CN104634891A - 一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146s测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146S测定方法。该方法采用分子量分离范围为2×10⁴-1×10⁷Da的尺寸排阻高效液相色谱柱，在高效液相色谱仪上对被检测的样品进行色谱分离。色谱仪操作压力为1.0-2.5MPa，色谱柱内的流速为0.5-1.0ml/min，流动相为含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.0-7.5)，柱温为15-25℃。采用紫外和激光检测器在尺寸排阻高效液相色谱柱出口检测流出液的光学信号，并经过高效液相色谱仪的计算机软件系统分析样品的出峰面积。通过对不同浓度的146S标准品紫外吸收峰与其浓度的关系，建立吸收峰面积和146S浓度的标准曲线。再对被测样品通过尺寸排阻高效液相色谱柱进行色谱分离。测量其紫外吸收峰面积，根据前述的标准曲线，获得被测样品中的146S浓度。

Description

一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146S测定方法

技术领域

本发明涉及对口蹄疫疫苗抗原146S进行定量分析，具体涉及用尺寸排阻高效液相色谱柱和高效液相色谱系统及方法定量病毒液中口蹄疫抗原146S含量的方法。

背景技术

口蹄疫病毒样品中与刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完整病毒颗粒，其沉降系数为146S，被认为与口蹄疫疫苗的效率具有平行关系。因此146S的含量是评价口蹄疫疫苗质量的一个重要指标。146S稳定性弱，例如在温和加热或pH低于6.0的条件下即会发生裂解，而裂解后的产物的免疫原性极低。因此对于口蹄疫疫苗的生产过程中及疫苗成品的储存过程中146S的定量都尤为重要，需要建立快速、准确的定量方法。

目前已有报道的口蹄疫抗原定量技术主要有：(1)细胞半数感染量(TCID50)测定；(2)补体结合试验(CFT)；(3)免疫扩散法；(4)ELISA定量法；(5)蔗糖密度梯度离心法；(6)凝胶过滤色谱法。方法(1)检测的是病毒活力，而并不能准确反映免疫原性；方法(2)由于容易受到前补体和抗补体因子的干扰，准确性和稳定性差；方法(3)和(4)由于需要针对不同的抗原获取相应抗体，成本高，周期长，且难以完全区分146S及146S的抗原降解物；方法(5)是目前国际上经典的检测口蹄疫抗原的方法，但此方法仪器成本较高，检测时间长(每个样品需要几个小时)，需要的样品量较多(至少若干毫升)，且离心前需要浓缩，操作相对复杂，尽管该方法已经进行了改进，可以自动配置蔗糖梯度和取样分析检测，但仍难以满足快速检测的需要；方法(6)是2011年Spitteler等(Spitteler MA,Fernandez I,Schabes E,Krimer A,Regulier EG,Guinzburg M,et al.Vaccine.2011；29:7182-7187)首次建立的用凝胶过滤色谱法在口蹄疫疫苗纯化过程中进行146S定量。

凝胶过滤色谱法是根据样品的尺寸大小进行分离，同时检测吸收峰，根据吸收峰的峰面积进行计算定量。该种方法相对于蔗糖密度梯度离心法更易标准化，可准确进行146S的体外定量和批次间检测，与蔗糖密度离心法具有良好的结果一致性。文献中Spitteler等采用的是Sephacryl S-400凝胶过滤色谱填料及色谱纯化系统。这种方法为了达到高的柱效以实现分离目的，需要较长的色谱柱，从而分析时间较长，填料的成本较高，且所需样品量依然较多。专利CN 102998378 B公开了一种利用液相色谱系统定量口蹄疫抗原中146S含量的方法，但是该方法由于仅仅是利用了液相色谱系统的检测系统，因此只能对纯化后的146S进行检测，无法检测含有杂质的抗原。

本发明的方法是利用高效液相色谱系统及尺寸排阻高效液相色谱柱定量分析口蹄疫抗原146S。尺寸排阻高效液相色谱柱由于其填料的尺寸小，耐压强，能在短的色谱柱高度下达到高的理论塔板数，实现样品的分离和检测，从而相比Spitteler等的方法极大的减短了检测时间和样品体积，与专利CN 102998378 B相比，可以对未经纯化的抗原进行检测。使用精度和准确性高的高效液相色谱系统，在微量进样条件下仍能准确控制样品体积，从而保证了结果的准确性和稳定性。本方法可用于监测多种口蹄疫疫苗在生产和储存过程中的抗原含量，间接评价疫苗效力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确、低样品量的测定各种口蹄疫抗原146S的方法。

基于以上目的，本发明提供了一种用尺寸排阻高效液相色谱法定量口蹄疫146S抗原的方法，包括以下步骤：

(1)将尺寸排阻高效液相色谱柱连接在高效液相色谱仪上，以pH大于7的缓冲溶液作为流动相，打开高效液相色谱仪的泵送系统和紫外检测系统，对尺寸排阻高效液相色谱柱进行冲洗和恒温，注意排出系统内任何残留的气泡。

(2)标准曲线的绘制：将146S纯品用缓冲溶液配置成不同浓度的标准溶液样品，其样品数量应该大于3个，浓度范围为0.2-60μg/ml。取标准溶液样品进样量100μl，按照高效液相色谱仪的操作对尺寸排阻高效液相色谱柱进样分析，洗脱液采用0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.0-7.5)，流速：0.5-1.0ml/min；色谱柱流出液在紫外波长下进行检测。对抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，与标准品中146S的浓度建立线性回归方程。

(3)待测样品的测定：将待测样品通过系统向尺寸排阻高效液相色谱柱进样，采用与(2)同样的洗脱液和紫外波长检测，对抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，根据(2)中建立的146S浓度与峰面积的线性回归方程，算得待测样品中146S的浓度。

样品测试时，对未经纯化的口蹄疫疫苗中间品样品，步骤(3)中的样品检测前需进行核酸酶处理：取100-200μl，加入终浓度为10U/ml DNase和2.5U/ml RNase，37℃反应0.5-1h后再进行尺寸排阻高效液相色谱法检测。对已加入佐剂的疫苗成品，需进行破乳预处理，破乳条件为：按照疫苗原液体积1/9加入正丁醇，混匀后在4℃下静置1h后，5000rpm离心2min，收集含抗原的底层溶液进行检测。

此项检测技术具有以下优势：

检测速度快，传统的蔗糖密度梯度离心方法每个样品需要3-5小时，加上浓缩抗原的时间，最多需要2天。文献报道的凝胶过滤色谱法每个样品的检测需要2h而本方法建立标准曲线后，每个样品的检测时间可减少到30min。

高灵敏度，低样品体积。该方法可以检测至24ng的146S，样品体积仅需10-100μl，样品不需要提前浓缩，而传统的蔗糖密度梯度离心及制备级凝胶过滤色谱法需要的样品在毫升级，且浓缩过程中可能导致抗原损失。

重复性好，批次内误差小。由于高效液相色谱系统实现全自动分析，从上样到检测都由仪器自动化控制，相对密度梯度离心的人工操作误差小，检测结果更准确。

具有广泛的实用性，可用于不同血清型或亚型的病毒抗原的检测。

因此，本发明解决了当前口蹄疫病毒抗原检测操作复杂，检测时间长，重复性差的问题。对于提升我国口蹄疫疫苗生产过程中及疫苗成品的质量控制具有重要意义。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步说明。

图1为实施例(1)中蔗糖密度梯度离心法收集的146S抗原的SDS-PAGE检测结果(A)和western blot检测(B)。

图2为实施例(1)中蔗糖密度梯度离心法收集的146S抗原的透射电子显微镜检测图片。

图3为实施例(2)中蔗糖密度梯度离心收集的纯146S标准品的尺寸排阻高效液相色谱法检测图谱。

图4为实施例(2)中不同稀释浓度下的纯146S抗原的吸收峰面积与浓度的线性关系；

如图所示，该曲线的R²达到0.9991，线性结果良好。

图5为实施例(3)尺寸排阻高效液相色谱法检测不同血清型的口蹄疫146S抗原的检测图谱。

图6为实施例(4)中用核酸酶处理不同时间后检测未经纯化的疫苗中间品的检测图谱。

图7为实施例(5)中56℃加热不同时间后疫苗的尺寸排阻高效液相色谱图。

图8为实施例(5)中不同温度下口蹄疫疫苗中146S抗原含量随加热时间的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步说明本发明。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明方案的细节和形式进行修改，在没有做出创造性劳动前提下的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1口蹄疫抗原146S标准品的制备

1.材料

(1)检测样品：O型口蹄疫灭活病毒液来自于兰州兽医研究所

(2)仪器和试剂：超速离心机为Sorvall WX Ultra，转子为Surespin 630水平转子，均购于thermo公司，蔗糖购于西陇化工股份有限公司，超滤浓缩管购于Millipore公司

2.实验步骤：

(1)超滤浓缩病毒：用截留分子量为30kDa的超滤浓缩管，4℃下5000g离心25min，将100ml病毒液浓缩至2ml。

(2)蔗糖密度梯度离心：在38ml超速离心管中制备15％～45％(w/v)均匀蔗糖密度梯度液35ml，取2ml步骤(1)所得病毒浓缩液加至制备好的蔗糖梯度顶部，8℃25，000rpm离心4h后，自梯度底部用蠕动泵连续吸取梯度，每1ml收集一个离心管。

(3)收集纯的146S抗原：从步骤(2)中收集自底部起13-16ml中经电泳检测为纯的146S电泳条带的组分，见图1(A)。

(4)检验146S抗原标准品：经过以口蹄疫病毒亚基蛋白VP1为目标蛋白的western blot验证，收集的确实为口蹄疫病毒组分，见图1(B)。

经过透射电子显微镜检测，证实收集的为完整的病毒粒子，见图2。

(5)抗原浓度测定：用分光光度计测定步骤3)所收集的146S纯品的259nm吸收值，根据下列公式计算其浓度：

C＝A/Eb

其中，C为146S抗原的浓度(％，g/100ml)，A为分光光度计测得的259nm的吸收值，b为样品池的光径，E为146S的消光系数，

由收集的146S的259nm吸光值为0.46，计算得浓度为60.5μg/ml

实施例2高效液相色谱法检测146S抗原的灵敏度检测及标准曲线绘制

高效液相色谱系统购自Agilent公司，尺寸排阻高效液相色谱柱TSK G4000 SW_XL购于Tosohaas公司，

(1)146S抗原纯品的稀释：将实施例1中所得的146S抗原纯品用20mM磷酸缓冲液(pH7.0-pH7.5)分别稀释1，2，4，10，30，150，250倍；

(2)尺寸排阻高效液相色谱法分析：采用高效液相色谱系统及尺寸排阻高效液相色谱柱进行分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：0.6ml/min，色谱柱：TSK G4000SW_XL，进样量100μl，检测波长259nm。

(3)建立标准曲线：经高效液相凝胶过滤法分析后，146S抗原表现为一个吸收峰，如图3。对不同浓度抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，以峰面积为横坐标，标准品的浓度为纵坐标获得线性响应曲线，

C＝0.0323PA+0.4551

其中C为146S的浓度，单位为μg/ml，PA为吸收峰的峰面积，单位为mAU*s，见图4。所得标准曲线的R²＝0.9991，表明本方法具有较高的准确性，且灵敏度高，可测定到24ng的146S含量。

实施例3不同血清型口蹄疫疫苗成品中146S抗原的测定。

以本发明的方法，可测定不同血清型的口蹄疫疫苗成品中146S抗原含量。分别以以下几种疫苗为样品，进行测定：a.O型和亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗(ONXC株+JSL株)b.猪口蹄疫O型灭活疫苗(O/Mya98/xj/2010株+O/GX/09-7株)c.猪口蹄疫O型灭活疫苗(O/GX/09-7株+O/XJ/10-11株)。

(1)疫苗成品的预处理：由于疫苗成品中加入了佐剂,因此测定前需要进行破乳。按照疫苗原液体积1/9加入正丁醇，混匀后在4℃下静置1h后，5000rpm离心2min，收集含抗原的底层溶液；

(2)抗原检测：采用高效液相色谱系统及尺寸排阻高效液相色谱柱进行分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：0.6ml/min，色谱柱：TSK G4000 SW_XL，进样量100μl，检测波长259nm。每种疫苗样品均在与实施例1中146S的纯品的保留时间处有相同的吸收峰，为146S抗原的吸收峰，见图5。

(3)浓度计算：将步骤(2)中疫苗样品的146S的抗原吸收峰峰面积积分，代入实施例2所得公式C＝0.0323PA+0.4551中计算得到抗原浓度，其中C为146S的浓度，单位为μg/ml，PA为吸收峰的峰面积，单位为mAU*s。重复测定三次，高效液相色谱分析结果见图5，三条曲线分别代表不同血清型三次测定的结果。含量测定结果见表1。

表1

由表1及图4可以看出：本方法重复型性好，不同次检测间偏差不大。

从实施例1的结果可以看出，该方法具有高的灵敏度和重复性，且具有较好的实用性，适合于不同血清型的口蹄疫病毒的146S抗原的检测定量。

实施例4疫苗中间品的146S抗原含量测定

以本发明的方法，不仅可以对纯化后的疫苗中146S抗原含量测定，同样可以进行不纯的疫苗中间品中146S抗原含量测定。由于疫苗在纯化前可能存在大量细胞培养过程中释放出的核酸等杂质，因此需要进行预处理去除核酸。

(1)样品预处理：分别取100μl经纯化前的病毒培养液，加入终浓度为10U/ml DNase和2.5U/ml RNase，反应0h，0.5h，1h。

(2)采用高效液相色谱系统及尺寸排阻高效液相色谱柱进行分析。流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：0.6ml/min，色谱柱：TSK G4000 SW_XL，进样量100μl，检测波长259nm。

结果如图6，未经核酸酶处理时，病毒培养液中由于可能存在核酸的干扰，无法检测到明显的146S的吸收峰，而经过核酸酶处理后，大量的核酸被降解，反应1h后，能清楚检测到146S的吸收峰，进行检测和定量。

实施例5

以本发明的方法，不仅可以用于检测疫苗成品或中间品的146S的抗原含量，也可用于研究146S抗原的稳定性。

1.材料：所用猪口蹄疫O型灭活疫苗来源于兰州兽医研究所。

2.方法：由于口蹄疫病毒很不稳定，在温和加热的条件下会发生裂解。分别在4、37、45、56℃下加热口蹄疫疫苗不同时间，检测146S抗原的变化情况，检验该方法是否能够监测146S抗原的降解。

3.尺寸排阻高效液相色谱柱条件为：流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)，流速：0.6ml/min，色谱柱：Superdex S200，进样量100μl，检测波长259nm。

4.结果：图7为56℃加热不同时间疫苗的尺寸排阻高效液相色谱图，由该图看出，随着加热，146S的紫外吸收峰在逐渐减小，30min后146S已经全部裂解。

图8为不同温度下将146S的吸收峰积分，按照如下公式计算剩余146S的含量所得的结果。剩余146S含量(％)＝PA_t/PA₀x 100％

其中，PA_t表示在不同温度下相应时间146S用尺寸排阻高效液相色谱检测259nm积分所得的峰面积；PA₀表示加热前146S用尺寸排阻高效液相色谱检测259nm积分所得的峰面积。

由图8可以看出，尺寸排阻高效液相色谱法可以检测口蹄疫疫苗抗原中146S含量的变化，从而监测到口蹄疫疫苗的质量情况。

Claims (7)

1.一种采用尺寸排阻高效液相色谱柱测定口蹄疫疫苗抗原146S的方法，其特征包括以下步骤：

(1)将尺寸排阻高效液相色谱柱连接在高效液相色谱仪上，以pH大于7的缓冲溶液作为流动相，打开高效液相色谱仪的泵送系统和紫外检测系统，对尺寸排阻高效液相色谱柱进行冲洗和恒温，注意排出系统内任何残留的气泡。

(2)标准曲线的绘制：将146S纯品用缓冲溶液配置成不同浓度的标准溶液样品，其样品数量应该大于3个，浓度范围为0.2-60μg/ml。取标准溶液样品进样量100μl，按照高效液相色谱仪的操作对尺寸排阻高效液相色谱柱进样分析，洗脱液采用含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.0-7.5)，流速：0.5-1.0ml/min；色谱柱流出液在紫外波长下进行检测。对抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，与标准品中146S的浓度建立线性回归方程。

(3)待测样品的测定：将待测样品通过系统向尺寸排阻高效液相色谱柱进样，采用与(2)同样的洗脱液和紫外波长检测，对抗原的吸收峰进行积分得到峰面积，根据(2)中建立的146S浓度与峰面积的线性回归方程，算得待测样品中146S的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法可用于口蹄疫疫苗成品和灭活疫苗中间品中146S抗原的含量测定，也可用于检测疫苗中抗原的含量变化。

3.根据权利要求1所述的方法，所用尺寸排阻高效液相色谱柱的分子量分离范围为2×10⁴-1×10⁷Da，例如TSK G4000 SW_XL或Superdex S200。

4.根据权利要求1所述的方法，其中的146S纯品可由药监部门提供，或来自于商业渠道，亦可通过文献上已有的超速离心方法制备。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中未经纯化的口蹄疫疫苗中间品需要进行核酸酶预处理。所用的核酸酶预处理条件为加入10U/ml DNase和2.5U/ml RNase，37℃反应0.5-1h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中对已经加入佐剂的口蹄疫疫苗成品需要进行破乳处理。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(3)中对已经加入佐剂的口蹄疫疫苗成品的破乳方法为：按照疫苗原液体积1/9加入正丁醇，混匀后在4℃下静置1h后，5000rpm离心2min，收集含抗原的底层溶液。