CN102031245B - 抗禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗禽网状内皮组织增生症病毒gp90蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明采用原核表达系统，用大肠杆菌表达的禽网状内皮组织增生症病毒gp90蛋白作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到一株稳定分泌抗gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4143；该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能与HLJ07I毒株发生反应，而与禽类其它相关病原不发生反应。本发明单克隆抗体可用于检测禽网状内皮组织增生症病毒，为建立一种快速、简易、准确的网状内皮组织增生症病毒诊断方法及其免疫机制研究、免疫功能检测等方面提供了物质基础。

Description

抗禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及抗禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的单克隆抗体以及分泌该抗gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及单克隆抗体在建立检测有关禽网状内皮组织增生症病毒方法中的应用，属于禽网状内皮组织增生症病毒的检测领域。

背景技术

禽网状内皮组织增生症是由禽网状内皮组织增生症病毒(Retieuloendotheliosis Viruse，REV)群引起的火鸡、鸡、鸭、鹤鹑和鹅等以淋巴-网状细胞增生为特征的一组综合症(Witter R L，Fadly A M.Reticuloendoetheliosis.In Disease of Poultry，11th edn，2003，517-535.Edited by Y M Saif，H J Barnes，J R Glisson，et al.Ames，IA，USA：Iowa State Press.)，包括急性网状细胞肿瘤形成、生长抑制综合症、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤形成。REV的自然宿主有鸡、火鸡、鸭、鹅、日本鹌鹑等，其中火鸡最易感染。REV一般感染低日龄鸡，特别是新孵出的雏鸡及胚胎，感染后引起严重的免疫抑制或免疫耐受。而高日龄鸡免疫系统发育完善，感染后一般不出现或仅出现一过性病毒血症。Bagus t等研究证明，REV可以直接或间接传播(BagustT，Grimes T，Dennet D，et al.Infection studies on a reticloendotheliosiscontaminant of a commercial marek’s diseasevaccine.Aust Vet J，1979，55：153-157.)。研究结果表明，污染REV的商业禽用疫苗也是其传播的一个重要因素，通过给鸡接种REV污染的马立克氏病疫苗、禽痘疫苗，亦可引起人工传播(McDougall J，Shilleto R，Biggs P M.Experimental infection of chickens with an Australian strain ofreticuloendotheliosis virus in the turkey.Avian Pathol，1981，10：163-169；Brunovskis P，Velicer L.The Marek’s disease virus unique shortregion：alpha herpes virus homologs，fowlpox virus homologs，andMarek′s disease virus-specific genes.Virology，1995，206：324-338；Theodros T，Willie M.Detection of specific reticuloendotheliosis virussequence and protein from REV-integrated fowlpox virus strains.Journalof virological Methods，2003，110：99-104.)。另外，REV与鸡痘病毒和马立克氏病毒重组现象的发生，也必将成为造成REV临床发病率增高的一个重要因素(Kim T，Tripathy N.Reticuloendoetheliosis virusintegration in the fowl poxvirus genome：not a recent event.Avian Dis，2001，45：663-669；Cui Z，Zhuang Q，Xu X，et al.Molecular andbiological characterization of a Marek’s disease virus field strain withreticuloendotheliosis virus LTR insert.virus genes，2010，40：236-43)。

禽网状内皮组织增生症病毒属于正反转录病毒亚科γ反转录病毒属的成员，其核酸是单股正链线性RNA(ssRNA)的二聚体，即其基因组核酸是双倍体正股RNA，完全复制REV的基因组大约为8.3kb(Barbosa T，Zavala G，Cheng S，et al.Full genome sequence and somebiological peoperties of reticuloendotheliosis virus strain APC-566isolated from endangered Attwater`s prairie chickens.Virus Res，2007，124：68-77；Lin C，Chen C，Wang C，et al.Isolation，identification andcomplete genome sequence of an avian reticuloendotheliosis virusisolated from geese.Veterinary Microbiology，2009，136(3-4)：246-249.)，不完全复制型(或缺陷型)T株的基因组仅有约5.7kb(Cohen M，Rein R，Stephens C，et al.Baboon endogenous virusgenome.III.non-Molecular cloning and structural characterization ofdefective viral genomes from the DNA of ababoon cell strain.Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A，1981，78：5207-5211.)，REV全基因组编码相应蛋白的顺反子图谱是：5′-p12-pp18/pp20-p30-p10-pol-gp90-gp20-p2(E)-3′，这些蛋白成熟后根据其功能又可分为：酶蛋白、囊膜蛋白和核心蛋白。囊膜蛋白(env)是糖蛋白，包括env基因编码的2个糖蛋白gp90和gp20两条肽链，较小的gp20贯穿病毒的囊膜，称为穿膜蛋白(TM)，较大的gp90通过二硫键和氢键与TM相连，暴露于囊膜之外，称之为表面蛋白(SU)，TM和SU是env基因编码的前体蛋白经水解后产生的(Tsai W，Copeland T，Oroszlan S，et al.Purification and chemical andimmunological charaterization of avian reticuloendotheliosis virusgag-gene-encoded structural proteins.Virology，1985，140：289-312.)。其中，gp90作为病毒的囊膜外糖蛋白，其C-末端表位位于感染细胞表面，其上有许多糖基化位点，在自然状态下可结合多糖；而且因gp90含有顺序和构像表位，所以它是REV的免疫显性蛋白，且具有病毒的型特异性；另外，其C-末端抗原簇具有受体结合的功能，可诱导宿主机体产生补体介导的细胞毒性反应(Davidson I，Yang H，Witter R，etal.The immunodominant proteins of reticuloendotheliosis virus.VetMicrobo，1995，49：273-284；Chen I，Cui Z，Lee L，et al.Serologicdifference among nondefective reticuloendotheliosis virus.Arch Virol，1987，93：233-246.)。gp90还是诱导宿主产生中和抗体的主要蛋白质，它非常容易发生变异，REV抗原的高度变异性主要体现在这一蛋白上。

关于REV的诊断，不仅需要见到典型的肉眼和组织学病变，而且需要证明REV的存在，因此通常将病原的分离鉴定与血清学方法结合起来进行确诊，但随着病毒的遗传变异，REV的致病性不断发生变化，很难根据临床症状对其确诊，必须借助于其它检测方法。关于REV的检测方法已有一些报道：如间接免疫荧光、病毒中和试验、PCR和RT-PCR等。这些检测方法在应用时或多或少会受到一些限制，难以及早检测病原，也不利于大规模的流行病学调查；而用于血清学检测的国外进口试剂盒，价格昂贵，检测成本高，不适合于临床大规模使用；分子生物学方法特异性高、结果确实，但对实验条件及操作人员的要求较高，因此多用于实验室研究，很难进入临床应用阶段。酶免疫测定技术将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机结合起来，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求不高、成本低、操作简便快捷、无放射性污染、自动化程度高、试剂保存时间长等优点，适用于大批量现地检测工作，将可能成为极具推广价值的诊断方法。随着REV对养禽业造成的损失逐年增大，以及国际、国内经济贸易的对食品安全要求的呼声越来越高，广泛地开展REV监测已不可避免，因此发展符合中国养禽业的监测方法，不仅符合中国养禽业的要求，而且具有巨大的市场潜力，研制检测禽网状内皮组织增生症的ELISA诊断试剂盒对该病的疫情监测、流行病学调查及完善免疫策略等都具有重要意义。二在此过程中，单克隆抗体是不可缺少的工具。

发明内容

本发明目的之一是提供一种抗禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的单克隆抗体以及分泌该抗gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是将上述抗禽网状内皮组织增生症gp90蛋白的单克隆抗体应用于制备成检测或诊断禽网状内皮组织增生症病毒的试剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明采用大肠杆菌表达的禽网状内皮组织增生症病毒gp90蛋白，纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得1株稳定分泌抗gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC NO 4143；其分类命名为：杂交瘤细胞株；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2010年9月3日。

由上述抗gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体A9E8，其重链为IgG2b，轻链为κ链。抗体的效价测定检测结果表明，本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价为10⁶，细胞上清的效价达到10⁴。

Western blot检测结果表明，本发明单克隆抗体能与禽网状内皮组织增生症病毒全病毒抗原特异性结合。IFA结果表明，杂交瘤细胞上清及融合前小鼠血清均能与REV感染的CEF发生反应，在荧光显微镜下可见到荧光信号而其他对照组均未见荧光，说明本发明获得的McAb均能与REV发生反应。单克隆抗体的特异性试验结果表明，本发明单克隆抗体具有良好的特异性，仅与REV抗体检测试剂盒发生反应，而与NDV、IBV、ILTV、IBDV和CAV抗体检测试剂盒不发生反应。本发明单克隆抗体可用于检测禽网状内皮组织增生症病毒，为建立一种快速、简易、准确的诊断方法，以及在免疫机制研究、免疫功能检测、检测方法的建立等方面提供了物质基础。

附图说明

图1A9E8株单克隆抗体亚类鉴定结果。

图2应用Western blot分析单克隆抗体A9E8与REV全病毒的反应性；M：预染蛋白质分子量；1：A9E8；2：REV阳性血清3：SP2/0上清。

图3应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体A9E8株与REVHLJ07I临床分离株的反应性结果；A，a：杂交瘤细胞A9E8上清；B，b：REV阳性血清；C，c：免疫鼠血清；D，d：S/P20上清；注：(+)表示REV感染的CEF；(-)表示正常的CEF。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。毒种、细胞、实验动物和生化试剂

(1)重组pET32a-gp90、SP2/0细胞均由本发明人实验室保存；

(2)禽网状内皮组织增生症病毒HLJ07I毒株由本发明人研究室分离并保存；

(3)8周龄实验用雌性BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；

(4)标准胎牛血清、培养基DMEM购于Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、选择性培养基HAT和HT、细胞融合用PEG(MW1450)、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP-IgG)购于Sigma公司。

实施例1单克隆抗体的制备

1、重组蛋白的纯化与检测

将诱导后的表达rgp90蛋白的基因工程菌在37℃200rpm振荡培养5h后收获菌液，5000g离心10min，加10mL的结合缓冲液。重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解(30％功率)裂解3s、间隔15s、超声至液体透明。然后10000g离心20min，去除细胞碎片，将上清液移入新管中。分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳以确定表达的蛋白是否为可溶性蛋白。利用Bio-RAD公司的电洗脱纯化系统对重组蛋白进行纯化，操作过程如下：

1.带上手套，将膜杯在60℃洗脱缓冲中浸泡，至少1h；

2.将过滤板塞到玻璃管底部(磨沙面)，使其底部齐平，套上白色接头(硅胶)；

3.将玻璃管插入洗脱模块，可将洗脱模块的环孔处打湿，玻璃管较易插入，确保玻璃管上缘与环孔齐平；将不用的环孔用灰色小帽盖上；

4.将浸泡好的膜杯插入硅胶接头，在接头内装满洗脱液，用枪头反复吸取洗脱液以去除透析膜上的气泡；

5.在玻璃管内装满洗脱液，将要洗脱的凝胶放入管内。为增加回收率，可放入多个凝胶条带，一般凝胶高度为1cm，如超过1cm，需增加洗脱时间；

6.将整个洗脱模块放入洗脱槽，加入约600mL下槽缓冲液，缓冲液液面必须没过接头上缘，否则透析膜上容易产生气泡。在上槽加入约100mL缓冲液；

7.在洗脱槽内放入一搅拌子，洗脱过程中剧烈搅拌可防止气泡产生；

8.盖上洗脱槽盖子，接电泳仪

(Bio-RadpowerPac1000/3000/Basic/Universal，红对红，黑对黑接入)；

9.洗脱，每管设电流为8-10mA，洗脱一般3-5h；

10.洗脱完成后关闭电泳仪，打开盖子，取下灰色小帽，将上槽缓冲液漏掉，或小心取出一个玻璃管，漏掉上槽缓冲液；

11.小心而快速地用枪头吸去玻璃管内的缓冲液至过滤板，确保在整个过程中过滤板下溶液没有被搅动；

12.小心取下整个接头和膜杯，用一新枪头，将膜杯内的液体吸出，体积约为400μL，加入200μL新鲜缓冲液，清洗膜杯后收集吸出。

结果表明，纯化后rgp90蛋白具有较高的纯度、蛋白得率比较高且具有良好的反应活性。

2、小鼠免疫

以纯化的rgp90蛋白作为免疫原，对6周龄雌性BALB/c小鼠进行3次免疫。免疫方案如下：首免，每只小鼠用50μg rgp90蛋白与等量FCA混合制成乳化剂，颈背部皮下多点和腹腔注射；二免于首免后2周进行，将FCA换成FICA，剂量和方法同上；三免于二免后2周进行，剂量和方法同二免。细胞融合前1周进行加强免疫，方法是腹腔注射100μg纯化的rgp90蛋白。

3、细胞融合

融合前2d准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取其脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞5∶1的比例用PEG1450进行融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上(Kohler G，MilsteinC.Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefinedspecificity.Nature，1975，256(5517)：495-497.)。

4、阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆

取纯化的REV全病毒以1μg/孔包被聚苯乙烯板，37℃，3h；PBST(0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次，5min/次；加PBST/FCS(0.01mol/L，pH7.3，PBST+10％FCS)，200μL/孔，37℃封闭3h或4℃过夜；PBST洗3次，5min/次，拍干，-20℃存放备用。通过方阵试验确定抗原的最佳稀释倍数，即将REV全病毒包被96孔板，进行方阵滴定试验，获得抗原的使用浓度及原核表达蛋白rgp90免疫鼠阳性血清的稀释倍数。同时设置阴性小鼠血清做为阴性对照。根据反应结果选择抗原的最佳包被浓度。按常规间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清。将酶标板置于ELISA酶标仪上读数，以S/P＞0.2作为阳性判定标准。挑选出抗r gp90蛋白的杂交瘤细胞克隆孔。

按上述筛选方法，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，亚克隆采用有限稀释法，将原始孔细胞用HT培养基稀释后重新分96孔细胞板，一个原始孔细胞分一块板子。亚克隆完成后注意观察每个孔的细胞个数及状态。取亚克隆后分泌抗体稳定并且尽可能是单个克隆的孔进行第二次亚克隆。经过三次亚克隆后原先是单克隆的亚克隆板子检测结果的阳性率应达到100％。获得了1株能够稳定分泌特异性针对gp90蛋白的单克隆抗体(命名为A9E8)的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC NO 4143。

5、单克隆抗体的大量制备

给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1w后腹腔注射10⁵个杂交瘤细胞，7-10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水1000g离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装于-20℃或-70℃保存。

试验例1单克隆抗体的鉴定

1、抗体的效价测定

纯化的REV全病毒用包被液稀释后，1μg/孔加入ELISA反应板中，4℃放置过夜。次日倾去空内的液体，洗涤3次，每次3min。每孔加100μL封闭液，37℃放置1h，洗涤3次，每次3min。将含有单克隆抗体的腹水在另一块板上用PBS进行10倍系列稀释，100μL/孔加到已封闭的ELISA板上，每个样品平行做两个重复，PBS做阴性对照，REV阳性血清作为阳性对照。于37℃温箱中温育1h，洗涤3次，每次3min。然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶8000)的抗体，100μL/孔，于37℃温箱中温育1h，洗涤5次，每次3min。加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置15min，再加入50μL/孔终止液，测定OD₄₅₀，以S/P＞0.2为阳性判定标准，阳性反应的最大稀释度为阳性细胞株培养上清以及腹水进行抗体效价检测。

检测结果见表1和表2，诱导小鼠产生的腹水效价为10⁶，细胞上清的效价达到10⁴。

表1A9E8株单抗腹水效价的测定

表2A9E8株单抗上清效价的测定

2、单克隆抗体亚类鉴定

使用捕获ELISA试剂盒检测单克隆抗体的亚类：

(1)将表位特征性抗体IgA，IgG1，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分别用PBS进行1∶1000稀释，100μL/孔包被，每种特征性抗体包被两孔，37℃孵育1h。

(2)用洗涤液PBST洗涤3次，5min/次。

(3)每孔加入100μL待检测的单克隆抗体上清，37℃孵育1h。

(4)用洗涤液洗涤3次，5min/次。

(5)用PBST将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(Fab片段)进行1∶1000稀释，每孔100μL，37℃孵育30min。

(6)用洗涤液洗涤三次，5min/次。

(7)每孔加入新鲜配置的底物溶液100μL，37℃避光孵育20min。

(8)每孔加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD₄₉₀的值。

以OD₄₉₀明显高于其他各个孔的表位特征性抗体判为其单抗亚类。

亚型鉴定结果见图1，本发明单克隆抗体A9E8重链为IgG2b，轻链为κ链。

3、McAbs免疫活性鉴定

Western blot用于分析单克隆抗体的免疫活性，Western blot程序如下：将纯化的禽网状内皮组织增生症病毒全病毒裂解产物和预染蛋白Marker进行SDS-PAGE电泳(胶浓度为12％)，电泳产物转印至硝酸纤维素膜(NC)，剪下每个泳道的蛋白条带及预染蛋白Marker条带(保存备用)，然后将含有全病毒裂解产物的NC膜条带放入去离子水中清洗10min，5％脱脂乳室温封闭1h，封闭后的NC膜条带分别与1∶100倍稀释的单克隆抗体诱生小鼠产生的腹水以及正常SP2/0细胞的培养上清液37℃作用1h，PBST(0.01mol/L，pH7.2；含0.05％的Tween-20)洗涤3次，然后与HRP-羊抗鼠IgG(1∶8000)37℃作用1h，PBST洗5次，用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液进行显色。

Western blot检测结果表明，本发明单克隆抗体能与禽网状内皮组织增生症病毒全病毒抗原特异性结合(图2)。

4、间接免疫荧光(IFA)试验

将REV HLJ07I毒株感染的细胞及CEF培养3-5天后，倒掉上清液，经PBS轻洗3次，用-20℃预冷的丙酮4℃固定15min；PBS洗涤3次，滴加杂交瘤细胞上清，同时以SP2/0细胞上清和免疫前小鼠血清、REV阳性血清和融合前小鼠血清分别作为阴、阳性对照，37℃作用1h；PBS洗涤3次，二抗为FITC标记的羊抗鼠或羊抗鸡IgG(1∶2000)于37℃作用1h；经PBS洗涤3次后，在荧光显微镜下观察。

IFA结果表明，杂交瘤细胞上清及融合前小鼠血清均能与REV感染的CEF发生反应，在荧光显微镜下可见到荧光信号而其他对照组均未见荧光，说明获得的McAb均能与REV发生反应，结果见图3。

5、单克隆抗体的特异性试验

采用IDEXX公司生产的新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)及禽白血病病毒(ALV)ELISA抗体检测试剂盒以及本发明人研究小组建立的传染性喉气管炎病毒(ILTV)抗体ELISA检测方法(何来.传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立[D].中国农业科学院硕士学位论文，2007，北京.)对杂交瘤细胞上清进行检测，检验其特异性。结果表明，本发明单克隆抗体仅与REV抗体检测试剂盒发生反应，而与NDV、IBV、ILTV、IBDV和CAV抗体检测试剂盒不发生反应，试验结果见表3。

表3 A9E8株单克隆抗体的特异性鉴定

Claims (4)

1.一株分泌抗禽网状内皮组织增生症病毒（ReticuloendotheliosisVirus）gp90蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏号是：CGMCCNO 4143。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测禽网状内皮组织增生症病毒试剂中的用途。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测禽网状内皮组织增生症病毒试剂中的用途。

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