CN103994988A - 一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，属于纳米生物技术领域。该方法是设计一系列带不同电荷数的多肽，这些多肽序列中包括一个组氨酸标签序列（HHHHHH），与量子点自组装成量子点生物探针，绘出标准曲线；将包括一个组氨酸标签序列的待测样品与量子点自组装成量子点生物探针，测定其在荧光毛细管电泳中的迁移时间，上述得到的标准曲线确定出待测样品的电荷数。通过荧光毛细管电泳来检测多肽中所带的电荷数。该方法快速准确、操作简单，拓宽了毛细管电泳在生物分析中的应用，并为量子点生物探针的进一步应用提供了参考。

Description

一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法

技术领域

本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法。

背景技术

量子点(QDs)是一种新型的纳米荧光材料，它所具有的荧光可调、宽吸收、窄发射和抗光漂白等独特的光学性质，引起了多个领域研究者的广泛关注，并在细胞成像、荧光免疫分析、核酸研究等方面得到了广泛应用。水溶性量子点可与抗体、蛋白、多肽、DNA和酶等生物分子偶联，组成量子点荧光探针。作为一种新型的荧光探针，量子点具有有机荧光染料和荧光蛋白无法比拟的光学性质，近年来基于量子点的荧光分析法己在生物分析领域得到了广泛应用。

目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子点。因此，必须将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs才能进行生物标记。而将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巯基小分子(如巯基乙酸、巯基丙酸、谷胱甘肽、巯基丁二酸等)取代脂溶性QDs表面的配体，然后通过偶联剂与生物分子偶联；另一种常用的QDs标记生物分子的方法是与含有组氨酸标签的多肽或蛋白结合。QDs表面的Zn原子和多组氨酸残基的金属亲和协调作用，含有组氨酸残基的蛋白质和多肽能够直接与QDs表面的Zn原子结合，这种方法具有很好的稳定性，已逐渐成为生物标记中一种常用的方法。Sapsford等(Sapsford K.E.,Pons T.,Medintz I.L.,et al.J.Phys.Chem.C2007,111,11528-11538)系统地研究了含组氨酸多肽与QDs之间的相互作用及结合常数等，组氨酸标签序列与QDs的结合速率是约100秒，K_d ^-1约为1nM。因此，量子点与含有组氨酸标签序列的多肽之间的结合是非常稳定和迅速的。

另一方面，作为一种高分辨、高灵敏、高速度、高通量及低样品消耗的微分离技术，毛细管电泳在生物分析领域也具有广阔的应用前景。

量子点经过巯基配体转换后，表面带有负电荷，因此，不同电荷的多肽与量子点相互作用后，可根据荷质比的不同进行分离。

因此，我们设计了一系列带不同电荷的含组氨酸标签序列多肽，使组氨酸标签序列与量子点结合，形成不同电荷数的量子点生物探针，通过荧光毛细管电泳的分析检测，得出不同电荷的多肽与量子点结合后，迁移时间不同，绘制标准曲线，从而可利用该性质检测多肽的电荷数。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种检测多肽电荷数的新方法，提高其在生物领域中的应用。为解决上述技术问题，本发明提供一种根据毛细管电泳迁移时间检测多肽电荷数的方法，该方法稳定性好，重复性高，可以方便的观察出待检测多肽的电荷数。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，包括以下步骤：(1)设计一系列带不同电荷数的多肽，并在多肽序列上加入一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，分别测定它们在在荧光毛细管电泳中的迁移时间，绘制迁移时间-电荷数的标准曲线；(2)在待测样品上加入一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，测定其在荧光毛细管电泳中的迁移时间，根据步骤(1)得到的标准曲线确定出待测样品的电荷数

步骤(1)中所述的一系列带不同电荷数的多肽是指0-6个带负电荷氨基酸的多肽。所述的多肽共12个氨基酸，由6个组氨酸(H)，不带电荷的丙氨酸(A)及带负电荷的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)的任意组合构成。

优选地，所述的多肽与量子点之间的摩尔比为64:1。

本发明所述的量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。

采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果是，本发明提供的可用于识别多肽所带电荷数的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了量子点—多肽复合物作为纳米荧光探针在生物领域中的应用。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是一组不同电荷数的含组氨酸标签多肽序列图。(图中H为组氨酸Histidine的缩写，A为丙氨酸Alanine的缩写、E为谷氨酸Glutamic acid的缩写)

图2是量子点与多肽自组装的生物探针示意图。

图3A是不同多肽与量子点自组装的电泳图谱：a，QDs；b，QDs-HHHHHHAAAAAA；c，QDs-HHHHHHAAAAEE；d，QDs-HHHHHHAAEEEE；e，QDs-HHHHHHEEEEEE电泳图谱(多肽与量子点摩尔比64)；B是多肽带负电荷数量与电泳峰时间的关系。

图4是待检测多肽HHHHHHAAAEEE的电泳图谱。

图5是待检测多肽HHHHHHAEEEEE的电泳图谱。

具体实施方式

实施例

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。

实施例1

荧光毛细管电泳检测多肽HHHHHHAAAEEE带电荷数量

1、多肽合成

一系列不同电荷数多肽(图1)采用常规的固相Fmoc法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。

(1)、基本材料：

①树脂与连接分子：固相Fmoc法选择的树脂为Rink Amide-MBHA树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为偶联剂，将多肽分子固定到树脂上。

②氨基酸：合成所用氨基酸为经化学修饰的α-氨基酸。

(2)、反应步骤：

第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上

加入偶联剂HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂的氨基偶联，以完成氨基酸的固定；

第二步，去保护

采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc保护集团，暴露出氨基。

第三步，激活和交联

采用HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基偶联，形成肽键。

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加氨基酸，直到合成完成。

(3)、合成后处理：

①洗脱和脱保护：用三氟乙酸(TFA)将肽链从树枝上洗脱下来，并脱除保护基。

②HPLC纯化，冻干保存。

2、量子点与多肽偶联

将多肽与量子点按64:1的比例混合，即得到量子点—多肽荧光探针(图2)。

3、荧光毛细管电泳分析检测

经过荧光毛细管电泳分析发现随着多肽配体所带负电荷增多，迁移时间越大，出峰时间分别为280s、396s、443s、466s(图3A)。将多肽所带电荷数与电泳峰迁移时间的关系给出标准曲线，如图3B所示。

4、检测多肽带电荷数量

将待检测多肽HHHHHHAAAEEE与量子点按64:1的比例混合，通过毛细管电泳检测，其迁移时间为401s(图4)，与标准曲线对照，其所带负电荷数为3。

实施例2

荧光毛细管电泳检测多肽HHHHHHAEEEEE

1-3步骤同实施例1。

4、检测多肽带电荷数量

将待检测多肽HHHHHHAEEEEE与量子点按64:1的比例混合，通过毛细管电泳检测，其迁移时间为457s(图5)，与标准曲线对照，其所带负电荷数为5。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (6)

1. 一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计一系列带不同电荷数的多肽，所述多肽序列中包括一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，分别测定它们在荧光毛细管电泳中的迁移时间，绘制迁移时间-电荷数的标准曲线；（2）在待测样品中包括一个组氨酸标签序列，与量子点自组装成量子点生物探针，测定其在荧光毛细管电泳中的迁移时间，根据步骤（1）得到的标准曲线确定出待测样品的电荷数。

2.根据权利要求1所述的一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，其特征在于步骤（1）中所述的一系列带不同电荷数的多肽是指0-6个带负电荷氨基酸的多肽。

3.根据权利要求2所述的一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，其特征在于所述的多肽由6个组氨酸，不带电荷的丙氨酸及带负电荷的天冬氨酸或谷氨酸组成，共12个氨基酸。

4.根据权利要求1所述的一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，其特征在于所述的量子点为含有Zn的量子点。

5.根据权利要求1所述的一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，其特征在于所述含有Zn的量子点是CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。

6.根据权利要求1所述的一种量子点生物探针检测多肽电荷数的方法，其特征在于所述的多肽与量子点之间的摩尔比为64:1。