CN1477108A - 重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用。伪狂犬病呈全球性分布流行，长期以来的控制措施主要是采用疫苗接种，现用的疫苗都是含gE基因缺失的弱毒疫苗，用常规的方法难以区分疫苗免疫动物和自然感染动物。本发明的重组gE蛋白是利用PCR技术扩增、克隆并在大肠杆菌中表达伪狂犬病毒不含信号肽和疏水跨膜区的gE基因，利用表达的gE基因产物作为诊断抗原。利用此重组抗原建立间接酶联免疫吸附试验(gE－ELISA)，用于检测伪狂犬病毒野毒感染后产生的抗gE抗体，此方法实用于伪狂犬病毒自然感染动物的诊断以及疫苗免疫动物和自然感染动物的鉴别诊断。

Description

重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用

技术领域：

本发明利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达了伪狂犬病病毒(PRV)囊膜蛋白(gE)基因的一部分作为诊断抗原，建立间接酶联免疫吸附试验，应用于伪狂犬病毒自然感染以及野毒和gE基因缺失弱毒疫苗免疫动物的鉴别诊断。

背景技术：

伪狂犬病(pseudorabies PR)是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的家畜和多种野生动物共患的一种急性传染病。伪狂犬病病毒属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员，主要贮主为猪和鼠。除猪外，其他易感动物感染本病为高度致死型感染，但呈散发形式。该病对猪危害严重，主要引起种猪不育、妊娠母猪流产、死产和产木乃伊胎；新生仔猪和断奶仔猪大量死亡；育肥猪增中减慢等症状。1902年匈牙利学者Aujeszky`s首次将伪狂犬病作为一种独立的疾病作了报道，所以伪狂犬病又称为奥叶兹基氏病。1947年我国首次报道发生伪狂犬病。伪狂犬病呈全球性分布流行，特别在东南亚与我国毗邻的许多国家和地区，诸如日本、越南、新加坡等均有该病的流行。在我国伪狂犬病已蔓延至许多省市，给畜牧业造成巨大的经济损失。长期以来，对伪狂犬病的防制主要措施就是接种疫苗。到了上世纪八十年代末，基因缺失标志疫苗及相应的弱毒疫苗免疫和野毒感染鉴别诊断技术相继问世与得到应用，使猪伪狂犬病的根除成为可能。九十年代初期，部分伪狂犬病流行国家正式启动本病的根除计划。即在使用疫苗防制本病的同时，配合以适当的鉴别诊断方法诊断出野毒感染猪，对已感染野毒的猪进行扑杀淘汰，从地区性净化猪场直至全国性根除本病。到现在为止，荷兰、美国、欧盟等许多国家或地区先后宣布了根除计划的成功。

我国是养猪大国，生猪存栏数居世界第一，伪狂犬病的流行不仅直接给我国的养猪业造成了不可估量的损失，而且在我国与正在或已根除此病的国家和地区进行国际贸易时，也必然会导致产生贸易壁垒。目前，我国仍是以接种疫苗为控制伪狂犬病的主要措施，接种疫苗虽然在短期内可以控制本病减少损失，但长期来讲也使得猪场伪狂犬病的形势更加复杂化，常规的血清学方法再难以区分野毒感染猪和疫苗免疫猪。许多猪场也正因为此，形成了对疫苗的依赖性，一旦接种疫苗就得长期连续的接种。针对这种情况，建立可以有效区分野毒感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断技术变得尤为重要紧迫。研究证实，我国目前广泛使用的疫苗是gE/gI双基因缺失标志疫苗，这与国际上最常用的弱毒疫苗一致。而据报道对上百株PRV的分离鉴定，证实野毒均含有gE基因且较为保守。因此，gE蛋白是建立鉴别诊断的理想标志蛋白。建立针对Ge蛋白的鉴别诊断技术，不仅可以满足我国根除伪狂犬病所必需的基础技术保障，而且可以使免疫猪场的伪狂犬病的形势明朗化，直接指导临床诊断和疫苗的使用。

发明内容：

本发明的目的：利用原核表达系统高效表达去掉信号肽和疏水跨膜区的猪伪狂犬病病毒gE蛋白，利用表达的gE蛋白作为抗原建立检测抗gE蛋白抗体的诊断或鉴别诊断方法。

发明内容：

本发明的目的是这样实现的：

重组gE蛋白，是利用PCR技术扩增、克隆并在大肠杆菌中表达伪狂犬病毒不含信号肽和疏水跨膜区的gE基因，利用表达的gE基因产物作为诊断抗原，所用的抗原是在大肠杆菌中表达的伪狂犬病病毒gE蛋白，或者在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原是在大肠杆菌中表达的去掉信号肽和全部跨膜区的伪狂犬病病毒gE蛋白。

该重组gE蛋白，是在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原是经过纯化的截短的gE蛋白。

该重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用，在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原可通过检测抗gE蛋白抗体区分带gE基因缺失标记的伪狂犬病弱毒疫苗免疫猪和伪狂犬病毒野毒感染猪。

该重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用，在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原可通过检测抗gE蛋白抗体诊断伪狂犬病野毒感染。具体的实现过程如下：

本发明首先参考已发表的关于PRV gE蛋白免疫反应表位的相关研究报道，利用Arth-4蛋白质分析软件分析gE基因疏水结构图谱，设计一对引物，利用PCR方法克隆了Min-A株PRV gE基因不含信号肽和跨膜区的部分，利用限制性内切酶将目的片段和原核表达载体PGEX-6p-1进行酶切，T4连接酶连接，获得含有PRV gE基因反应表位的表达质粒pGEXgE。

用pGEXgE转化受体菌BL21。提取单个菌落，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实gE基因的表达，并确定IPTG的最佳诱导浓度及诱导时间分别是0.2Mm和3.5小时。将SDS-PAGE后的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上进行Western-blot试验，证实了所表达的重组蛋白大小相符具有免疫反应活性。通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验，建立了猪伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断技术。1，PRV的培养及DNA的提取

取长成亚单层的VERO细胞按MOI＝8～10接种Min-A株PRV，感作1小时后，换含10％小牛血清、1％青链霉素(双抗)的DMEM继续培养24小时后收获细胞及上清。冻融三此后，经蛋白酶K消化后酚/氯仿抽提，然后用无水乙醇沉淀。70％乙醇洗涤后真空抽干，用pH＝8.0的TE缓冲液溶解。所提取的DNA用于聚合酶链式反应(PCR)。2，设计合成用于扩增PRV gE基因片段的引物。

根据GeneBank中Rice株PRV gE基因序列设计一对针对gE基因片段的特异性引物。

上游引物为：CGG ATC CCC GAG CCT CTC CGC CGA GAC

下游引物为：GAA GGC GTC GAC GGG TCA GGC GGT CAG3，gE基因的PCR

取“1”所述的5μl DNA产物作为PCR模板，PCR反应组成(100μl反应体系)：

TaKaRa LA Taq(5u/μl)  1μl

2×G+CBuffer II(含Mg²⁺) 50μl

dNTP Mixture(各2.5mM)    8μl

引物P1(10pmol/μl)       4μl

引物P2(10pmol/μl)       4μl

灭菌去离子水             28μl

PCR反应条件：95℃预变性10分钟，94℃1分钟，68℃1分钟，72℃1分钟，进行35个循环，反应结束前72℃延伸10分钟。4，表达载体pETgE的构建(1)、将PCR产物用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司产品)胶回收后，与PMD18-T载体(大连宝生物公司)连接，其体系为：PCR产物4μl，T载体1μl，Solution I 5μl。于16℃连接6小时后将连接产物转化DH5α感受态细菌后，随机提取一些白色菌落，用碱裂解法小量提取质粒，然后用BamHI进行酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，从中筛选出含有1.5kb大小的外源片段的重组质粒(命名为TgE)。(2)、将上述的重组质粒TgE和原核表达载体PGEX-6p-1用BamHI限制性内切酶进行消化，然后用胶回收试剂盒回收，再用SalI限制性内切酶消化处理，胶回收试剂盒回收含有gE基因的片段和同样处理的原核表达载体。将回收后的片段和载体质粒PGEX-6p-1以摩尔比3∶1混匀，用T4 DNA连接酶(上海生物工程公司)16℃过夜连接，连接产物转化BL21菌种制备的感受态。随机挑取一些菌落，于含氨苄青霉素(购自上海华舜生物公司)的LB中37℃培养过夜后小量提取质粒并保留菌种。质粒用BamHI/SalI双酶切筛选阳性重组质粒，并命名为PGEXgE。将PGEXgE送上海博亚生物公司测序。5，gE基因片段的诱导表达

将上述含有重组质粒PGEXgE的BL21菌种在含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上划线，37℃培养过夜，随机挑取单个菌落，于10ml含Amp抗生素的LB中37℃摇床中培养至OD₆₀₀为0.6-0.7时加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷、大连宝生物公司产品)至终浓度1mM，继续振摇培养3-6小时，收获细菌。离心后将菌体用0.5M Nacl、20mM Tris·cl(pH＝7.6)的缓冲液洗两次，然后用1ml PBS(PH＝7.4)悬浮细胞，经超声波裂解后，加入2×上样缓冲液(100mmol/L Tris·HCl PH＝6.8、200mmol/L二硫苏糖醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)，煮沸变性后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，考马斯亮兰染色，观察结果。

本发明的优点在于：

1.上述观察的结果：在带有PGEXgE质粒的细菌经诱导后表达了约62ku的融合蛋白。而对照细菌没有相应的条带。薄层扫描分析，该蛋白可占菌体蛋白总量的30％左右。

2.重组蛋白免疫反应活性(1)、Western-blot分析：表达蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用含有5％(w/v)脱脂奶粉的PBS(PH＝7.4)37℃温育1-2小时封闭NC膜；然后加入含5％脱脂奶粉、1％猪伪狂犬病标准阳性血清的PBS 37℃温育1小时；PBS洗涤膜三次后用150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris·Cl(PH＝7.5)洗涤一次，然后加入用Tris·Cl缓冲液1/5000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG 37℃温育1小时；用150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris·Cl(PH＝7.5)洗涤三次，加入含6mg二氨基联苯胺、10μl 30％H₂O₂的Tris·Cl(0.01mol/LPH＝7.6)的显色液进行反应，观察当形成的蛋白带颜色深度达到要求时用水漂洗，放入PBS中保存。结果能见到与SDS-PAGE特异性条带相对应的反应条带。(2)、酶联免疫吸附试验(ELISA)：将纯化后的重组蛋白用0.05mol/L的碳酸盐缓冲液(CBS pH9.6)适当稀释后包被聚苯乙烯微量反应板，4℃放置过夜后，用洗液PBST(含0.05％Tween20的0.01mol/L，pH7.4PBS)洗涤三次，3-5分钟/次，每次均用吸水纸沥干。然后用封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST)每孔加150μl，37℃湿盒内封闭2小时后，同前洗涤；将待检血清用稀释液(含0.1％牛血清白蛋白的PBST)作适当稀释后，每孔加100μl，37℃湿盒内作用一定时间，同上洗涤；将辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(Sigma公司产品)用稀释液作适当倍数稀释后，每孔加100μl，37℃湿盒内作用一定时间后同上洗涤；然后每孔加入100μl用磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的邻笨二胺底物溶液(OPD 4mg/10ml含2μl 30％的过氧化氢)。室温避光反应15分钟，用2M硫酸溶液每孔50μl终止反应。自动酶标测定仪在波长492nm处用空孔调零后，测定每孔的光密度吸收值(OD值)，每份样品每次平行做2-4孔，取其平均值判定阴阳性。

附图说明图1：伪狂犬病病毒基因组及其主要编码的蛋白结构图谱图2：猪伪狂犬病病毒重组gE蛋白表达载体pGEXgE质粒结构示意图图3：伪狂犬病毒gE基因结构示意图图4：PGEX-gE诱导产物SDS-PAGE结果分析图5：PRV gE基因的原核表达及ELISA诊断技术的构建流程图

本发明的更具体的实施方式：

检测伪狂犬病毒gE蛋白抗体的重组gE-ELISA伪狂犬病强弱毒鉴别诊断技术的具体构建方法见如下实施例：1，抗原制备

将上述含有重组质粒PGEXgE的BL21菌种在含氨苄青霉素的LB平板上划线，37℃培养过夜，随机挑取单个菌落于10ml含Amp抗生素的LB中37℃振荡培养过夜，次日按1∶200接菌于2000ml含Amp的LB中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.7时加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mM，于25℃振荡培养3.5小时。Beckman离心机JA-10转子5000rpm离心10分钟，收获细菌。将菌体用100m10.01M PBS(pH7.3)悬浮。加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶，冰浴作用1小时后超声波裂解，然后取上清。按pharmacia biotech公司GST纯化试剂盒操作说明书进行纯化。纯化后测定蛋白浓度，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化结果。2，间接ELISA最佳工作条件的选择不同封闭液及工作时间的选择：用含3％BSA、1％BSA、5％牛血清、0.5％马血清、3％脱脂奶粉等按不同封闭时间分别进行封闭，按间接ELISA试验操作流程进行ELISA试验。选用可以有效封闭载体表面残留活性部位，试验特异性高的一组作为试验用封闭液和作用时间。抗原最佳工作量的确定：用碳酸液缓冲液(CBS)将重组gE抗原按100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml等不同浓度没空100μl包被反应板。被检血清暂定1∶100倍稀释，按间接ELISA试验操作进行试验，选用阳性血清与阴性血清对比最为明显的抗原包被量作为抗原最佳工作量。血清最佳稀释度及工作时间的确定：按上述的抗原量包被反应板，将PRV标准阳性血清，弱阳性血清和阴性血清从1∶12.5开始倍比稀释，作用时间选择30、60、90、120分钟分别进行试验，按间接ELISA试验操作进行试验。选择阳性血清与阴性血清OD值比值最为明显的一组作为血清最佳稀释度和作用时间。最佳底物显色时间的确定：选四份抗体水平不同的阳性血清和一份阴性血清进行间接ELISA试验，同一批次中测定不同显色时间(5、10、15、20分钟)OD值及其比值。选择比值最为明显的显色时间作为最佳工作时间。间接gE-ELISA判定标准的确定：将从北京SPF猪育种管理中心所采的49份SPF PRV阴性猪血清按上述的最佳工作条件进行间接ELISA试验。对其结果进行统计学分析，选用OD值得平均值加上2个标准误作为被检血清阳性的判定下限。特异性试验：在同一条件下对猪瘟、猪丹毒、猪大肠杆菌病、猪细小病毒、猪轮状病毒、猪生殖与呼吸综合征、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪流感等九种猪疫病阳性血清及SPF猪血请按间接ELISA试验操作。重复性试验：批内重复性试验，取抗体水平不同的五份阳性血清和一份阴性血清，同一批次试验中按间接ELISA程序测定不同孔的OD值，对结果进行统计学分析。

批间重复性试验，取抗体水平不同的五份阳性血清和一份阴性血清，在八个不同工作日按间接ELISA程序测定其OD值，对结果进行统计学分析。试剂盒保存期试验：将试剂盒分别保存于4℃、-20℃，30、60、90天后进行间接ELISA试验操作，分析结果。

以猪伪狂犬病病毒重组gE蛋白为基础可以进行多方面的开发应用，例如：(1)，以重组gE蛋白为基础的ELISA诊断技术可实现对接种gE基因缺是疫苗的猪场猪伪狂犬病野毒感染的诊断。(2)，以重组gE蛋白为基础的ELISA诊断技术可实现对未接种疫苗的猪场的伪狂犬病病毒感染的诊断。--------CGGATCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACCTCTCCACCGAGGCCGGCGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCCTCCCTGAGGGAGGCACCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCCGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGACCACGGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACCTGGTACTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCCGGAGATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGTGCCGCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACCCCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCGGGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACGACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGGTGGGCGACCGGCCGCCCGCGCCGGCGGACCCGGTGGGCCCCGCGCGCCACGAGCCCCGCTTCCACGCGCTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGACACGTTCGACCTGATGCCGCGCGTGGTCTCGGACATGGGCGACTCGCGCGAGAACTTTACTGCCACGCTGGACTGGTACTACGCGCGCGCGCCCCCGCGGTGCCTGCTGTACTACGTGTACGAGCCCTGCATCTACCACCCGCGCGCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGCGTGCAGCTTCACCTCGCCGGCGCGCGCGCGGCTGGTGGCGCGCCGCGCGTACGCCTCGTGCAGCCCGCTGCTCGGGGACCGGTGGCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTC

      去掉信号肽和跨膜区的伪狂犬病毒gE基因序列。GSPSLSAETTPGPVTEVPSPSAEVWDLSTEAGDDDLNGDLDGDDRRAGFGSALASLREAPPAHLVNVSEGANFTLDARGDGAVPAGIWTFLPVRGCDAVSVTTVCFETACHPDLVLGRACVPEAPEMGIGDYLPPEVPRLRREPPIVTPERWSPHLSVLRATPNDTGLYTLHDASGPRAVFFVAVGDRPPAPADPVGPARHEPRFHALGFHSQLFSPGDTFDLMPRVVSDMGDSRENFTATLDWYYARAPPRCLLYYVYEPCIYHPRAPECLRPVDPACSFTSPARARLVARRAYASCSPLLGDRWLTACPFDAF

去掉信号肽和跨膜区的伪狂犬病毒gE基因表达产物氨基酸序列。

Claims (4)

1，一种重组gE蛋白，其特征是：所述的重组gE蛋白是利用PCR技术扩增、克隆并在大肠杆菌中表达伪狂犬病毒不含信号肽和疏水跨膜区的gE基因，利用表达的gE基因产物作为诊断抗原，所用的抗原是在大肠杆菌中表达的伪狂犬病病毒gE蛋白，或者在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原是在大肠杆菌中表达的去掉信号肽和全部跨膜区的伪狂犬病病毒gE蛋白。

2，根据权利要求1所述的重组gE蛋白，其特征是：在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原是经过纯化的截短的gE蛋白。

3，一种重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用，在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原可通过检测抗gE蛋白抗体区分带gE基因缺失标记的伪狂犬病弱毒疫苗免疫猪和伪狂犬病毒野毒感染猪。

4，一种重组gE蛋白及其在诊断伪狂犬病毒感染中的应用，在gE-ELISA诊断技术中所用的抗原可通过检测抗gE蛋白抗体诊断伪狂犬病野毒感染。

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