CN105241942A - 一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米生物技术领域一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法：含有谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST-tag)的143C型鼻病毒酶(HRV)重组蛋白酶(GST-HRV)与量子点(QDs)按一定摩尔比例在毛细管内相互作用形成量子点生物探针(QD-GST-HRV)，随后注入还原型谷胱甘肽(GSH)溶液，通过毛细管电泳检测两者在毛细管内的相互作用，测定量子点生物探针复合物峰面积与总面积的比和谷胱甘肽浓度的关系，绘制变化曲线。本发明提供了一种可以准确、快速、灵敏检测谷胱甘肽浓度的方法，操作简单，可重复性高，拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法。
背景技术
近年来，量子点(QDs)作为一种新型荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、颜色可调、抗光漂白和荧光寿命长等优点。这些优点弥补了传统荧光探针的不足，逐渐使其在生物分析检测中得到广泛应用。
谷胱甘肽巯基转移酶标签是最早使用的亲和标签，1988年D.B.Smioth和K.S.John-son设计了以GST为融合表达标签的pGEX原核表达载体，成功地运用于寄生虫抗原蛋白的克隆表达亲和纯化。用于亲和纯化的GST来源于日本血吸虫，相对分子质量为26×103，与其配体还原性谷光氨肽(GSH)的亲和常数为(0.43±0.07)mmol/L，由于GST和谷胱甘肽的亲和力适中，非常适合作为亲和标签。
另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。且毛细管内的方法相对毛细管外的方法更灵敏、更迅速、样品消耗更低。
检测谷胱甘肽浓度的常用方法有分光光度法、荧光法和放射性核素法等，但这些方法操作繁琐、耗费的样品多，在微量样品的检测方面有很大的局限性。
本方法通过谷胱甘肽与量子点生物探针在毛细管内相互作用的峰面积比的变化，绘制变化曲线，可以准确、快速、灵敏的检测谷胱甘肽浓度的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术中尚无良好检测谷胱甘肽浓度检测方法的不足，提供一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为，一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，步骤如下，
(1)将脂溶性QDs经不同巯基配体稳定转换为水溶性QDs，提高QDs在水溶液中的稳定性；(2)设计含有谷胱甘肽巯基转移酶标签的重组蛋白，并通过大肠杆菌原核表达纯化；(3)GST-HRV酶与QDs按摩尔比例10:1在毛细管内相互作用形成QD-GST-HRV量子点生物探针复合物；(4)随后将不同摩尔浓度的谷胱甘肽溶液注入毛细管，测定复合物与总面积比和谷胱甘肽浓度的关系，绘制峰面积比-谷胱甘肽浓度(Scomplex/Stotal-CGSH)变化曲线。
采用上述的技术方案后，本发明所取得的有益效果是，本发明提供一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中谷胱甘肽浓度，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。
附图说明
图1：GSH和QD-GST-HRV生物探针在毛细管内相互作用的电泳图。(a)QD-GST-HRV，GSH浓度分别为；(b)，62.5mM；(c)，125mM；(d)，250mM；(e)，500mM(λex＝420nm，λem＝565nm)。
图2：不同浓度的谷胱甘肽溶液与量子点生物探针(QD-GST-HRV)在毛细管内相互作用的变化曲线(Scomplex/Stotal-CGSH)。
具体实施方案
实施例
本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
实施例1
CdSe/ZnSQDs与GST-HRV在毛细管内的相互作用
1、脂溶性QDs经GSH转换为水溶性QDs
将18mg谷胱甘肽，5mgKOH，250μL甲醇混匀，取40μL混合溶液加入200μL脂溶性量子点中，振荡30min。振荡结束后，加入200μL1mMNaOH，脂溶性量子点即转移到水相中。取出上层量子点，加入1mL甲醇与30μLNaCl(30mg/mL)沉淀，溶于硼酸缓冲液(pH7.4，10mM)中。反复沉淀两次，最后溶于200μL硼缓冲液(pH7.4，10mM)中。
2、重组蛋白酶GST-HRV的克隆、表达、纯化
将人鼻病毒蛋白酶的目的基因序列克隆到载体pGEX-6P-1上，测序验证。后通过热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中后接种到含有A+(30μg/mL)平板上生长。选取单菌落接种到LB(10mL)培养液中，37℃培育过夜。细胞接种到含有1％抗生素LB(1L)培养基中，37℃培育(OD600～0.6)。18℃加IPTG(0.2mM)诱导表达12小时。在0℃进行所有后续步骤，5000r/min离心5min收集菌体，30mlPBS缓冲液(含0.01ml/ml甘油，1mmol/LDTT和1mmol/LPMSF)重悬。超声处理裂解细胞40min，离心过滤。上清液装入5mLGlutathioneSepharose4B柱，用10倍柱体积PBS缓冲液平衡,然后用洗脱缓冲液(20mMTris,500mMNaCl,3mMDTT,0.1mMPMSF,0.1mMbenzamide,10mMreducedglutathione,pH7.5)进行洗脱，-80℃保存。
3、GSH与QD-GST-HRV在毛细管内的相互作用与检测
GST-HRV酶与QDs按摩尔比例10:1在毛细管内相互作用形成QD-GST-HRV量子点生物探针复合物，随后将不同摩尔浓度的谷胱甘肽溶液注入毛细管，测定复合物与总面积比和谷胱甘肽浓度的关系。分析发现，随着谷胱甘肽溶液摩尔浓度的不断增加，QD-GST-HRV复合物的电泳峰逐渐降低，而单独量子点的电泳峰逐渐增加(图1)。
4、待测样品中谷胱甘肽浓度的检测
通过荧光毛细管电泳检测，绘制峰面积比-谷胱甘肽浓度(Scomplex/Stotal-CGSH)拟合曲线。得到曲线方程y＝0.47e-x/72+0.53，然后将待测样品注入毛细管内，得到峰面积比值为0.73，代入方程，得到待测样品中谷胱甘肽浓度为61.51mM(图2)。
实施例2
CdTe/ZnSQDs与GST-HRV在毛细管内的相互作用
1-3步骤同实施例1，不同的是所用的量子点为CdTe/ZnS。
4、待测样品中谷胱甘肽浓度的检测
通过荧光毛细管电泳检测，绘制峰面积比-谷胱甘肽浓度(Scomplex/Stotal-CGSH)拟合曲线。得到曲线方程y＝0.32e-x/91+0.52，然后将待测样品注入毛细管内，得到峰面积比值为0.65，代入方程，得到待测样品中谷胱甘肽浓度为81.97mM。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
Claims (7)
1.一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，
人鼻病毒(HRV)蛋白酶与量子点(QDs)在毛细管内形成量子点生物探针，随后注入不同摩尔浓度的谷胱甘肽(谷胱甘肽)溶液，通过毛细管电泳检测两者在毛细管内的相互作用，测定峰面积比和谷胱甘肽浓度的关系，绘制峰面积比-谷胱甘肽浓度变化曲线。
2.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，所述酶为重组蛋白酶，其中融合了谷胱甘肽巯基转移酶(GST)作为亲和标签，通过大肠杆菌原核表达和纯化。
3.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，所述酶含有GST作为亲和标签，其巯基与重金属有较强的共价耦合作用，结合力强。
4.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，所述酶含有GST作为亲和标签，与谷胱甘肽亲和力适中，非常适合作为亲和标签。
5.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，所述酶与量子点均为纳升。
6.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，所述的量子点为含有Zn的量子点。
7.根据权利要求6所述的一种基于毛细管电泳快速检测谷胱甘肽浓度的方法，其特征在于，所述的量子点为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
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