CN101930003B - 抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法，在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜上铺设玻璃纤维纸以及硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上包被检测线和对照线，检测线侧贴有金标探针聚酯膜，对照线侧贴有吸水滤纸，其中检测线是包被狂犬病毒纯化抗原，对照线是包被抗SPA纯化抗体。本发明的试剂板检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，可供多种动物和人的狂犬病毒抗体检测。检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。

Description

抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂板及制备方法，具体地是一种抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的人畜共患传染病，其主要宿主为犬、猫等动物。典型症状为恐水症，又称：恐水病。本病极为凶险，病死率几乎为100％。随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大。从宠物医疗市场得到的信息，人们迫切希望了解宠物犬接种狂犬疫苗后犬只是否获得保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于印度。由于狂犬病是人畜共患性疾病，多数的人狂犬病是与人类密切接触的带毒犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。

目前，国内外用ELISA方法检测人血清中抗狂犬病毒抗体，辅助临床上狂犬病的诊断和用于狂犬疫苗效果的评价方法已经成熟。用于实验动物包括犬、猴、鼠等狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒，也有一定的研究和报道。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。ELISA方法虽然灵敏度高，但容易出现假阳性结果。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。而胶体金免疫层析法刚好可以避免以上几种检测方法的缺点。该方法是一种很成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低，操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受。中国专利公开号为CN1963509的专利申请公开了一种狂犬病毒保护性抗体胶体金检测试纸条，该法采用包被糖蛋白，标记狂犬病毒的双抗原夹心法。中国专利公开号为CN101029894的专利申请公开了一种动物狂犬病毒抗体双抗原夹心胶体金检测试纸及制备方法，该法采用包被狂犬病毒，标记GP/NP的双抗原夹心法。中国专利公开号为CN101042401的专利申请公开了一种犬抗狂犬病毒抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法，该法采用包被糖蛋白，标记二抗的间接检测犬抗狂犬病毒IgG的方法。中国专利公开号为CN1326101A的专利申请公开了一种胶体金免疫层析狂犬病病毒抗体检测试剂条及制备方法，该法采用包被狂犬病毒，标记抗人二抗的间接检测人抗狂犬病毒IgG的方法。

以上文献资料涉及的方法存在着检测受种属限制和蛋白纯化及复性困难的缺点。

发明内容

本发明的目的为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，而提供一种抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法。本发明采用金标记蛋白A(SPA)做探针，包被狂犬病毒和抗SPA抗体的间接法检测抗狂犬病毒IgG抗体，可供多种动物和人的抗体检测。本发明的试剂板检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。

本发明的技术方案为：

抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为：样品吸收区1、金标记蛋白A(SPA)区2、固相化抗原、抗体区3和吸水区4，样品吸收区1铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上铺设玻璃纤维膜，且玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜7和硝酸纤维素膜6；硝酸纤维素膜6上包被检测线31和对照线32，其中检测线31侧贴有金标探针聚酯膜7，对照线32侧贴有吸水滤纸8，其特征在于：检测线31包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为0.1-10μg蛋白；对照线32包被的是抗SPA纯化抗体，包被量为0.1-10μg蛋白，金标探针合适SPA标记量为1-10μg/ml。

抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)狂犬病毒纯化抗原的制备：将狂犬病毒悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培养5～6天后，每隔3天连续收取培养液上清液3次；将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入体积浓度为1/3000的甲醛溶液灭活病毒；将灭活的病毒悬液于5000rpm离心30分钟去沉淀，上清液通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化得狂犬病毒纯化抗原；

(2)胶体金标记SPA的方法：分别取半径为5-40nm的胶体金20ml及SPA 50-200μg，在pH6.0-7.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1-5％，采用离心法除去未结合的SPA和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-SPA复合物；

(3)将胶体金-SPA复合物喷涂于聚酯膜上：用20ml聚乙二醇洗涤胶体金-SPA复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2ml浓度为2mmol/L，pH6.0-8.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，冻干；

(4)免疫层析膜的包被：检测线包被的是狂犬病毒纯化抗原，对照线包被的是抗SPA纯化抗体，每条线宽2-5mm，狂犬病毒纯化抗原合适包被量为0.1-10μg蛋白，抗SPA纯化抗体合适包被量为0.1-10μg蛋白；

(5)试剂板装备：用聚乙烯板作为支撑载体，上面依次粘上一层聚氯乙烯衬膜、玻璃纤维组成样品吸收区，再依次铺上吸附了胶体金-SPA复合物的聚酯膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸，外面用胶带包封制成。

本发明的试剂板具有以下优点：

检测时，抽取被测者少量血清，滴在该试剂板上，对比检测线和对照线的颜色，即可判定被测者体内是否产生了抗狂犬病毒IgG抗体。

1、检测快速：检测时间只需5-10分钟，能够满足现场检测的需要。

2、检测准确率高、特异性强：本反应与其他犬易感病原体没有交叉反应，检测灵敏度与ELISA基本相同。

3、携带方便，操作简便：本发明不需要借助其它仪器设备，适合各级人兽医院及个人使用。

4、检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。

附图说明

图1为抗狂犬病毒IgG抗体检测试剂板平面结构区域图。

图2为抗狂犬病毒IgG抗体检测试剂板纵切面结构图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细的说明：

实施例1：如图1、图2所示，抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为：样品吸收区1、金标SPA区2、固相化抗原、抗体区3和吸水区4，样品吸收区1铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上铺设玻璃纤维膜，且玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜7和硝酸纤维素膜6；硝酸纤维素膜6上包被检测线31和对照线32，其中检测线31侧贴有金标探针聚酯膜7，对照线32侧贴有吸水滤纸8，检测线31包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为0.1μg蛋白；对照线32包被的是抗SPA纯化抗体，包被量为0.1μg蛋白，金标探针合适SPA标记量为1μg/ml。

上述抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板制备方法如下：

(1)狂犬病毒纯化抗原的制备：将狂犬病毒悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培养5或6天后，每隔3天连续收取培养液上清液3次；将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入体积浓度为1/3000的甲醛溶液灭活病毒；将灭活的病毒悬液于5000rpm离心30分钟去沉淀，上清液通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化得狂犬病毒纯化抗原；

(2)胶体金标记SPA的方法：分别取半径为40nm的胶体金20ml及SPA50μg，在pH6.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为5％，采用离心法除去未结合的SPA和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-SPA复合物；

(3)将胶体金-SPA复合物喷涂于聚酯膜上：用20ml聚乙二醇洗涤胶体金-SPA复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2ml浓度为2mmol/L，pH6.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，冻干；

(4)免疫层析膜的包被：检测线包被的是狂犬病毒纯化抗原，对照线包被的是抗SPA纯化抗体，每条线宽2mm；

(5)试剂板装备：用聚乙烯板作为支撑载体，上面依次粘上一层聚氯乙烯衬膜、玻璃纤维组成样品吸收区，再依次铺上吸附了胶体金-SPA复合物的聚酯膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸，外面用胶带包封制成。

实施例2：

除检测线31包被量为10μg蛋白；对照线32包被的是抗SPA纯化抗体，包被量为5μg蛋白，金标探针合适SPA标记量为10μg/ml，胶体金标记SPA的方法：分别取半径为5nm的胶体金20ml及SPA 200μg，在pH7.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1％，采用离心法除去未结合的SPA和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-SPA复合物外，其余与实施例1相同。

实施例3：

除检测线31包被量为5μg蛋白；对照线32包被的是抗SPA纯化抗体，包被量为10μg蛋白，金标探针合适SPA标记量为5μg/ml，胶体金标记SPA的方法：分别取半径为20nm的胶体金20ml及SPA 100μg，在pH7.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为2.0％，采用离心法除去未结合的SPA和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-SPA复合物外，其余与实施例1相同。

抗狂犬病毒IgG抗体快速检测试剂板的使用方法：

检测时，抽取被测者少量血清，滴在该试剂板上，对比检测线和对照线的颜色，检测线出现红色为阳性反应，如检测线无此反应，即为阴性，表明血清中没有狂犬病抗体或抗体量不足，应及时加强免疫。对照线不管血清中有没有狂犬病抗体均出现红色的阳性反应，表明试剂板有效，如对照线无反应，说明试剂板失效。

Claims (1)

1.抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为：样品吸收区（1）、金标记SPA区（2）、固相化抗原、抗体区（3）和吸水区（4），样品吸收区（1）铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜（5）上铺设玻璃纤维膜，且玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜（7）和硝酸纤维素膜（6）；硝酸纤维素膜（6）上包被检测线（31）和对照线（32），其中检测线（31）侧贴有金标探针聚酯膜（7），对照线（32）侧贴有吸水滤纸（8），其特征在于：检测线（31）包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为0.1-10μg蛋白；对照线（32）包被的是抗SPA纯化抗体，包被量为0.1-10μg蛋白，金标探针合适SPA标记量为1-10μg/ml。

2、抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）狂犬病毒纯化抗原的制备：将狂犬病毒悬液接种到已长成单层的Vero细胞上，35℃培养5～6天后，每隔3天连续收取培养液上清液3次；将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入体积浓度为1/3000的甲醛溶液灭活病毒；将灭活的病毒悬液于5000rpm离心30分钟去沉淀，上清液通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化得狂犬病毒纯化抗原； 

（2）胶体金标记SPA的方法：分别取半径为5-40nm的胶体金20ml及SPA 50-200μg，在pH6.0-7.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1-5％，采用离心法除去未结合的SPA和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－SPA复合物；

（3）将胶体金－SPA复合物喷涂于聚酯膜上：用20ml聚乙二醇洗涤胶体金－SPA复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2ml浓度为2mmol/L，pH6.0-8.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，冻干；

（4）免疫层析膜的包被：检测线包被的是狂犬病毒纯化抗原，对照线包被的是抗SPA纯化抗体，每条线宽2-5mm，狂犬病毒纯化抗原合适包被量为0.1-10μg蛋白，抗SPA纯化抗体合适包被量为0.1-10μg蛋白；

（5）试剂板装备：用聚乙烯板作为支撑载体，上面依次粘上一层聚氯乙烯衬膜、玻璃纤维组成样品吸收区，再依次铺上吸附了胶体金－SPA复合物的聚酯膜、硝酸纤维膜和吸水滤纸，外面用胶带包封制成。