CN107490614B - 一种康复新液的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种康复新液的质量检测方法，它是采用毛细管电泳法检测的，步骤如下：a、制备对照品溶液；b、制备供试品溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效毛细管电泳仪检测；d、根据检测结果计算得到康复新液中的两种多肽含量。本发明质量检测方法，线性关系良好、精密度高，检测准确可靠、简便快速，可提高康复新液的质量控制水平奠定了良好基础。
Description
技术领域
本发明属于药材质量检测领域，具体涉及一种康复新液的质量检测方法。
背景技术
康复新液是一种单方制剂，主成分为美洲大蠊的乙醇提取物，该制剂有通利血脉，养阴生肌的功效，可用于金疮、外伤、溃疡、瘘管、烧伤、烫伤、褥疮之创面。
目前，康复新液的质量标准中，对产品的含量测定只有总氨基酸一项，难以达到对产品进行全面评价和有效的质量控制。这严重影响了其临床用药安全性和有效性，亦影响了其进一步的开发和利用。
研究报道，美洲大蠊中极性较大的小分子多肽为其活性成分【何正春de ng,美洲大蠊神经肽的研究进展[J].天然产物研究与开发,2008,(01):180-186；吴红梅.上市品种“康复新液”的药学再评价[D].成都中医药大学,2013】，可发挥抗消化性溃疡、抗肿瘤、免疫调节等作用，但是，目前尚未见对康复新液中活性多肽进行含量测定的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种康复新液的质量检测方法。
本发明提供了一种康复新液的质量检测方法，它是采用毛细管电泳法检测的，步骤如下：
a、制备对照品溶液：
取SEQ ID NO:1所示的多肽1和/或SEQ ID NO:2所示的多肽2对照品，制备对照品溶液；
b、制备供试品溶液：
取康复新液，过滤，浓缩，得供试品溶液；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效毛细管电泳仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：未涂层毛细管柱；
检测波长：214nm；
运行缓冲液：80mM乙酸-80mM乙酸铵溶液；
d、根据检测结果计算得到康复新液中的两种多肽含量。
SEQ ID NO:1：AGGAAPASLLAPSGPLGTA
SEQ ID NO:2：SLHTAPGL-NH2。
其中，步骤a中，对照品溶液的溶剂为步骤c中的运行缓冲液。
其中，步骤b中，所述过滤为过0.22μm的微孔滤膜。
其中，步骤b中，所述浓缩的方法为：取过滤后的续滤液，真空干燥箱中放置24h。
其中，步骤b中，浓缩至原体积的2/3即可。
其中，步骤c中，对照品溶液、供试品溶液均采用压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为8s。
其中，步骤c中，所述运行缓冲液的pH为3.0。
其中，步骤c中，所述色谱柱的尺寸为75μm×60cm，有效长度为49.5cm。
其中，步骤c中，所述色谱柱的柱温为25±2℃。
其中，检测时的分离电压为20kV。
本发明选择了康复新液中的两种活性多肽，通过对电泳方式和电泳分离条件的筛选，建立了康复新液的区带毛细管电泳质量检测方法。实验证明所建方法线性关系良好、精密度高，样品中两种多肽在6min内能达到基线分离，且分离度较高，可以用于实际样品的测定，该方法准确可靠、简便快速，可提高康复新液的质量控制水平奠定了良好基础。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1康复新液样品(a)及其多肽标准对照品(b)电泳谱图，1-多肽1，2-多肽2。
图2(a)MEKC模式下多肽电泳谱图(b)本发明方法电泳多肽谱图，进样样品为五种多肽混合标准溶液(内含肽1﹑肽2)。
图3缓冲液种类对分析物迁移时间的影响图，a-e分别对应乙酸-乙酸铵，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，磷酸二氢钠-硼砂，甲酸-氨水，硼砂-硼酸。
图4不同缓冲液pH值的电泳谱图；其中，a-e分别对应pH2.87，pH3，pH4，pH5，pH5.85。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
多肽1(AGGAAPASLLAPSGPLGTA)﹑多肽2(SLHTAPGL-NH2)标准品均来自上海吉尔生化有限公司(纯度98％)；
康复新液(四川好医生攀西药业批号：160217)；
Beckman P/ACETM MDQ型毛细管电泳仪(配备二极管阵列检测器)。
实施例1本发明测定方法
本发明使用Beckman P/ACETM MDQ型毛细管电泳仪(配备二极管阵列检测器)进行方法测定，具体实验如下：
1、对照品溶液的制备
分别精密称定多肽1﹑多肽2各1.0㎎，置1毫升容量瓶中，用缓冲液溶解并定容置刻度，即得，各溶液浓度为1.0㎎/ml。
2、阴性对照溶液的制备
取甘油﹑苯甲酸钠和山梨酸，制成不含美洲大蠊药材的阴性样品
3、空白试验
按本发明电泳工作条件测定，乙醇(即康复新液的提取溶液)为供试品，记录图谱。
4、供试品制备
取各康复新液，过0.22μm的微孔滤膜，取滤液，康复新液放入真空干燥箱干燥24h，浓缩至原有体积的2/3倍。
5、毛细管电泳
色谱柱：未涂层毛细管柱75μm×60cm(有效长度为49.5cm)；
检测波长：214nm；
分离电压：20kV；
运行缓冲液：为pH＝3的80mM乙酸-80mM乙酸铵溶液；
电泳运行条件：分离电压20kV，压力进样0.5psi×8s，检测波长214nm，温度25℃。
6、结果分析
根据检测结果计算得到康复新液中的两种多肽含量，即可。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明方法的方法学考察
配制不同浓度的两种多肽混合标准溶液，按照实施例1的方法进行毛细管电泳分析，考察本发明方法的多肽检测线性关系、检测限、回收率及精密度实验，结果见表1。表1中，LOQ为定量限；LOD为检测限。
表1 2种多肽的回归方程、线性范围及检测限、精密度
表2 2种多肽的重复性测定
可见，两种多肽在各自质量浓度范围内线性关系良好、精密度高、样品回收率高、重复性好，说明本发明方法准确度高，可以用于实际样品的测定。
试验例2本发明方法对康复新液的测定结果
取康复新液，按照实施例1的方法测定两种多肽成分的含量。
结果见图1。
结果显示，通过外标法测得样品中2种多肽的含量分别为61.09μg/mL和33.1μg/mL。
试验例3本发明方法的筛选
一、不同电泳方式的比较
发明过程中选择了两种电泳模式，分别是本发明方法及胶束毛细管电动色谱(MEKC)，对样品色谱峰分离效果进行对比。
其中，MEKC分离时：供试品溶液制备同本发明方法，MEKC实验参数：运行缓冲液为pH＝3的80mM乙酸-80mM乙酸铵溶液，20mM的SDS,20mM的SC。其余实验参数与本发明一致。
结果见图2。
结果表明，使用本发明方法，目标样品峰均可以很好的分离测定；而MEKC模式下，目标样品不出峰或分离效果差。
二、电泳分离检测条件的优化
1、缓冲溶液的选择
实验考察了磷酸氢二钠-磷酸二氢钠﹑甲酸-氨水﹑乙酸-乙酸铵﹑Na2HP O4-硼酸﹑NaH2PO4-硼砂﹑硼酸-硼砂体系的缓冲液，各缓冲液浓度均为80Mm，其余实验参数与本发明一致。
结果见图3。
可见，选用Na2HPO4-硼酸﹑NaH2PO4-硼砂﹑硼酸-硼砂缓冲液，各组分分离度很差，基本不能分开；选用甲酸-氨水缓冲液分离效果稍好，但仍有一些峰达不到基线分离，且电流不稳定；当选用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液时，分离效果一般；当以乙酸-乙酸铵为缓冲液时，样品各组分分离效果最好，故选择乙酸-乙酸铵缓冲体系。
2、缓冲液pH值的优化
在实验中以80mmol/L乙酸-80mmol/L乙酸铵为背景缓冲液，考察了pH2.87～5.85对康复新液分离效果的影响，结果见图4。
可见，pH值增加到一定程度(大于3.0)后，分离度降低。因此，最终选择的pH为3.0。
3、分离电压的优化
实验考察了分离电压在18～25kV时，对分离效果的影响。实验结果表明随着分离电压的增加，迁移时间相应缩短，但由于电流增加，焦耳热增多，基线噪音变大，当分离电压超过20kV时，分离效果降低；当分离电压低于20kV时，迁移时间延长；故综合考虑分离度和分析时间，选择最佳分离电压为20kV。
综上，本发明建立了康复新液的区带毛细管电泳质量检测方法，该方法线性关系良好、精密度高，检测准确可靠、简便快速，可提高康复新液的质量控制水平奠定了良好基础。
序列表
<110> 福建中医药大学
<120> 一种康复新液的质量检测方法
<130> GY136-17P1347
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 美洲大蠊(Americana Linn，多肽1)
<400> 1
Ala Gly Gly Ala Ala Pro Ala Ser Leu Leu Ala Pro Ser Gly Pro Leu
1 5 10 15
Gly Thr Ala
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 美洲大蠊(Americana Linn，多肽2)
<400> 2
Ser Leu His Thr Ala Pro Gly Leu
1 5
Claims (9)
1.一种康复新液的质量检测方法，其特征在于，它是采用毛细管电泳法检测的，步骤如下：
a、制备对照品溶液：
取SEQ ID NO:1所示的多肽1和/或SEQ ID NO:2所示的多肽2对照品，制备对照品溶液；
b、制备供试品溶液：
取康复新液，过滤，浓缩，得供试品溶液；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效毛细管电泳仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：未涂层毛细管柱；
检测波长：214nm；
运行缓冲液：80mM乙酸-80mM乙酸铵溶液，pH为3.0；
d、根据检测结果计算得到康复新液中的两种多肽含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，对照品溶液的溶剂为步骤c中的运行缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述过滤为过0.22μm的微孔滤膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述浓缩的方法为：取过滤后的续滤液，真空干燥箱中放置24h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，浓缩至原体积的2/3即可。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，对照品溶液、供试品溶液均采用压力进样，进样压力为0.5psi，进样时间为8s。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱的尺寸为75μm×60cm，有效长度为49.5cm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱的柱温为25±2℃。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于：检测时的分离电压为20kV。
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| 15种氨基酸及2种多肽的毛细管电泳法定量分析;薛洪宝等;《四川大学学报(工程科学版)》;20100331;第42卷(第2期);第1、2节 * |
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