CN110274982B - 狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 - Google Patents

狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法。该方法，包括：首先用SDS‑PAGE法和TEM法对目标峰定性鉴定；然后用蛋白定量试剂盒测定标准品的浓度；将此标准品进行系列稀释，用凝胶色谱柱在色谱仪上检测标准品在280nm处的吸收峰，建立浓度和峰面积的线性回归方程；根据线性回归方程和待测样品的峰面积计算得到待测样品中的狂犬病毒灭活抗原浓度。本发明的方法可用于狂犬病毒生产的质量控制，具有快速、稳定、重复性好的优点，可指导疫苗的生产，对提高疫苗品质起到重要作用。

Description

狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及病毒的定量检测方法，具体涉及狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法。
背景技术
狂犬病毒由弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)引起的一种人畜共患、急性、高度致死性的传染病。根据对狂犬病毒N蛋白单克隆抗体以及G蛋白系列的分析和鉴定，全球各地的狂犬病毒主要分成4个血清型。其中血清1型即为人们所熟知的地理分布最广、对世界人民健康威胁最大的狂犬病毒，包括野病毒和固定毒实验室株(如SAD)。随着现代分子生物学的研究进展，参照狂犬病毒核蛋白(N protein)基因N端500个核苷酸的相似率，狂犬病毒属被分成7种基因型，基因型2～6只在欧洲和非洲发现。RABV呈典型的子弹状，其长度大约180nm，直径75nm。狂犬病毒颗粒包括核衣壳和外壳两部分，将其进行免疫染色后在电子显微镜下观察可发现其表面有子弹状突起物，同时也可观察到狂犬病毒内部存在一系列的似蜂窝状结构的条纹。狂犬病毒为不分节段的单股负链RNA病毒，其基因组总长度约1,2000nt，主要编码五种已知的结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。上述编码五种结构蛋白基因在病毒RNA基因组中从3’到5’依次为N、P、M、G、L，其中在N基因前存在一段长度为56nt或58nt的Leader RNA序列，在G和L基因之间存在423nt的假基因(ψ)序列。其中，N，P，L形成高度螺旋的核糖核蛋白复合体(RNP)，在病毒复制、转录及诱导细胞免疫和体液免疫方面发挥关键作用，RNP被M蛋白和G蛋白构成的病毒衣壳包裹成完成的病毒粒子。狂犬病毒因其高致病性，一直以来，对狂犬病毒的评价主要是NIH法，即免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。该方法耗时长、操作复杂，需用参考疫苗进行对照，且对试验人员有一定的安全隐患，不适宜用于疫苗生产的质量控制。
狂犬病毒分子量大，约为475000KD，目前狂犬病毒检测方法主要以抗体检测试剂盒测定狂犬抗体为主。对狂犬抗原的检测方法较少，主要有核酸检测、酶联免疫两种方法。狂犬病免疫荧光抗原检测试剂盒、狂犬病病毒巢式RT-PCR检测试剂盒这两种试剂盒都基于核酸检测，而且核酸到蛋白质涉及转录后翻译过程，与实际病毒蛋白的含量不一定呈正比，因此核酸检测法仅是对实际抗原含量的间接反映。基于核酸检测的方法，需要保持环境的严格控制，否则核酸的气溶胶污染很容易造成检测结果的假阳性，且很难在短时间内完全清除核酸的气溶胶污染，对试验环境要求较高。另外有狂犬病疫苗抗原测定试剂盒，是基于酶联免疫法，将已知狂犬病抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，然后进行抗原的定量，该方法需要制备抗体，其对不同狂犬病毒株的特异性反应存在差别。
高效液相色谱法(HPLC)是一种操作简单、高效和灵敏度高的分析方法，分析速度快。凝胶色谱柱分离的原理是根据物质分子量的大小在凝胶色谱柱上实现分离，是一种高效的分子筛效应，分离过程中不会对样品造成损害。该法区别于其他方法的最优处在于是对病毒粒子进行检测，直接反映样品的真实状态。并且检测过程可视化，即病毒粒子的色谱吸收峰直观地呈现在色谱图上，配备的紫外检测器可通过色谱峰积分面积的大小就可直观反映出不同灭活抗原的病毒含量高低。样品无需特别处理，检测时间短，半小时内就可出结果。操作简单，属仪器分析法，人为操作的失误极小，重复进样的相对标准偏差一般小于2％，重复性非常好。非常适宜进行中间质控和成品检测。因此，利用HPLC检测技术进行狂犬病毒的定量分析，不仅能缩短传统的ELISA法的检测时间，还能提高检测稳定性，有利于狂犬病抗原生产的质量控制，进而起到提升狂犬病疫苗产品品质的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种操作简单、灵敏度高、重复性好的狂犬病毒灭活抗原的检测方法。本发明根据狂犬病毒的结构特征，设计采用凝胶柱分离的高效液相色谱检测方法，结合样品处理、标准品的制备以及检测条件优化，建立了高效的狂犬灭活抗原的定量方法，解决了生产实际中狂犬病毒难以快速定量的关键技术问题。
本发明的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，用于对待测样品中的狂犬病毒灭活抗原进行定量检测，包括下述步骤：
(1)对目标峰进行定性鉴定
(2)待测样品进行离心澄清；
(3)用蛋白定量试剂盒测定标准品中抗原浓度；
(4)取标准品进行系列稀释，使用高效液相色谱法上进行检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程；
(5)对待测样品用步骤(4)所述的高效液相色谱法进行检测得到对应的峰面积；
(6)根据线性回归方程及样品中狂犬抗原的峰面积计算得到待测样品中的狂犬病毒灭活抗原浓度；
其中，(4)、(5)中所使用的高效液相色谱法使用的色谱柱为凝胶色谱柱，检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。
所述高效液相色谱法流动相为含10mM磷酸氢二钠、40mM磷酸二氢钠和0.1M硫酸钠，pH为7.2的缓冲液。
所述流动相的流速为0.5-1.0ml/min，优选为0.6ml/min，进样量：50μl
优选的，凝胶色谱柱为Thermo Bio Basic SEC-1000或TSKgel G4000SWXL或TSKgel G6000 PWxl。
待测样品选自悬浮培养液、分离纯化液或抗原成品中的任意一种。
待测样品采用10000r/min进行离心澄清。
狂犬病毒灭活抗原在色谱上的保留时间为19.9min。
在本发明的一个实施方式，步骤(1)中，采用SDS-PAGE法、透射电子显微镜法对目标峰进行定性鉴定。
更进一步的，步骤(2)中，所述待测样品选自悬浮培养液、分离纯化液或抗原成品中的任意一种。
所述步骤(2)中，所述待测样品采用10000r/min离心5分钟进行澄清。
所述步骤(3)中，用Lorry法蛋白定量试剂盒测定标准品中抗原浓度。
所述步骤(4)中，取蛋白含量已被确定的狂犬病毒灭活抗原标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行色谱检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程，R2应大于0.99。
发明作用与效果
根据本发明提供的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，由于采用了基于凝胶色谱柱的HPLC法来对病毒进行检测，因此能够有效地分离病毒和杂质，达到检测病毒的目的。更适用于实际生产过程的产品检测和质量控制。通过定量狂犬病毒中灭活抗原的含量，可有效指导疫苗的生产，对于提升疫苗的品质具有重大指导意义。
附图说明
图1是狂犬病毒标准品的HPLC检测结果；
图2是狂犬病毒标准品的SDS-PAGE鉴定结果；
图3是狂犬病毒标准品的透射电镜(TEM)鉴定结果；
图4是狂犬病毒定量的标准曲线；
图5是悬浮培养液样品的检测结果；
图6是同一样品5次重复检测结果。
具体实施方式
本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
本发明所采用的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法主要包括以下步骤：
1、材料
1.1标准品：购自中检院的狂犬疫苗标准品
1.2仪器和试剂：高效液相色谱仪购自岛津公司，型号为：LC20A。
液相色谱检测系统由恒定流速泵、检测器、色谱工作站组成。泵流速准确度1％；检测器为紫外检测器，波长范围：190-700nm；波长精密度<0.1nm，波长准确度≤1nm。色谱工作站具有强大的数据处理能力，自动判峰，自动积分计算峰面积。
2、方法
2.1标准品中狂犬抗原的定性鉴定：取购买的标准品以10000rpm离心5分钟，取上清50μl，用液相色谱检测，得到标准品在280nm的吸收图谱。
收集组分，用SDS-PAGE法和TEM法对组分进行定性鉴定。根据鉴定结果，确定收集的组分为狂犬病毒。
2.2标准品蛋白浓度测定：用Lorry法蛋白定量试剂盒测定标准品浓度；
2.3高效液相色谱体系：流动相为含10mM磷酸氢二钠、40mM磷酸二氢钠和0.1M硫酸钠，pH为7.2的缓冲液；凝胶色谱柱为Thermo Bio Basic SEC-1000或TSKgel G4000SWXL或TSKgel G6000 PWXL；流速为0.6ml/min；进样量50μl。
2.4建立线性回归方程：对浓度已知的狂犬病毒灭活抗原标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行HPLC检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程；
待测样品准备：待测样品以10000rpm离心5分钟，取上清液，待测；
待测样品检测：用于标准品相同的方法，对待测样品进行HPLC检测得到对应的样品峰面积；
根据线性回归方程及样品峰面积计算得到待测样品中的狂犬抗原浓度。
实施例1、
1、仪器与试剂
岛津高效液相色谱仪LC20A，配备紫外检测器。
流动相的配制：取磷酸氢二钠十二水合物、磷酸二氢钠二水合物和无水硫酸钠，用超纯水溶解，定容至1000mL，配制成含10mM磷酸氢二钠、40mM磷酸二氢钠和0.1M硫酸钠，pH为7.2的缓冲液，0.45μm滤膜过滤。凝胶色谱柱为Thermo Bio Basic SEC-1000或TSKgelG4000SWXL或TSKgel G6000 PWXL；流速为0.6ml/min。
待测样品：狂犬病毒悬浮培养灭活抗原
上样量：50μl
2、狂犬病毒标准品
从中检院购买狂犬病疫苗国家标准品(货号：250009)。
图1为本发明实施例的狂犬病毒标准品的HPLC检测结果。如图1所示，经过HPLC检测，标准品中的狂犬病毒保留时间为19.9min，标准品中抗原纯度>98％。
图2为本发明实施例中狂犬病毒标准品保留时间19.9min的特征峰的SDS-PAGE电泳检测结果。电泳结果显示，特征峰中含26KD、55KD、72KD的条带，这三种蛋白分别对应狂犬病毒的M蛋白、N蛋白、G蛋白。表明此特征峰为狂犬病毒。
图3是本发明实施例中狂犬病毒标准品HPLC特征峰的透射电子显微镜观察结果。可见明显的呈子弹状的狂犬病毒粒子，进一步说明此特征峰为狂犬病毒。
3、病毒标准品的标准曲线绘制
将狂犬病毒标准品用Lorry法进行蛋白定量。
然后用与流动相相同的缓冲液将标准品稀释成浓度为3300μg/ml、1650μg/ml、660μg/ml、412.5μg/ml、330μg/ml、206.25μg/ml等浓度的标准品溶液。取50μl进行检测，流动相含10mM磷酸氢二钠、40mM磷酸二氢钠和0.1M硫酸钠，pH为7.2的缓冲液，流速0.6ml/min，检测波长280nm。记录保留时间为19.9min特征峰面积，每组重复3次，结果如表1所示。
表1:不同浓毒狂犬病毒标准品检测结果
Figure BDA0002110736420000061
以狂犬病毒的浓度与特征峰面积作线性回归，结果如图4所示，狂犬病毒抗原浓度与特征峰面积的线性关系是y＝0.0003x-87.085(y：浓度，单位μg/ml；x：峰面积值)；R2值为0.9994,说明狂犬抗原的特征峰峰面积与浓度的线性关系高，证明本发明的检测方法可用于狂犬抗原的定量检测。
4、样品检测精密度
将已知浓度的标准品(330μg/ml)加入培养液中，用HPLC法平行检测5次，检测结果如图6；记录每次检测特征峰的峰面积值，计算检测的精密度和回收率，结果如下表2所示。
表2:检测的精密度和回收率
Figure BDA0002110736420000062
如表2所示，一个样品平行测定5次，样品的相对标准偏差仅为0.28％，方法的精密度高；平均回收率为101.61％，方法的回收率高。
5、样品含量测定
对悬浮培养的狂犬病毒灭活抗原量进行定量，样品用离心法澄清(待测样品以10000rpm离心5分钟，取上清液，待测)，取50μl检测。
图5为本发明实施例的样品的HPLC检测结果。
如图5所示，上述样品的检测结果图谱中，保留时间19.9min处有狂犬病毒的特征峰。连续检测3次，通过标准曲线可计算出3次检测的浓度分别为374.23μg/ml、376.49μg/ml、374.81μg/ml，由此计算出此悬浮培养的狂犬病毒抗原含量为375.17μg/ml。
实施例作用与效果
本实施例提供的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，采用了基于凝胶色谱柱的HPLC法对狂犬病毒进行定量检测，能有效将病毒和杂质分离，达到检测病毒的目的。本实施例的相对标准偏差仅为0.28％，方法的重复性好、精密度高，能够达到检测方法的定量要求，可以作为狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法应用。
HPLC具有操作简便、检测时间短等优点，使得本实施例的定量检测方法适用于狂犬疫苗产业化生产过程中的质量控制。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，用于对待测样品中的狂犬病毒灭活抗原进行定量检测，其特征在于：包括下述步骤：
（1）对目标峰进行定性鉴定
（2）待测样品进行离心澄清；所述待测样品选自含狂犬病毒灭活抗原的悬浮培养液、分离纯化液或抗原成品中的任意一种；
（3）用蛋白定量试剂盒测定标准品中抗原浓度；
（4）取标准品进行系列稀释，用高效液相色谱（HPLC）法进行检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程；
（5）对待测样品用步骤（4）所述的高效液相色谱（HPLC）法进行检测得到对应的峰面积；
（6）根据线性回归方程及样品中狂犬抗原的峰面积计算得到待测样品中的狂犬病毒灭活抗原浓度；
其中，（4）、（5）中所使用的高效液相色谱法使用的色谱柱为凝胶色谱柱，检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm；所述高效液相色谱法的流动相为含10mM磷酸氢二钠、40mM磷酸二氢钠和0.1M 硫酸钠，pH为7.2的缓冲液；所述流动相的流速为0.5-1.0ml/min；所述凝胶色谱柱为Thermo Bio Basic SEC-1000或TSKgel G4000SWXL或TSKgel G6000 PWXL。
2.根据权利要求1所述的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，其特征在于：进样量为50µl；所述流动相的流速为0.6ml/min；所述狂犬病毒灭活抗原在色谱上的保留时间为19.9min。
3.根据权利要求1所述的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，其特征在于：
步骤（1）中，采用SDS-PAGE法、透射电子显微镜（TEM）法对目标峰进行定性鉴定。
4.根据权利要求1所述的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，其特征在于：
步骤（2）中，所述待测样品采用10000r/min离心5分钟进行澄清。
5.根据权利要求1所述的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，其特征在于：
步骤（3）中，用Lorry法蛋白定量试剂盒测定标准品中抗原浓度。
6.根据权利要求1所述的狂犬病毒灭活抗原的定量检测方法，其特征在于：
步骤（4）中，取蛋白含量已被确定的狂犬病毒灭活抗原标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行色谱检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程，R2应大于0.99。
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