CN101339192B - 一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，该试纸条含有支撑层、吸附层和保护层，吸附层从测试端依次为样品纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PDEV和抗RV的单克隆抗体或多克隆抗体中的至少一种；检测印迹用抗TGEV、抗PDEV和抗RV的多克隆抗体液或单克隆抗体液中对应的至少一种印制，对照印迹用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液、或用羊抗或兔抗猪的IgG溶液印制。本发明试纸条检测时特异性强、敏感性高，操作简便、快速，检测结果直观、准确；特别适合现场快速鉴别诊断。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种检测猪病毒性传染病病原的器具，特别是涉及一种一步检测三种猪病毒性腹泻疾病病原中至少一种的试纸条。
二、技术背景：
猪腹泻性疾病是一类严重影响养猪业发展的疾病，其中病毒性腹泻尤其难以防治。猪流行性腹泻病毒(PEDV，代号P)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV，代号T)和猪轮状病毒(RV，代号R)是引起猪病毒性腹泻的主要病毒，这三种病毒引起的猪腹泻性疾病，其临床症状相似，而且往往在同一个猪场混合感染的情况比较多。因此，为了及时预防和治疗猪病毒性腹泻，需要快速鉴别诊断猪病毒性腹泻的特异方法，即需要快速检测相关病毒及其特异抗体。目前，实验室检测这三种病毒的方法有：(1)病毒分离与鉴定，即取新鲜腹泻粪便或肠内容物，处理成无菌病料，接种适合的细胞系分离培养相应病毒，然后用酶或荧光标记的抗体或者标准阳性血清鉴定病毒，也可以用免疫电镜方法检查病毒；(2)取新鲜腹泻粪便或肠内容物，制成涂片或冰冻切片，用荧光抗体检测其中的病毒抗原；(3)用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病料中的病毒核酸。其中，还可用酶联免疫吸附试验(ELISA)中的双抗体夹心法检测粪便中的TGEV。病毒分离与鉴定、RT-PCR技术，都需要实验室条件和专业人员，操作过程繁琐，检测费时、费力；ELISA和荧光抗体检测法，分别需要酶标仪和荧光显微镜，也需要较多的操作步骤和经验；而且，这些方法一次只能检测一种猪病的病毒抗原。可见，上述方法尽管检测特异或敏感，但操作不够简便与快速，均不适合基层或现场快速检测或诊断。因此，研究一种简便而快速、一步可以检测这三种猪病病毒抗原的实时在线检测技术，非常重要而迫切。
三、发明内容：
本发明的目的是为了克服现有技术中检测猪病病原存在的缺点，提供一种特异性强、敏感性高、简便、快速的一步可以检测三种猪病毒性腹泻疾病病原中至少一种的免疫试纸条。
要解决上述问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，该试纸条含有支撑层和吸附层，支撑层为不吸水的薄片层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹；所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV、抗猪流行性腹泻病毒PEDV和抗猪轮状病毒RV单克隆抗体中的任一种或任两种或三种，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗体液中对应的任一种或任两种或三种印制，对照印迹用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗体中的任一种或任两种或三种，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV单克隆抗体液中对应的任一种或任两种或三种印制，对照印迹用羊抗或兔抗猪的IgG溶液印制。
所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种单克隆抗体的混合液，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三种多克隆抗体液印制，对照印迹用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种多克隆抗体的混合液，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三种单克隆抗体液印制，对照印迹用羊抗或兔抗猪的IgG溶液印制。
所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的单克隆抗体液印制为用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的单克隆抗体的IgG溶液印制；所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗体液印制为用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗体的IgG溶液印制。
所述支撑层用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成；所述测试端样品吸附纤维层用玻璃棉、或尼龙纤维、或聚酯纤维制成；所述吸附金标抗体纤维层用玻璃棉制成。
所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纤维素膜制成。
所述吸水材料层用吸水纸制成。
所述检测印迹和对照印迹为直线式、或斜线式、或实心圆点，所述纤维素膜层上含有一条或个检测印迹时，一条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“||”、“＝”、“//”、“\\”、“-|”、“|-”、“+”、“
”“
”“”●●、
中的任一种；纤维素膜层上含有两条或个检测印迹时，两条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“|||”、“
”、“///”、“\\\”、“●●●”、
”“
”“
”“、
”“
”“
””中的任一种；纤维素膜层上含有三条或个检测印迹时，三条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“||||”、“”、“////”、“\\\\”、“”“”“、●●●●、
”“
”中的任一种。
所述试纸条吸附层上面含有一层保护层，保护层附着在吸附层上，在测试端样品吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端样品吸附纤维层与吸附金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端样品吸附纤维层一侧0.5cm处。
根据测试要求，选择上述吸附金标抗体纤维层、检测印迹和对照印迹中对应的一种表达形式。
注明：如果吸附金标抗体纤维层吸附的是胶体金标记的抗病毒的单克隆抗体液，纤维素膜层上的检测印迹应用抗相关病毒的多克隆抗体的抗体液印制，其对照印迹用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液印制；如果吸附金标抗体纤维层吸附的是抗病毒的多克隆抗体液，纤维素膜层上的检测印迹用抗相关病毒的单克隆抗体的抗体液印制，其对照印迹用羊(或兔)抗猪的IgG溶液印制。
本发明的积极有益效果：
1、检测特异性强、敏感性高：本发明快速检测试纸条以胶体金标记高亲和力的特异性单克隆抗体或特异性多克隆抗体为基础而制成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体或多克隆抗体的特异性和结合力影响很小，并且具有较高的标记率。因此，本发明快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克相应病毒的蛋白。
2、操作简便、快速：使用本发明试纸条检测时无需附加任何其它仪器和试剂，只需将其测试端插入待检的澄清样品液中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测结果。
3、检测得到的结果显示直观、准确：本发明试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上只显示一条(个)棕红色对照印迹C，表示这3种猪病病毒在被检测样品液中均未检出；在纤维素膜上显示一条(个)棕红色对照印迹C和三条(个)棕红色检测印迹T、P、R，则表示在被检测样品液中检出这3种猪病病毒；在纤维素膜上显示一条(个)棕红色对照印迹和三条(个)棕红色检测印迹T、P、R中的任一条(个)或任两条(个)，则表示在被检测样品液中检测出对应的任一种或两种猪病病毒；检测结果呈阳性。结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
4、减少投资和降低检测成本：使用本发明快速检测试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；一条试纸一次可以检测3种猪病病毒(原)中的至少一种，而且专业和非专业人士均可随时随地进行实时在线检测，无需支付专家诊断检查费及其相关费用，这样以来可以节省检测成本，降低检测费用。
5、应用范围广、便于推广应用：本发明快速检测试纸条操作简单成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
四、附图说明：
图1一种一步检测猪病毒性腹泻疾病病原试纸条的侧视结构示意图
图2一种一步检测猪病毒性腹泻疾病病原试纸条的俯视结构示意图
五、具体实施方式：
以下实施例仅为了进一步说明本发明，并不限制本发明的内容。
要制成一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，首先需要制备抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗体和单克隆抗体，用于制备检测印迹和吸附金标抗体纤维层；其次需要制备羊(兔)抗小鼠的IgG抗体，或者羊(兔)抗猪的IgG抗体，用于制备对照印迹。
1、羊(兔)抗小鼠的IgG抗体、或羊(兔)抗猪的IgG抗体的制备：
以饱和硫酸铵法提取小鼠或者猪血清中的IgG：取1份血清加2份PBS液(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2h，在4℃、10000r/min离心15min，弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33％，置4℃冰箱内2h，在4℃、10000r/min条件下离心15min，弃上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液(pH7.2)过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000r/min条件下离心15min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以50μg～100μg(IgG)/kg体重经皮下或肌肉注射抗体阴性健康羊或家兔3～4次，末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1：2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取羊(兔)抗小鼠或猪的IgG(其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于制备本发明试纸条的对照印迹。
2.抗TGEV、抗PEDV和抗RV单克隆抗体(Wi)的制备：
以50μg～100μg/只的TGEV(PEDV或RV)蛋白免疫Balb/c系小鼠三次，每次间隔15～30天；第三次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2～5×107的NSO浆细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7～1ml的40％～50％PEG4000(pH8.5～9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100μl～200μl/孔)，置于37℃5％CO2培养箱中培养。培养7～10天后，以5μg～10μg/ml的纯化TGEV(PEDV或RV)蛋白包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(OD450≥0.5)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92～98，其分泌的抗TGEV(PEDV或RV)的单克隆抗体W1(W2或W3)特异地与TGEV(PEDV或RV)反应，而不与其它猪病病毒发生交叉反应，亲和力常数达109～10，轻链亚型为K或λ，重链亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3；抗这3种病毒的单克隆抗体，用于制备金标单克隆抗体或检测印迹。
3.抗TGEV、抗PEDV和抗RV金标单克隆抗体(Wi)和金标单抗玻璃棉的制备：
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶：即在50～100ml沸腾的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5～9.5，以1:1000～1300的标记比将待标记的抗TGEV(PEDV或RV)的单克隆抗体W1(W2或W3)加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至最终浓度为0.05％，4℃、1500～3000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000r/min离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，分别获得胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV的单克隆抗体。将1:100～500稀释的胶体金标记单克隆抗体中的任一种、任两种或三种吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备金标单克隆抗体玻璃棉。
4.抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗体(Xi)的制备，金标多克隆抗体和金标多克隆抗体玻璃棉的制备：
分别采用国家批准的上述三种猪病的灭活疫苗或弱毒疫苗，多次免疫接种抗体阴性健康猪。末次免疫20天后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述)。
TGEV(代号T)、PEDV(代号P)和RV(代号R)金标多克隆抗体及其金标多克隆抗体玻璃棉的制备，与具体实施方式3的方法相同，不再重述。
5.本发明快速检测试纸条实施检测的原理：
当本发明快速检测试纸条测试端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检猪病病毒及金标抗体玻璃棉(吸附金标抗体纤维层)中的金标抗体(单抗或多抗)一起向硝酸纤维素膜(纤维素膜层)扩散，并最终渗入手柄端滤纸(吸水材料层)中，扩散过程中待检猪病病毒可与该病毒相应的金标抗体相结合，进而与纤维素膜上抗该病毒的抗体(多抗或单抗)检测印迹结合，从而显示出1～3条(个)棕红色的检测印迹T、P、R；而羊(兔)抗小鼠的IgG、或羊(兔)抗猪的IgG则可与相应的金标单抗或多抗结合，形成1条(个)棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有TGEV、PEDV、RV这3种猪病病毒，试纸条只显示出一条(个)棕红色对照印迹C；样品溶液中含有TGEV(或PEDV、或RV)，则分别与其金标抗体结合，再与纤维素膜上的抗该病毒的抗体检测印迹T(P或R)结合，显示棕红色检测印迹，为阳性标记；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。
6.本发明快速检测试纸条的检测操作方法：
(1)检测样品液的制备：无菌取病猪新鲜腹泻粪便或小肠内容物，用生理盐水配成1:2～5的悬液，置4℃澄清或3000r/min离心20分钟，取上清液待检。
(2)检测操作：将本发明快速检测试纸条测试端插入待检测样品澄清液中，插入深度不超过标记线9，约30秒后取出试纸条，水平放置约1～5分钟，同时观察结果。
(3)结果判断：如果在检测试纸条纤维素膜上只显示出一条(个)棕红色对照印迹C，表示检测结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出TGEV、PEDV和RV；如果检测试纸条上的纤维素膜出现棕红色的对照印迹C和检测印迹T或P或R，表示检测结果呈阳性，即在待检样品中检测出TGEV、或PEDV、或RV；如果检测印迹T、P、R同时出现，表示在待检样品中检测出TGEV、PEDV、RV这3种猪病病毒；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。
实施例一：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条
参见图1和图2，图中1为支撑层，用硬质塑胶薄片条制成，2为测试端的样品吸附纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附金标抗体纤维层，吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种单克隆抗体的玻璃棉，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉，4为纤维素膜层，采用硝酸纤维素膜制成，5为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层从左端测试端至右粘贴在硬质塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹T、P、R，7为用羊或兔抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹C，检测印迹和对照印迹为直线式、或斜线式、或实心圆点，两种印迹带排列形成的组合形式为“||||”、“”、“////”、“\\\\”、“”“”“、●●●●、
”“
”中的任一种。8—1为覆盖在测试端样品吸附纤维层2和吸附金标抗体纤维层3上面的白色保护膜，在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏向于样品吸附纤维层2一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水材料层5(手柄端)上覆盖有其它颜色(如黄色)保护膜8-2。
待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例二：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例一基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种多克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹T、P、R“|”，7为用羊(或兔)抗猪的IgG溶液印制的对照印迹C“|”，两种印迹平行排列组合为“||||”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例三：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例一基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗TGEV单克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉，6为用抗TGEV的多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹T，7为用羊或兔抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹C，检测印迹和对照印迹为直线式、或斜线式、或实心圆点，两种印迹带排列的组合形式为“||”、“＝”、“//”、“\\”、“-|”、“|-”、“+”、“
”“
”“、●●”、
中的任一种。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例四：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例三基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗TGEV多克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉，6为用抗TGEV的单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹线“|”T，7为用羊或兔抗猪的IgG溶液印制的对照印迹线“|”C，两种印迹线平行排列组合为“||”。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例五：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例三基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗PEDV单克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉，6为用抗PEDV的多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹P，7为用羊或兔抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹线平行排列组合为“●●”。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例六：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例五基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗PEDV多克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉，6为用抗PEDV的单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹P，7为用羊或兔抗猪的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹线平行排列组合为“//”。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例七：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例三基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗RV单克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉，6为用抗RV的多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹R，7为用羊或兔抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹C。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例八：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例七基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗RV多克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉，6为用抗RV的单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹R，7为用羊或兔抗猪的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹线平行排列组合为“\\”。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，与具体实施方式6中的检测操作方法相同，不再重述。
实施例九：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例一基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3为吸附有胶体金标记的抗TGEV和抗PEDV的多克隆抗体的玻璃棉，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗TGEV和抗PEDV的单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹T、P，7为用羊(或兔)抗猪的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹排列组合的形式为“|||”、“
”、“///”、“\\\”、“●●●”、
中的任一种。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例十：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例九基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3为吸附有胶体金标记的抗TGEV和抗PEDV的单克隆抗体的玻璃棉，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗TGEV和抗PEDV的多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹“|”T、P，7为用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹“|”C，两种印迹平行排列组合为“|||”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例十一：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例九基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗TGEV和抗RV多克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗TGEV和抗RV的单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹T、R，7为用羊(或兔)抗猪的IgG溶液印制的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例十二：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例十一基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗TGEV和抗RV的单克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗TGEV和抗RV的多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹T、R，7为用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹平行排列组合为“///”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例十三：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例九基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3为吸附有胶体金标记的抗PEDV和抗RV的单克隆抗体的玻璃棉，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标单克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗PEDV和抗RV的多克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹P、R，7为用羊(或兔)抗小鼠的IgG溶液印制的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例十四：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例十三基本相同，不同之处在于：
吸附金标抗体纤维层3用吸附有胶体金标记的抗PEDV和抗RV的多克隆抗体的玻璃棉制成，根据上述具体实施方式3中所述的制备方法制备其金标多克隆抗体玻璃棉；在硝酸纤维素膜层4上，6为分别用抗PEDV和抗RV的单克隆抗体的IgG溶液印制的检测印迹P、R，7为用羊(或兔)抗猪的IgG溶液印制的对照印迹C，两种印迹平行排列组合为“\\\”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与具体实施方式6中的操作方法相同，不再重述。
实施例十五：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例一基本相同，不同之处在于：
支撑层1用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜制成；检测印迹和对照印迹平行排列为“////”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的操作方法，不再重述。
实施例十六：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例三基本相同，不同之处在于：
支撑层1用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2用聚酯纤维制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜制成；检测印迹和对照印迹平行排列为“\\”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的检测操作方法，不再重述。
实施例十七：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，同实施例五基本相同，不同之处在于：
支撑层1用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯纤维素膜制成；检测印迹和对照印迹平行排列为“||”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的操作方法，不再重述。
实施例十八：一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，与实施例十一基本相同，不同之处在于：
支撑层1用不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2用聚酯纤维制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜制成，检测印迹和对照印迹平行排列为“●●●”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式6中的检测操作方法，不再重述。
Claims (8)
1.一种一步检测猪病毒性腹泻疾病病原的试纸条，该试纸条含有支撑层和吸附层，支撑层为不吸水的薄片层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，其特征是：所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗猪传染性胃肠炎病毒TGEV、抗猪流行性腹泻病毒PEDV和抗猪轮状病毒RV单克隆抗体中的任一种或任两种或三种，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗体液中对应的任一种或任两种或三种印制，对照印迹用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV多克隆抗体中的任一种或任两种或三种，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV单克隆抗体液中对应的任一种或任两种或三种印制，对照印迹用羊抗或兔抗猪的IgG溶液印制。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种单克隆抗体的混合液，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三种多克隆抗体液印制，对照印迹用羊抗或兔抗小鼠的IgG溶液印制；或者，所述吸附金标抗体纤维层吸附有胶体金标记的抗TGEV、抗PEDV和抗RV三种多克隆抗体的混合液，所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的三种单克隆抗体液印制，对照印迹用羊抗或兔抗猪的IgG溶液印制。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是：所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的单克隆抗体液印制为用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的单克隆抗体的IgG溶液印制；所述检测印迹用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗体液印制为用抗TGEV、抗PEDV和抗RV的多克隆抗体的IgG溶液印制。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述支撑层用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成；所述测试端样品吸附纤维层用玻璃棉、或尼龙纤维、或聚酯纤维制成；所述吸附金标抗体纤维层用玻璃棉制成。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层用硝酸纤维 素膜、或纯纤维素膜、或羧化纤维素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纤维素膜制成。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述吸水材料层用吸水纸制成。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述检测印迹和对照印迹为直线式、或斜线式、或实心圆点，所述纤维素膜层上含有一条或个检测印迹时，一条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“||”、“＝”、“//”、“\\”、“-|”、“|-”、“+”、 
“●●”、
中的任一种；纤维素膜层上含有两条或个检测印迹时，两条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“|||”、
“///”、“\\\”、“●●●”、 
中的任一种；纤维素膜层上含有三条或个检测印迹时，三条或个检测印迹和对照印迹的排列形式为“||||”、“////”、“\\\\”、
“●●●●”、 
中的任一种。
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述试纸条吸附层上面含有一层保护层，保护层附着在吸附层上，在测试端样品吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端样品吸附纤维层与吸附金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端样品吸附纤维层一侧0.5cm处。
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