CN102135534A - 恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒包被有恩诺沙星抗原的酶标板，镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体、恩诺沙星抗体等。本发明还公开了应用上述试剂盒检测恩诺沙星残留的方法。本发明提供的检测恩诺沙星的试剂盒采用间接竞争时间分辨免疫分析技术，灵敏度高、稳定性好，大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，降低了成本，非常适合大量样品的筛查，具有重要的现实意义。

Description

恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种化学品污染残留的检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种检测恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析试剂盒及其制备方法。

背景技术

食品安全是关系到广大人民的日常生活的一件大事。食品安全问题主要包括食品中的物理危害、化学危害和微生物危害等几个因素，其中化学危害主要包括兽药残留、农药残留、重金属、环境有害物等。、

联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)残留联合立法委员会将兽药残留定义为：动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及兽药有关的杂质。兽药残留已成为困扰全世界食品安全的难题，也是各国用以设置贸易壁垒的最主要的手段之一。

恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)又名乙基环丙沙星，化学名为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸。该药物具有广谱抗菌效果，对霉菌和革兰氏阴性菌效力强，对革兰氏阳性和厌氧菌效果较弱；内服及肌肉注射吸收迅速，且在体内代谢为同样具有抗菌活性的环丙沙星，代谢物生成与消除缓慢，分布广泛。恩诺沙星分子结构式如下：

恩诺沙星(Enrofloxacin)为一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物，在兽医临床上得到广泛应用。然而在兽医临床应用时所产生的耐药性、残留毒性以及其代谢产物环丙沙星对人体的不良反应已引起广泛关注。欧盟和WHO相继规定了恩诺沙星在牛、猪和家禽中的最高残留限量(MRLs)分别为30μg/kg和40μg/kg。美国食品药品监督管理局(FDA)不允许将恩诺沙星用于对家禽和水产品细菌感染的治疗；日本厚生劳动省也在该国食品卫生法中禁止使用恩诺沙星等合成抗菌剂。目前，我国规定恩诺沙星在牛、猪、家禽肌肉中的MRLs为100μg/kg。由于动物性食品中的兽药残留问题越来越受到国际社会的关注，世界各国均加强了对国际贸易中动物性食品中兽药残留的检测。因此，为了保证动物性食品的安全，保障消费者健康，促进国际贸易的顺利开展，建立动物性食品中恩诺沙星的检测标准具有重要的意义。

现今，国内外已经建立了许多方法检测动物性食品中残留的恩诺沙星，包括微生物检测法、HPLC法、MS法和LC-MS等方法。其中微生物检测法的检测限常高于药物的最大残留量，不够灵敏，且难以用于样品的定性。仪器方法准确、灵敏，但是由于价格昂贵、时间长、技术要求高等原因从而限制其应用于大批量样品的筛选。目前常用的免疫分析方法有酶联免疫吸附法(免疫分析)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨免疫分析(TRFIA)方法，其中时间分辨免疫分析(TRFIA)具有灵敏度高、快速、特异性强、稳定性好、操作简便、分析结果准确等优点，是目前最具有潜力的免疫分析方法之一。

时间分辨免疫分析(TRFIA)和通常的普通的荧光分析原理基本相同，只是TRFIA采用了一种特殊的标记物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。

时间分辨免疫分析(TRFIA)是以镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)、铽(Te)等稀土离子为标记物，稀土离子需通过双功能螯合剂的桥联作用才能标记抗原或抗体，双功能螯合剂的一端与Eu³⁺等连接，另一端同抗原或抗体分子上的氨基连接。常用的螯合剂有N₂-[p-异硫氰酸-苯基]-二乙烯三胺四醋酸(DTTA)、异硫氰酸-苯基-EDTA及环化二乙烯三胺五醋酸酐(cDPTA)等，它们含有带氨基羧酸或带异硫氰酸基羧酸等活性基团，有很强的螯合稀土元素的能力。

时间分辨免疫分析(TRFIA)根据免疫分析方法模式的不同可以分为竞争法和夹心法两种。

(1)竞争法：主要用于小分子抗原、半抗原及一些抗体的检测。包括直接竞争法或间接竞争法，直接竞争法一般在微孔板预先包被第二抗体，先加入一定量的第一抗体和样品，孵育洗涤后再加入Eu³⁺标记的小分子抗原竞争结合第一抗体。间接竞争法一般在微孔板预先包被抗原，加入一定量的第一抗体和样品，孵育洗涤后再加入Eu³⁺标记的第二抗体进行示踪。而在一些抗体的检测中，标记抗体和样品中的抗体通过竞争结合一定量的中和抗原来进行分析的。最后，通过孵育洗涤加入增强溶液，所测得的荧光强度与样品的含量成反比，标准曲线为竞争抑制曲线。

(2)夹心法：用于大分子生物活性物质的检测，该分析的微孔板包被一株抗体，稀土离子标记另一株抗体，最后形成抗体-抗原-抗体-标记物复合物，所测得的荧光强度与样品的含量成正比，标准曲线为饱和平衡曲线。

近年来时间分辨免疫分析(TRFIA)以其特殊的优点逐渐为人们所重视，目前，该技术已不局限于临床诊断领域，而渗透到生物学研究的各个领域。它是目前最灵敏的超微量分析技术之一，其灵敏度高达10^-19mol/L，较荧光免疫分析(RIA)的10^-16mol/L高出3个数量级。

但目前尚无采用时间分辨免疫分析法检测恩诺沙星的相关技术报道，更没有一种适合进行恩诺沙星时间分辨免疫分析检测的试剂盒，以便于实现高灵敏度、操作简单的大批量快速检测。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种检测恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供所述检测恩诺沙星残留的方法，高灵敏度、操作简单，能大批量快速检测。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种检测恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，包括包被了恩诺沙星抗原的酶标板、恩诺沙星抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体(二抗)；所述镧系元素包括Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺或Sm³⁺等稀土元素。

所述恩诺沙星抗原是将恩诺沙星和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白，通过碳二亚胺法(EDC)、活泼酯法(DCC、NHS)或混合酸酐法(氯甲酸异丁酯)进行偶联得到，包括包被抗原与免疫原。免疫原与包被原通过柱层析进行纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定。

所述恩诺沙星抗体包括单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体。

所述单克隆抗体经动物免疫、细胞融合与克隆、细胞冻存和复苏及体内诱生法制备得到；所述动物免疫是以恩诺沙星与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c小鼠进行间隔免疫，间接免疫分析检测并得到血液里含有恩诺沙星特异性抗体的小鼠脾脏。所述细胞融合与克隆是取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。所述单克隆抗体的制备与纯化是采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸胺法或亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

所述恩诺沙星兔多克隆抗体是采用新西兰大白兔作为免疫动物，以恩诺沙星与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸胺分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

所述恩诺沙星基因工程抗体是指小分子抗体，包括：Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由V_H和V_L构成)，ScFv(单链抗体，V_H和V_L之间由一条连接肽连接而成)，单域抗体(仅由V_H组成)等经基因工程技术改造后的抗体。

制备方法为：提取恩诺沙星单克隆细胞或经恩诺沙星免疫原免疫后的小鼠脾细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链(V_H和V_L)扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因，插入适当的表达质粒，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定。

所述镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体的制备，以Eu³⁺标羊抗兔为例，取溶解于0.05mol/L PBS pH7.0的5mg/mL羊抗兔IgG 1ml，经PD-10柱转换缓冲盐条件，洗脱液为50mmol/L pH 9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗兔至2mg/mL。取500μL稀释后的羊抗兔IgG加入含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸

(Eu³⁺-DTTA)的棕色小瓶中，置于28℃恒温烘箱中反应48h，反应液用50mmol/L Tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的SepharoseCL-6B(1×30cm)层析，测定每管的荧光计数值，检测稀释后的第一个计数峰，稀释后备用。

标记率＝标记个数/IgG分子数

为了方便现场操作和批量检测，所述试剂盒还可以包括恩诺沙星标准溶液、增强液、浓缩洗涤液、样品稀释浓缩液。

优选地，还可以包括盒体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液和盖板膜。

所述恩诺沙星标准溶液是以浓度为1000μg/L的恩诺沙星作为贮备液，使用前再配成浓度梯度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L的恩诺沙星标准品溶液；

所述增强液包括β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH值为2.0～3.2)；将6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmolβ-二酮体(β-NTA)，50μmol三辛基氧化膦，1mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。

所述浓缩洗液包括0.5～1.5％(体积比浓度)吐温20的磷酸盐缓冲液(pH值7.4，0.1mol/L)，为常规使用浓度的15～25倍。

所述浓缩稀释液pH值7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的磷酸盐缓冲液，为常规使用浓度的5～15倍。

所述酶标板是96/40孔酶标板，包被有能与抗恩诺沙星抗体特异结合的恩诺沙星抗原，并封闭微孔表面未吸附位点；所述封闭液包括溶于PBS的脱脂奶粉溶液(5g脱脂奶粉：100mL PBS)和以稀释液稀释至终浓度3％(体积比浓度)的小牛血清3mL(灭活)。

本发明同时提供了检测恩诺沙星残留的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理；

a.蜂蜜

称取样品3g，加入3mL蒸馏水，振荡均匀，加入6mL乙酸乙酯，振荡15min，5000r/min离心10min。吸取上层2mL旋转蒸干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL PBS(pH值7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液)溶液复溶。除去上层正己烷相，下层清夜50μL待测；

b.禽蛋

称取样品3g，加入乙腈-水溶液(80∶20)6mL，振荡10min。5000r/min离心10min。取上层2mL，加入2mL乙酸乙酯，振荡15min。5000r/min离心10min，吸取全部上层溶液，旋转蒸干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL PBS溶液复溶。除去上层正己烷相，下层清夜50μL待测；

c.组织(检测用肌肉、肝脏、肾脏等)

称取样品3g，加入PBS 3mL，振荡10min。5000r/min离心10min。取上层2mL加入等量正己烷，轻轻混匀，5000r/min离心10min。取下层清夜50μL待测。

(2)利用本发明试剂盒对标准溶液和样品进行检测。

(3)根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。

本发明主要试剂以工作液的形式提供，节省操作时间，所述检测具体包括以下步骤：

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做两个平行实验，按顺序编号；

(2)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL恩诺沙星抗体工作液，混匀；振荡反应45min；

(3)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入100μL镧系元素标记抗体工作液，振荡反应45min；

(4)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡5min；

(5)用TRFIA检测仪测定各孔荧光值；

(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。

以所获标准样品吸光值的平均值计算百分荧光值，以百分荧光值为纵坐标，恩诺沙星标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。用同样的方法计算样品溶液的百分荧光值，根据方程式求出对应样品的恩诺沙星浓度。所述百分荧光值的计算式为：

百分荧光度值(％)＝(B/B₀)×100

其中，B为标准溶液或样品的平均荧光值，B₀为0μg/L标准溶液的平均荧光值。

检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对环丙沙星线性检测范围为0.1～8.1μg/L，检测限可达到0.1μg/L，整个检测过程需2h就可以完成。

本发明的有益效果：

本发明采用镧系元素作标记物，DTTA为螯合剂，建立了对恩诺沙星的定量分析方法，此法操作流程短、简单、快速，精密度和准确度均较好，样品前处理简单。尤其采用铕(Eu³⁺)做标记物，DTTA为螯合剂，效果好，成本低。

本发明采用密封保存的方式保证所述酶标板的空白板的荧光值低于1000，没有稀土元素的污染。

浓缩洗涤液为含0.5～1.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1mol/L)，为正常使用浓度的15～25倍；所述样品稀释浓缩液为pH7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5～15倍，减少体积，方便在试剂盒中配备。

本发明使用酸性增强液，使铕离子(Eu³⁺)从螯合物中解离下来，游离的Eu³⁺在三辛基氧化膦协同下，重新与β-二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下，铕离子获能，经过电子跃迁并返回基态，便可发射出极强的荧光信号，在时间分辨免疫(TRFIA)分析仪上读出其荧光值，其灵敏度可达16×10^-18molEu³⁺。

附图说明

图1标准曲线

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1恩诺沙星抗原的制备

a.将50μmol/L恩诺沙星溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在该溶液中加入等摩尔的二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下反应过夜；

b.离心，取上清液800μL，缓慢加入到含4mL 15mg/mL的BSA或OVA载体蛋白碳酸缓冲溶液中，然后在磁力搅拌下反应4h；

c.待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次，然后用0.8％生理盐水透析，得产物；

d.采用紫外扫描测定结合比(陈新建等，1998)，最后将抗原浓缩保存或冻干保存得到恩诺沙星免疫原和包被原，分装保存于-20℃的冰箱中。

实施例2抗体的制备

(1)恩诺沙星兔多克隆抗体制备

动物免疫程序：采用新西兰大白兔作为免疫动物。以恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，取兔血，离心，取上清，用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，100μL/管分装冻存。

(2)恩诺沙星兔单克隆抗体制备

动物免疫：以恩诺沙星与载体蛋白偶联物为免疫原对Balb/c小鼠进行间隔免疫，间接免疫分析检测并得到血液里含有恩诺沙星特异性抗体的小鼠脾脏。

细胞融合与克隆：取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸胺法或亲和层析法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

(3)恩诺沙星基因工程抗体的制备

所述恩诺沙星基因工程抗体是指小分子抗体，包括：Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由V_H和V_L构成)，ScFv(单链抗体，V_H和V_L之间由一条连接肽连接而成)，单域抗体(仅由V_H组成)等经基因工程技术改造后的抗体。

制备方法为：提取恩诺沙星单克隆细胞或经恩诺沙星免疫原免疫后的小鼠脾细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因，插入适当的表达质粒(TG1菌株，市购)，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定。

其中V_H(Back)、V_H(For)两条引物用于扩增抗体重链可变区基因V_H；V_L(Back)、V_L(For)两条引物用于扩增抗体轻链可变区基因V_L；Linker1、Linker2两条引物作为接头引物用于重叠延伸PCR法拼接V_H、V_L基因片段成scFv基因片段，此接头引物内含编码连接肽(Gly₄Ser)₃基因片段，5′端与V_H片段端3′互补，3′端与V_L片段5′端互补。RS(Back)、RS(For)两条引物用于二次PCR扩增全长scFv基因片段，同时引入Bal I及Not I酶切位点。R1、R2两条引物为载体上引物，用于载体插入片段的PCR鉴定。

V_H(Back)       5

CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG-3

V_H(For)        5

TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3

V_L(Back)       5

GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3

V_L(For)        5

CCG TTT TAT TTC CAG CCT GGT CCC-3

Linker1        5GGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA

GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GG-3

Linker2        5

TGG AGA CTG AGT GAG CTC GAT GTC CGATCC GCC

ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC-3

RS(Back)       5

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG

(含Bgl I位点)  GCC CAG GTC AAA CTG CAG GAG TCA GG-3

RS(For)        5

GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCG TTT TAT TTC

(含Not I位点)  CAG CCT GGT CCC-3

R1             5

CCA TGATTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3

R2             5

CGATCTAAA GTT TTG TCG TCT TTC C-3

V_L的扩增条件：反应溶液涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应过程及条件为：94℃×5min变性，加入1μL高保真Pfu酶(2.5U)，进行以下循环：94℃×30s，54℃×1min，72℃×1min，共25个循环，最后72℃延伸10min。反应完毕后，V_L反应产物取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

V_H的扩增条件：反应溶液涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应过程及条件为：94℃×5min变性，加入1μL高保真Pfu酶(2.5U)，进行以下循环：94℃×30s，60℃×1min，72℃×1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应完毕后，V_H反应产物取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(1)scFv基因片段拼接及PCR扩增：

重叠延伸反应

首先按以下反应体系进行linker的预拼接：

Linker1引物(10μmol/L)            0.5μL

Linker2引物(10μmol/L)            0.5μL

10×PCR Buffer                    5μL

dNTP(2.5mmol/L)                   4μL

去离子水                          34.5μL

                                             

总体积                            44.5μL

反应溶液涡旋混匀，短暂离心。于PCR仪上94℃×5min预变性，加入0.5μL高保真Pfu酶，进行以下循环：94℃×45s，50℃×1min，72℃×1min，共3个循环。

在上面体系中补加V_H，V_L进行scFv的拼接：

V_H纯化产物(50ng)                3μL

V_L纯化产物(50ng)                2.5μL

Linker预拼接溶液                44.5μL

                                         

总体积                        50μL

先后将V_H，V_L加入后，用枪轻轻混匀。于PCR仪上94℃×5min预变性，补加0.5μL高保真Pfu酶，进行以下循环：94℃×45s，50℃×1min，72℃×1min，共30个循环，72℃延伸10min。

(2)scFv基因的PCR扩增

采用以下反应体系：

拼接产物                        4μL

5×PCR Buffer                   10μL

dNTP(2.5mmol/L)                 4μL

RS(Back)引物(10μmol/L)         1μL

RS(For)引物(10μmol/L)          1μL

无菌纯水                        30μL

                                            

总体积                          50μL

混合均匀，短暂离心后，于PCR仪上，94℃×2min预变性，加入0.5μL高保真Pfu酶，进行以下循环：94℃×45s，60℃×1min，72℃×1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取5μL反应产物进行电泳检测。

实施例3Eu³⁺标记羊抗兔的制备和纯化

取溶解于0.05mol/L PBS pH7.4的5mg/mL羊抗兔IgG 1ml，经PD-10柱转换缓冲盐条件，洗脱液为50mmol/L pH 9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗兔至2mg/mL。取500μL稀释后的羊抗兔IgG加入含0.2mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的棕色小瓶中，置于28℃恒温烘箱中反应48h，反应液用50mmol/L Tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的SepharoseCL-6B(1×30cm)层析，测定每管的荧光计数值，检测稀释后的第一个计数峰，稀释后备用。

标记率＝标记个数/IgG分子数

实施例4时间分辨免疫分析试剂盒组分的配制

(1)浓缩洗涤缓冲液的配制：含0.5～1.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1mol/L)，为正常使用浓度的15～25倍。

(2)样品稀释浓缩液的配制：pH7.4～8.0、0.1～0.25mol/L、含有的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5～15倍。

(3)封闭液的配制：脱脂奶粉1.0～5.0g溶于100mL蒸馏水。

(4)增强液的配制：6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmol

-二酮体(

-NTA)，50μmol三辛基氧化膦(TOPO)，1mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。

(5)酶标板微孔板的包被：包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.1～5ug/mL，在酶标板的每孔加100uL，37℃包被1h后4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200uL1.0～5.0％脱脂奶粉，放入37℃温箱中1h后用PBST洗涤3次，干燥后封入铝箔袋中4℃保存。

(6)恩诺沙星标准溶液的配制：准确称取恩诺沙星标样8.1mg，溶于0.1L缓冲液中，然后用缓冲液稀释分别配制8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L恩诺沙星溶液，另外缓冲液配制0μg/L对照样，4℃保存。

(8)试剂分装：各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装恩诺沙星抗体工作液7mL/瓶，恩诺沙星标准样品1mL/瓶，二抗工作液10mL/瓶，增强液20mL/瓶，终止液7mL/瓶，浓缩洗液50mL/瓶，浓缩样品稀释液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。

(9)试剂盒的组装：分别将可拆卸包被好包被抗原的微孔板1块，恩诺沙星抗体工作液、二抗工作液、增强液、浓缩洗液、浓缩样品稀释液各1瓶，恩诺沙星标准溶液6瓶，使用说明书1份置试剂盒内指定位置。试剂盒检验合格后封装，4℃保存。

实施例5检测恩诺沙星的时间分辨免疫分析试剂盒的组建

组建检测恩诺沙星的时间分辨免疫分析试剂盒，包括包被了恩诺沙星抗原的酶标板、恩诺沙星抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体，其他工作液可以在检验室配备。

如果为了大批量快速的检测样品中恩诺沙星，组建的检测恩诺沙星的时间分辨免疫分析试剂盒包括下述组分：

(1)包被恩诺沙星抗原的酶标板，96孔；

(2)恩诺沙星抗体，7mL/瓶；

(3)铕标二抗工作液，10mL/瓶；

(4)恩诺沙星标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，1mL/瓶；

(5)增强液，7mL/瓶；

(6)浓缩洗涤液，50mL/瓶；

(7)浓缩样品稀释液，50mL/瓶；

(8)使用说明书，1份；

(9)盖板膜，2张；

(10)自封袋(含干燥剂)，1个。

本发明的检测恩诺沙星残留的荧光免疫分析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)包被了恩诺沙星抗原的酶标板的制备方法：将EF-OVA以包被缓冲液稀释为100μg/L，向酶标板微孔中加入抗原100μL，放入4℃冰箱中包被过夜，室温平衡后洗板两次，以脱脂奶粉封闭液(250μL)37℃封闭1h，洗板三次，用无尘吸水纸上拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。固定恩诺沙星抗原载体为以下物质中的一种，例如聚苯乙烯、硝酸纤维素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交联葡萄糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶等。

(2)恩诺沙星抗体稀释液的制备方法：将恩诺沙星多克隆抗体用辛酸-硫酸铵法纯化后，用PBS稀释成1mg/mL，冻存分装备用。

(3)Eu3+标羊抗兔的制备方法：取溶解于0.05mmol/L PBS pH7.4的6mg/mL羊抗兔IgG0.1ml，经PD-10柱转换缓冲盐条件，洗脱液为50mmol/L pH 9.6NaCO₃-NaHCO₃缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A₂₈₀-0.74A₂₆₀)，用上述洗脱液稀释羊抗兔至01mg/mL。取500μL稀释后的羊抗兔IgG加入含0.4mg的Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu³⁺-DTTA)的棕色小瓶中，置于28℃恒温烘箱中反应48h，反应液用50mmol/L Tris-HCl pH 7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B(1×30cm)层析，测定每管的荧光计数值，检测稀释后的第一个计数峰，稀释后备用。标记率＝标记个数/IgG分子数

(4)恩诺沙星标准溶液的配制：以浓度为1000μg/L的恩诺沙星作为贮备液，使用前再配成浓度梯度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L的恩诺沙星标准品工作液；

(5)增强液的配制：6mL冰醋酸用0.1mol/L的邻苯二甲酸氢钾调pH值至3.2，加入15μmol

-二酮体(-NTA)，50μmol三辛基氧化膦(TOPO)，1mL Triton X-100，加三蒸水定容至1L。

(6)包被缓冲液的配制：取Na₂CO₃ 0.375g，NaHCO₃ 0.732g，NaCl 2.250g，NaN₃ 0.100g，加蒸馏水至250mL，得0.1mol/L碳酸盐缓冲液。

(7)洗涤缓冲液(PBST)的配制：取KH₂PO₄ 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O5.8g，NaCl 16.0g，KCl 0.4g，Tween-20 1.0mL，加蒸馏水至2000mL。

(8)封闭液：1)脱脂奶粉5g溶于100mL PBS；2)小牛血清3mL(灭活)，以稀释液稀释至终浓度3％(体积百分比浓度)。

(9)稀释液(50mmol/L Tris-HCl，pH 7.85)：取Tris-base 6.4g，NaCl 9.0g，NaN₃ 0.4g，以浓HCl(12M)调整其pH值为7.85，加蒸馏水定容至1L。

实施例6样品前处理

a.蜂蜜

称取样品3g，加入3mL蒸馏水，振荡均匀，加入6mL乙酸乙酯，振荡15min。5000r/min离心10min.吸取上层2mL旋转蒸干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL PBS溶液复溶。除去上层正己烷相，下层清夜50μL待测

b.禽蛋

称取样品3g，加入乙腈-水溶液(体积比为80∶20)6mL，振荡10min。5000r/min离心10min。取上层2mL，加入2mL乙酸乙酯，振荡15min。5000r/min离心10min，吸取全部上层溶液，旋转蒸干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL PBS(pH值7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液)溶液复溶。除去上层正己烷相，下层清夜50μL待测。

c.组织(检测用肌肉、肝脏或肾脏等)

称取样品3g，加入PBS 3mL，振荡10min；5000r/min离心10min。取上层2mL加入等量正己烷，轻轻混匀，5000r/min离心10min。取下层清夜50μL待测。

实施例7试剂盒的检测方法

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做两个平行实验，按顺序编号。

(2)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL恩诺沙星单克隆抗体工作液，混匀；振荡反应45min。

(3)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入100μL铕标二抗工作液，振荡反应45min。

(4)待反应后洗板六次，并在吸水纸上拍干，以保证完全除去孔中的液体。每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡5min。

(5)用时间分辨免疫分析(TRFIA)检测仪测定各孔荧光值。

(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。

以所获标准样品荧光值的平均值计算百分荧光值，以百分荧光值为纵坐标，恩诺沙星标准溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，见附图1所示，直线方程y＝41.36-36.38x，R²＝0.99716。用同样的方法计算样品溶液的百分荧光值，根据方程式求出对应样品的恩诺沙星浓度。所述百分荧光值的计算式为：

百分荧光值(％)＝(B/B₀)×100

其中，B为标准溶液或样品的平均荧光值，B₀为0μg/L标准溶液的平均荧光值。

检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对恩诺沙星线性检测范围为0.1～8.1μg/L，检测限为0.1μg/L，整个检测过程只需2h就可以完成。

实施例8试剂盒精密度与准确度试验

1、标准品溶液重复性试验

从3批按照实施例4(6)中的方法制备的酶标板中，各抽出20个微孔，测定0.9μg/L标准溶液的荧光值(CPS值)，重复20次，计算变异系数CV％，结果见表1。

表1标准品溶液重复性试验

样品	浓度μg/L	第1批	第2批	第3批	批间CV％
								CV％	CV％	CV％
标准品	0.9	3.2	4.9	2.9	7.6

结果表明试剂盒标准品检测的批内变异系数范围在2.9～4.9％之间，批间变异系数为7.6％。

2、样本重复性与准确度试验

准确度是指测得值与真值的符合程度，在免疫分析测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白蜂蜜、禽蛋、组织(鸡肉)中，将恩诺沙星添加至终浓度为10μg/L(μg/kg)、15μg/L(μg/kg)，每个浓度各10个平行，测定3批。计算平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。结果见表2。

表2样本重复性与准确度试验结果

结果表明样本蜂蜜、禽蛋、组织(鸡肉)的添加回收率在87.0～110％之间，批内变异系数在4.9～9.4％之间，批间变异系数在14.2～18.3％之间。

实施例9保存期试验

(1)将试剂盒放置于2～8℃，分别取0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对恩诺沙星标准样品(0.1μg/L)的荧光值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

(2)将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对恩诺沙星标准样品(0.1μg/L)的荧光值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

(3)将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对恩诺沙星标准样品(0.1μg/L)的荧光值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

从结果可看出，经过三种条件保存试验，恩诺沙星标准样品(0.1μg/L)的荧光值下降小于5％，且CPS不低于100000；50％抑制率在0.5～1.0μg/L之间；

添加回收率在80～110％之间；批内变异系数小于10％；各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。

Claims (10)

1.一种检测恩诺沙星残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被了恩诺沙星抗原的酶标板、恩诺沙星抗体、镧系元素标记羊抗兔或羊抗鼠抗体；所述镧系元素为Eu³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺或Sm³⁺。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述恩诺沙星抗原是将恩诺沙星和载体蛋白偶联得到；所述恩诺沙星抗体包括单克隆抗体、兔多克隆抗体或基因工程抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括恩诺沙星标准溶液、增强液、浓缩洗涤液和样品稀释浓缩液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述恩诺沙星标准溶液是以浓度为1000μg/L的恩诺沙星配成的浓度梯度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L的恩诺沙星标准品溶液。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述增强液包括β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton X-100、冰醋酸和pH值为2.0～3.2的邻苯二甲酸氢钾。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗液包括0.5～1.5％吐温20的磷酸盐缓冲液；所述浓缩稀释液为pH值7.4～8.0、0.1～0.25mol/L的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1所述的时间分辨免疫分析试剂盒，其特征在于所述酶标板是96/40孔酶标板，且空白板的荧光值低于1000。

8.一种恩诺沙星的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1～7任一项所述的试剂盒进行检测；

(3)结果处理与分析。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述样品前处理为：

(1)蜂蜜：

称取样品3g，加入3mL蒸馏水，振荡均匀，加入6mL乙酸乙酯，振荡15min，5000r/min离心10min，吸取上层2mL旋转蒸干，加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL PBS溶液复溶，除去上层正己烷相，下层清夜50μL待测；

或(2)禽蛋：

称取样品3g，加入乙腈-水溶液6mL，振荡10min，5000r/min离心10min，取上层2mL，加入2mL乙酸乙酯，振荡15min，5000r/min离心10min，吸取全部上层溶液，旋转蒸干，加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL PBS溶液复溶，除去上层正己烷相，下层清夜50μL待测；

或(3)组织：

所述组织为肌肉、肝脏或肾脏；称取样品3g，加入PBS 3mL，振荡10min；5000r/min离心10min，取上层2mL加入等量正己烷，轻轻混匀，5000r/min离心10min，取下层清夜50μL待测。

10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于20～24℃环境中平衡不少于30min，将酶标板条固定，做平行实验，按顺序编号；

(2)在标准品孔加入50μL标准溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL恩诺沙星抗体工作液，混匀；振荡反应；

(3)步骤(2)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入100μL铕标二抗工作液，振荡反应；

(4)步骤(3)所述振荡反应后洗板，拍干，每孔加入200μL增强液，混匀，避光室温轻拍振荡；

(5)用时间分辨免疫分析检测仪测定各孔荧光值；

(6)根据标准溶液荧光值与浓度半对数做标准曲线，根据标准曲线与样品溶液荧光值计算样品浓度。