CN106370870A - 一种用于检测克伦特罗的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测克伦特罗的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，含有检测装置和HRP标记的克伦特罗；所述检测装置的主体为具有上开口和下开口的中空柱状结构，主体内自上至下具有不相接的两层填充物，上层填充物为结合有克伦特罗抗体的固相载体，下层填充物为结合有HRP抗体的固相载体。实验证明，本发明所提供的试剂盒可检测待测样品中是否含有克伦特罗。与传统检测克伦特罗的方法相比，具有操作简便、设备简易便宜、不需要专业人员操作、灵敏度较高等优势。因此，本发明所提供的试剂盒具有重要的应用价值。

Description

一种用于检测克伦特罗的试剂盒
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种用于检测克伦特罗的试剂盒。
背景技术
克伦特罗(clenbuterol，CLE)又名克喘素，为肾上腺素支气管解痉药物，属β-兴奋剂类药物，其主要用来治疗哮喘引起的支气管狭窄和肺气肿，对于平滑肌的β2受体有强效选择性，其扩张效果为舒喘灵(主要成分为沙丁胺醇的平喘药)的100倍，主要给药方式为口服、气雾吸入和直肠给药。德国Boehringer Ingelheim动物保健公司将克伦特罗开发为兽药产品，主要用作马匹的气管扩张剂。上世纪80年代，美国氰胺公司意外发现了克伦特罗的营养重分配作用所带来的巨大经济价值，因而逐渐被畜牧养殖业用于促进动物生长和提高瘦肉率，从此克伦特罗也成为了最古老的人工合成的“瘦肉精”品种。克伦特罗进入猪、牛、羊等常见食用动物体内的残留消除规律已多有报道，普遍呈现出在动物体内快速广泛分布于各组织器官，代谢消除缓慢，易于蓄积在动物体内的特点。克伦特罗过量，对人畜都有很大危害作用：对动物的危害主要表现为血压升高、呼吸加剧、精神不安、全身震颤、心脏和肾脏负担过重等；对人类而言，食用了含有克伦特罗残留的动物制品后，容易出现与动物症状类似，甚至于更为严重的中毒反应，对本身具有高血压、糖尿病、心脏病、甲亢等病症的患者危险性更大，可以诱发心率失常、代谢紊乱等症状。长期食用含有克伦特罗的食物，还容易导致染色体变异，诱发癌症。
国内外有关克伦特罗的检测方法有液相色谱法、气相色谱法和色谱联用法等仪器分析方法。这类仪器分析方法准确、稳定、灵敏，但耗时、设备昂贵，前处理方法繁琐，需要专业人员操作，不适用实际生产生活中。免疫检测技术在目前市场上应用的比较广泛，其中可视化凝胶酶联免疫吸附分析法具有简单快速，结果直观，且不需要专业分析人员等诸多优点，特别适合现场监测克伦特罗的残留情况，为食品安全监控提供了有效的技术手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测克伦特罗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测克伦特罗的检测装置。
本发明所提供的用于检测克伦特罗的检测装置，其主体可为具有上开口和下开口的中空柱状结构，主体内自上至下具有不相接的两层填充物，上层填充物可为结合有克伦特罗抗体的固相载体，下层填充物可为结合有HRP抗体的固相载体。
所述上层填充物和所述下层填充物之间留有0.5～1.0cm的间隔，即形成空气层。
所述克伦特罗抗体可以直接与固相载体连接，也可以借助其它物质与固相载体连接。所述克伦特罗抗体具体可以借助所述克伦特罗抗体的抗体与固相载体连接。
所述HRP抗体可以直接与固相载体连接，也可以借助其它物质与固相载体连接。所述HRP抗体具体可以借助所述HRP抗体的抗体与固相载体连接。
所述检测装置的主体可为层析柱，具体可为免疫亲和柱。
上述检测装置中，所述上层填充物由所述克伦特罗抗体、所述克伦特罗抗体的抗体和固相载体依次结合得到。
上述检测装置中，所述下层填充物由所述HRP抗体、所述HRP抗体的抗体和固相载体依次结合得到。
上述检测装置中，所述克伦特罗抗体可为鼠源的克伦特罗单克隆抗体。所述固相载体可为CNBr活化的Sepharose 4B。所述克伦特罗抗体的抗体可为羊抗鼠二抗。所述HRP抗体可为兔源的抗辣根过氧化物酶多克隆抗体。所述HRP抗体的抗体可为羊抗兔二抗。
所述上层填充物为以CN-Br活化的Sephrose 4B作为固相载体，偶联羊抗鼠二抗，然后加入鼠源的克伦特罗单克隆抗体与固定的羊抗鼠二抗特异性的发生反应，过量的鼠源的克伦特罗单克隆抗体受重力作用直接流出。
所述下层填充物以CN-Br活化的Sephrose 4B作为固相载体，偶联羊抗兔二抗，然后加入抗HRP多克隆抗体与固定的羊抗兔二抗特异性的发生反应，过量的抗HRP多克隆抗体受重力作用直接流出。
上述检测装置具体可为可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱。所述可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱的制备方法具体可如下：
A、检测凝胶的制备
(1)将a mL抗鼠偶联胶和a mL封闭胶混匀，得到混合物。
(2)完成步骤(1)后，取所述混合物，加入a mL鼠源的克伦特罗单克隆抗体，混匀。
(3)完成步骤(2)后，置于摇床上，400rpm反应6min，得到检测凝胶。
B、质控凝胶的制备
(1)将抗兔偶联胶和封闭胶按照1：4(体积比)的比例混匀，得到混合物。
(2)完成步骤(1)后，取所述混合物，按照与抗兔偶联胶1:1(体积比)的比例加入抗HRP多克隆抗体，混匀。
(3)完成步骤(2)后，置于摇床上，400rpm反应5min，得到质控凝胶。
C、制备可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱
(1)取免疫亲和柱(规格为1mL)，加入筛板(即质控层的下筛板)，然后加入200μL质控凝胶，待自然沉积形成柱床后，加入筛板(即质控层的上筛板)，即形成质控层。
(2)完成步骤(1)后，取所述免疫亲和柱，加入筛板(即检测层的下筛板)且该筛板与质控层的上筛板之间留有0.5～1.0cm的间隔，即形成空气层。
(3)完成步骤(2)后，取所述免疫亲和柱，加入200μL检测凝胶，待自然沉积形成柱床后，加入筛板(即检测层的上筛板)，即形成检测层。
经过上述步骤，即制备成了可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱。可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱分为三个部分，从上至下依次为检测层、空气层和质控层。空气层的主要作用是用来隔离检测层和质控层的反应。
所述封闭胶的制备方法可如下：(1)将2.0g CNBr活化的Sepharose 4B置于玻璃层析柱，加入1mM的盐酸水溶液，待凝胶完全溶解后，用200mL的1mM的盐酸水溶液洗涤3遍；(2)完成步骤(1)后，取所述凝胶，加入pH8.4的凝胶偶联缓冲液(将8.4g NaHCO3和29.5g NaCl溶解至1000mL超纯水中得到)进行充分平衡；(3)完成步骤(2)后，取所述凝胶，加入50mLpH8.0的凝胶封闭缓冲溶液(将8.4g NaHCO3、29.5g NaCl和15g甘氨酸溶解至1000mL超纯水中得到)，室温条件下振荡2h；(4)完成步骤(3)后，取所述凝胶，重复如下步骤3次：先用100mL的pH 4.3、1mol/L的醋酸盐缓冲液充分洗涤，再用100mL pH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(5)完成步骤(4)后，取所述凝胶，加入24mL的pH7.4、0.01M PBS缓冲液，然后置于无菌离心管中，加入Procline 300，即为制备的封闭胶。置于4℃保存备用。
所述抗兔偶联胶的制备方法可如下：(1)将0.5g CNBr活化的Sepharose 4B置于玻璃层析柱，加入1mM的盐酸水溶液，待凝胶完全溶解后，用200mL的1mM的盐酸水溶液洗涤3遍；(2)完成步骤(1)后，取所述凝胶，加入pH8.4的凝胶偶联缓冲液进行充分平衡；(3)完成步骤(2)后，取所述凝胶，加入混合液，室温条件下振荡16h；所述混合液由150μL的浓度为1.8mg/mL的羊抗兔二抗和25mL的pH 8.4的凝胶偶联缓冲液混合而成；(4)完成步骤(3)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(5)完成步骤(4)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.0的凝胶封闭缓冲溶液，室温条件下振荡2h；(6)完成步骤(5)后，取所述凝胶，重复如下步骤3次：先用100mL的pH 4.3、1mol/L的醋酸盐缓冲液充分洗涤，再用100mLpH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(7)完成步骤(6)后，取所述凝胶，加入6mL的pH7.4、0.01MPBS缓冲液，然后置于无菌离心管中，加入Procline 300，即为制备的抗兔偶联胶。置于4℃保存备用。
所述抗鼠偶联胶的制备方法可如下：(1)将0.5g CNBr活化的Sepharose 4B置于玻璃层析柱，加入1mM的盐酸水溶液，待凝胶完全溶解后，用200mL的1mM的盐酸水溶液洗涤3遍；(2)完成步骤(1)后，取所述凝胶，加入pH8.4的凝胶偶联缓冲液进行充分平衡；(3)完成步骤(2)后，取所述凝胶，加入混合液，室温条件下振荡16h；所述混合液由150μL的浓度为2.4mg/mL的羊抗鼠二抗和25mL的pH 8.4的凝胶偶联缓冲液混合而成；(4)完成步骤(3)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(5)完成步骤(4)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.0的凝胶封闭缓冲溶液，室温条件下振荡2h；(6)完成步骤(5)后，取所述凝胶，重复如下步骤3次：先用100mL的pH 4.3、1mol/L的醋酸盐缓冲液充分洗涤，再用100mLpH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(7)完成步骤(6)后，取所述凝胶，加入6mL的pH7.4、0.01M PBS缓冲液，然后置于无菌离心管中，加入Procline 300，即为制备的抗鼠偶联胶。置于4℃保存备用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于检测克伦特罗的试剂盒甲。
本发明所提供的试剂盒甲，可含有上述任一所述的检测装置。
所述试剂盒甲还可包括HRP标记的克伦特罗。
所述试剂盒甲还可包括显色剂。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种待测样品中是否含有克伦特罗的方法。
本发明所提供的检测待测样品中是否含有克伦特罗的方法，可包括如下步骤：
(1)取上述任一所述的检测装置，加入HRP标记的克伦特罗和待测样品溶液，孵育；
(2)加入显色剂，判断待测样品中是否含有克伦特罗。
上述方法中，所述步骤(1)中，“加入HRP标记的克伦特罗和待测样品溶液”的方式可为D1)或D2):
D1)将HRP标记的克伦特罗和待测样品溶液混合，然后加入；
D2)先加入待测样品溶液，再加入HRP标记的克伦特罗。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于检测克伦特罗的试剂盒乙。
本发明所提供的试剂盒乙，可包括克伦特罗抗体、所述克伦特罗抗体的抗体和酶标记的克伦特罗。所述酶可为辣根过氧化物酶(HRP)。
所述试剂盒乙还可包括固相载体。
所述试剂盒乙还可包括显色剂。
上述试剂盒乙还可包括免疫亲和柱。
上述试剂盒乙还可包括上述任一所述HRP抗体和上述任一所述HRP抗体的抗体。
所述克伦特罗抗体可以直接与所述固相载体连接，也可以借助其它物质与所述固相载体连接。所述克伦特罗抗体具体可以借助所述克伦特罗抗体的抗体与所述固相载体连接。
所述HRP抗体可以直接与所述固相载体连接，也可以借助其它物质与所述固相载体连接。所述HRP抗体具体可以借助所述HRP抗体的抗体与所述固相载体连接。
上述试剂盒乙中，所述克伦特罗抗体可为鼠源的克伦特罗单克隆抗体。所述固相载体可为CNBr活化的Sepharose 4B。所述克伦特罗抗体的抗体可为羊抗鼠二抗。所述HRP抗体可为兔源的抗辣根过氧化物酶多克隆抗体。所述HRP抗体的抗体可为羊抗兔二抗。
上述任一所述检测装置，或，上述任一所述试剂盒甲、或、上述任一所述试剂盒乙在检测克伦特罗中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，所述鼠源的克伦特罗单克隆抗体具体是由保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的抗体。所述CNBr活化的Sepharose 4B可为美国GE公司的产品，产品目录号为17-0756-01。所述羊抗鼠二抗、所述兔源的抗辣根过氧化物酶多克隆抗体和所述羊抗兔二抗均可为美国Jackson公司的产品。HRP为美国Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为p8375。所述显色剂可为TMB显色底物液。所述TMB显色底物液具体可为国药集团化学试剂有限公司的产品，产品目录号为138813。
实验证明，本发明所提供的试剂盒可检测待测样品中是否含有克伦特罗。与传统检测克伦特罗的液相色谱法、气相色谱法、色谱联用法和酶联免疫吸附法相比，具有操作简便，设备简易便宜，不需要专业人员操作等优势；与胶体金免疫层析试纸条相比，本发明能够显著提高免疫层析检测方法的灵敏度。因此，本发明所提供的试剂盒具有重要的应用价值。
附图说明
图1为可视化凝胶酶联免疫吸附分析法的反应原理.
图2为采用可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱检测待测样品中是否含有克伦特罗的步骤。
图3为定性检测的灵敏度实验结果。
图4为定量检测反应结果判定标准与饱和度S(％)之间的对应关系。
图5为定量检测的灵敏度实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
鼠源的克伦特罗单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的抗体。TMB显色底物液为国药集团化学试剂有限公司的产品，产品目录号为138813。CNBr活化的Sephrose 4B为美国GE公司的产品，产品目录号为17-0756-01。羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗和抗HRP多克隆抗体均为美国Jackson公司的产品。CLE标准品为德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司的公司产品，产品目录号为129138-59-6。HRP为美国Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为p8375。
酶标抗原的制备方法如下：(1)取5mg CLE标准品，用0.5mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液溶解，得到CLE溶液；(2)取CLE溶液，置于冰水浴，逐滴加入0.2mL的浓度为25mg/mL亚硝酸钠水溶液，然后4℃反应2h，得到CLE重氮盐；(3)取20mg HRP用1mL的浓度为1mol/L的碳酸钠水溶液溶解，得到HRP溶液；(4)取HRP溶液，逐滴加入CLE重氮盐，然后搅拌过夜，得到反应液；(5)将反应液置于pH7.2、0.01M PBS缓冲液中透析3d，然后离心，上清即为酶标抗原，在下文中简称CLE-HRP。
封闭胶的制备方法如下：(1)将2.0g CNBr活化的Sepharose 4B置于玻璃层析柱，加入1mM的盐酸水溶液，待凝胶完全溶解后，用200mL的1mM的盐酸水溶液洗涤3遍；(2)完成步骤(1)后，取所述凝胶，加入pH8.4的凝胶偶联缓冲液(将8.4g NaHCO3和29.5g NaCl溶解至1000mL超纯水中得到)进行充分平衡；(3)完成步骤(2)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.0的凝胶封闭缓冲溶液(将8.4g NaHCO3、29.5g NaCl和15g甘氨酸溶解至1000mL超纯水中得到)，室温条件下振荡2h；(4)完成步骤(3)后，取所述凝胶，重复如下步骤3次：先用100mL的pH 4.3、1mol/L的醋酸盐缓冲液充分洗涤，再用100mL pH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(5)完成步骤(4)后，取所述凝胶，加入24mL的pH7.4、0.01M PBS缓冲液，然后置于无菌离心管中，加入Procline300，即为制备的封闭胶。置于4℃保存备用。
抗兔偶联胶的制备方法如下：(1)将0.5g CNBr活化的Sepharose 4B置于玻璃层析柱，加入1mM的盐酸水溶液，待凝胶完全溶解后，用200mL的1mM的盐酸水溶液洗涤3遍；(2)完成步骤(1)后，取所述凝胶，加入pH8.4的凝胶偶联缓冲液进行充分平衡；(3)完成步骤(2)后，取所述凝胶，加入混合液，室温条件下振荡16h；所述混合液由150μL的浓度为1.8mg/mL的羊抗兔二抗和25mL的pH 8.4的凝胶偶联缓冲液混合而成；(4)完成步骤(3)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(5)完成步骤(4)后，取所述凝胶，加入50mL pH8.0的凝胶封闭缓冲溶液，室温条件下振荡2h；(6)完成步骤(5)后，取所述凝胶，重复如下步骤3次：先用100mL的pH 4.3、1mol/L的醋酸盐缓冲液充分洗涤，再用100mL pH8.4的凝胶偶联缓冲液充分洗涤；(7)完成步骤(6)后，取所述凝胶，加入6mL的pH7.4、0.01M PBS缓冲液，然后置于无菌离心管中，加入Procline 300，即为制备的抗兔偶联胶。置于4℃保存备用。
抗鼠偶联胶的制备方法如下：按照抗兔偶联胶的制备方法，仅将步骤(3)中的150μL的浓度为1.8mg/mL的羊抗兔二抗替换为150μL的浓度为2.4mg/mL的羊抗鼠二抗，其它步骤均不变。
实施例1、可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱的制备
制备可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱的步骤具体如下：
1、检测凝胶的制备
(1)将a mL抗鼠偶联胶和a mL封闭胶混匀，得到混合物。
(2)完成步骤(1)后，取所述混合物，加入a mL鼠源的克伦特罗单克隆抗体，混匀。
(3)完成步骤(2)后，置于摇床上，400rpm反应6min，得到检测凝胶。
2、质控凝胶的制备
(1)将抗兔偶联胶和封闭胶按照1：4(体积比)的比例混匀，得到混合物。
(2)完成步骤(1)后，取所述混合物，按照与抗兔偶联胶1:1(体积比)的比例加入抗HRP多克隆抗体，混匀。
(3)完成步骤(2)后，置于摇床上，400rpm反应5min，得到质控凝胶。
3、制备可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱
(1)取免疫亲和柱(规格为1mL)，加入筛板(即质控层的下筛板)，然后加入200μL质控凝胶，待自然沉积形成柱床后，加入筛板(即质控层的上筛板)，即形成质控层。
(2)完成步骤(1)后，取所述免疫亲和柱，加入筛板(即检测层的下筛板)且该筛板与质控层的上筛板之间留有0.5～1.0cm的间隔，即形成空气层。
(3)完成步骤(2)后，取所述免疫亲和柱，加入200μL检测凝胶，待自然沉积形成柱床后，加入筛板(即检测层的上筛板)，即形成检测层。
经过上述步骤，即制备成了可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱。可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱分为三个部分，从上至下依次为检测层、空气层和质控层。空气层的主要作用是用来隔离检测层和质控层的反应。
实施例2、采用实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱检测待测样品是否含有克伦特罗
检测原理：在检测层中，经CN-Br活化的Sephrose 4B作为固相载体，偶联羊抗鼠二抗，然后加入鼠源的克伦特罗单克隆抗体与固定的羊抗鼠二抗特异性的发生反应，过量的鼠源的克伦特罗单克隆抗体受重力作用直接流出；从柱口处加入待测溶液和CLE-HRP，再共同竞争有限的鼠源的克伦特罗单克隆抗体，最后加入TMB显色底物液显色；检测层呈现蓝色说明待测溶液不含有克伦特罗，检测层呈现无色说明待测溶液含有克伦特罗。在质控层中，经CN-Br活化的Sephrose 4B作为固相载体，偶联羊抗兔二抗，然后加入抗HRP多克隆抗体与固定的羊抗兔二抗特异性的发生反应，过量的抗HRP多克隆抗体受重力作用直接流出；从柱口处加入待测溶液和CLE-HRP，CLE-HRP与抗HRP多克隆抗体结合，最后加入TMB显色底物液显色；质控层呈现蓝色说明检测结果有效；质控层呈现无色说明检测结果无效，需重新检测。
可视化凝胶酶联免疫吸附分析法的反应原理如图1所示(Test layer为检测层，Control layer为质控层，Result为具体的检测结果：Negative为待测溶液不含有克伦特罗的检测结果，Positive为待测溶液含有克伦特罗的检测结果，Invalid为检测结果无效的检测结果)。采用可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱检测待测样品中是否含有克伦特罗的步骤详见图2(洗涤液具体为含Tween-100的pH7.4、0.01MPBS缓冲液，显色底物液具体为TMB显色底物液)。
一、定性检测的灵敏度
1、取CLE标准品，用无菌水溶解，分别得到浓度为0μg/L的CLE溶液1、浓度为0.05μg/L的CLE溶液2、浓度为0.10μg/L的CLE溶液3、浓度为0.15μg/L的CLE溶液4、浓度为0.30μg/L的CLE溶液5和浓度为0.60μg/L的CLE溶液6。
2、完成步骤1后，取1mL CLE溶液(CLE溶液1、CLE溶液2、CLE溶液3、CLE溶液4、CLE溶液5或CLE溶液6)，加入实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱(流速为1滴/秒，目的为抗原抗体充分反应)。
3、完成步骤2后，取所述可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱，加入150μL酶标抗原稀释液，孵育6min后吹干；所述酶标抗原稀释液为用pH7.4、0.01M PBS缓冲液稀释酶标抗原至4000倍得到。
4、完成步骤3后，用含Tween-100的pH7.4、0.01MPBS缓冲液洗涤7次。
5、完成步骤5后，加入150μL TMB显色底物液，吹干，5min后观察检测层和质控层的颜色。
实验结果见图3(0为CLE溶液1，0.05为CLE溶液2，0.10为CLE溶液3，0.15为CLE溶液4、0.30为CLE溶液5，0.60为CLE溶液6)，结果表明，质控层显示蓝色，证明本次实验结果有效；检测层显示蓝色的程度随着CLE溶液浓度的增加而逐渐降低，当CLE浓度达到0.30μg/L时，抑制完全。因此，可以利用实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱检测克伦特罗，灵敏度为0.30μg/L。
二、待测样品的定性检测
(1)样品的制备
a、取1mL的猪尿，5000g离心5min，收集上清液；向所述上清液中加入2mL含Tween-100的pH7.4、0.01MPBS缓冲液，涡旋混匀1min，得到样品1。
b、取1.0g猪肉，加入3mL的浓度为0.1mol/L的盐酸水溶液，涡旋混匀1min，然后5000g离心10min，收集上清液；向所述上清液中加入NaOH水溶液调节pH值至7.0，得到样品2。
c、按照步骤b的方法，将猪肉替换为羊肉，其它步骤均不变，得到样品3。
d、按照步骤b的方法，将猪肉替换为牛肉，其它步骤均不变，得到样品4。
(2)样品的定性检测
a、将样品1加入实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱(流速为1滴/秒，目的为抗原抗体充分反应)。
b、完成步骤a后，取所述可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱，加入150μL酶标抗原稀释液，孵育6min后吹干；所述酶标抗原稀释液为用pH7.4、0.01M PBS缓冲液稀释酶标抗原至4000倍得到。
c、完成步骤b后，用含Tween-100的pH7.4、0.01MPBS缓冲液洗涤7次。
d、完成步骤c后，加入150μL TMB显色底物液，吹干，5min后观察检测层和质控层的颜色。
按照上述方法，将样品1分别替换为样品2、样品3和样品4，其它步骤均不变，得到相应样本的检测层和质控层的颜色。
结果表明：样品1和样品2的质控层显示蓝色，证明本次实验结果有效；检测层显示无色，表明样品1和样品2中均含有克伦特罗。样品3和样品4的质控层显示蓝色，证明本次实验结果有效；检测层显示蓝色，表明样品3和样品4中均不含有克伦特罗。
三、定量检测及其灵敏度
1、以饱和度S(％)为表征对步骤一的结果进行量化
将步骤一的实验结果用数码相机拍照(存为jpg格式)，然后利用AdobeIllustrator CS6软件对照片中检测柱的检测层的颜色的饱和度S(％)进行分析，具体步骤为：打开拾色器，利用取样工具对检测层进行多点采样(至少选择3个)，选择HSB模式，记录下饱和度S(％)的数值。
反应结果判定标准与饱和度S(％)之间的对应关系如图4所示(图4中，-为无色，+、++、+++、++++、+++++均为蓝色)。
2、绘制标准曲线
以步骤一中CLE溶液1的图像的饱和度S(％)为B0值，CLE溶液2、CLE溶液3、CLE溶液4、CLE溶液5和CLE溶液6的图像的饱和度S(％)为B值。以B/B0＝50％时的CLE溶液浓度(即IC50)来评价所建立的凝胶ELISA检测方法的灵敏度。以B/B0为纵坐标，以CLE溶液的浓度的对数作为横坐标，绘制标准曲线，得到图5所示的标准曲线，进一步得到线性方程，并由四参数方程logistic函数计算得到IC50。
Y = A - D 1 + ( X / C ) B + D
公式中Y为图像的饱和度S(％)；A代表标准品溶液浓度最低或者未添加标准品溶液的图像饱和度S(％)；D代表标准品浓度最高时的图像饱和度S(％)；C为IC50；B为标准曲线的斜率。
定量检测方法的检测线(LOD)一般为IC10(即B/B0＝90％)，灵敏度为IC50(即B/B0＝50％)，线性范围为IC20－IC80。图5表明，实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱的灵敏度为0.14μg/L，比通过定性分析的灵敏度提高2倍。
根据标准曲线和待测样品的B/B0值，即可得到待测样品中CLE的浓度。
实施例3、实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱的特异性分析
1、制备供试药物溶液
取供试药物，用无菌水溶解，得到浓度为100μg/L的供试药物溶液。供试药物为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、氯丙那林、西马特罗、班布特罗、齐帕特罗或波洛母特罗。
2、将供试药物溶液加入实施例1制备的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱(流速为1滴/秒，目的为抗原抗体充分反应)。
3、完成步骤2后，取所述可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱，加入150μL酶标抗原稀释液，孵育6min后吹干；所述酶标抗原稀释液为用pH7.4、0.01M PBS缓冲液稀释酶标抗原至4000倍得到。
4、完成步骤3后，用含Tween-100的pH7.4、0.01MPBS缓冲液洗涤7次。
5、完成步骤4后，加入150μL TMB显色底物液，吹干，5min后观察检测层和质控层的颜色。
结果表明，供试药物溶液的质控层均显示蓝色，证明本次实验结果有效；除克伦特罗溶液的检测层显示无色，其它供试药物溶液的检测层均显示蓝色。因此，本发明所提供的可视化凝胶酶联免疫吸附检测柱可特异的检测克伦特罗。

Claims (9)

1.一种用于检测克伦特罗的检测装置，其主体为具有上开口和下开口的中空柱状结构，主体内自上至下具有不相接的两层填充物，上层填充物为结合有克伦特罗抗体的固相载体，下层填充物为结合有HRP抗体的固相载体。
2.如权利要求1所述的检测装置，其特征在于：所述上层填充物由所述克伦特罗抗体、所述克伦特罗抗体的抗体和固相载体依次结合得到；所述下层填充物由所述HRP抗体、所述HRP抗体的抗体和固相载体依次结合得到。
3.如权利要求1或2所述的检测装置，其特征在于：所述克伦特罗抗体为鼠源的克伦特罗单克隆抗体；所述固相载体为CNBr活化的Sepharose 4B；所述克伦特罗抗体的抗体为羊抗鼠二抗；所述HRP抗体为兔源的抗辣根过氧化物酶多克隆抗体；所述HRP抗体的抗体为羊抗兔二抗。
4.一种用于检测克伦特罗的试剂盒甲，含有权利要求1至3中任一所述的检测装置。
5.如权利要求4所述的试剂盒甲，其特征在于：所述试剂盒甲还包括HRP标记的克伦特罗。
6.一种检测待测样品中是否含有克伦特罗的方法，包括如下步骤：
(1)取权利要求1至3中任一所述的检测装置，加入HRP标记的克伦特罗和待测样品溶液，孵育；
(2)加入显色剂，判断待测样品中是否含有克伦特罗。
7.一种用于检测克伦特罗的试剂盒乙，包括克伦特罗抗体、所述克伦特罗抗体的抗体和酶标记的克伦特罗。
8.如权利要求7所述的试剂盒乙，其特征在于：所述试剂盒乙还包括固相载体。
9.权利要求1至3任一所述检测装置，或，权利要求4或5所述试剂盒甲、或、权利要求7或8所述试剂盒乙在检测克伦特罗中的应用。
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