CN101458254A - 一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法。本发明的盐酸克伦特罗检测试纸包括支撑固定粘衬层，在支撑固定粘衬层上依次有样品吸附层、结合垫、微孔虹吸反应层和吸水材料层，在结合垫上有示踪粒子标记的盐酸克伦特罗抗体和示踪粒子标记的抗体A，抗体A不同于盐酸克伦特罗抗体；微孔虹吸反应层上从样品吸附层端到吸水材料层端依次有盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液印迹区和检测区域，检测区包括检测溶液印迹区和对照溶液印迹区。当样品中含有5纳克以上的盐酸克伦特罗时，检测区出现两条线；当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，检测区出现一条线。该试纸具有与夹心法等同的检测模式及判读方式且成本低，检测方法简便快捷，操作简单。

Description

一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法

技术领域

本发明涉及兽药残留免疫分析技术领域，特别涉及一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法。

背景技术

盐酸克伦特罗(clenbuterol，CLB)又称瘦肉精、氨哮素、克喘素，是β2-肾上素受体激动剂(简称β-兴奋剂)。化学名称为羟甲叔丁肾上腺素，白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161℃。该药物可选择性地作用于肾上腺素受体，是一种强效激动剂，可引起交感神经兴奋，动物吃了含有盐酸克伦特罗的饲料，能够改善养分的代谢途径，促进动物肌肉，特别是骨骼蛋白质的合成，抑制脂肪合成的积累，从而加速动物生长速度，瘦肉相对增加。一般来说，饲料中添加适量的盐酸克伦特罗以后，可使猪等畜禽生长速度、饲料转化率、酮体瘦肉率提高10％以上。因此，习惯上称其为“瘦肉精”。在体内代谢慢，当给动物用药90天，宰前停药5天，仍在尿液、血液、肌肉、和肝脏检出克伦特罗。克伦特罗的化学结构稳定，在体内不会破坏分解，以原形排出体外。污染的肉食品如猪肝食用要经过煮熟，但研究显示克伦特罗完全耐受100℃高温。要经过126℃油煎5分钟才会破坏减半。因此，常规烹调对肉食品克伦特罗残留不起破坏作用。人类食后发生中毒。临床表现为心跳加速、四肢颤抖、腹痛头晕，同时伴有呼吸困难、恶心呕吐等症状。长期食用，可致染色体畸变，诱发恶性肿瘤等。

目前，测定盐酸克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气/质联用分析法(GC/MS)、气相色谱法、薄层色谱法等等。上述这些方法由于其试验操作烦琐、时间长，需要经过专业培训、有丰富经验的操作人员，所需的仪器设备也比较昂贵、检测成本高，受限于实验室内进行，难于在基层普及与推广，更不适于现场、野外的大规模快速检测。酶联免疫吸附测定法(ELISA)也是一种常用检测技术，ELISA既可检测多个样品，也可定性、定量检测，但目前市场上尚无商品化的此试剂盒出售，而且ELISA需要一定操作经验的专业人员，其操作过程比较复杂，检测时间比较长，不同人员操作往往会出现不同的检测结果，且须配套的酶标板阅读仪器，很难实施现场检测。

现有盐酸克伦特罗免疫层析试纸采用免疫层析竞争法，在检测的过程中盐酸克伦特罗和检测线处固相化的盐酸克伦特罗偶联物竞争胶体金标记的单克隆抗体，当样品中含有5ng/毫升以上的盐酸克伦特罗时检测线不显色，盐酸克伦特罗含量低于5ng/毫升时检测线显色，样品中盐酸克伦特罗的含量和检测线显色的状况呈负相关，而人们的判断思维首先的是正相关，因此极易出现判读错误，且负相关的情况经常出现检测线是否有显色而出现不必要的假阴性造成漏检。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种盐酸克伦特罗检测试纸，该试纸结构简单、使用方便、判读直观且成本低，采用显色与盐酸克伦特罗药品含量呈正相关的判读方法更符合人们的思维模式，并且不会出现假阴性造成漏检。

本发明的另一个目的在于提供一种应用上述盐酸克伦特罗检测试纸检测盐酸克伦特罗的方法，该方法简便快捷，操作简单，不需要特定仪器设备辅助，易于在中小型企业、基层普及与推广应用，同时适于现场快速检测盐酸克伦特罗。

为实现本发明的目的，采用如下的技术方案：

本发明的一种盐酸克伦特罗检测试纸，包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次有样品吸附层、结合垫、微孔虹吸反应层和吸水材料层，在所述结合垫上有示踪粒子标记的盐酸克伦特罗抗体和示踪粒子标记的抗体A，所述抗体A不同于盐酸克伦特罗抗体；所述微孔虹吸反应层上从所述样品吸附层端到所述吸水材料层端依次有盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液印迹区和检测区域，所述检测区包括检测溶液印迹区和对照溶液印迹区。

所述示踪粒子包括胶体金、纳米乳胶颗粒、胶体硒、胶体铁。

所述微孔虹吸反应层为硝酸纤维素反应膜或者聚偏氟乙烯反应膜。

所述盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液为盐酸克伦特罗与载体蛋白偶联的复合溶液印迹，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、铁蛋白或血蓝蛋白。

所述检测溶液为盐酸克伦特罗的二抗溶液。

所述对照溶液为抗体A的二抗溶液。

上述各吸附层之间可以相互交叠；相互交叠距离可以为0.1cm，盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液印迹可以为“-”，检测印迹可以为“-”或“|”，对照印迹可以为“-”或“|”。具体来说，以样品吸附层为前端，以吸水材料层端为底端，在距前端0.5cm处的微孔虹吸反应层上用偶联盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液印制截留印迹“—”，在距前端1.5cm处的微孔虹吸反应层上用检测印迹溶液印制检测印迹“—””或“|”。在距底端1cm处的微孔虹吸反应层上用对照印迹溶液印制对照印迹“—””或“|”。

本发明的一种用上述检测试纸检测盐酸克伦特罗的方法，包括以下步骤：

(1)样品处理；

(2)样品检测：将上述检测试纸的样品吸附层部分放入步骤(1)所得的样品溶液中；

(3)结果判读：当样品中含有5纳克以上的盐酸克伦特罗时，所述检测区出现两条线；当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，所述检测区出现一条线。

本发明所述的盐酸克伦特罗检测试纸具有以下优点：

(1)特异性强，敏感性高。本发明中的盐酸克伦特罗快速检测试纸条是以微球金胶颗粒标记高亲和力的单克隆抗体或多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记单克隆抗体或多克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。此发明制备的盐酸克伦特罗快速检测试纸条产品可检测到5ppb，且对四环素、磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺吡啶、链霉素、氯霉素药物检测无交叉性反应。

(2)该检测试纸具有与夹心法等同的检测模式及判读方式。当待检样品中的盐酸克伦特罗含量低于检测下限时，由于在微孔虹吸反应层上的盐酸克伦特罗的载体蛋白可以结合过量的标记有示踪粒子的盐酸克伦特罗抗体，从而能阻断标记有示踪粒子的盐酸克伦特罗抗体与检测区的盐酸克伦特罗的二抗结合而使检测区不显色，相反，当待检样品中的盐酸克伦特罗含量高于检测下限时，阻断效果被样品中的盐酸克伦特罗小分子与标记有示踪粒子的盐酸克伦特罗抗体形成的复合物掩盖，而使检测区显色。在检测区显色则样品中含有药物，检测区不显色则不含有药物，更加符合人们的判读习惯。

(3)显示检测结果形象、直观准确。当待检样品中含有5纳克以上的盐酸克伦特罗时，检测区出现“＝”、“||”、“+”、

或者

的两条线，当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，检测区出现“-”或“|”一条线。结果判定直观、准确、不易出现假阴性和假阳性误判。

(4)操作简便、快速。使用快速检测试纸条时无需其它任何试剂，只要将其插入待检测样品中15秒左右取出，在3分钟内即可检测出结果。

(5)成本低、投资少。使用快速诊断试纸条，不需另配仪器设备，节约大量投资，成本低，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

(6)易于大范围推广应用。快速检测试纸操作简单，无须专业培训，按说明书即可完成操作，易于普及，广泛适用于食品专业检验、海关检疫、卫生防疫、兽医站、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等各层次的需求。

附图说明

图1为盐酸克伦特罗检测试纸的一个优选实施例的结构侧视示意图；

图2为盐酸克伦特罗检测试纸的一个优选实施例的结构俯视示意图；

图3为盐酸克伦特罗检测试纸结果判定示意图；

图4为8ppb、5ppb、1ppb、0ppb的盐酸克伦特罗标准品的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行，如：现代免疫学技术(湖北科学技术出版社)、蛋白实验技术指南、分子克隆等，或者按照制造厂商所建议的条件或操作方法进行。

实施例一：盐酸克伦特罗的胶体金检测试纸的制备

1.偶联盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液截留印迹溶液的制备

(1)采用重氮偶合反应，以500μL0.25mol/L的H₂SO₄溶解10mg盐酸克伦特罗，取200μL2％ NaNO₂溶液缓慢滴入上述溶液，4℃反应10min。

(2)磁力搅拌条件下，将所得的混合液滴入2mL事先分别加入牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、铁蛋白(FE)、血蓝蛋白(KLH)溶液中，用1mol/LNaOH调pH值到9.5，4℃缓慢搅拌过夜，形成以偶氮键相联的四种连接产物。

(3)得到的四种连接产物分别装入透析袋，用10mM pH7.4的磷酸缓冲液透析三天，每天换2次，以去除游离未结合的盐酸克伦特罗小分子后，置于冷冻干燥仪中抽干，分装后于-80℃保存备用。

(4)另：将步骤(3)抽干的四种连接产物分别称取1.5mg，用含有pH7.2，10mM PBS缓冲印迹溶液(含0.1％ SDS，0.1％ NaN3，0.1％ Tween 20)充分溶解，即为盐酸克伦特罗与载体蛋白偶联复合溶液，分别为CL-BSA、CL-OVA、CL-FE、CL-KLH的偶联复合溶液，-20℃保存以备用于微孔虹吸反应层上的印制截留印迹。

2.盐酸克伦特罗金标抗体溶液及金标羊IgG溶液玻璃棉的制备

微球金胶颗粒采用柠檬酸三钠化学还原法进行合成，即0.01％氯金酸水溶液250ml在磁力加热搅拌器中加热沸腾后，迅速一次性加入1％柠檬酸三钠溶液4ml，溶液颜色即变黑且渐向紫红色转变，直至颜色保持不变1min后，即制得颗粒大小为35-40nm左右的微球金胶溶液。与抗体标记前以0.5mol/LK₂CO₃调金胶溶液pH值至8.2左右，采用经典NaCl滴定法确定金胶溶液与盐酸克伦特罗抗体的最佳标记量为10μg/ml，抗体可盐酸克伦特罗单克隆抗体，或为盐酸克伦特罗多克隆抗体。然后按最佳抗体标记量进行标记，10min后，加10％BSA至终浓度1％，充分混匀静置10min，4℃ 12000rpm离心25min，弃上清以除去未与微球金胶颗粒结合的抗体，沉淀用pH8.2，20mM Tris-HCL缓冲保护溶液(配制：Tris 3.0285g，HCL0.35ml，BSA10g，蔗糖50g，NaN₃2g，PEG2000 2g，去离子水900ml，用1Mol NaOH调pH至8.2后加补去离子水至1000mL)进行重悬，即获得金标抗体溶液。将金标抗体溶液平铺于纤维玻璃棉上，用涂布棒来回均匀分布，制得盐酸克伦特罗金标抗体溶液纤维玻璃棉，真空低温冷冻干燥，铝铂封装备用。采用同样的过程制备金标羊IgG溶液玻璃棉。

3.纤维层玻璃棉的处理

将玻璃棉浸泡于0.01M PH7.4磷酸缓冲液(含1％ BSA，0.1％ PVP K-30，0.2％NaN₃)中30min后，置于37℃烘干备用。

4.微孔虹吸反应层的包被

分别称取羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG抗体1.5mg，用pH7.2，10mM PBS缓冲印迹溶液(配制：SDS 1g，Tween 20 1ml，NaN3 1g，磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2gk，氯化钠8g，氯化钾0.2g，去离子水900ml，用1Mol NaOH调PH至7.2后加补去离子水至1000mL)充分溶解，在距底端1cm处的微孔虹吸反应层上印制0.1cm宽的检测印迹，在距底端0.2cm处的微孔虹吸反应层上用盐酸克伦特罗偶联的载体蛋白溶液印制0.2-0.5cm宽的截留印迹，两印迹之间的距离为5mm，在距检测印迹0.5cm，截留印迹的对称面用兔抗羊IgG或驴抗羊IgG溶液印制0.1cm宽的对照印迹，于冷冻干燥仪抽干，铝铂袋加干燥剂封装备用。

5.试纸条的组装

将样品吸附纤维层2、结合垫3、微孔虹吸反应层4、吸水材料层5按图1所示的顺序相互交叠0.1cm依次粘贴在支撑固定粘衬层1片条上，其中，在结合垫3上吸附有盐酸克伦特罗金标抗体溶液及金标羊IgG溶液，在微孔虹吸反应层4吸附有盐酸克伦特罗偶联的载体蛋白溶液41、羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG抗体42以及兔抗羊IgG或驴抗羊IgG溶液43。试纸条的组装切好后，切成3-5mm宽的小条，真空铝铂袋封装，4-30℃保存。

实施例二：盐酸克伦特罗纳米乳胶标记抗体溶液及纳米乳胶标记IgG溶液玻璃棉制备

纳米乳胶颗粒经过活化和待标记的抗体或IgG按比例混匀后调整pH值至所需范围加入偶联剂(例如EDC、NHS等)待反应完全加10％BSA至终浓度1％，充分混匀静置10min，4℃ 12000rpm离心25min，弃上清以除去未与纳米乳胶颗粒结合的抗体，沉淀用pH8.2，20mM Tris-HCL缓冲保护溶液(配制：Tris3.0285g，HCL0.35ml，BSA10g，蔗糖50g，NaN₃ 2g，PEG2000 2g，去离子水900ml，用1Mol NaOH调pH至8.2后加补去离子水至1000mL)进行重悬，即获得纳米乳胶标记抗体溶液。将纳米乳胶标记抗体溶液平铺于纤维玻璃棉上，用涂布棒来回均匀分布，制得盐酸克伦特罗纳米乳胶标记抗体溶液纤维玻璃棉，真空低温冷冻干燥，铝铂封装备用。采用同样的过程制备纳米乳胶标记羊IgG溶液玻璃棉。其余组装方法同胶体金试纸条组装方法。

实施例三：盐酸克伦特罗胶体硒、胶体铁标记抗体溶液及胶体硒、胶体铁标记IgG溶液玻璃棉制备

将胶体硒、胶体铁使用0.5mol/L K₂CO₃调金胶溶液pH值至8.2左右，加入所需量的盐酸克伦特罗抗体，10min后，加10％BSA至终浓度1％，充分混匀静置10min，4℃ 12000rpm离心25min，弃上清以除去未与胶体硒、胶体铁结合的抗体，沉淀用pH8.2，20mM Tris-HCL缓冲保护溶液(配制：Tris3.0285g，HCL0.35ml，BSA10g，蔗糖50g，NaN₃2g，PEG2000 2g，去离子水900ml，用1Mol NaOH调pH至8.2后加补去离子水至1000mL)进行重悬，即获得胶体硒、胶体铁标记的抗体溶液。将胶体硒、胶体铁标抗体溶液平铺于纤维玻璃棉上，用涂布棒来回均匀分布，制得盐酸克伦特罗胶体硒、胶体铁标抗体溶液纤维玻璃棉，真空低温冷冻干燥，铝铂封装备用。采用同样的过程制备胶体硒、胶体铁标羊IgG溶液玻璃棉。其余组装方法同胶体金试纸条组装方法。

实施例四：用检测试纸检测盐酸克伦特罗的方法

1.检测样品液的制备

1)尿液检测样品溶液的预处理

若尿液比较混浊3000r/min离心15min，取上清滴加在样品端或将样品端浸入尿液上清中15秒，水平放置，在规定时间内判读结果。

2)组织检测样品溶液的预处理

取切碎的组织样本，于组织捣碎机中均质(10000r/min)1min，称取5g均质物置于50ml离心管中，加入大约15ml蒸馏水然后置于水浴锅中100℃至组织变为白色或褐色为止；3000r/min离心15min，取上清滴加在样品端或将样品端浸入上清中15秒，水平放置，在规定时间内判读结果。

2.检测及结果判定

如图2、图3所示：将盐酸克伦特罗检测试纸条样品吸附层1端插入待检测样品溶液中，插入深度不超过标记线6，待检溶液经样品吸附层2吸附滤过结合垫上的标记抗体溶液纤维玻璃棉3与标记的盐酸克伦特罗抗体结合形成复合物，通过虹吸作用一起向微孔虹吸反应层4移动，若待检样品溶液中含有盐酸克伦特罗5ppb以上，则阻止标记抗体与微孔虹吸反应层4上偶联的载体蛋白溶液的截留印迹41结合，在检测印迹42处能显示条带“-”或“|”，而对照印迹43含兔抗羊IgG抗体或驴抗羊IgG抗体则可与标记羊IgG结合，形成对照条带印迹43“-”或“|”，这两条线形成“＝”或“||”，结果判定为阳性，见图3中的A图；反之样品溶液中盐酸克伦特罗含量低于5ppb，则不能阻止标记抗体与微孔虹吸反应层4上偶联的载体蛋白溶液的截留印迹41结合，在检测印迹42处不能出现“-”或“|”状的有色条带，同样兔抗羊IgG抗体或为驴抗羊IgG抗体可与标记的羊IgG结合，显示对照条带印迹43“-”或“|”，结果判定为阴性，见图3中的B图；若质控线没有条带印迹出现，则该检测试纸条无效，见图3中的C、D图。

实施例五：特异性试验

按实施例四所述方法进行试验，将磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺吡啶、克伦特罗、链霉素、氯霉素等药物浓度稀释为500ppb，用本实用新型试纸条进行样品检测，微孔虹吸反应层4上检测印迹42及对照印迹43呈“-”排列，如图3中的B图，结果为阴性，即为盐酸克伦特罗检测试纸条与磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺吡啶、链霉素、氯霉素等药物无交叉性反应。

实施例六：敏感性试验

用实施例四所述方法，用本发明的检测试纸分别检测0ppb、1ppb、5ppb、8ppb、10ppb、20ppb、40ppb的盐酸克伦特罗标准品，重复10次，其中5ppb、8ppb、10ppb、20ppb、40ppb标准品检测的微孔虹吸反应层4检测印迹42上出现一条出现有色条带，对照印迹43也出现一条有色条带，微孔虹吸反应层4上出现两条有色条带，8ppb标准品检测结果如图4中的A图，5ppb标准品检测结果如图4中的B图；为阳性，而且8ppb标准品检测结果的检测线较5ppb标准品检测结果的检测线。0ppb、1ppb的盐酸克伦特罗标准品检测的微孔虹吸反应层4上的检测印迹42没有有色条带，对照印迹43出现有色条带，1ppb的盐酸克伦特罗标准品检测结果如图4中的C图，0ppb的盐酸克伦特罗标准品检测结果如图4中的D图，为阴性。因此本发明的检测试纸的灵敏度为5ppb。

实施例七：均一性试验

用本发明检测试纸按实施例四所述的方法，对0ppb，5ppb盐酸克伦特罗分别进行10次平行检测，反应时间3min时观察结果，0ppb对照印迹43有色条带出现而检测条带42不出现，5ppb检测印迹42和对照印迹43均显色，其显色深度均一，反应结果一致。

实施例八：稳定性实验

将铝铂袋真空包装完好的试纸条置于37℃进行破坏性实验，时间为30天，各项指标均符合，即检测其它药物无交叉性反应，灵敏度达5ppb，检测显色深度均一，反应结果一致。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种盐酸克伦特罗检测试纸，包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次有样品吸附层、结合垫、微孔虹吸反应层和吸水材料层，其特征在于：所述结合垫上有示踪粒子标记的盐酸克伦特罗抗体和所述示踪粒子标记的抗体A，所述抗体A不同于盐酸克伦特罗抗体；所述微孔虹吸反应层上从所述样品吸附层端到所述吸水材料层端依次有盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液印迹区和检测区，所述检测区包括检测溶液印迹区和对照溶液印迹区。

2.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于：所述示踪粒子包括胶体金、纳米乳胶颗粒、胶体硒、胶体铁。

3.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于：所述微孔虹吸反应层为硝酸纤维素反应膜或者聚偏氟乙烯反应膜。

4.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于：所述盐酸克伦特罗的载体蛋白溶液为盐酸克伦特罗与载体蛋白偶联的复合溶液印迹，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、铁蛋白或血蓝蛋白。

5.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于：所述检测溶液为盐酸克伦特罗的二抗溶液。

6.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于：所述对照溶液为抗体A的二抗溶液。

7.一种用权利要求1-6之一所述检测试纸检测盐酸克伦特罗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)样品处理；

(2)样品检测：将权利要求1-6之一所述检测试纸的样品吸附层部分放入步骤(1)所得的样品溶液中；

(3)结果判读：当样品中含有5纳克以上的盐酸克伦特罗时，所述检测区出现两条线；当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，所述检测区出现一条线。

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