CN103217527B - 马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒快速联检试纸条 - Google Patents

Abstract

发明公开一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成；纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗MDV和抗REV的抗体检测印迹；所述抗MDV和抗REV的抗体为抗MDV和抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗REV的混合多克隆抗体或单克隆抗体。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便，检测快速，结果直观，适用于MDV和REV病毒的现场快速联合检测，亦可用于两种病毒的单独感染或混合感染的鉴别诊断。该试纸条应用范围广，便于推广应用。

Description

马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒快速联检试纸条

技术领域

本发明涉及一种检测马立克氏病和禽网状内皮组织增生病的器具，特别是涉及一种一步法快速检测马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的联检胶体金试纸条。

技术背景

马立克氏病（Marek’s disease，MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起的一种禽类高度接触性、传染性、淋巴组织增生性肿瘤病，主要危害鸡，鹌鹑、山鸡也有发病。该病可引起内脏器官、肌肉和外周神经的淋巴细胞瘤的神经肿大。临床上MD发病鸡群表现为生长不均匀、极度消瘦、死亡等症状，最常见的病变是神经损害和多种实质脏器的淋巴肿瘤，以肝脏、脾脏肿瘤最为多见，因神经损害导致的不对称性进行性麻痹, 最终可引起单个或多个肢体的完全性麻痹。MDV属于疱疹病毒科，有三种不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原, 也含有特异性抗原。I 型MDV感染能引起肿瘤，II 型和III 型MDV毒株无致病性，可用于疫苗株。

禽网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis，RE）是由禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其他禽类以网状细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生病、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。REV属于反转录病毒科, 是另外一种可引起禽类肿瘤的病毒，虽然不同毒株的致病力不太相同，但都具有相似的抗原性，即属于同一血清型。RE是禽类最重要的免疫抑制性和肿瘤性疾病之一。

作为能诱发禽类肿瘤及免疫抑制疾病最重要的两种病毒， MDV和REV已在世界范围内对养禽业造成了巨大损失。近年来，免疫抑制性病毒共感染的报道越来越多, 不同临床症状的鸡群中MDV和REV共感染的现象已经相当普遍，在疑似MD肿瘤的病例中，至少有三分之一的病例可以同时分离到MDV和REV。MDV和REV单独感染鸡均可导致肿瘤病变, 二者协同作用会导致更加明显的肿瘤病变。尽管MDV和REV诱导产生淋巴瘤的机制不同, 但肿瘤在组织脏器的分布却非常相似。此外，国外已有多项研究证实，MDV和REV在CEF细胞共培养数代后会发生体外重组。更加令人担忧的是，我国学者已从发病鸡群中分离到含有REV病毒基因组片段的MDV自然重组毒株，这种重组增加了MDV在感染鸡群中的水平传播能力。

由于临床症状和剖检病变非常相似, 再加上MDV和REV的共感染普遍存在，增加了这两种家禽病毒性肿瘤病的临床诊断尤其是鉴别诊断的难度，一些传统的诊断方法很难将其准确、快速地区分开来, 给临床诊断及防制工作带来了困难。目前，临床上最常用鉴别诊断方法是病毒分离培养、血清学检测、分子生物学方法等。病毒分离鉴定不但对临床诊断很有价值，对流行病学及病原学研究亦至关重要，但该方法检测周期长，约需 1～2个月，同时细胞培养的操作要求高，局限性较大。血清学方法如ELISA等主要用于检测羽毛囊上皮、溶细胞感染的淋巴细胞组织及细胞培养物等样品。此类方法检测成本相对较高，并且由于部分病例中的REV感染呈“一过性”特征、病毒血症时间较短，病毒含量低，导致检出率较低。分子生物学方法如PCR、荧光定量PCR 和LAMP 等技术主要是用于病毒核酸的检测，这些技术虽然能比较准确的鉴别诊断MDV和REV，但操作复杂，需要特定的试剂及昂贵的仪器设备，操作要求高，难以适合生产一线或疫病现场快速鉴别诊断的需要。因此，急需研究一种快速鉴别检测MDV和REV的新技术，这对于MD和RE的有效防控具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种简便、准确、结果直观、肉眼可判的一步法快速检测马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的试纸条，该试纸条特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、成本低廉，并且可以同时检测两种病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有抗羊IgG或抗小鼠IgG的对照印迹，以及分别含有MDV抗体和REV抗体的检测印迹，所述MDV抗体和REV抗体分别为抗MDV和抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV和抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。

所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。

所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成；所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。

在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7 cm处印制有样品标记线，检测印迹与对照印迹的排列组合为“︱︱︱”、“ / / / ”、“＋＋＋”、“┴┴┴”、“┬┬┬”、“├├├”中的一种。

所述胶体金标记的抗MDV和抗REV的单克隆抗体是通过以下方法制备的：

将筛选获得的抗MDV和抗REV的单克隆细胞株分别进行扩大培养，用PBS洗涤2遍后1000 r/min离心10 min，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个细胞的量分别对经产母鼠进行腹腔注射，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，分别获得抗MDV和抗REV的单克隆抗体腹水；

用柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100 mL沸腾的0.01%～0.05%（wt）氯金酸水溶液中加入2～4 mL的0.5～2 %（wt）柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15～20 nm的胶体金溶胶；以0.1mol/L的K₂CO₃溶液调节胶体金溶胶的pH值至8.5～9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将所述抗MDV的单克隆抗体腹水或抗REV的单克隆抗体腹水分别加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加20 %（wt）的PEG-10000至PEG-10000的终浓度为0.05 %（wt），4℃下、1500～3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，在4℃、15000 r/min条件下离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分别分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗MDV单抗和抗REV单抗。

所述抗MDV和抗REV的单克隆抗体细胞株是由以下方法分别制备的：

分别用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的重组质粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重组质粒PET-28a-gp90，转化大肠杆菌BL-21并挑选阳性克隆菌株；摇菌培养后用IPTG诱导蛋白表达，菌液上清经超声波裂解后过镍柱纯化，分别得到纯化的MDV gB表达蛋白和REV gp90表达蛋白；

将纯化的gB表达蛋白和gp90表达蛋白分别以20～30 μg/只的剂量用福氏佐剂乳化，制备免疫原免疫6周龄Balb/c系小鼠两组，每组免疫三次，每次间隔15～30 d；最后一次加强免疫后3～4 d，分别将两组免疫鼠眼球放血，拉颈处死后置于75%（v）的酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌摘取免疫鼠的脾脏，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将每组收集的免疫鼠的1×10⁸个脾细胞分别与2×10⁷～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬稀释至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清，分别将两种混合细胞沉淀置于37℃水浴中，在1 min内分别缓缓加入0.7～1.0 mL pH值为8.5～9.0的PEG-1500，边加边轻轻摇晃，然后再分别缓慢加入GNK 洗液15 ml，37℃水浴5 min，最后补足GNK洗液至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清；将两种细胞沉淀分别重悬于1640/HAT选择培养基中，最后以200 µL/孔分别铺板至96孔培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7~10 d，杂交瘤的培养上清分别用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，分别用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后分别筛选获得特异性抗MDV和抗REV的单抗杂交瘤细胞株。

所述GNK 洗液是由以下方法制备的：称取NaCl 24 g、KCl 1.2 g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.68 g、NaH₂PO₄·2H₂O 2.34 g、葡萄糖 6 g、苯酚红0.03 g，混合后加双蒸水至3000 ml，115℃灭菌15 min。

本发明的有益效果：

（1）本发明根据ELISA的基本原理，用免疫层析试纸检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原-抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况，即时获得检测结果，因此该方法比ELISA等血清学方法更为简便、快速。

（2）检测特异性强，敏感性高。该检测试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗或多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗或多抗特异性和亲和力（结合力）影响很小，且具有较高的印迹率。

（3）操作简便，快速。使用本发明的试纸条时，可以一次同时进行MDV和REV病毒的快速检测，大大节省检测时间和检测费用，提高了工作效率。使用时只需将测试端插入待检样品液中30 s左右，在1～5 min内即可判定检测结果。

（4）结果显示直观、准确。试纸条以显示两条棕红色的检测印迹T1和T2以及一条对照印迹C作为检测的阳性和质控印迹，即在纤维素膜上显示三条棕红色印迹T1、T2和C，表示MDV和REV均在被检测样品液中被检出，结果为双阳性；在纤维素膜上显示一条棕红色的检测印迹T1或T2以及一条对照印迹C，表示只有相对应的MDV或REV的一种病毒在被检测样品液中被检出，结果为单阳性；在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C，表示两种病毒均在被检测样品液中未检出，结果为阴性。结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性的误判。

（5）减少投资和检测成本。使用该试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用，专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本。使用该试纸条检测每份样品仅需人民币3～5元，比用通常的仪器分析（每份样品300元左右）和进口ELISA试剂盒（每份样品30元左右）的检测费大幅下降。

（6）应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，成“一步式”或“傻瓜式”操作，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖和个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。

附图说明

图1为本发明试纸条的俯视结构示意图。

图2为图1试纸条的侧面结构示意图。

图中，1为支撑层，2为样品吸附纤维层，3为金标抗体纤维层，4为纤维素膜层，5为吸水层，6-1为MDV检测印迹，6-2为REV检测印迹，7为对照印迹，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为印迹线。

具体实施方式

实施例 1 ：一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，参见图1、图2。支撑层1以塑胶薄片条制成，样品吸附纤维层2以玻璃棉制成，金标抗体纤维层3为附着有胶体金标记的抗MDV、抗REV的两种单克隆抗体的玻璃棉制成的混合金标抗体，纤维素膜层4为硝酸纤维素制成，吸水层5由吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5各层依次粘贴在支撑层1上，彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有抗MDV和抗REV的两种多克隆抗体IgG溶液分别标记的MDV检测印迹6-1和REV检测印迹6-2（代号分别为T1和T2），以及以羊（或兔）抗小鼠IgG溶液标记的对照印迹7（代号C）；两检测印迹与对照印迹的排列形式为“｜｜｜”。测试端保护膜8-1覆盖在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面，为白色；测试端保护膜8-1上偏向于样品吸附纤维层2的一侧0.5 cm处印有印迹线9，印迹线9的右端印有箭头及MAX字样，吸水层5上覆盖有其它颜色（如黄色或蓝色）的手柄端保护膜8-2。

用于对照印迹的羊（或兔）抗小鼠IgG 抗体，及用于检测印迹和金标抗体纤维层的抗MDV和抗REV的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下：

（1）羊（或兔）抗小鼠IgG的制备

以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG：取1份血清加2份PBS液（pH 7.2）混匀，再加等体积的饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2 h，在4℃、10000 r/min离心15 min，弃上清液；以适量PBS液（pH7.2）溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33%，置4℃冰箱内2 h，在4℃、10000 r/min条件下离心15 min，弃上清液，以少量PBS液（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液（pH7.2）过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000 r/min条件下离心15 min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。按 50 μg/kg～100 μg/kg体重的剂量经皮下或肌肉注射纯化的IgG抗体至阴性健康羊或家兔3～4次，末次免疫20 d后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，分离制备高免血清。以饱和硫酸铵法提取羊（或兔）抗小鼠的IgG（其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述），用于标记本发明试纸条的对照印迹。

（2）抗MDV和抗REV单克隆抗体细胞株的制备

分别用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的PET-28a-gB重组质粒和REV囊膜糖蛋白gp90的PET-28a-gp90重组质粒，转化大肠杆菌BL-21，挑取两种阳性克隆菌株，分别接种于5 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取5 mL 培养物转接于100 mL LB液体培养基中，37℃培养约3 h，达到对数生长期，即OD₆₀₀约0.8～1.2，按照每毫升培养基加入10 μL、100 mmol/L的IPTG至终浓度为1.0 mmol/L分别进行诱导表达，28℃条件下缓慢振荡培养4～5 h。在4℃、5000 r/min条件下分别离心15～20 min，弃上清，按1 g湿重菌体/2～5 ml平衡缓冲液的比例充分悬浮菌体沉淀。用超声波裂解仪分别裂解两种菌体，直至云雾状的菌液变得比较清亮，4℃、15000 rpm离心15 min，分别收集上清液备用。

将两种上清液分别上样至用平衡缓冲液（NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑5 mmol/L，pH 8.0）平衡的镍离子亲和层析柱，再依次分别用含30 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲液（NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L，pH7.4）进行分阶段洗脱，分别收集两种蛋白的各阶段洗脱液。将两种各阶段洗脱峰分别进行SDS-PAGE分析，电泳完毕后用考马斯亮蓝G2250（甲醇∶水∶冰乙酸 = 4. 5∶4. 5∶1）室温染色2 h，用脱色液（40%甲醇、10%冰乙酸）脱色至背景清晰，观察结果表明：两种重组菌经IPTG 诱导后均有明显的与各自预期大小相符的目的蛋白条带，说明MDV的gB蛋白和REV的gp90蛋白在E. coli中均获得了大量表达，经亲和层析的重复洗脱液中，两种蛋白均在前两次的洗脱液中含量较大，此后洗脱液中含量迅速减少，电泳与浓度测定结果一致，表明各自洗脱液中的gB表达蛋白和gp90表达蛋白纯度较高，可满足两种单抗制备免疫原的需要。

将纯化gB表达蛋白和gp90表达蛋白分别以20～30 μg/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠两组，每组免疫三次，每次间隔15-30 d；最后一次加强免疫后3～4 d，分别将gB蛋白和gp90蛋白免疫鼠眼球放血，拉颈处死，于75%（v）的酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌分别摘取两组免疫鼠的脾脏，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液（NaCl 24g、KCl 1.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.68 g、NaH₂PO₄·2H₂O 2.34 g、葡萄糖 6 g、苯酚红0.03 g，混合后加双蒸水至3000 ml，115℃灭菌15 min）混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将各自收集的两种免疫鼠的1×10⁸个脾细胞与2×10⁷～5×10⁷个的NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬稀释至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min，弃上清，分别将两种混合的细胞沉淀置于37℃水浴中，在1 min内缓缓加入0.7～1.0 mL的PEG-1500（pH 8.5～9.0），边加边轻轻摇动，然后再分别缓慢加入GNK 洗液15 ml，37℃水浴5 min后补加GNK 洗液至总体积为40 ml，1000 r/min离心10 min 弃上清，将两种细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，最后以200 µL/孔分别铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7～10 d，用间接免疫荧光试验分别检测细胞培养上清，挑选荧光较强的细胞克隆，分别用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后分别筛选获得特异性抗MDV和抗REV的单抗杂交瘤细胞株。

（3）抗MDV和抗REV金标单克隆抗体和金标单克隆抗体纤维膜的制备

将筛选获得的抗MDV和抗REV的单克隆细胞株分别进行扩大培养，用PBS洗涤2遍后1000 r/min离心10 min，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个细胞量分别对经产母鼠（母鼠至少一周前腹腔注射灭菌弗氏不完全佐剂）进行腹腔注射，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，分别获得抗MDV和抗REV的单克隆抗体腹水。

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～100 mL沸腾的0.01%～0.05%（wt）氯金酸水溶液中加入2～4 mL的0.5%～2%（wt）柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径15 nm 左右的胶体金。以0.1 mol/L的K₂CO₃溶液调胶体金的pH值至8.5～9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将待印迹的抗MDV和抗REV的单抗腹水分别加入pH8.5～9.5 的金溶胶中，印迹10 min后，加20%（wt）的PEG-10000至PEG-10000终浓度达到0.05%，4℃、1500～3000 r/min条件下分别离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000 r/min条件下再次分别离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分别分离纯化金标蛋白，获得胶体金印迹的抗MDV单抗和抗REV单抗。将1:100～1:500稀释的胶体金印迹的上述两种单克隆抗体分别吸附于精制玻璃棉（尼龙纤维或聚酯纤维）中，4℃下低温真空干燥，即分别制得抗MDV和抗REV的金标单克隆抗体纤维膜。

（4）抗MDV和抗REV的多克隆抗体的制备

用差速离心或蔗糖密度梯度离心的方法分别对MDV CEF细胞毒和REV CEF细胞毒进行浓缩、纯化，甲醛灭活后用福氏佐剂乳化，分别制备免疫原，单独多次分别免疫接种抗体阴性健康羊或兔两组。末次免疫20 d后静脉采血，分别以IFA 检测两组免疫动物血清中抗MDV和抗REV的抗体水平，效价达到1:2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，分别分离制备抗MDV和抗REV的高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体（方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述）。

（5）试纸条的检测操作方法

a、检测样品液的制备 采集病例鸡的全血，以抗凝剂生理盐水作1:10～1:50 倍稀释，低速离心分离血液淋巴细胞悬液待检；若取病鸡的组织（如羽髓、肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊等）则将其剪碎、研磨，以生理盐水制成1:2～1:5的待检测样品悬液，置4℃澄清或离心收集上清液备用。

b、检测操作 将试纸条测试端插入待检测样品上清中，插入深度不超过印迹线（MAX），约30 s后取出试纸条，水平放置约1～5 min，同时观察结果。

c、结果判断 如果在试纸条纤维素膜上只显示出一条棕红色对照印迹C，表示检测结果呈阴性，说明在被检样品液中MDV和REV均未检测出；如果检测试纸条上的纤维素膜上出现棕红色的对照印迹C和两条检测印迹T1和T2，表示检测结果呈双阳性，即在待检样品中同时检测出MDV和REV；如果检测试纸条上的纤维素膜上出现棕红色的对照印迹C和一条检测印迹T1或T2，表示检测结果呈单阳性，即在待检样品中检测出MDV或REV；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。

（6）本发明试纸条的灵敏性、特异性试验

a、灵敏性试验。将MDV的CEF细胞培养液用PBS（PH7.4）或双蒸水分别配制成不同病毒滴度的病毒溶液（100 PFU/mL、50 PFU/mL、25 PFU/mL、12.5 PFU/mL），将REV的CEF细胞培养液用PBS（PH7.4）或双蒸水分别配制不同病毒滴度的溶液（10^5.0 TCID₅₀/mL、10^4.0 TCID₅₀/mL、10^3.0 TCID₅₀/mL、10^2.0 TCID₅₀/mL、10^1.0 TCID₅₀/mL），两种病毒液按1:1的比例混合均匀，将试纸条测试端插入混合病毒液中，插入深度不超过印迹线（MAX），约30 s后取出试纸条，水平放置约1～5 min，同时观察结果。插入MDV 的100 PFU/mL、50PFU/mL和REV 的10^5.0 TCID₅₀/mL、10^4.0 TCID₅₀/mL两种混合病毒液中的试纸条均出现棕红色的对照印迹C和两条检测印迹T1和T2，即检测结果为双阳性；插入MDV 25 PFU/mL和REV 10^3.0 TCID₅₀/mL的混合病毒液中的试纸条出现棕红色的对照印迹C，但检测印迹T1和T2的棕红色均较弱，即检测结果为双弱阳性；插入MDV 12.5 PFU/mL和REV 10^2.0 TCID₅₀/mL的混合病毒液的试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C，即检测结果为阴性。由此可见，该试纸条对MDV和REV均具有较高的灵敏度，检测MDV和REV的最低病毒滴度分别为25 PFU/mL和10^3.0 TCID₅₀/mL。

b、特异性试验。用本发明的试纸条检测其他家禽免疫抑制病病毒如禽白血病病毒（ALV）和鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的病毒培养液，结果显示该试纸条的检测结果均为双阴性，说明该试纸条用于检测MDV和REV具有良好的特异性，可用于MD和RE的快速检测。

（7）上述试纸条的测试原理

当该试纸条测试端（样品吸附带）插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带动待检病鸡病料中的MDV和/或REV病毒粒子及金标抗体纤维膜中的金标MDV和REV抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端吸水层中，扩散过程中待检MDV和/或REV可与相对应的金标单抗相结合，进而与纤维素膜上检测印迹中的抗MDV和/或抗REV的多抗IgG结合，从而显示出棕红色的检测印迹T1和/或T2；而对照印迹中的羊或（兔）抗小鼠IgG则可与金标MDV单抗和金标REV单抗结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有MDV和REV，试纸条只显示出一条棕红色对照印迹C；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。

实施例 2 ：马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的快速检测试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着以胶体金标记的抗MDV和抗REV的混合金标多克隆抗体；在硝酸纤维素制成的纤维素膜层4上分别设有以抗MDV和抗REV单克隆抗体IgG 溶液喷涂的检测印迹T1和T2，以羊（兔）抗小鼠IgG溶液喷涂的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同，不重述。

实施例 3 ：马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的快速检测试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于：由聚酯纤维制成的金标抗体纤维层3上附着有抗MDV和抗REV的混合金标单克隆抗体；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上分别设有以抗MDV和抗REV多克隆抗体IgG溶液喷涂的检测印迹T1和T2，以羊（兔）抗小鼠IgG溶液喷涂的对照印迹C。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。

实施例 4 ：马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的快速检测试纸条，与实施例3基本相同，不同之处在于：

由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着抗MDV和抗REV的混合金标多克隆抗体；聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上分别设有以抗MDV和抗REV单克隆抗体IgG溶液喷涂的检测印迹T1和T2，以羊（兔）抗小鼠IgG溶液喷涂的对照印迹C。

实施例 5 ：马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒的快速检测试纸条，与实施例3基本相同，不同之处在于：

由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着有抗MDV和抗REV的混合金标单克隆抗体；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上分别设有识别另一表位的抗MDV和抗REV单克隆抗体IgG溶液喷涂的检测印迹T1和T2，以羊（兔）抗鼠IgG溶液标记出对照印迹C，检测印迹与对照印迹的排列组合为“/ / /”、“＋＋＋”、“┴┴┴”、“┬ ┬ ┬”、“├├├”中的任意一种。

实施例 6 ：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：

支撑层1由不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2由尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜制成。

实施例 7 ：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：

样品吸附纤维层2由聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4为羧化纤维素膜制成。

实施例 8 ：试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯（PVDF）纤维膜制成。

实施例 9 ：纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于：

样品吸附纤维层2采用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。

Claims (8)

1.一种一步法快速检测马立克氏病病毒MDV和禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于：所述纤维素膜层上标记有羊抗鼠IgG的对照印迹，以及标记的抗MDV抗体、抗REV抗体的检测印迹，所述抗MDV抗体、抗REV抗体为抗MDV、抗REV的多克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗MDV gB蛋白和抗REVgp90蛋白的单克隆抗体；

所述胶体金标记的抗MDV gB蛋白或抗REV gp90蛋白的单克隆抗体是通过以下方法制备的：

将筛选获得的抗MDV gB蛋白或抗REV gp90蛋白的单克隆抗体细胞株分别进行扩大培养，用PBS洗涤2遍后1000r/min离心10min，收集细胞，以每只1×10⁶～2×10⁶个的细胞量分别对经产母鼠进行腹腔注射，10～20d后采集小鼠腹水，4000r/min离心10min后取上清，分别获得抗MDV gB蛋白或抗REV gp90蛋白的单克隆抗体腹水；

用柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100mL沸腾的0.01％～0.05％(wt)氯金酸水溶液中加入2～4mL的0.5～2％(wt)柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15～20nm的胶体金溶胶；以0.1mol/L的K₂CO₃溶液调节胶体金溶胶的pH值至8.5～9.5，以1∶1000～1∶1300的印迹比将抗MDV gB蛋白或抗REV gp90蛋白的单克隆抗体腹水分别加入胶体金溶胶中，印迹10min后，加20％(wt)的PEG-10000至PEG-10000的终浓度为0.05％(wt)，4℃下、1500～3000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，在4℃下、15000r/min再次分别离心1h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400 柱层析，分别分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗MDV gB蛋白或抗REVgp90蛋白的单克隆抗体；

所述抗MDV gB蛋白或抗REVgp 90蛋白的单克隆抗体细胞株是由以下方法分别制备的：

分别用原核表达MDV囊膜糖蛋白gB的重组质粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重组质粒PET-28a-gp90转化大肠杆菌BL-21，挑选阳性克隆菌株；摇菌培养后用IPTG诱导蛋白表达，菌液上清经超声波裂解后过镍柱纯化，分别得到纯化的MDVgB表达蛋白和REV gp90表达蛋白；

将纯化的MDVgB表达蛋白和REV gp90表达蛋白分别以20～30μg/只的剂量用福氏佐剂乳化，制备免疫原免疫6周龄Balb/c系小鼠两组，每组免疫三次，每次间隔15～30d；最后一次加强免疫后3～4d，分别将两组免疫鼠眼球放血，拉颈处死后置于75％(v)的酒精溶液中浸泡5～10min，无菌摘取免疫鼠的脾脏，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK洗液混悬脾细胞，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将每组收集的免疫鼠的1×10⁸个脾细胞分别与2×10⁷～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK洗液混悬稀释至总体积为40ml，1000r/min离心10min，弃上清，分别将两种混合细胞沉淀置于37℃水浴中，在1min内分别缓缓加入0.7～1.0mLpH值为8.5～9.0的PEG-1500，边加边轻轻摇晃，然后再分别缓慢加入GNK洗液15ml，37℃水浴5min，最后补足GNK洗液至总体积为40ml，1000r/min离心10min，弃上清；将两种细胞沉淀分别重悬于1640/HAT选择培养基中，最后以200μL/孔分别铺板至96孔培养板，置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养7～10d，将杂交瘤的培养上清分别用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，分别用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后分别筛选获得特异性的抗MDV gB蛋白或抗REV gp90蛋白的单抗杂交瘤 细胞株；

抗MDV和抗REV的多克隆抗体的制备：

用差速离心或蔗糖密度梯度离心的方法分别对MDV CEF细胞毒和REV CEF细胞毒进行浓缩、纯化，甲醛灭活后用福氏佐剂乳化，分别制备免疫原，单独多次分别免疫接种抗体阴性健康羊或兔两组；末次免疫20d后静脉采血，分别以IFA检测两组免疫动物血清中抗MDV和抗REV的抗体水平，效价达到1∶2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，分别分离制备抗MDV和抗REV的高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；所述吸水层用吸水纸制成。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成。

6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7cm处印制有样品标记线。

7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：检测印迹与对照印迹的排列为“|||”、“///”、“+++”、中的一种。

8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述GNK洗液是由以下方法制备的：称取NaCl 24g、KCl 1.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 10.68g、NaH₂PO₄·2H₂O2.34g、葡萄糖6g、苯酚红0.03g，混合后加双蒸水至3000ml，115℃灭菌15min。