CN105241941A - 一种毛细管内快速检测酶浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米生物技术领域一种毛细管内快速检测酶浓度的方法，步骤如下，(1)将量子点与荧光标记的多肽在毛细管外混合反应，得到量子点生物探针；(2)荧光毛细管电泳检测：将酶与量子点生物探针在毛细管内相互作用，通过荧光检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比与酶浓度的关系，绘制峰面积比-时间的标准曲线，对照标准曲线确定待测样品中酶浓度。采用上述的技术方案后，本发明所取得的有益效果是，本发明提供的毛细管内快速检测酶浓度的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中酶浓度，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。

Description

一种毛细管内快速检测酶浓度的方法

技术领域

本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种毛细管内快速检测酶浓度的方法。

背景技术

检测酶浓度的常用方法有分光光度法、荧光法和放射性核素法等，但这些方法操作繁琐、耗费的样品多，在微量样品的检测方面有很大的局限性。

量子点(QDs)作为一种新型荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、颜色可调、抗光漂白和荧光寿命长等优点。将量子点与荧光多肽结合，当它们之间的距离小于半径时，会发生非辐射能量转移，即荧光能量共振转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)。从而，通过荧光检测，可以分析彼此之间的相互作用。

近年来，一些研究小组已经开始开展基于QDs-FRET的生物检测分析。Willard等利用CdSe/ZnSQDs与四甲基罗丹明分别作为FRET的供体和受体，并将之用于生物素化牛血清白蛋白与链霉亲和素之间的相互作用研究。Yildiz等基于QDs-FRET开展了受体底物相互作用的研究。Rosenzweig等将QDs-FRET用于酶活性的检测和酶抑制研究。Krull等基于多色QDs-FRET技术对寡核苷酸的杂交进行了分析检测。

另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。且毛细管内的方法相对毛细管外的方法更灵敏、更迅速、样品消耗更低。

本方法通过酶与量子点生物探针在毛细管内相互作用的FRET变化，绘制标准曲线，来快速检测样品中的酶浓度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术中尚无良好检测酶浓度检测方法的不足，提供一种毛细管内快速检测酶浓度的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为，一种毛细管内快速检测酶浓度的方法，步骤如下，

(1)将量子点与荧光标记的多肽在毛细管外混合反应，得到量子点生物探针；

(2)荧光毛细管电泳检测：将酶与量子点生物探针在毛细管内相互作用，通过荧光检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比与酶浓度的关系，绘制峰面积比-时间的标准曲线，对照标准曲线确定待测样品中酶浓度。

进一步地，所述的酶与量子点生物探针在毛细管内的进样顺序为先进电泳速度慢的酶，再进电泳速度快的量子点生物探针。

作为优选，所述的量子点生物探针中，多肽C端具有一个六聚组氨酸序列偶联QDs，N端偶联荧光染料，以及具有一个酶切位点“LVPRGS”，QDs与荧光染料之间能产生FRET。

进一步地，所述的量子点为含有Zn的量子点。

作为优选，所述的量子点为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。

本发明所述的酶与量子点生物探针在毛细管内的进样顺序应先进电泳速度慢的样品，再进电泳速度快的样品，进样的时间差应控制在两个样品能在有效长度内相互作用。

采用上述的技术方案后，本发明所取得的有益效果是，本发明提供的毛细管内快速检测酶浓度的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中酶浓度，进一步拓展了量子点探针在生物分析领域的应用。

附图说明

图1：:ATTO590-H6-QDs电泳图(实线，565nm，QDs供体检测通道；虚线，625nm，ATTO590受体检测通道)。

图2：不同浓度的凝血酶与量子点生物探针在毛细管内不同检测通道的峰面积比的拟合(曲线：曲线拟合，直线：线性拟合)。

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。

实施例1

ATTO590-H6-QD检测凝血酶浓度

1、脂溶性QDs经GSH转换为水溶性QDs

将18mgGSH，5mgKOH，250μL甲醇混匀，取40μL混合溶液加入200μL脂溶性量子点中，振荡30min。振荡结束后，加入200μL1mMNaOH，脂溶性量子点即转移到水相中。取出上层量子点，加入1mL甲醇与30μLNaCl(30mg/mL)沉淀，溶于硼酸缓冲液(pH7.4，10mM)中。反复沉淀两次，最后溶于200μL硼缓冲液(pH7.4，10mM)中。

2、多肽合成与标记

多肽DDDLVPRGSGP₉G₂H₆采用Fmoc固相合成法合成。用HBTU/HOBt(1:1)活化Fmoc保护的氨基酸，偶联30min；用碱性溶剂20％哌啶脱保护，暴露出氨基；采用HBTU和HOBt活化下一个氨基酸上的羧基，与树脂上的氨基偶联，形成肽键；重复上述步骤，反复循环添加氨基酸，直至合成完成。再用20％哌啶脱保护，暴露出氨基，用EDC/HOBt(1:1)活化ATTO-590的羧基，进行染料的标记。用切割试剂(TFA,乙二硫醇,水和TIS,94:2.5:2.5:1,v/v)将多肽从树脂上切割下来，然后经过冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，经过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到最后产品ATTO-DDDLVPRGSGP₉G₂H₆(ATTO590-H6)。

3、量子点生物探针的组装

QDs与H6-ATTO(1:32)在毛细管外等体积混合反应1min。

4、不同浓度凝血酶的配置

配置5M、10M、20M、40M的凝血酶溶液。

5、荧光毛细管电泳检测

先进凝血酶(5M、10M、20M、40M)10s，间隔20s后，再进量子点生物探针10s，荧光毛细管电泳检测。通过毛细管电泳检测，随着凝血酶浓度的增加，FRET呈线性下降。测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积(S₆₂₅与S₅₆₅)，计算峰面积比(S₆₂₅/S₅₆₅)(图1)，进行拟合，发现在酶浓度20M内呈线性，因而绘制酶浓度与峰面积比的标准曲线(y＝-0.03709x+1.452)(图2)。再进含有凝血酶的待测样品10s，间隔20s，再进样量子点生物探针10s，经毛细管电泳检测，计算不同检测波长的峰面积比(S₆₂₅/S₅₆₅)为0.905，对照标准曲线y＝-0.03691x+1.458，得出待测样品中凝血酶的浓度为15M。

实施例2

Cy5-H6-QD检测凝血酶浓度

量子点生物探针由荧光染料“Cy5”，量子点“CdSe/ZnSQDs605nm”，多肽“DDDLVPRGSGP₉G₂H₆”组成。

其他步骤同实施例1。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

Claims (5)

1.一种毛细管内快速检测酶浓度的方法，其特征在于，

(1)将量子点与荧光标记的多肽在毛细管外混合反应，得到量子点生物探针；

(2)荧光毛细管电泳检测：将酶与量子点生物探针在毛细管内相互作用，通过荧光检测，测定受体检测通道与供体检测通道的峰值面积之比与酶浓度的关系，绘制峰面积比-时间的标准曲线，对照标准曲线确定待测样品中酶浓度。

2.根据权利要求1所述的毛细管内检测酶动力学的方法，其特征在于，所述的酶与量子点生物探针在毛细管内的进样顺序为先进电泳速度慢的酶，再进电泳速度快的量子点生物探针。

3.根据权利要求1所述的毛细管内检测酶动力学的方法，其特征在于，所述的量子点生物探针中，多肽C端具有一个六聚组氨酸序列偶联QDs，N端偶联荧光染料，以及具有一个酶切位点“LVPRGS”，QDs与荧光染料之间能产生FRET。

4.根据权利要求1所述的毛细管内检测酶动力学的方法，其特征在于，所述的量子点为含有Zn的量子点。

5.根据权利要求4所述的毛细管内检测酶动力学的方法，其特征在于，所述的量子点为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。