CN103983781A - 猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用 - Google Patents

猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用。该试纸卡包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳，样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内。样品吸收区包被有纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白；所述的金标探针区包被有胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体；固化抗体区依次有检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，和对照线C包被有羊抗鼠IgG。本发明的试纸卡操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、工艺简单可大量制备，成本低廉，适合基层大批量现场检测并可用于猪群PRV野毒感染的早期诊断。

Description

猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
 
技术领域
本发明涉及一种检测试纸卡及其制备方法，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用。
背景技术
猪伪狂犬病，是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的以怀孕母猪繁殖障碍、新生仔猪高热和神经僵直症状为特征的一种烈性传染病，可达100%的高死亡率。由于猪是该病最主要的贮存宿主，病猪和带毒猪均为本病的传染源，且流行范围遍及世界，严重危害着世界养猪业发展。
本病的检测方法较多，主要有ELISA和PCR等，但这些方法存在操作复杂、需要专门仪器和人员、检测时间长等缺点，胶体金免疫层析方法是在免疫渗滤的基础上发展起来的快速检测方法，该方法操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、并可大量制备，工艺简单、成本低廉，适合基层大批量现场检测。而且，目前这些方法多检测PRV抗原和IgG抗体，很少检测IgM抗体。而gE蛋白是PRV重要的糖蛋白，但其不是病毒增殖必须的蛋白，很多疫苗将便将其作为基因缺失疫苗的缺失段。因此gE IgM抗体的胶体金免疫层析法检测能快速有效区分野毒早期感染，为该病的早期诊断和预防以及猪场的净化提供了一种快速简便的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于弥补现有检测技术的缺点与不足，提供一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。该检测试纸卡将样品吸收区纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白作为检测抗原，特异性结合待检血清中猪伪狂犬病毒gE蛋白的IgM抗体，再结合胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体，固化抗体区检测线处包被的鼠抗猪IgM单克隆抗体进行捕获，利用夹心法进行猪伪狂犬病毒gE IgM抗体的检测。
本发明的另一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡在猪群PRV早期感染诊断中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳，样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内；所述的样品吸收区包被有纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白，其包被量优选为1～50μg；所述的金标探针区包被有金标探针，所述的金标探针为胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体，其标记量优选为每毫升胶体金标记1～30μg单抗，包被量优选为10～50μL/cm；固化抗体区依次有检测线T和对照线C，检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量优选为0.1～10μg/cm，对照线C包被有羊抗鼠IgG，包被量优选为0.1～10μg/cm。
所述的样品吸收区的材料为聚酯纤维膜；所述的金标探针区的材料为玻璃纤维膜；所述的固化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸；所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的卡壳为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。
上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤：将纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白包被于聚酯纤维膜上；将胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；将鼠抗猪IgM单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜检测线T处，将羊抗小鼠IgG包被于硝酸纤维素膜对照线C处。将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到聚乙烯板上，装入卡壳内，得到猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
优选的，所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤：
（1）纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白的制备：
1）提取猪伪狂犬病毒基因组，参照GenBank发表的登陆号为AF403050.1 PRV广东株基因序列，针对gE基因设计引物：
上游引物：5，-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3，，
下游引物：5，-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3，；
2）用步骤1）所述的基因设计引物扩增基因片段后克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段插入PET-32a原核表达载体，构建pET-32a-gE重组表达载体；
3）将构建的pET-32a-gE重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，进行诱导表达；
4）将步骤3）制得的表达产物经亲和层析法纯化后获得纯化的重组蛋白gE，作为样品吸收区包被用抗原。
（2）抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备包括如下步骤：
1）将前述猪伪狂犬病毒gE蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；用ELISA法和间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞；采用有限稀释法亚克隆后得到单抗杂交瘤细胞株；
2）选8周龄雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔注射抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，接种量为2×106细胞/0.5mL/只，一周后待小鼠腹部膨大抽取腹水，经硫酸铵沉淀纯化即得纯化的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体。
（3）胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的方法：取半径为20～40nm的浓度为0.01%的胶体金20mL调pH值为8.2～9.0，加入抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体20～600μg，在搅拌条件下使其结合，加BSA作为稳定剂，且使得BSA终浓度为0.1～10%，离心除去未结合的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.01M pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物。
（4）聚酯纤维膜的制备：将上述纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白用0.01M pH值为7.4的PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，包被量为1～50μg，烘干。
（5）玻璃纤维膜的制备：将上述胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物喷涂于玻璃纤维膜上，包被量为10～50μL/cm，冻干。
（6）硝酸纤维素膜的制备：检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1～10μg/cm，对照线C包被羊抗鼠IgG，包被量为0.1～10μg/cm。
（7）试纸卡制备：将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互重叠组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸，装入卡壳内，即得到猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡可用于猪群PRV早期感染诊断中，所述的早期感染包括疫苗接种或自然感染或其组合。其使用方法包括如下步骤：将待检血清样品3～4滴用1mL 0.01M pH值为7.4的PBS稀释后滴于样品孔中4～5滴，10～15min判定结果，对照线C出现红色表明试纸卡有效，对照线C和检测线T均出现红色，表明样品IgM抗体为阳性，仅对照线C出现红色，表明样品IgM抗体为阴性。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
（1）检测准确率和特异性高：本发明试纸卡与其他猪易感病原抗体没有交叉反应，检测敏感性与ELISA相当。
（2）检测快速：检测时间只需10～15分钟，满足基层以及现场检测的需要。
（3）携带方便，操作简便，结果直观易辨：本发明不需要其它仪器设备和专业技术人员，适合各级兽医院、大小猪场及个人使用。
（4）试纸卡在常温下即可保存，保存期可达1年，且重复性良好。
（5）本发明的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡采用胶体金标记猪伪狂犬病毒gE单克隆抗体作为探针，鼠抗猪IgM单克隆抗体包被硝酸纤维素膜，纯化的gE蛋白作为检测抗原，夹心法特异性捕获血清中PRV gE蛋白IgM抗体，建立了PRV gE蛋白IgM抗体胶体金免疫层析检测方法。除具有试纸卡检测本身优点外，又克服了抗原纯化过程以及纯度问题等导致的灵敏度低的缺点，显著提高了检测的特异性（特异性100%）和敏感性（灵敏度1:800），可用于猪群PRV野毒感染的早期快速诊断。
附图说明
图1是猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的结构示意图；其中，1为吸水区，2为固化抗体区，3为金标探针区，4为样品吸收区，5为底板，6为卡壳，7为检测线T，8为对照线C。
图2是试纸卡特异性试验结果图；其中，从左至右为猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株）免疫7日血清、猪伪狂犬病毒感染7日血清，猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株）免疫60天血清、猪伪狂犬病活疫苗（HB-98株）免疫7日血清、猪伪狂犬病毒IgM抗体阴性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体阳性血清、猪瘟IgM抗体阳性血清、猪细小病毒IgM抗体阳性血清、猪圆环病毒病IgM抗体阳性血清。
图3是试纸卡敏感性试验结果图；其中，1～7：已知阳性样品从1:50倍比稀释至1:3200。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做详细描述和具体说明，但并不限制本发明实质。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的结构示意图如图1所示，试纸卡内试纸条水平面从左到右依次为吸水区1、固化抗体区2、金标探针区3、样品吸收区4，依次相互部分重叠组装于底板5上切成4mm宽试纸条后装入卡壳6内即为猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡；吸水区1、固化抗体区2、金标探针区3、样品吸收区4，底板5的材料分别为吸水滤纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、聚酯纤维膜和聚乙烯板，卡壳6为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。固化抗体区2检测线T 7处包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为2μg/cm，对照线C 8处包被有羊抗鼠IgG，包被量为4μg/cm。金标探针区3包被有胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体，标记量为12μg单抗/mL胶体金，包被量为25μL/cm；样品吸收区4包被有纯化的PRV gE蛋白抗原30μg。
上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡制备方法如下：
（1）纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白的制备：
1）提取猪伪狂犬病毒基因组，参照GenBank发表的登陆号为AF403050.1 PRV广东株基因序列，针对gE基因设计引物：
上游引物：5，-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3，，
下游引物：5，-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3，；
2）将步骤1）所述的基因设计引物扩增基因片段后克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段插入PET-32a原核表达载体，构建pET-32a-gE重组表达载体；
3）将构建的pET-32a-gE重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，进行诱导表达；
4）将步骤3）制得的表达产物经亲和层析法纯化后获得纯化的重组蛋白gE，作为样品吸收区包被用抗原。
（2）抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备包括如下步骤：
1）将前述猪伪狂犬病毒gE蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；用ELISA法和间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞；采用有限稀释法亚克隆后得到单抗杂交瘤细胞株；
2）选8周龄雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔注射抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，接种量为2×106细胞/0.5mL/只，一周后待小鼠腹部膨大抽取腹水，经硫酸铵沉淀纯化即得纯化的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体。
（3）胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的方法：取半径为25nm pH值为9.0浓度为0.01%的胶体金25mL，加入抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体300μg，在搅拌条件下使其结合，加BSA至终浓度为5%，离心除去未结合的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.01M pH值为7.4的PBS溶解，即为胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物。
（4）聚酯纤维膜的制备：将上述纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白用0.01M pH 7.4 PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，包被量为30μg，烘干。
（5）玻璃纤维膜的制备：将上述胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物喷涂于玻璃纤维膜上，25μL/cm，冻干。
（6）硝酸纤维素膜的制备：检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为2μg/cm，对照线C包被羊抗鼠IgG，包被量为4μg/cm。
（7）试纸卡制备：将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互重叠组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸，装入卡壳内，即得到猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
实施例2
除检测线T 7包被抗猪IgM单克隆抗体的量为6μg/cm；对照线C 8包被羊抗小鼠IgG的量为8μg/cm；金标探针区3包被的胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的标记量为10μg/mL，包被量为20μL/cm；胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的方法：取半径为40nm pH值为8.2浓度为0.01%的胶体金20mL，加入抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体200μg，在搅拌条件下使其结合，加BSA至终浓度为8%，离心除去未结合的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.01M pH 7.4 PBS缓冲液溶解，即为胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物外，其余与实施例1相同。
实施例3
上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的使用方法：
将待检血清样品3～4滴用1mL 0.01M pH 7.4 PBS稀释后滴于样品孔中4～5滴，10～15min判定结果，对照线C出现红色表明试纸卡有效，对照线C和检测线T均出现红色，表明样品PRV IgM抗体为阳性，仅对照线C出现红色，表明样品PRV IgM抗体为阴性。
实施例4
本发明猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的特异性和敏感性测试：
应用实施例1和2制备的两种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡分别检测已知的猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株，gE未缺失）免疫7日血清、猪伪狂犬病毒感染7日血清，猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株）免疫60天血清、猪伪狂犬病活疫苗（HB-98株，gE缺失）免疫7日血清、猪伪狂犬病毒IgM抗体阴性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体阳性血清、猪瘟IgM抗体阳性血清、猪细小病毒IgM抗体阳性血清、猪圆环病毒病IgM抗体阳性血清。将待检血清样品3～4滴用0.01M pH值为7.4的PBS 1mL稀释后滴于样品孔中4～5滴，10～15min判定结果。结果表明（见图2和表1）：猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株）免疫7日血清和猪伪狂犬病毒感染早期血清检测结果为阳性，其它血清检测结果为阴性，特异性良好；说明本发明试纸卡可用于包括猪伪狂犬病毒疫苗接种或自然感染或其组合早期感染的诊断。
表1本发明特异性检测结果
样品号 样品名称 检测结果
1 猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株）免疫7日血清 +
2 猪伪狂犬病毒感染7日血清 +
3 猪伪狂犬病灭活疫苗（鄂A株）免疫60天血清 -
4 猪伪狂犬病活疫苗（HB-98株）免疫7日血清 -
5 猪伪狂犬病毒IgM抗体阴性血清 -
6 猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体阳性血清 -
7 猪瘟IgM抗体阳性血清 -
8 猪细小病毒IgM抗体阳性血清 -
9 猪圆环病毒病IgM抗体阳性血清 -
将ELISA检测IgM抗体效价为1:800的阳性血清用0.01M pH值为7.4的 PBS从1:50依次倍比稀释至1:3200，应用实施例1制备的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡检测，将PBS稀释的待检血清样品4～5滴滴于样品孔中，10～15min判定结果。结果表明（见图3和表2）：本发明试纸卡检测已知IgM抗体效价为1:800的阳性血清的最高稀释倍数为1:800，与ELISA检测结果相当，表明敏感性良好。
表2本发明敏感性检测结果
样品号 血清稀释倍数 检测结果
1 1:50 +
2 1:100 +
3 1:200 +
4 1:400 +
5 1:800 +
6 1:1600 -
7 1:3200 -
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  武汉中博生物股份有限公司
 
<120>  猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
 
<130>  1
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  上游引物
 
<400>  1
atggattcat gctgagggag gcacccccg                                         29
 
 
<210>  2
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  下游引物
 
<400>  2
cgaagcttta ataacggccg gtcgcccac                                         29

Claims (7)

1.一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于：包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳；样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内；所述的样品吸收区包被有纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白；所述的金标探针区包被有金标探针，所述的金标探针为胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体；所述的固化抗体区依次有检测线T和对照线C，所述的检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，所述的对照线C包被有羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于：所述的纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白的包被量为1～50μg；所述的金标探针的标记量为1～30μg/mL，包被量为10～50μL/cm；所述的鼠抗猪IgM单克隆抗体的包被量为0.5～10μg/cm；所述的羊抗鼠IgG的包被量为0.1～10μg/cm。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，其特征在于：所述的样品吸收区的材料为聚酯纤维膜；所述的金标探针区的材料为玻璃纤维膜；所述的固化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸；所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的卡壳为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。
4.权利要求1-3任一项所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白包被于聚酯纤维膜上；将胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；在硝酸纤维素膜检测线T处包被鼠抗猪IgM单克隆抗体、对照线C处包被羊抗鼠IgG；将包被有纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白的聚酯纤维膜、包被有胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜、包被有检测线T和对照线C的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次组装到聚乙烯板上，装入卡壳内，得到猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白的制备：
1）提取猪伪狂犬病毒基因组，参照PRV广东株基因序列，针对gE基因设计引物：
上游引物：5，-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3，，
下游引物：5，-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3，；
2）用步骤1）所述的基因设计引物扩增基因片段后克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段插入PET-32a原核表达载体，构建pET-32a-gE重组表达载体；
3）将构建的pET-32a-gE重组表达载体转化至大肠杆菌BL21中，进行诱导表达；
4）将步骤3）制得的表达产物经亲和层析法纯化后获得纯化的重组蛋白gE；
（2）抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备：包括如下步骤：
1）将前述猪伪狂犬病毒gE蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；用ELISA法和间接免疫荧光方法筛选阳性杂交瘤细胞；采用有限稀释法亚克隆后得到单抗杂交瘤细胞株；
2）选8周龄雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔注射抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，接种量为2×106细胞/0.5mL/只，一周后待小鼠腹部膨大抽取腹水，经硫酸铵沉淀纯化即得纯化的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体；
（3）胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的方法：分别取半径为20～40nm的浓度为0.01%的胶体金20mL调pH值为8.2～9.0，加入抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体20～600μg，在搅拌条件下使其结合，加BSA作为稳定剂，且使得BSA终浓度为0.1～10%，离心除去未结合的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒以及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀用2mL 0.01M pH值为7.4的 PBS溶解，即为胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物；
（4）聚酯纤维膜的制备：将上述纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白用0.01M pH值为7.4的 PBS溶解后均匀包被于聚酯纤维膜上，包被量为1～50μg，烘干；
（5）玻璃纤维膜的制备：将上述胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的复合物喷涂于玻璃纤维膜上，包被量为10～50μL/cm，冻干；
（6）硝酸纤维素膜的制备：检测线T包被鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1～10μg/cm，对照线C包被羊抗鼠IgG，包被量为0.1～10μg/cm；
（7）试纸卡制备：将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次相互重叠组装到聚乙烯板上，用切条机切成4mm宽试纸，装入卡壳内，即得到猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。
6.权利要求1-3任一项所述的所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡在猪群PRV早期感染诊断中的应用，其特征在于：所述的早期感染包括疫苗接种或自然感染或其组合。
7.权利要求1-3任一项所述的所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的使用方法，其特征在于包括如下步骤：将待检血清样品3～4滴用1mL 0.01M pH值为7.4的 PBS稀释后滴于样品孔中4～5滴，10～15min判定结果，对照线C出现红色表明试纸卡有效，对照线C和检测线T均出现红色，表明样品IgM抗体为阳性，仅对照线C出现红色，表明样品IgM抗体为阴性。
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