CN103353526B

CN103353526B - 一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒

Info

Publication number: CN103353526B
Application number: CN201310310937.4A
Authority: CN
Inventors: 魏冬青; 窦文茂
Original assignee: HENAN FENGHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HENAN FENGHUA BREEDING SHARE CO., LTD.
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN103353526A

Abstract

本发明公开了一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，包括猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体、快速包被液、快速封闭液、样品稀释液、TMB显色液、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照、阳性对照。本发明通过采用基因工程途径所表达处的高纯度、高活性的猪伪狂犬病毒特异性gE抗原来包被酶联板，含有辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG单克隆抗体的酶结合物以及TMB显色液，使得本发明所提供的检测猪伪狂犬抗体试剂盒拥有特异性强、敏感性高，不易出现假阳性或假阳性误差判断等优点。另外，本试剂盒结构简单，检测成本低，操作简便、快速、时效性强，具有广阔的市场前景，并能够创造出更大的社会效益。

Description

一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及动物疫病检测领域，具体涉及一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒。

背景技术

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性传染病，多种家畜和野生动物都可以感染，以猪感染最为普遍，给养猪业造成很大的经济损失，接种疫苗是预防本病最为有效的方法。目前市面上的伪狂犬疫苗都是gE基因缺失疫苗，接种疫苗的猪只，血清中不含有猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体。如果在猪血清中检测出了gE蛋白抗体，说明猪已经被伪狂犬病病毒的野毒感染，可将感染的猪只淘汰，从而根除伪狂犬病。

目前一般采用间接gE-ELISA的方法来检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体，这些方法的特异性不是很强，敏感度不高，容易出现假阳性和假阴性，不可避免地会造成误判，并产生不必要的损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、灵敏度高，能快速、简便地检测猪伪狂犬抗体的试剂盒。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，包括猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体、快速包被液、快速封闭液、样品稀释液、TMB显色液、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照、阳性对照。

所述快速包被液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的NaOH；所述快速封闭液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的KOH。

所述样品稀释液中含有质量分数为1%的酪蛋白，质量分数为0.001%的NaN₃。

所述TMB显色液中TMB的质量浓度为0.3g/L；所述终止液是浓度为2M的H₂SO₄溶液。

所述20倍浓缩洗液包括质量浓度为21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、质量浓度为2.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、质量浓度为170g/L的NaCl和体积浓度为20ml/L吐温-20。

所述阴性对照为经样品稀释液稀释的不含猪伪狂犬gE抗体的猪血清或血浆；所述阳性对照为经样品稀释液稀释的含有猪伪狂犬gE抗体的猪血清或血浆。

所述样品稀释液是通过在浓度为0.01M，pH为7.2的PBS中添加质量分数为1%的酪蛋白，质量分数为0.001%的NaN₃制备而成。

所述20倍浓缩洗液是通过在浓度为0.01mol/L，pH为7.4的PBST中添加质量分数为10%小牛血清制备而成。

作为优选的，所述的快速包被液的pH为13，所述的快速封闭液的pH为13。

所述的猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板通过如下方法制备得到：

（1）以PRV Bartha-K61株的总DNA为模板，P1和P2作为引物进行PCR反应，其中：

引物P1的序列为：5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC— 3′

引物P2的序列为：5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′；

（2）回收的PCR反应产物，并将其克隆入pET28a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建成重组载体pET28a-E3，然后将重组载体pET28a-E3转化入大肠杆菌宿主菌BL21中，进行重组蛋白表达；

（3）纯化重组蛋白，得到猪伪狂犬病毒gE抗原；

（4）将猪伪狂犬病毒gE抗原包被固化于酶联板上。

所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液由以下方法制得：

（1）用猪IgG免疫家兔后，分离得到血清，将血清纯化后获得兔抗猪IgG抗体；

（2）用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；

（3）将20倍浓缩洗液进行20倍稀释后制备成原液，用原液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体，获得辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液。

所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒在检测猪伪狂犬病中的应用。

一种用检测猪伪狂犬抗体的试剂盒测定猪伪狂犬抗体的方法，包括以下步骤：

（1）检测样品制备：采血后，3000转/分钟离心5分钟，取上清即得血清；

（2）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；

（3）配洗液：将20倍浓缩洗液用双蒸水稀释20倍备用；

（4）加样：在酶标板中分别设定空白对照、阳性对照、阴性对照，空白对照不加样品稀释液，阳性对照加入加入100μL阳性对照血清，阳性对照加入100μL阴性对照血清；在剩余的酶标板反应孔中中加入100μL检测样品，振荡混匀；

（5）温育：将酶标板置于室温避光反应20分钟；

（6）洗板：弃去反应液，反应孔中注满洗液，浸泡15秒，弃洗液。连续洗板5次，最后拍干；

（7）加酶：反应孔中加入100μL辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG溶液，其中空白对照孔不加；

（8）温育：将酶标板置于室温避光反应20分钟；

（9）洗板：洗板5次；

（10）显色：在包括空白对照孔在内的反应孔中，依次加入TMB显色剂100μL，振荡混匀，室温避光反应10分钟；

（11）终止：在包括空白对照孔在内的反应孔中，加入终止液各50μL，振荡混匀终止反应；

（12）测定：用酶标仪对空白孔调零，单波长450nm测定各孔OD值，并根据如下公式，并判定结果：

当测定标本OD值≥临界值的2倍，为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性；

当测定标本OD值介于临界值与临界值的2倍之间时为可疑；

当测定标本OD值＜临界值，为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阴性；

其中，临界值=0.10+阴性对照OD平均值，当阴性对照OD平均值≤0.05时，按0.05计算。

所述步骤（1）为：采血，加入抗凝剂，3000转/分钟离心5分钟，上清即为血浆。

本发明通过采用基因工程途径所表达处的高纯度、高活性的猪伪狂犬病毒特异性gE抗原来包被酶联板，含有辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG单克隆抗体的酶结合物以及TMB显色液，使得本发明所提供的检测猪伪狂犬抗体试剂盒拥有特异性强、敏感性高等优点，其中特异性为：100%，总符合率为100%。本试剂盒在1小时内即可检测出被检样品的结果，检测结果显示科学，直观，简明、准确，不易出现假阳性或假阳性误差判断。另外，本试剂盒结构简单，仅需实验室准备纯净水和酶标仪等仪器，检测成本低，操作简便、快速、时效性强，特别适用于临床猪伪狂犬血清、血浆的定性检测，监测猪伪狂犬的免疫效果，具有广阔的市场前景，并能够创造出更大的社会效益。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本实施例所提供的检测猪伪狂犬抗体试剂盒，包括猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体、快速包被液、快速封闭液、样品稀释液、TMB显色液、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照、阳性对照。

所述的快速包被液是浓度为0.1mol/L，pH为13的NaOH；所述的快速封闭液是浓度为0.1mol/L，pH为13的KOH。

所述样品稀释液是通过在浓度为0.01M，pH为7.2的PBS中添加酪蛋白和NaN₃制备而成的，其中样品稀释液中所含酪蛋白和NaN₃的质量分数分别为1%和0.001%。

所述的TMB显色剂中的TMB浓度是0.3g/L；所述终止液是浓度为2M的H₂SO₄溶液；其中，TMB显色剂购买自sigma公司。

所述20倍浓缩洗液是通过在浓度为0.01mol/L，pH为7.4的PBST中添加质量分数为10%小牛血清制备而成；20倍浓缩洗液为Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl和吐温-20的水溶液，其中Na₂HPO₄·12H₂O的质量浓度为21g/L，NaH₂PO₄·2H₂O的质量浓度为2.8g/L，NaCl的质量浓度为170g/L，吐温-20的体积浓度为20ml/L。

所述阴性对照为经样品稀释液稀释的不含猪伪狂犬gE抗体的猪血清，其中稀释的倍数为1000；所述阳性对照为经样品稀释液稀释的含有猪伪狂犬gE抗体的猪血清，其中稀释的倍数为1000。

（1）根据PRV的gE基因序列，设计一对引物P1、P2。其中，上游引物P1序列为：5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC—3′，下游引物P2序列为：5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′，然后通过PCR方法扩增PRV的gE基因的主要抗原表位区序列。

PCR的具体反应体系为：2.5μL10×Buffer（Mg²⁺plus，TaKaRa，），0.5μL浓度为10mmoL/L dNTP混合物，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，上游引物P1、下游引物P2各1μL(25μmol/L)，模板为3μL伪狂犬病毒DNA，加纯水至总体积25μL，其中10×Buffer、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司。

PCR的具体反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸35s，30个循环；72℃再延伸10min，扩增产物于4℃保存。取5μL的 PCR产物做1%的琼脂糖凝胶电泳，然后用溴乙锭染色检测结果，在1737bp处扩增出现清晰的PCR条带，证明扩增成功；

（2）回收PCR扩增产物，由于PCR扩增产物两端自带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，将pET28a载体用BamHⅠ和XhoⅠ酶切后，再将其与PCR扩增产物连接，构建成重组载体pET28a-E3，将重组载体pET28a-E3进一步转化入大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，然后用浓度为0.4mM的IPTG诱导重组蛋白表达，应用亲和树脂进行表达蛋白的纯化，纯化的表达蛋白用pH为7.4，浓度为0.01M的PBS透析过夜，进行蛋白定量后-70℃保存备用。经测定表达蛋白浓度为2.1mg/ml，该表达蛋白即为猪伪狂犬病毒特异性gE蛋白抗原。其中，亲和树脂购自上海生工生物工程有限公司，货号为IT1839-500g。

然后用western blot法对表达产物进行鉴定：表达产物经SDS-PAGE分析后，转移至PVDF膜上进行Western blot；结果显示，表达产物能被PRV阳性血清所识别，而对照没有出现条带，证明表达产物具有免疫反应，对猪伪狂犬病毒抗体有很好的特异性，该PRV阳性血清购自中国兽医药品监察所；

（3）将猪伪狂犬病毒特异gE蛋白性抗原用快速包被液稀释至0.1μg/mL，然后加入到酶联板的微孔中，100μL/孔，室温置3～5分钟，再用快速封闭液150μL/孔室温封闭3～5分钟，弃去液体，干燥，封装。酶联板为聚苯乙烯材质，设有96个微孔。

所述的辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG溶液是通过如下方法制备而成：

（1）兔抗猪IgG制备：用猪IgG免疫家兔4只，第一次用弗氏完全佐剂与猪IgG混合均匀后多点注射免疫；半个月后，以弗氏不完全佐剂与猪IgG 混合均匀后多点注射免疫；10天后，与耳缘静脉处，采血测效价，合格(效价>1:10000)则采血，不合格则加强免疫；效价合格后，再过10天采血，分离血清，用饱和硫酸铵纯化后即得兔抗猪IgG，紫外分光光度计测蛋白含量；

（2）辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG：称取5mg的HRP溶于1ml蒸馏水中，加入200μL浓度为0.1M的NaIO₄，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋，用浓度为1mM，PH4.4的醋酸盐缓冲液透析4℃过夜，加20μL浓度为0.2M，pH9.5的碳酸盐缓冲液使溶液的pH值升到9.2，然后立即加入1ml兔抗猪IgG溶液，室温避光轻轻搅拌2小时后，再加入100μL新配的4mg/ml的NaBH₄溶液，混匀，在4℃放置2小时，将上述液体放入透析袋中用浓度为0.15M，pH7.4的PBS透析，4℃过夜，取出透析袋内液体，加入等量甘油后放置-20℃保存。所述的兔抗猪IgG溶液为10mg兔抗猪IgG溶解在1ml浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中，碳酸盐缓冲液是由质量分数为1.59%的Na₂CO₃、2.93%的NaHCO₃、0.2%的NaN₃所组成的水溶液。

另外，试剂盒中的阳性对照和阴性对照所被稀释的倍数可以根据实际需要选定，一般为1000的整数倍，即所稀释的倍数还可以为2000、3000、4000、8000等；试剂盒中所采用的阴性对照也可以为经稀释的不含猪伪狂犬gE抗体的猪血浆，阳性对照也可以为经样品稀释液稀释的含有猪伪狂犬gE抗体的猪血浆。

试剂盒的组装：

（1）溶液的分装：将按照上述方法制备的辣根过氧化物（HRP）标记兔抗猪IgG用稀释液稀释至1:8000，混匀，分装为2ml/瓶；样品稀释液分装为5ml/瓶；TMB显色剂分装为50ml/瓶；终止液分装为10ml/瓶；20倍浓缩洗液分装为30ml/瓶；阴性对照分装为1ml/瓶；阳性对照分装为1ml/瓶；

（2）试剂盒的组装：将所有瓶装试剂插于盒托的对应孔内，与酶联板、说明书、自封袋、封板膜一起放入纸盒，储存于2～8℃，检验合格后贴检验合格的标签。

本实施例所提供的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒主要应用于检测猪伪狂犬病。

实施例2

本实施例提供了检测猪伪狂犬抗体试剂盒测定伪狂犬抗体的方法，包括以下步骤：

（3）配洗液：将20倍浓缩洗液用双蒸水稀释20倍备用；

（4）设定：在酶标板中设定A1-A6孔，其中A1和A2孔中不加标本稀释液，A3和A4孔中加入100μL阳性对照血清，A5和A6孔中加入100μL阴性对照血清，即A1和A2孔为空白对照，A3和A4孔为阳性对照，A5和A6孔为阴性对照；

（5）加样：在酶标板的反应孔中加入100μL检测样品，振荡混匀；

（6）温育：置室温避光反应20分钟；

（7）洗板：弃去反应液，反应孔中注满洗液，浸泡15秒，弃洗液。连续洗板5次，最后拍干；

（8）加酶：反应孔中加入100μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪 IgG溶液，其中空白对照孔不加；

（9）温育：置室温避光反应20分钟；

（10）洗板：洗板5次；

（11）显色：每孔依次加入TMB显色剂100μL（包括空白对照孔），振荡混匀，室温避光反应10分钟；

（12）终止：每孔加入终止液各50μL（包括空白对照孔），振荡混匀终止反应；

（13）测定：用酶标仪对空白孔调零，单波长450nm测定各孔OD值；

（14）根据检测样品的OD值，进行结果判定：

若测定标本OD值≥（2×临界值），为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性；

若测定标本OD值介于临界值与（2×临界值）之间时为可疑；

若测定标本OD值＜临界值，为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阴性；

根据判定的结果以及总受检数，计算群体保护率：

群体保护率=（抗体阳性数+抗体可疑数×75%）/总受检数×100%。

另外，若检测样品也可以制备成血浆，当检测样品制备成血浆时，步骤（1）为：采血，加入抗凝剂，3000转/分钟离心5分钟，上清即为血浆；

根据本方法制备得到的检测样品应为淡黄色、黄色、无乳糜、无溶血及异物的血清或血浆。各种常用抗凝剂对试验结果均无影响。如果不立即试验，可在2～8℃冰箱保存1～2天。长期储存需要在-18℃～-25℃冷冻，试验前应将样品置于室温平衡30分钟后，方可使用。

试验例1

取临床样本30例，采用实施例1所提供的检测猪伪狂犬抗体试剂盒，并用实施例2所提供的测定伪狂犬抗体的方法对样本进行测定，检测结果如表格1所示。

表格1试验例1样品OD值测定结果

注：本试验例中，当OD≥0.2时所测样品为阳性。

从表格1中可以看到，利用本试剂盒所测得的样品结果为：阳性23例，阴性7例。对比发现：本试验例测定结果与测定样品的实际结果完全相同，吻合率100%。本试验例中所使用的检测猪伪狂犬抗体试剂盒测定结果准确，不易出现假阳性和假阴性的误差判断，符合率为100%。

试验例2

从市面上购买口蹄疫阳性血清、蓝耳病阳性血清、猪瘟阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清，采用实施例1所提供的检测猪伪狂犬抗体试剂盒，并用实施例2所提供的测定伪狂犬抗体的方法对购买的血清进行测定，试验如下表2所示。

表格2试验例2样品OD值测定结果

注：样本号1-5为口蹄疫阳性血清，6-10为蓝耳病阳性血清，11-15为猪瘟阳性血清。16-20为猪伪狂犬阳性血清；本试验例中，当OD≥0.2时所测样品为阳性。

从表格2中可以看到，利用本试剂盒检测口蹄疫阳性血清、蓝耳病阳性血清、猪瘟阳性血清，结果均为阴性；当检测猪伪狂犬病毒阳性血清时，结果为阳性，从而证明本试验例所使用的检测猪伪狂犬抗体试剂盒拥有良好的特异性，克服了现有试剂盒特异性不强，容易出现误差判断的缺点，具有广阔的市场前景，并能够创造出更大的社会效益。

Claims

1.一种检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，包括猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体、快速包被液、快速封闭液、样品稀释液、TMB显色液、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照、阳性对照；

其中，所述的猪伪狂犬病毒gE抗原包被的酶联板通过如下方法制备得到：

(1)根据PRV的gE基因序列，设计一对引物P1、P2，其中，上游引物P1序列为：

5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC—3′，

下游引物P2序列为：

5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′，

然后通过PCR方法扩增PRV的gE基因的主要抗原表位区序列；

PCR的具体反应体系为：2.5μL 10×Buffer，0.5μL浓度为10mmoL/L dNTP混合物，0.5μL Taq DNA聚合酶，上游引物P1、下游引物P2各1μL，模板为3μL伪狂犬病毒DNA，加纯水至总体积25μL，其中10×Buffer、dNTP混合物、TaqDNA聚合酶均购自TaKaRa公司；

PCR的具体反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸35s，30个循环；72℃再延伸10min，扩增产物于4℃保存；

(2)回收PCR扩增产物，由于PCR扩增产物两端自带有BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，将pET28a载体用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后，再将其与PCR扩增产物连接，构建成重组载体pET28a-E3，将重组载体pET28a-E3进一步转化入大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，然后用浓度为0.4mM的IPTG诱导重组蛋白表达，应用亲和树脂进行表达蛋白的纯化，纯化的表达蛋白用pH为7.4，浓度为0.01M的PBS透析过夜，进行蛋白定量后-70℃保存备用；

(3)将猪伪狂犬病毒特异gE蛋白性抗原用快速包被液稀释至0.1μg/mL，然后加入到酶联板的微孔中，100μL/孔，室温置3～5分钟，再用快速封闭液150μL/孔室温封闭3～5分钟，弃去液体，干燥，封装；

(1)兔抗猪IgG制备：用猪IgG免疫家兔4只，第一次用弗氏完全佐剂与猪IgG混合均匀后多点注射免疫；半个月后，以弗氏不完全佐剂与猪IgG混合均匀后多点注射免疫；10天后，与耳缘静脉处，采血测效价，合格则采血，不合格则加强免疫；效价合格后，再过10天采血，分离血清，用饱和硫酸铵纯化后即得兔抗猪IgG，紫外分光光度计测蛋白含量；

(2)辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG：称取5mg的HRP溶于1ml蒸馏水中，加入200μL浓度为0.1M的NaIO₄，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋，用浓度为1mM，pH4.4的醋酸盐缓冲液透析4℃过夜，加20μL浓度为0.2M，pH9.5的碳酸盐缓冲液使溶液的pH值升到9.2，然后立即加入1ml兔抗猪IgG溶液，室温避光轻轻搅拌2小时后，再加入100μL新配的4mg/ml的NaBH₄溶液，混匀，在4℃放置2小时，将上述液体放入透析袋中用浓度为0.15M，pH7.4的PBS透析，4℃过夜，取出透析袋内液体，加入等量甘油后放置-20℃保存；所述的兔抗猪IgG溶液为10mg兔抗猪IgG溶解在1ml浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中，碳酸盐缓冲液是由质量分数为1.59％的Na₂CO₃、2.93％的NaHCO₃、0.2％的NaN₃所组成的水溶液。

2.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述快速包被液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的NaOH；所述快速封闭液是pH为10.0～14.0，浓度为0.1mol/L的KOH。

3.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中含有质量分数为1％的酪蛋白和质量分数为0.001％的NaN₃。

4.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述TMB显色液中TMB的质量浓度为0.3g/L；所述终止液是浓度为2M的H₂SO₄溶液。

5.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述20倍浓缩洗液包括质量浓度为21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、质量浓度为2.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、质量浓度为170g/L的NaCl和体积浓度为20ml/L的吐温-20。

6.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬抗体的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为经样品稀释液稀释的不含猪伪狂犬gE抗体的猪血清或猪血浆；所述阳性对照为经样品稀释液稀释的含有猪伪狂犬gE抗体的猪血清或猪血浆。