测线T线包被浓度的选择

检测线T线包被的是恩诺沙星人工合成抗原，其原始浓度为4.0mg/mL，T线的包被浓度分别为4.0mg/mL、3.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL和0.5mg/mL的恩诺沙星人工抗原；观察结果发现当检测线T线包被浓度2.0mg/mL时，显色条带颜色为红色，颜色易于区分，边缘清晰。

（4）检测线T线、质控线C线最佳包被液的选择

抗恩诺沙星单克隆抗体和恩诺沙星药物人工抗原在包被之前都要进行稀释，所以选择最佳的稀释液对其进行稀释，包被到NC膜后，可能会使检测线T线和质控线C线的显色更加清晰和均一，良好的包被液会使显色条带颜色较深，易于识别，条带的宽度适中。用几种不同的包被液将恩诺沙星药物人工抗原和兔抗鼠IgG抗体稀释到试验中选择浓度后，用Bio-dot包被在NC膜上，根据显色条带来判断最合适的包被液。观察结果发现0.01MpH7.2PBS+1%BSA+1%Sucrose为最佳包被液。

样品垫封闭液的选择

样品垫在试验的过程中不能吸附样品中的待测成分，要使试验结果真实可靠，样品垫在使用前要经过封闭，封闭液中的成分会防止待测成分被吸附而造成结果的不准确。观察结果发现0.01MpH7.2PBS+2%BSA+0.1%TrionX-100+0.5%Sucrose为最合适的封闭液。

（6）试纸条的组装

按照图1所示，将NC膜、吸水垫、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度大约为1mm。将组装好的试纸板经过切条机切成3mm宽度的试纸条后，将试纸条装入塑料卡套中即可。

恩诺沙星检测限确定

将恩诺沙星标准品配制成10mg/mL，然后用磷酸盐溶液（PBS）稀释，使配制的恩诺沙星溶液使其质量浓度为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL并设1个空白阴性对照，分别插入组装好的试纸条，10min后根据试纸条的显色结果进行判断，每个浓度重复5次试验。当检测线T线颜色明显浅于空白阴性对照时，即是试纸条的检测限。实验结果如表2所示。

表2

由表2观察结果发现，在所肉眼不能识别到检测线，而质控线颜色为红色。当浓度增至500ng/mL时，检测线无红色条带出现，质控线出现红色条带。重复试验5次，实验结果一致。由此判断该试纸条的100%抑制浓度为500ng/mL。

所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸包括卡套10、试纸条，试纸条包括依次重叠粘贴在PVC底板6上的吸水垫5、NC膜7、金标垫2、样品垫1，NC膜7上设有两条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的抗恩诺沙星单克隆抗体兔抗鼠IgG作为质控线C线4，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检测线T线3；金标垫2上包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧光作为示踪物。

卡套10的外壁上设有观察孔8、点样孔9，观察孔8位于所述质控线C线4和检测线T线3的上方，点样孔9位于样品垫1的上方。

用本发明所述方法制备的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的检测与应用：

（1）特异性测试

将试纸条插入各种恩诺沙星结构类似物：恩诺沙星、环丙沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、妥舒沙星、吉米沙星、克林沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星，以恩诺沙星和空白样品为对照，10min后观察结果。各种类似物标准品用甲醇溶解，然后用PBS稀释使其浓度为500ng/mL。将恩诺沙星类似物试纸条T线的颜色和恩诺沙星空白样品T线颜色进行比较，根据颜色的深浅来判断其特异性，试验重复5次。采用间接竞争测定，按照常规方法计算抗体的交叉反应率，以交叉反应率为指标判断抗体特异性。实验结果如表3所示，抗体除了与环丙沙星、丹诺沙星分别有62%和43%的交叉反应率，与沙拉沙星、二氟沙星、妥舒沙星、吉米沙星、克林沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星均无交叉反应。

表3

（2）准确度与精密度测试

样品为购买自大型超市标有安全检查标签的猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉，经过高效气相色谱检测，样品中不含有或者含有量低于高效气相色谱的检出限。样品的前处理方法如前所述。向样品中添加恩诺沙星标准品，使添加水平分别为100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。每个浓度重复5次，重复3天，并计算回收率和变异系数（结果见表4），结果表明，恩诺沙星在不同样品中的回收率在78.2%~102.6%之间，变异系数均小于15%。

表4

（3）用本发明所述方法制备的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的应用

本试验选择50头15kg左右的长大二元杂交去势健康仔猪，随机分为2组，即对照组和试验组。对照组饲喂不含任何兽药的饲料，试验组饲喂含100mg/kg恩诺沙星的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。连续饲喂7d后，试验组停止饲喂加药饲料。于停药后0d、4d、10d、14d分别屠宰试验组猪2头，对照组也分别在停药0d、4d、10d、14d屠宰1头，采肌肉和肝脏，同时用试剂盒（ELISA）和液相（HPLC）法同步测定。测定结果见表5，试验结果表明试纸具有更高的灵敏度，可用于定量检测动物源性食品中的恩诺沙星残留。

表5

Claims (5)

1.一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺沙星、N-羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7.2的磷酸盐缓冲液中,将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到磷酸盐缓冲液中，并于室温下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色粉末；

步骤二、抗恩诺沙星单克隆抗体的制备：用步骤一所制备的偶合物Enro-BSA免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG，以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体IgG；采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG；

步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时间分辨荧光Eu³⁺；

步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu³⁺作为标记物标记抗恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6.0，抗恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量为每毫升时间分辨荧光Eu³⁺添加32.5μg抗恩诺沙星单克隆抗体，制备出经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光；

步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星药物人工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG包被在质控线C线处，经过时间分辨荧光Eu³⁺标记后的抗恩诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度为0.9~1.1mm，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸。

2.根据权利要求1所述的所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所制得的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸100%抑制浓度为500ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸包括卡套、试纸条，试纸条包括依次重叠粘贴在PVC底板上的吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫，NC膜上设有两条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的兔抗鼠IgG作为质控线C线，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检测线T线；金标垫上包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧光作为示踪物。

4.根据权利要求3所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所述卡套的外壁上设有观察孔、点样孔，观察孔位于所述质控线C线和检测线T线的上方，点样孔位于样品垫的上方。

5.根据权利要求3所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：所述NC膜型号为Millipore135。