CN101042405A - 一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条及其制备方法，属于对农药的检测技术领域。该测试条包括PVC背衬(1)、粘合剂层(2)、样品垫(3)、结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)、重叠带A(6)、检测带(7)、对照带(8)、重叠带B(9)、吸水垫(10)、限位线(11)和箭头线(12)；其制备方法包括：制备有机磷农药－BSA载体蛋白偶联物；制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体；制备羊或兔抗鼠IgG；制备胶体金；制备单克隆抗体胶体金标记等步骤；该测试条具有简单、快速，仅需要3－15分钟、特异性强，灵敏度高、重复性好、准确、无毒、易保存、廉价等特点，可在对蔬菜、果品、肉类、水产品、蜂产品等有机磷农药残留检测中推广应用。

Description

一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条及其制备方法

                       技术领域

本发明涉及对农药的检测技术领域，尤其涉及一种应用抗体免疫胶体金技术检测有机磷农药残留的测试条及其制备方法。

                       背景技术

目前我国对农药残留检测的主要手段仍然依赖液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS/MS)、气相色谱-质谱法(GC/MS)等大型现代分析仪器，这类仪器虽然检测灵敏度高，但仪器的价格昂贵，而且需要受过严格训练的专业技术人员进行操作使用，同时从样品处理到最后得到结果，需要几个小时甚至过夜，期间的操作过程需要几步到十几步，从技术上和经济上都无法满足大批量样品或临时样品的适时快速检测，从而无法保证人们在日常生活中对食品质量安全的要求，因此研究蔬菜及食品中农药残留快速检测技术已成为各级主管部门和广大居民关注的问题，因此尽快研制出能灵敏、快速、准确的检测有机磷的设备与方法，用以检测蔬菜、水果、组织等样品的有机磷残留有着重要的意义。在现有同类技术中，ELISA试剂盒的生产厂商主要是美国EnviroLogixInc.，其检测样本为水体，不能用于检测蔬菜水果中的有机磷农药残留，最低检出限为0.023ppb；此外，国内、外还有多家生产厂商，如美国Neogen公司，国内的浙江后秀生物制品开发有限公司研制生产的多种速测卡，一般均是利用胆碱酯酶抑制法原理检测蔬菜水果中的有机磷农药残留；此类速测卡虽应用国家标准GB/T5009.199，以快速检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量，但对检测农药对象尚不够完善，如对毒死蜱的检出限无说明；且以上速测卡仅适用于对少量样品的处理，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，震摇50次，静置2min以上即行检测，故实际只能检测到样品表面的农药含量。

                       发明内容

本发明目的是针对上述已有技术存在的缺陷，提供一种不需要特定贵重仪器设备辅助，即能快速、准确、特异、方便、低成本地检测蔬菜、水果、食品样品所含有机磷农药残留的简易测试条；本发明的另一目的是提供该测试条的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条，该测试条包括PVC背衬、不干胶粘合剂层、样品垫、包被有抗有机磷农药特异性单克隆抗体--胶体金标记物的结合垫、硝酸纤维素膜、包被有有机磷农药-BSA载体蛋白偶联物的检测带、包被有羊或兔抗鼠IgG的对照带和吸水垫；其中，所述的检测带设置在硝酸纤维素膜的中端左侧，对照带设置在硝酸纤维素膜的中端右侧，在样品垫的顶面上与其下方结合垫的左端相对应处设一限位线，在限位线的右侧设有指向左方的箭头线；上述各部件间的结构是：粘合剂层的底面粘合在PVC背衬的顶面上，在粘合剂层的顶面中段粘贴硝酸纤维素膜，粘合剂层的左端先粘贴胶体金结合垫，在其上方再粘贴样品垫，在样品垫与结合垫的右端下方与硝酸纤维素膜的左端上方相叠合形成重叠带A，粘合剂层的右端粘贴吸水垫，吸水垫的左端下方与硝酸纤维素膜的右端上方相叠合形成重叠带B。

一种检测有机磷农药免疫胶体金测试条的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备有机磷农药-BSA载体蛋白偶联物：将有机磷农药与BSA载体蛋白按1∶5～50(mol/mol)比例混匀，形成稳定的颗粒，通过纯化形成有机磷农药-BSA偶联物；

(2)制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体：用有机磷农药-BSA偶联物多次免疫Balb/c纯系小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在体外融合形成杂交瘤细胞，经选择性培养基筛选得阳性杂交瘤细胞株；通过将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔获取腹水或以体外细胞培养收集培养上清液的方式，大量制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体；

(3)制备羊或兔抗鼠IgG：用有机磷农药-BSA偶联物多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，纯化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；

(4)制备胶体金：用柠檬酸三钠等还原剂将氯金酸还原成20nm～40nm的胶体金颗粒；

(5)制备单克隆抗体胶体金标记：将胶体金与抗有机磷农药特异性单克隆抗体按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混匀，形成稳定的胶体颗粒，通过纯化、浓缩形成抗有机磷农药特异性单克隆抗体--胶体金标记物；

(6)将抗有机磷农药特异性单克隆抗体--胶体金标记物包被在胶体金结合垫上；将有机磷农药-BSA偶联物包被在硝酸纤维素膜的检测带上；将羊或兔抗鼠IgG包被在对照带上，并充分干燥；

(7)将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫通过不干胶粘合剂层依次粘合在PVC背衬上，切成条状，即制成检测有机磷农药的免疫胶体金测试条。

本发明检测有机磷农药免疫胶体金测试条具有下列各项优点：

(1)简单：操作人员不需要测试、样品处理等专业知识，普通大众经简单培训即可独立使用，检测过程操作简单，易于推广应用；

(2)快速：可分批或单个样品及时检测，也可以实现自我检测与现场检测，检测过程仅需要3-15分钟，连同样品处理整个过程也只需要15-30分钟；

(3)准确：根据免疫学原理进行检测，能特异性识别药物，灵敏度高、重复性好，结果判断形象、直观、准确，简单明了，而且本发明一次处理样品为10-30g，经研磨、组织捣碎等处理后，所测结果不仅是样品表面的农药含量值，也是样品组织中的农药含量值，故检测结果更可靠；

(4)无毒：该产品成分对人体无害，对环境无污染；

(5)易保存：不需要特殊的保存条件，在一般室温下即可保存与检测；

(6)廉价：除样品处理外，不需要配置其他仪器、设备，肉眼即可观察结果，产品本身亦很廉价，检测费用比其它检测方法约便宜5-10元/次；

(7)本产品的主要技术指标高于同行企业的产品质量标准，如一般速测卡对毒死蜱的检出限无说明，而本测试条对毒死蜱的检测限为0.1mg/kg以下。

                      附图说明

图1为本发明免疫胶体金测试条的剖面结构示意图。

                    具体实施方式

结合图1，通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但这并不是对本发明的具体限定。

实施例1：(检测有机磷农药的免疫胶体金测试条)

一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条，该测试条包括PVC背衬1、不干胶粘合剂层2、聚脂纤维样品垫3、包被有抗有机磷农药特异性单克隆抗体--胶体金标记物的聚脂纤维结合垫4、硝酸纤维素膜5、包被有有机磷农药-BSA偶联物的检测带7、包被有羊或兔抗鼠IgG的对照带8和滤纸吸水垫10；其中，所述的检测带7设置在硝酸纤维素膜5的中端左侧，对照带8设置在硝酸纤维素膜5的中端右侧，两者间隔8-10毫米，在样品垫3的顶面上与其下方结合垫4的左端相对应处设一限位线11，并在限位线11的右侧设有指向左方的箭头线12；上述各部件之间的结构是：粘合剂层2的底面粘合在PVC背衬1的顶面上，在粘合剂层2的顶面中段粘贴硝酸纤维素膜5，粘合剂层2的左端先粘贴胶体金结合垫4，在其上方再粘贴样品垫3，在样品垫3与结合垫4的右端下方与硝酸纤维素膜5的左端上方相叠合形成宽度为1-2毫米的重叠带A6，粘合剂层2的右端粘贴吸水垫10，吸水垫10的左端下方与硝酸纤维素膜5的右端上方相叠合形成宽度为1-2毫米的重叠带B9；上述的各部件按所述的结构方式组合成本发明的一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条。

实施例2：(检测有机磷农药免疫胶体金测试条的制备方法1)

按以下步骤制备：

1)制备有机磷农药-BSA载体蛋白偶联物：将有机磷农药与BSA牛血清白蛋白偶联物按1∶5(mol/mol)比例混匀，使有机磷农药与BSA形成稳定的颗粒，通过纯化形成有机磷农药-BSA偶联物；

2)制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体：以50ug-100ug/只的偶联有机磷的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；第三次加强免疫后3天，将免疫小鼠眼放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾，粉碎，经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2-5×107的NSO骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水浴中，缓缓加入0.7-1ml的40％-50％PEG4000(pH8.5-9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清的I640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96空培养板(100ul-200ul)孔，置37℃5％CO₂培养箱中培养；培养7-10天后，以5-10ug/ml的偶联有机磷的载体蛋白包被酶标板(40孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强细胞克隆(OD492＝0.8以上)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体特异地与有机磷反应，而不与其他蛋白发生交叉反应，亲和力常数达109-10，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1IgG2a IgG2b IgG3针对有机磷特异抗原决定簇的单克隆抗体；通过将杂交瘤注入小鼠腹腔获取腹水的方式，大量制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体；

3)制备羊抗鼠IgG：用有机磷农药-BSA载体蛋白偶联物多次免疫小鼠，以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，bc 1份小鼠血清加2份PBS(7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃12000r/min离心15min，弃上清；以适量PBS(7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS(7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(7.2)过夜透析，换液2-3次，4℃12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50ug-100ug/kg体重的小鼠血清IgG经皮下和肌肉注射免疫健康羊3-4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高兔血清，以饱和硫酸铵提取羊抗小鼠IgG抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)；

4)制备胶体金：以柠檬酸钠还原法，将沸腾的100ml 0.01％氯化金用0.9ml1％柠檬酸三钠还原成40nm大小的胶体金颗粒；

5)制备有机磷农药单抗-胶体金标记物：以0.1mol/L K₂CO₃调胶体金PH至8.5-9.5，以1∶0.005(ml/mg)的标记比，将有机磷单克隆抗体加入PH在8.5-9.5胶体金溶胶中，标记10min后形成稳定的胶体金颗粒，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃15000g离心1h，弃上清，获得纯化的抗有机磷农药特异性单克隆抗体--胶体金标记物，冷藏备用；

6)用Biodot点膜机将调至在540纳米波长下吸光度为0.5-0.8浓度的有机磷农药单抗-胶体金标记物，喷附于聚酯膜上成为胶体金结合垫4；将有机磷一牛血清白蛋白偶联物以0.7-1.5微升/厘米的喷布量，喷附在硝酸纤维素膜5的检测带7上；将浓度为1-2毫克/毫升的羊抗小白鼠IgG1抗体，以0.7-1.5微升/厘米的喷布量喷附在硝酸纤维素膜5的对照带8上，检测带7与对照带8相间隔8-10毫米，并充分干燥；

7)将硝酸纤维素膜5、胶体金结合垫4、样品垫3、吸水垫10等通过不干胶粘合剂层2依次粘贴在PVC背衬1上，切成3-5毫米宽的条状，即制成检测有机磷农药的免疫胶体金测试条，或根据需要切成较宽的测试板。

实施例3：(检测有机磷农药免疫胶体金测试条的制备方法2)

在本实施例中，除有机磷农药与BSA载体蛋白按1∶25(mol/mol)比例混匀，形成有机磷农药-BSA偶联物；将杂交瘤细胞通过在体外细胞培养收集培养上清液方式，制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体；小鼠提取抗血清免疫家兔，纯化后得兔抗鼠IgG；将氯金酸还原成30nm的胶体金颗粒及按以1∶0.010(ml/mg)的标记比，将有机磷单克隆抗体加入PH在8.5-9.5胶体金溶胶中，形成稳定的胶体金复合物外，其余制备方法均同于实施例2。

实施例4：(检测有机磷农药免疫胶体金测试条的制备方法3)

在本实施例中，除有机磷农药与BSA载体蛋白按1∶50(mol/mol)比例混匀，形成有机磷农药-BSA偶联物；将杂交瘤注入小鼠腹腔获取腹水方式，大量制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体；小鼠提取抗血清免疫羊，纯化后得羊抗鼠IgG；将氯金酸还原成20nm的胶体金颗粒及按1∶0.015(ml/mg)的标记比，将有机磷单克隆抗体加入PH在8.5-9.5胶体金溶胶中，形成稳定的胶体金复合物外，其余制备方法均同于实施例2。

实施例5：(免疫胶体金测试条的应用1)

一般在检测前先将待检样本和测试条或测试板放在室温条件下约10分钟，使其恢复至室温；再把样本加工成溶液，并从铝箔袋中取出测试条或测试板，将测试条样品垫3的限位线11以下的部位，按箭头线12所示方向浸入样本溶液中，液面不得超过限位线11，5秒-8秒后取出，平放在操作台上；如果是测试板，从铝箔袋中取出后平放在操作台上，往样品垫3上滴加3滴(约120ul)样品溶液即可。将试剂条插入待检样品溶液后，样品溶液因层析作用往上扩散，如果样品溶液含有有机磷药物的残留，药物和胶体金颗粒上的抗体先行反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线7时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的药物占据而无法与检测线7上药物抗原结合；所以当样品中的有机磷农药含量超过试剂条检出限时，试剂条上的检测线7将较对照线8显色淡或甚至无显色，判定为阳性；反之，当样品中有机磷农药含量在试剂条检出限以下或无残留时，试剂条上的检测线7显色与对照线8相近或偏深，判定为阴性。上述测试条或测试板在3-15分钟内即可判断结果，30分钟后判断的结果为无效；如果对照线8上没有红色条带出现，则表明不正确的操作过程或测试条已变质而失效，应用新的测试条重新测试。

实施例6：(免疫胶体金测试条的应用2-肌肉、鱼、虾等-组织样品)

按以下方法操作：

1取20g左右的组织样本，切碎混匀；

2称取10g样本于烧杯中，加入大约5ml蒸馏水和35ml乙腈，用高速组织捣碎机捣碎约1min；

3用布氏漏斗过滤或室温下3000r/min离心5min，滤液或上清转入100mL具塞量筒；

4加入约4g氯化钠，上下翻转振荡1～2min，静置20min分层；

5移取乙腈上清6ml于试管中，在50℃下氮气吹干；

6用0.4ml PBST溶解管底残留，静置分层，吸取至少100μl下层溶液待检。

注：当0.4ml PBST难以溶解试管壁残留物时，需加入0.4ml正己烷，振荡1min，静置分层，吸取至少100μl下层溶液待检。

实施例7：(免疫胶体金测试条的应用2-蜂蜜、蜂王浆样品)

无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀；有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，待样品全部融化后搅匀。

<法一>适用于实验室检测的处理方法：

1称取10g待检蜂蜜或蜂王浆于离心管中，再加入5ml蒸馏水，振荡溶解样品；

2于离心管中加入35ml乙腈，上下翻转振荡1～2min；

3加入约4g氯化钠，上下翻转振荡1～2min，静置20min分层；

4移取乙腈上清6ml于试管中，在50℃下氮气吹干。

5加入0.4ml PBST，振荡溶解管底残留，待检。

<法二>适用于野外现场检测的处理方法：

1于15ml离心管中加入蜂蜜至“3ml”标志线以上，切勿超过“5ml”标志线；若检测蜂王浆，则根据刻度再滴加2ml纯净水，振荡溶解样品；

2使用滴管加入8ml乙酸乙酯于离心管中；

3剧烈振荡5～8min后，静置分层，用滴管转移4ml上清液于另一5ml刻度冷冻管中，用电吹风吹干；

4使用滴管垂直滴加7滴PBST缓冲液于冷冻管中，溶解残留物，待检。

实施例8：(免疫胶体金测试条的应用3-蔬菜、水果样品)

<法一>适用于实验室检测的处理方法：

1取20g左右的蔬菜、水果样本的可食用部分，切碎混匀；

2称取10g样本于烧杯中，加入大约5ml蒸馏水和35ml乙腈，用高速组织捣碎机提取约1min；

3用布氏漏斗过滤或室温下3000r/min离心5min，滤液或上清转入具塞量筒；

4加入约4g氯化钠，上下翻转振荡1～2min，静置20min分层；

5移取乙腈上清6ml于试管中，在50℃下氮气吹干；

6用0.4ml PBST缓冲液溶解瓶底残留，待检。

<法二>适用于野外现场检测的处理方法：

1取30-40g的蔬菜、水果样品的可食部分，切碎混匀；用研钵研出汁；

2用滤纸或纱布过滤出蔬菜、水果汁，吸取汁0.5mL与小烧杯内，加入0.5mLPBST缓冲液溶解，待测。

<法三>适用于家庭检测的处理方法：

1取30-40g的蔬菜、水果样品的可食部分，放入家庭用冰箱(冷冻箱)，过夜。

2切碎混匀；用木棍剁出汁或用手挤出汁(速冻后组织细胞破坏，色素较少，汁较清淡，有利测定)；

3吸取汁0.5mL与小烧杯内，加入0.5mLPBST缓冲液溶解，待测。

本产品用于快速检测组织(肌肉、鱼、虾等)、蜂蜜、蜂王浆、蔬菜、水果中的有机磷农药残留，整个检测过程只需要30分钟，对13种有机磷农药的检出限见表1。本产品适用于各类企业及检测机构。

实施例9：(对有机磷农药特异性检测试验)对19种农药标准品进行检测，其中13种农药检出结果为阳性，见表1；对30mg/L倍硫磷、久效磷、克线丹、马拉硫磷、敌百虫、克百威六种标准品的检出结果为阴性。

表1  对13种农药标准品的检出限(mg/kg)及其检出结果

农药名称	检出限(mg/kg)		农药名称	检出限(mg/kg)
					毒死蜱	0.1		甲基对硫磷	0.375
对硫磷	0.2		杀螟硫磷	0.75
					甲拌磷	0.75		乐果	3.0
水胺硫磷	3.0		喹硫磷	0.75
					三唑磷	0.75		杀扑磷	1.5
甲胺磷	3.0		敌敌畏	3.0
					乙酰甲胺磷	1.5

Claims (2)

1、一种检测有机磷农药的免疫胶体金测试条，其特征在于：该测试条包括PVC背衬(1)、不干胶粘合剂层(2)、样品垫(3)、包被有抗有机磷农药特异性单克隆抗体--胶体金标记物的结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)、包被有有机磷农药-BSA载体蛋白偶联物的检测带(7)、包被有羊或兔抗鼠IgG的对照带(8)和吸水垫(10)；所述的检测带(7)设置在硝酸纤维素膜(5)的中端左侧，对照带(8)设置在硝酸纤维素膜(5)的中端右侧，在样品垫(3)的顶面上与其下方结合垫(4)的左端相对应处设一限位线(11)，在限位线(11)的右侧设有指向左方的箭头线(12)；上述各部件间的结构是：粘合剂层(2)的底面粘合在PVC背衬(1)的顶面上，在粘合剂层(2)的顶面中段粘贴硝酸纤维素膜(5)，粘合剂层(2)的左端先粘贴胶体金结合垫(4)，在其上方再粘贴样品垫(3)，在样品垫与结合垫(3、4)的右端下方与硝酸纤维素膜(5)的左端上方相叠合形成重叠带A(6)，粘合剂层(2)的右端粘贴吸水垫(10)，吸水垫(10)的左端下方与硝酸纤维素膜(5)的右端上方相叠合形成重叠带B(9)。

2、一种制备权利要求1所述检测有机磷农药免疫胶体金测试条的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备有机磷农药-BSA载体蛋白偶联物：将有机磷农药与BSA载体蛋白按mol/mol 1∶5～50比例混匀，形成稳定的颗粒，通过纯化形成有机磷农药—BSA偶联物；

2)制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体：用有机磷农药-BSA偶联物多次免疫Balb/c纯系小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在体外融合形成杂交瘤细胞，经选择性培养基筛选得阳性杂交瘤细胞株；通过将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔获取腹水或以体外细胞培养收集培养上清液的方式，大量制备抗有机磷农药特异性单克隆抗体；

3)制备羊或兔抗鼠IgG：用有机磷农药-BSA偶联物多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，纯化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；

4)制备胶体金：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原成20nm～40nm的胶体金颗粒；

5)制备单克隆抗体胶体金标记：将胶体金与抗有机磷农药特异性单克隆抗体按ml/mg 1∶0.005～0.015比例混匀，形成稳定的胶体颗粒，通过纯化、浓缩形成抗有机磷农药特异性单克隆抗体—胶体金标记物；

6)将抗有机磷农药特异性单克隆抗体—胶体金标记物包被在胶体金结合垫(4)上；将有机磷农药-BSA偶联物包被在硝酸纤维素膜(5)的检测带(7)上；将羊或兔抗鼠IgG包被在对照带(8)上，并充分干燥；

7)将硝酸纤维素膜(5)、胶体金结合垫(4)、样品垫(3)、吸水垫(10)通过不干胶粘合剂层(2)依次粘合在PVC背衬(1)上，切成条状，即制成检测有机磷农药的免疫胶体金测试条。

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