CN100538363C - 检测安定残留的酶联免疫试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测动物源性食品中安定残留量的酶联免疫试剂盒，它含有：包被安定抗原的酶联板或包被抗体的酶联板，酶标记物，安定特异性抗体，安定标准品溶液，显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测安定的方法，它包括以下步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的检测动物源性食品中安定残留量的酶联免疫试剂盒及方法，样品前处理过程简单，费用低廉，且能同时检测大批样品。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测动物源性食品中安定残留的酶联免疫试剂盒及方法。
背景技术
安定(Diazepam)作为一种镇静剂在畜禽中的应用日益广泛，可以减少畜禽动物的运动量，增加动物的体重并可保证畜禽在长途运输中不会产生应激反应。但动物大量摄取安定会导致药物残留于食品而被人体吸收，大剂量可产生中枢神经抑制，呼吸抑制等中毒表现。长期服用该类药物可产生依赖性或成瘾性，突然停药可产生停药反应，表现为抑郁、精神激动、失眠等。
目前，用于安定残留检测的方法主要是高效液相色谱分析法。高效液相法重复性好，但样本前处理和测定操作烦琐，费用高，不适用于大量样本的筛查。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适合大量样本筛查的检测动物源性食品中安定残留的酶联免疫试剂盒及方法。
(二)技术方案
本发明的检测原理为：当包被原为安定偶联抗原时是将安定偶联抗原吸附于固相载体上，加入样本或安定标准品并加入安定抗体，待测样品中残留的安定和酶标板上包被的安定抗原竞争安定特异性抗体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中安定残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中安定残留的浓度范围；当包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入抗体后，再加入样本或标准品溶液和安定酶标记抗原，待测样本中残留的安定和安定酶标记抗原竞争结合在抗抗体上的抗安定抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中安定残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中安定的残留量。
本发明提供了一种检测动物源性食品中安定的酶联免疫试剂盒，它含有：
(1)包被安定抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；
(2)酶标记物；
(3)安定特异性抗体；
(4)安定标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)浓缩洗涤液；
(8)浓缩复溶液。
本发明所述试剂盒中包被原为安定抗原时，是采用水溶性碳化二亚胺法将安定半抗原与人血清白蛋白进行偶联得到的；包被原是抗抗体时，可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体对无病原体山羊进行免疫得到的，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体对无病原体山羊进行免疫得到的。
本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记安定抗原，所用酶可为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶。
本发明所述试剂盒中安定特异性抗体分为单克隆抗体或多克隆抗体，所用的免疫原是采用水溶性碳化二亚胺法将安定半抗原和甲状腺蛋白进行偶联得到的。
本发明所述试剂盒中安定标准品溶液为六个浓度梯度的安定溶液，安定稀释液为含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中终止液为1～2mol/L的硫酸、盐酸或2mol/L的氢氧化钠缓冲液。
本发明所述试剂盒中浓缩洗涤液为pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐温20和1‰叠氮化钠(NaN3)的磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中浓缩复溶液为含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中包被安定抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板的制备步骤为：
(1)用包被缓冲液将安定半抗原与人血清白蛋白(HAS)偶联物或抗抗体以0.05～0.1μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；
(2)向酶联板的每个孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，并4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤1min，拍干；
(3)向酶联板的每个孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
本发明所述试剂盒中酶联板在制备的过程中，所用的包被缓冲液为pH值6.0、0.02～0.05mol/L、含1％小牛血清(BSA)的柠檬酸钠缓冲液；所用的包被安定抗原或抗抗体的载体的物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为pH7.4、含有0.8％～1.2％吐温20，1‰的叠氮化钠(NaN3)防腐剂按照20倍比例稀释的浓缩磷酸盐缓冲液；所用的封闭液为含有3％～5％的小牛血清(BSA)和1％惰性蛋白的溶液。
本发明所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为：
(1)抗抗体的制备：以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。
(2)辣根过氧化物酶标记抗抗体的制备：将抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是过碘酸钠法，采用过碘酸钠法使得抗抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4:1，制备的偶联物中混有许多聚合体，因为辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点。这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，从而降低酶标记物的酶活性，为了解决这个问题，本发明将传统的方法进行了改良，即：省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；同时降低辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失也减少。
本发明酶标记安定抗原是采用混合酸酐法将标记酶与安定半抗原进行偶联得到的。
本发明所述试剂盒中酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液或工作液，所述酶标记物工作液所用的稀释液为含有50％甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1％的叠氮化钠防腐剂(便于保存)溶液。
优选地，标记酶为辣根过氧化物酶。
本发明所述试剂盒中安定特异性抗体分为单克隆抗体或多克隆抗体，其制备如下：
(1)安定单克隆抗体制备的步骤为：
a.动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原免疫剂量为80-100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
b.细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5～10:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
c.细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1～5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105～106个/只，7～10天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
e.抗体冻干粉的制备是将腹水在37℃烘干，放入-20℃保存。
f.抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02～0.08μg/ml浓度进行稀释。
(2)安定多克隆抗体制备的步骤为：
采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7～10d后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
本发明所述试剂盒中抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液，抗体工作液所用的抗体稀释液为pH 8.2、含有3％小牛血清和20％甲醇的0.05mol/L磷酸盐缓冲液。
本发明所述试剂盒中试剂的配制具体为：
a.安定标准溶液：安定系列标准溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L，1.6μg/L；
b.包被缓冲液：pH 6.0、0.02～0.05mol/L、含1％小牛血清(BSA)的柠檬酸钠缓冲液；
c.封闭液：3～10％小牛血清(BSA)和1％惰性蛋白溶液；
d.浓缩洗涤液：含有0.8％～1.2％吐温20、1‰叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)，为正常使用浓度的15～25倍；
e.酶标记物：酶标记抗抗体工作液或酶标记安定抗原工作液；
f.底物显色液A液：过氧化氢或过氧化脲；
g.底物显色液B液：邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)；
h.底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液：pH 8.1、含有MgCl2 0.01％ 100mmolTris-HCl；
i.终止液：1～2mol/L硫酸、盐酸或2mol/L氢氧化钠缓冲液；
j.浓缩复溶液：含5‰ N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5～10倍。
本发明所述检测动物源性食品中安定残留的方法，包括了以下步骤：
(1)样品前处理；
(2)检测方法
a.向包被安定抗原的酶标板微孔中加标准品溶液或样品溶液并加入安定抗体工作液，温育后洗涤拍干，然后加入酶标记抗抗体，温育洗板后显色，终止，用酶标仪测定吸光度值；
b.向包被抗抗体的酶标板微孔中加安定抗体工作液，温育后洗涤拍干，然后加入酶标记安定抗原并加入安定系列标准品或样品溶液，温育洗板后显色，终止，用酶标仪测定吸光度值。
(3)分析检测结果。
本发明所述检测动物源性食品中安定残留的方法，样品前处理方法具体为：
(1)猪肉、猪肝
取组织样品用匀浆机10000r/min匀浆1min，称取2±0.1g匀浆物于50ml离心管中，加入8ml 0.1M NaOH溶液剧烈振荡5min。于15℃、3000rpm以上速度离心10min。取1ml上清液，加入10ml正己烷混合振荡5min，15℃、3000rpm以上速度离心5min。取5ml上层正己烷相到离心管中用氮气吹干。取稀释后的复溶液1ml用于溶解残留物，即可进行分析。
(2)尿液
取1ml清亮尿样于50ml离心管中加入4ml 0.1M NaOH溶液剧烈振荡2～5min。取1ml到另一离心管中，加入10ml正己烷混合振荡5min，15℃、3000rpm以上速度离心5min。取5ml上层正己烷相到离心管中用氮气吹干。取稀释后的复溶液1ml溶解残留物，即可进行分析。
(3)饲料样本
取1g饲料于50ml离心管中加入1ml去离子水和3ml 0.1M NaOH溶液涡动1min，再加入10ml正己烷上下剧烈振荡10min，15℃、3000rpm以上速度离心5min。取1ml上上层正己烷相，用氮气吹干。取稀释后的复溶液1ml溶解残留物，即可进行分析。
(三)有益效果
本发明提供的检测动物源性食品中安定残留的酶联免疫试剂盒及方法，样品前处理过程简单，费用低廉，且能同时检测大批样品；该试剂盒采用高特异性的安定单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、精确度高、准确度高、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染等优点，可在动物性食品安定残留检测中发挥重要作用。
附图说明
图1：安定的检测标准曲线图
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1 检测安定残留的酶联免疫试剂盒的组分制备
1.抗原的合成
a.包被原的合成
将安定和羧甲基羟胺缩合半抗原，给安定接出了一个含2个碳的间隔臂，这样突出了安定分子的全部特征结构。将半抗原和人血清白蛋白载体蛋白，采用水溶性碳化二亚胺法进行偶联得到包被原。
b.免疫原的合成
将安定和羧甲基羟胺缩合半抗原，给安定接出了一个含2个碳的间隔臂，这样突出了安定分子的全部特征结构。将半抗原和甲状腺蛋白载体蛋白，采用水溶性碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原。
2.安定鼠单克隆抗体的制备
a.动物免疫
采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以安定半抗原与人血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
b.细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
c.细胞冻存和复苏
取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化
采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/只，7天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
3.酶标板的制备
用包被缓冲液将安定半抗原与甲状腺蛋白偶联物稀释成0.05μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，并4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例2 检测安定的酶联免疫试剂盒的的组建
组建检测安定的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被安定抗原的酶联板；
(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
(3)安定鼠单克隆抗体；
(4)安定标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L，1.6μg/L；
(5)显色液A液为过氧化氢，显色液B液为邻苯二胺；
(6)终止液为1mol/L的硫酸缓冲液；
(7)浓缩洗涤液为PH 7.4，含有0.8％～1.2％吐温20和1‰叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(8)浓缩复溶液为含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
实施例3 检测安定的酶联免疫试剂盒的的组建
组建检测安定的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被羊抗兔抗抗体的酶联板；
(2)用碱性磷酸酯酶标记的安定抗原；
(3)安定兔多克隆抗体；
(4)安定标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L，1.6μg/L；
(5)底物液为对硝基磷酸盐缓冲液；
(6)终止液为2mol/L的氢氧化钠；
(7)浓缩洗涤液为PH 7.4，含有0.8％～1.2％吐温20和1‰叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(8)浓缩复溶液为含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
实施例4 样品中安定残留的检测
1、样品前处理
取猪肉组织用匀浆机10000r/min匀浆1min，称取2±0.1g匀浆物于50ml离心管中，加入8ml 0.1M NaOH溶液剧烈振荡5min。于15℃，3000rpm离心10min。取1ml上清液，加入10ml正己烷混合振荡5min，15℃、3000rpm离心5min。取5ml上层正己烷相到离心管中用氮气吹干。取1ml稀释后的复溶液溶解残留物，取50μl进行分析。
2、用试剂盒检测
向安定偶联抗原包被的96孔酶标板微孔中加系列标准品或样本溶液50μl，再加入安定抗体工作液50μl，用盖板膜封板，20～25℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μl浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入辣根过氧化物酶标记抗抗体100μl，用盖板膜封板，20～25℃恒温箱中反应30min。底物显色液A液过氧化氢50μl，再加B液邻苯二胺50μl，轻轻振荡混匀，20～25℃恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。
3、检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以安定浓度(μg/L)的半对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品中安定残留的浓度则可从标准曲线上读出。
实施例5 样品中安定残留的检测
1、样品前处理
取1ml清亮尿样于50ml离心管中，加入4ml 0.1M NaOH溶液剧烈振荡5min。取1ml到另一离心管中加入10ml正己烷混合振荡5min，15℃、3000rpm离心5min。取5ml上层正己烷相到离心管中用氮气吹干，取1ml稀释后的复溶液溶解残留物，取50μl进行分析。
2、用试剂盒检测
向羊抗兔抗抗体包被的96孔酶标板微孔中加入安定多克隆抗体工作液100μl，用盖板膜封板，20～25℃恒温箱中反应1h。倒出孔中液体，每孔加入250μl浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入安定系列标准品或样本溶液50μl，再加入用辣根过氧化物酶标记的安定抗原50μl，用盖板膜封板，20～25℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μl浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加底物显色液A液过氧化脲50μl，再加B液四甲基联苯胺50μl，轻轻振荡混匀，20～25℃恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液2mol/L盐酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。
3、检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以安定浓度(μg/L)的半对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品中安定残留的浓度则可从标准曲线上读出。
实验例1 标准品精密度试验：
分别从三批试剂盒中抽取10个试剂盒，测定0.4μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。
表1 标准可重复性试验(CV％)
结果表明变异系数范围在5.6％～9.1％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。
实验例2 样本可重复性试验：
猪尿、猪肉样本按4μg/kg浓度安定药物标准品进行添加，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2～4。
表2 猪尿样品可重复性试验
表3 猪肉样品可重复性试验
结果表明尿样本变异系数均低于20％，猪肉样本的变异系数均低于20％。符合了变异系数小于25％的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。
实验例3 试剂盒的准确度：
取两个浓度安定药物标准品溶液为4μg/L、8μg/L，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。
表4 试剂盒的准确度
结果表明猪尿添加的回收率在68.7％～91.2％之间，猪肉添加回收率在75.6％～91.4％之间。
实验例4
试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、安定添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃保存6个月以上。
Claims (7)
1、一种检测动物源性食品中安定的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：
(1)包被安定抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；
(2)酶标记物；
(3)安定特异性抗体；
(4)安定标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)浓缩洗涤液；
(8)浓缩复溶液，
其中，所述安定抗原是通过将安定和羧甲基羟胺缩合，给安定接出了一个含2个碳的间隔臂，得到半抗原，再将所述半抗原与载体蛋白偶联获得；所述抗体是由所述抗原制备获得。
2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：安定包被抗原是采用水溶性碳化二亚胺法将安定半抗原与人血清白蛋白进行偶联得到的；包被原或酶标记物所用抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记安定抗原，所用标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶。
4、如权利要求1-3之任一所述的试剂盒，其特征在于：当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺、终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠；浓缩洗涤液为pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐温20和1‰叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸盐缓冲液。
5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：安定标准品溶液为六个浓度梯度的安定溶液，安定标准品稀释液为含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸盐缓冲液。
6、如权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于：安定特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所用的免疫原是采用水溶性碳化二亚胺法将安定半抗原和甲状腺蛋白进行偶联得到的。
7、一种检测动物源性食品中安定的方法，包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用权利要求1-6之任一所述的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Owner name: JIUDINGYANG TECHNOLOGY( BEIJING ) CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: BEIJING WANGER BIOISYSTECH CO., LTD. Effective date: 20090807 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20090807 Address after: Beijing Changping District Huilongguan international information industry base hi tech 4 Street, No. 8 Patentee after: Jiudingyang Science and Technology (Beijing) Co.,Ltd. Address before: National veterinary drug safety evaluation center, West School of veterinary medicine, China Agricultural University, 2 West Road, Beijing, Haidian District, China Patentee before: Beijing Wanger Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING WANGER BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: JIUDINGYANG TECHNOLOGY (BEIJING) CO., LTD. Effective date: 20100730 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20100730 Address after: 102206 Huilongguan international information industry base, Changping District, high street, No. 8, No. four, Beijing Patentee after: Beijing Wanger Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 102206, 8, 4 hi tech street, Huilongguan international information industry base, Beijing, Changping District Patentee before: Jiudingyang Science and Technology (Beijing) Co.,Ltd. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GUIZHOU QINBANG FOOD SAFETY SCIENCE AND TECHNOLOGY Free format text: FORMER OWNER: BEIJING WANGER BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20130605 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 102206 CHANGPING, BEIJING TO: 550009 GUIYANG, GUIZHOU PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130605 Address after: 550009, Guizhou province Guiyang Xiaohe Industrial Park standard factory building No. two, building 1, building 1-2 Patentee after: GUIZHOU KWINBON SCIENCE AND TECHNOLOGY FOR FOOD SAFETY Co.,Ltd. Address before: 102206 Huilongguan international information industry base, Changping District, high street, No. 8, No. four, Beijing Patentee before: Beijing Wanger Biotechnology Co.,Ltd. |
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| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Tao Guangcan Document name: payment instructions |
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| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090909 Termination date: 20211103 |