CN116348498A - 多肽、多聚体、固相、受试物质的测定方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明以提供进一步降低对于D‑生物素的结合性，强固地结合于L‑生物素的多肽作为课题。提供属于亲和素‑链霉亲和素家族的多肽，所述多肽的甘氨酸以外的氨基酸残基之中，90％以上的氨基酸残基含D‑氨基酸残基，具有对于L‑生物素的结合能力，基本上不具有对于D‑生物素的结合能力的多肽。

Description

多肽、多聚体、固相、受试物质的测定方法及试剂盒

【技术领域】

本发明涉及多肽、多聚体、固相、受试物质的测定方法及试剂盒。

【背景技术】

属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽和生物素之间的亲和性非常地强，该多肽和生物素在各种各样的领域中利用。例如，在诊断领域中，在免疫学测定方法中，向板或粒子等的固相经链霉亲和素及生物素固定捕获体，进行使用其测定目标物质。另外，在治疗领域中知晓，将附加亲和素的抗体和附加生物素基的药剂施用于患者的前打靶疗法(例如，非专利文献1)。

但是，在受试者的血液含天然型的D-生物素时，此D-生物素(内源性D-生物素)可结合于亲和素或链霉亲和素。特别是，在受试者摄取维生素剂等的辅助物时，有D-生物素的血中浓度高的情况。此时，在使用血液受试体的免疫学测定方法中，有生物素化的捕获体和血中的内源性D-生物素竞争结合，无法将一部分的捕获体固定于固相，测定精度降低的情况。另外，在前打靶疗法中，当将结合亲和素的抗体施用于患者时，有亲和素结合有血中的内源性D-生物素的情况。此时，可发生在该抗体附加生物素基的药剂无法结合，达到患部的药剂的量降低的问题。作为用于解决这样的问题的手段，知晓例如专利文献1的技术。在专利文献1中公开了，使对于D-生物素的亲和性降低的链霉亲和素变体和能结合于该变体的生物素修饰体。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：美国专利申请公开第2016/0137704号说明书

【非专利文献】

非专利文献1：Hnatowich et al.，Journal of Nuclear Medicine 28.8(1987)：1294-1302

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

专利文献1中记载的链霉亲和素变体依然维持与D-生物素的结合性，另外，该变体和生物素修饰体的亲和性不充分。本发明旨在提供与D-生物素基本上不结合，对于L-生物素强固地结合的多肽。另外，本发明旨在提供该多肽的多聚体、固定了该多肽的固相、使用该固相的受试物质的测定方法及含该固相和L-生物素结合的捕获体的试剂盒。

【用于解决课题的手段】

提供属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽，上述多肽的甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基含D-氨基酸残基，具有对于L-生物素的结合能力，基本上不具有对于D-生物素的结合能力的多肽。

本发明提供上述多肽及上述多肽的多聚体。本发明提供固定化上述多肽及上述多聚体的固相，使用上述固相的测定方法，含上述固相和L-生物素结合的捕获体的试剂盒。

【发明的效果】

由本发明提供与D-生物素基本上不结合，对于L-生物素具有结合能力的多肽。另外，由本发明提供，上述多肽的多聚体、结合有上述多肽的固相、使用上述固相的测定方法及含上述固相和L-生物素结合的捕获体的试剂盒。

【附图的简单的说明】

【图1】是显示本实施方式的测定方法的一例的概略图。

【图2】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。

【图3】是显示凝胶过滤层析中的波长280nm的吸光度推移的坐标图。

【图4A】是实施例2的多肽和L-生物素的表面等离子体共振(SPR)的传感图。

【图4B】是实施例2的多肽和D-生物素的表面等离子体共振(SPR)的传感图。

【图5】是实施例2的天然体核心链霉亲和素和D-生物素标记白蛋白的表面等离子体共振(SPR)的传感图。

【图6】是显示实施例3的结果的坐标图。

【图7】是显示实施例4的结果的坐标图。

【图8A】是实施例5的将涉及结构维持的第21位氨基酸取代为L体之前的结构模型。

【图8B】是实施例5的将涉及结构维持的第21位氨基酸取代为L体之后的结构模型。

【图8C】是实施例5的将涉及结构维持的第21位氨基酸取代为L体之后进行由CleanGeometry的结构优化的结构模型。

【图9A】是实施例7的D-Tamavidin(商标)2和L-生物素标记白蛋白的表面等离子体共振(SPR)的传感图。

【图9B】是实施例7的D-Tamavidin(商标)2和D-生物素标记白蛋白的表面等离子体共振(SPR)的传感图。

【图10】是显示实施例8的结果的坐标图。

【图11】是显示实施例9的结果的坐标图。

【图12A】是L-生物素的结构。

【图12B】是D-生物素的结构。

【具体实施方式】

【1.多肽】

本实施方式的多肽属于亲和素-链霉亲和素家族。在此多肽中甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基是D-氨基酸残基。此多肽是具有对于L-生物素的结合能力，基本上不具有对于D-生物素的结合能力的多肽。

亲和素-链霉亲和素家族的多肽除去不存在旋光异构性体的甘氨酸，在天然中由L-氨基酸残基构成。本实施方式的多肽可含L-氨基酸残基，甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基优选为D-氨基酸残基。更优选的实施方式的多肽是甘氨酸以外的氨基酸残基之中95％以上的氨基酸残基是D-氨基酸残基，再优选的实施方式的多肽是，甘氨酸以外的全部的氨基酸残基是D-氨基酸残基。由此认为，至少与D-生物素结合的部位的立体结构称为镜像异构体。结果，与天然型的D-生物素的结合性降低，变得能与作为D-生物素的镜像异构体的L-生物素结合。

本实施方式的多肽由于即使受试者的血中存在D-生物素，也与D-生物素基本上不结合，在免疫学测定方法中可降低内源性D-生物素的影响。另外，在前打靶疗法中，可降低内源性D-生物素的影响，更适合地将药剂送达患部。

在本说明书中，“多肽”含蛋白质及其片段。本实施方式的多肽的氨基酸的长度只要是具有与L-生物素的结合能力，就不特别限定，例如，数十～数百个残基。本实施方式的多肽优选至少具有核心序列。其中，“核心序列”是指本实施方式的多肽的氨基酸序列之中，对于结合于生物素而言必要的氨基酸序列。

“属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽”含亲和素、链霉亲和素、来源于榆木茸(Pleurotus cornucopiae)的亲和素样蛋白质(以下，Tamavidin(商标))、慢生根瘤亲和素(Bradavidin)、根瘤亲和素(Rhizavidin)、它们的嵌合体、修饰体等。在本说明书中，D类型的多肽(例如，D类型的亲和素(以下，称为“D-亲和素”或“本实施方式的亲和素”)、D类型的链霉亲和素(以下，称为“D-链霉亲和素”或“本实施方式的链霉亲和素”)、D类型的Tamavidin(商标)(以下，称为“D-Tamavidin(商标)”或“本实施方式的Tamavidin(商标)”)、D类型的慢生根瘤亲和素(Bradavidin)(以下，称为“D-慢生根瘤亲和素(Bradavidin)”)、及D类型的根瘤亲和素(Rhizavidin)也包含在“属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽”中。

多肽的修饰体例如，可举出改变氨基酸序列的多肽或化学处理多肽的多肽。作为氨基酸序列的改变的例，可举出氨基酸残基的取代、缺损、附加等。作为化学处理的例，可举出脱糖基化等。

链霉亲和素是来源于亲和素链霉菌(Streptomyces avidinii)的生物素结合性蛋白质。

在优选的实施方式中，D-链霉亲和素含SEQ ID NO:1的第19位～第133位氨基酸序列。第19位～第133位氨基酸序列作为D-链霉亲和素的核心序列知晓。在更优选的实施方式中，D-链霉亲和素含第13位～第133位氨基酸序列或第19位～第133位氨基酸序列。在再优选的实施方式中，D-链霉亲和素含第13位～第139位氨基酸序列。在别的实施方式中，D-链霉亲和素含SEQ ID NO:1的氨基酸序列整体。本实施方式的链霉亲和素由于甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基由D-氨基酸残基构成，与D-生物素的结合性低，与L-生物素的结合性高。

亲和素是由鸟类等产生的生物素结合性蛋白质。作为本发明的一实施方式的D-亲和素可含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在优选的实施方式中，D-亲和素含SEQ ID NO:2的第2位～第128位氨基酸序列。第2位～第128位氨基酸序列被认为D-亲和素的核心序列。在别的实施方式中，D-亲和素含SEQ ID NO:2的氨基酸序列整体。本实施方式的亲和素由于甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基由D-氨基酸残基构成，与D-生物素的结合性低，与L-生物素的结合性高。

Tamavidin(商标)是从榆木茸发现的蛋白质。对于生物素具有高的亲和性，与亲和素相比，具有热稳定性优良等的特征(国际公开第2002/072817号)。Tamavidin(商标)的氨基酸序列可举出例如SEQ ID NO:3(Tamavidin(商标)1)或SEQ ID NO:4(Tamavidin(商标)2)所示的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，D-Tamavidin(商标)1含SEQ ID NO:3的第4位～第129位氨基酸序列。第4位～第129位氨基酸序列被认为Tamavidin(商标)1的核心序列。D-Tamavidin(商标)2含SEQ ID NO:4的第4位～第127位氨基酸序列。第4位～第127位氨基酸序列被认为Tamavidin(商标)2的核心序列。D-Tamavidin(商标)1及D-Tamavidin(商标)2由于甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基由D-氨基酸残基构成，与D-生物素的结合性低，与L-生物素的结合性高。

本实施方式的多肽的核心序列可含L-氨基酸残基，但甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基优选为D-氨基酸残基。在更优选的实施方式中，核心序列的甘氨酸以外的氨基酸残基之中95％以上的氨基酸残基是D-氨基酸残基，在再优选的实施方式中，甘氨酸以外的全部的氨基酸残基是D-氨基酸残基。

本实施方式的多肽也可为与上述的氨基酸序列比较，含取代、缺失或附加等的氨基酸的改变的多肽。优选的实施方式是与上述的氨基酸序列具有90％以上的相同性的多肽，更优选的实施方式是与上述的氨基酸序列具有95％以上的相同性的多肽。

作为改变氨基酸序列的多肽的具体例，可举出Qureshi et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.276,No.49,Issue of December 7，pp.46422-46428,2001中记载的链霉亲和素修饰体(以下，称为“链霉亲和素修饰体1”)。链霉亲和素修饰体1与SEQID NO:1的氨基酸序列比较而具有S45A、T90A及D128A的取代变异(SEQ ID NO:5)。链霉亲和素的核心序列和链霉亲和素修饰体1的核心序列的相同性是97.4％。一实施方式的链霉亲和素是D体的链霉亲和素修饰体1(以下，称为“D-链霉亲和素修饰体1”)，含SEQ ID NO:5的第19位～第133位氨基酸序列。第19位～第133位氨基酸序列作为链霉亲和素修饰体1的核心序列知晓。在更优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体1含第13位～第133位氨基酸序列或第19位～第139位氨基酸序列。在再优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体1含第13位～第139位氨基酸序列。在别的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体1含SEQ ID NO:5的氨基酸序列整体。

作为链霉亲和素修饰体的其他例，可举出Wu et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.280,No.24,Issue of June 17,pp.23225-23231,2005中记载的链霉亲和素修饰体(以下，称为“链霉亲和素修饰体2”)。链霉亲和素修饰体2与SEQ IDNO:1的氨基酸序列比较，具有T76R、V125R、V55T及L109T的取代变异(SEQ ID NO:6)。链霉亲和素的核心序列和链霉亲和素修饰体2的核心序列的相同性是96.5％。一实施方式的链霉亲和素是D体的链霉亲和素修饰体2(以下，称为“D-链霉亲和素修饰体2”)，含SEQ ID NO:6的第19位～第133位氨基酸序列。第19位～第133位氨基酸序列作为链霉亲和素修饰体2的核心序列知晓。在更优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体2含第13位～第133位氨基酸序列或第19位～第139位氨基酸序列。在再优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体2含第13位～第139位氨基酸序列。在别的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体2含SEQ ID NO:6的氨基酸序列整体。

作为链霉亲和素修饰体的其他例，可举出Lim et al.，BIOTECHNOLOGY ANDBIOENGINEERING,2013Jan；110(1)：57-67中记载的链霉亲和素修饰体(以下，称为“链霉亲和素修饰体3”)。此蛋白质具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。一实施方式的链霉亲和素是D体的链霉亲和素修饰体3(以下，称为“D-链霉亲和素修饰体3”)，优选含SEQ ID NO:7的氨基酸序列整体。

作为链霉亲和素修饰体的其他例，可举出Sano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.94,pp.6153-6158,June 1997中记载的链霉亲和素修饰体(以下，称为“链霉亲和素修饰体4”)。链霉亲和素修饰体4与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比较，具有H127D的取代变异和G113-W120的缺失变异(SEQ ID NO:8)。链霉亲和素的核心序列和链霉亲和素修饰体2的核心序列的相同性是92.2％。一实施方式的链霉亲和素是D体的链霉亲和素修饰体4(以下，称为“D-链霉亲和素修饰体4”)，含SEQ ID NO:8的第19位～第125位氨基酸序列。第19位～第125位氨基酸序列作为链霉亲和素修饰体4的核心序列知晓。在更优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体4含第13位～第125位氨基酸序列或第19位～第131位氨基酸序列。在再优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体4含第13位～第131位氨基酸序列。在别的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体4含SEQ ID NO:8的氨基酸序列整体。

作为链霉亲和素修饰体的其他例，可举出国际公开第2006/058226号中记载的链霉亲和素修饰体(以下，称为“链霉亲和素修饰体5”)。链霉亲和素修饰体5具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。一实施方式的链霉亲和素是D体的链霉亲和素修饰体5(以下，称为“D-链霉亲和素修饰体5”)，含SEQ ID NO:9的第1位～第20位、第35位～第196位及第213位～第261位氨基酸序列。第1位～第20位、第35位～第196位及第213位～第261位氨基酸序列作为相当于链霉亲和素修饰体5的核心序列的序列知晓。在更优选的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体5含第1位～第24位、第29位～第202位及第207位～第261位。在别的实施方式中，D-链霉亲和素修饰体5含SEQ ID NO:9的氨基酸序列整体。

本说明书中的D-或L-的表述是基于IUPAC命名法表示化合物的立体配置的表述，基于以d-甘油醛作为立体配置的基准，以可不使此立体配置崩解的化合物作为D体，将其镜像异构体表述为L体的表述法。

作为本实施方式的多肽的结合配偶的L-生物素是D-生物素的镜像异构体。在本说明书中，“L-生物素”是含游离的L-生物素和附加到捕获体等其他物质的L-生物素基的概念。L-生物素由例如非专利文献(Journal of the American Chemical Society 1978、100、1558-1563)的方法等的公知的方法合成，可通过使用手性柱层析等光学分割而得到。L-生物素只要是D-生物素的镜像异构体，制造方法就不特别限定，也可使用市售品。

本实施方式的多肽的对于L-生物素或D-生物素的结合性可例如以使用生物素化酶和多肽固定化板的板测定中的信号或表面等离子体共振(SPR)中的传感图的变化及解离常数(Kd值)作为指标确认。解离常数的测定方法可使用例如，使用SPR解析或等温滴定型量热法解析等的公知的方法。作为测定装置，例示例如Biacore T200(Cytiva公司)。

本实施方式的多肽和L-生物素的解离常数优选为10^-7M以下，更优选为10^-10M以下，最优选为10^-13M以下。

“基本上不具有对于D-生物素的结合能力”是指，例如，本实施方式的多肽和D-生物素的解离常数成为优选为10^-6M以上，更优选为10^-4M以上，再优选为10^-2M以上。在最优选的实施方式中，在使用Biacore T200(Cytiva公司)测定本实施方式的多肽和L-生物素的结合能力时，确认不到因分析物的结合导致的特异性的传感图的变化。再者，“基本上不具有对于D-生物素的结合能力”与“基本上不结合于D-生物素”同义。

使用Biacore T200系统的结合性的决定方法例如，如下所述。对于Biacore T200系统的CM5传感器芯片(Cytiva制)的流动池1及3，将牛血清白蛋白由使用胺偶联试剂盒(Cytiva公司)的胺偶联法以靶水平400RU固定化。再者，对于流动池2、4，同样地由胺偶联法，将各自L-生物素标记白蛋白、D-生物素标记白蛋白用靶水平400RU固定化。将各流动池用1M乙醇胺溶液、pH8.5(Cytiva制)封闭。作为D-生物素标记白蛋白，使用由HABA法而每白蛋白的D-生物素标记数被推定为0.4的，作为L-生物素标记白蛋白，使用通过与上述D-生物素标记白蛋白在同条件下调制而推定为同样的D-生物素标记数的。

作为电泳缓冲液，使用HBS-EP+(Cytiva制)，使属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽由单循环法，以100pM～100nM的范围内以流速30μL/min流经各流动池，由Biacore T200Evaluation Software(Cytiva制)取得显示对于D-生物素标记白蛋白或L-生物素标记白蛋白的SPR中的传感图的变化的数据。由于从固定化牛血清白蛋白的流动池取得的数据显示背景的值，也可使用背景的值，使显示对于D-生物素标记白蛋白或L-生物素标记白蛋白的SPR中的传感图的变化的数据标准化。属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽的结合性可例如，基于[显示L-生物素标记白蛋白和属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽的结合性的数据](以下，作为“数据L1”)和[显示D-生物素标记白蛋白和属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽的结合性的数据](以下，作为“数据D1”)而确定。

例如，数据D1的值除以数据L1的值的值是1/10以下，1/100以下，或者1/1000之时，可确定为属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽“与D-生物素基本上不结合”。

例如，数据L1的值除以数据D1的值的值是10以上、100以上、或者1000以上之时，可确定为属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽“与D-生物素基本上不结合”。

例如，从数据L1的值减去数据D1的值的值、或者从数据D1的值减去数据L1的值的值的绝对值是数据L1的值的1/10以下，1/100以下，或者1/1000之时，可确定为属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽“与D-生物素基本上不结合”。

基于使用生物素化酶和多肽固定化板的板测定中的信号的结合性的决定方法例如，基于后述的实施例3而构建利用ELISA法的生物素的测定系，取得使用L-生物素之时的酶活性的值(数据L2)和使用D-生物素之时的酶活性的值(数据D2)。与使用上述BiacoreT200系统时同样地，基于数据L2及数据D2而确定属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽是否与D-生物素实质上结合。

【2.多聚体】

别的实施方式是以上述的多肽作为单体单元的多聚体。此多聚体可多个上述的多肽缔合而形成。在此多聚体中，单体单元的数不特别限定。例如，此多聚体是2聚体、4聚体或8聚体。

【3.多肽的合成方法】

本实施方式的多肽可由公知的肽的合成方法制造。作为肽的合成方法，只要是得到期望的多肽，就不特别限制。例如，可举出液相合成、固相合成、由使用人工tRNA的无细胞系的合成等。另外，在生产物的多肽的氨基酸残基数是一常数以上(一般而言30个残基～50个残基以上)时，可通过合成2个以上的肽片段之后使用公知的连接反应，将多肽连接来制造。本实施方式的多肽可由例如以下的固相合成法合成。

(1)使用保护基将保护氨基的氮原子的第1个残基的氨基酸的羧基结合于树脂。

(2)使用脱保护剂脱离由上述(1)或(3)的结合反应得到的反应物的保护基之后，用溶剂清洗而形成游离氨基酸。

(3)将在上述(2)中得到的游离氨基酸和氨基被保护基保护的任意的氨基酸使用缩合剂缩合。

(4)使用脱保护剂脱离上述(3)的生成物的保护基，形成游离氨基酸。

(5)通过重复(2)～(4)的工序，可得到连接向C末端结合树脂的任意的氨基酸的多肽。

(6)在(5)的工序后的任意的时间点、及制造结合有期望的多肽的树脂的时间点使用溶剂清洗。

(7)通过将在(6)中清洗的上述树脂结合的多肽由保护基保护N末端氨基之后，使用酸切断树脂，可得到结合有保护基的任意的多肽。

各工序可手动合成，也可使用自动合成机等。也可将一部分用手动合成进行，适宜使用自动合成机。作为自动合成机的例，可举出Liberty Blue(CEM制)、Multipep2(CEM制)、Initiator+Alstra(Bιge制)、SyrII(Bιge制)等，但不特别限定。

作为(1)中使用的树脂，只要是在固相合成法中使用的公知的树脂即可。作为以C末端作为酰胺基供给的树脂，优选使用例如，用氨基官能化的Rink-Amide-树脂(MerckKGaA制)、Rink-Amide-PEGA-树脂(Merck KGaA制)及Fmoc-NH-SAL-树脂(渡边化学工业制)。另外，也可使经氨基官能化的Amino-PEGA-树脂(Merck KGaA制)等结合Fmoc-NH-SAL-树脂-接头(渡边化学工业制)等。

另外，作为以C末端作为羧酸时的树脂，可使用例如，用氯官能化的2-氯三苯甲基氯化物树脂(Merck KGaA制)或用氨基官能化的Amino-PEGA-树脂(Merck KGaA制)、具有羟基的NovaSyn TGT醇树脂(Merck KGaA制)、Wang-树脂(Merck KGaA制)、HMPA-PEGA-树脂(Merck KGaA制)等。另外，也可使Amino-PEGA-树脂和氨基酸之间存在接头，作为这样的接头，可举例如，4-羟基甲基苯氧基醋酸(HMPA)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基醋酸(HMPB)等。可使用C末端的氨基酸预先结合于树脂的H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG树脂(Merck KGaA制)等。

在使用具有羟基的树脂或经氯官能化的树脂时，树脂和氨基的氮原子被保护基保护的氨基酸的结合将氨基酸的羧基与树脂由酯键结合。另外，在使用经氨基官能化的树脂时，将该氨基酸的羧基与树脂由酰胺键结合。

作为保护基，使用公知的保护基即可，例如，可使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团、t-丁基氧基羰基(Boc)基团、苄基、烯丙基氧基羰基、乙酰基等的，碳酸系或酰胺系的保护基。在向氨基酸导入保护基时，例如在导入Fmoc基团时，可通过加9-芴基甲氧基羰基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯和碳酸钠进行反应来导入。反应温度可为0～50℃、优选为室温，反应时间可为1～5小时、优选为3小时。

作为使用保护基保护氨基的氮原子的氨基酸，也可使用市售的氨基酸。例如，可举出Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-AIa-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-SeMet-OH、Fmoc-3-(Methylseleno)-Ala-OH。

另外，作为被保护基保护的氨基酸，也可使用向侧链导入保护基的氨基酸。例如，可举Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Sec(Trt)-OH、Fmoc-Sec(pMeOBzl)-OH、Fmoc-Sec(pMeBzl)-OH、Fmoc-HomoSec(pMeBzl)-OH、Fmoc-HomoSec(Mob)-OH。

在使用具有羟基的树脂时，例如，只要是HMPB树脂，就可作为酯化催化剂使用。此时、脱水缩合剂可使用1-均三甲苯磺酰-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二酰亚胺(DCC)、二异丙基碳二酰亚胺(DIC)等的公知的脱水缩合剂。氨基酸和脱水缩合剂的使用比例相对于前者1当量，后者通常是1～10当量、优选为1～5当量。

酯化反应优选例如，通过向固相柱供树脂，用溶剂清洗，加氨基酸溶液来进行。作为清洗用溶剂，可举例如二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷(DCM)等。作为溶解氨基酸的溶剂，可举例如二甲基亚砜(DMSO)、DMF、DCM等。酯化反应的反应温度可为0～50℃、优选为室温，反应时间可为10分钟～30小时左右、优选为15分钟～24小时左右。

此时，优选将固相上的未反应的官能团使用无水醋酸等乙酰基化而封端。

脂溶性保护基的脱离可通过例如用碱处理来进行。作为碱基，可举例如哌啶、吗啉等。此时，优选在溶剂的存在下进行。作为溶剂，可举出例如DMF、DMSO、甲醇等。

游离氨基和氨基氮被保护基保护的任意的氨基酸的羧基的酰胺化反应优选在活化剂、碱基及溶剂的存在下进行。

作为活化剂，可举出例如，DIC、DCC、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺·盐酸盐(WSC·HCl)、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、二乙基氰基膦酸酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六磷酸氟(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六磷酸氟(HCTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六膦酸氟(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四硼酸氟(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(DHBT)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉□氯化物(DMT-MM)等。

活化剂的使用量优选对于氨基氮被保护基保护的任意的氨基酸，设为1～20当量、优选为1～10当量、再优选为1～5当量。

作为碱基，优选可与烷基化反应共存的碱基。例如，可举N-乙基二异丙基胺(DIPEA)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、DMAP,1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、2,6-二甲基吡啶、三乙基胺(TEA)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)等，但不特别限定。

作为溶剂，可举例如DMF、DMSO、DCM等。反应温度也可为0～50℃、优选为室温，反应时间进行10分钟～30小时左右、优选为15分钟～24小时左右。保护基的脱离可与上述同样地进行。在从树脂切断肽链中，优选用酸处理。作为酸，可举例如，三氟醋酸(TFA)。

作为将2以上的肽片段连接的公知的连接反应，可利用天然Chemical连接(NCL法)(Dawson et al.，Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science、266：776-779(1994))。

NCL法是设为在C末端具有α羧基硫酯部分的第1肽和N末端具有半胱氨酸残基的第2肽的化学选择反应，半胱氨酸的侧链的巯基(也称为SH基团，巯基)与硫酯基的羰基碳选择性地反应，由巯基交换反应生成硫酯键初期中间体。此中间体自发分子内转位而向连接部位给天然酰胺键，一方面，使半胱氨酸侧链巯基再生。

在NCL法中，也可在N末端具有半胱氨酸残基的第2肽的半胱氨酸结合部位连接反应后由脱硫反应(Yanet al.，J.Am.Chem.Soc.123,526(2001))取代为丙氨酸。即，可将原本是丙氨酸的部位取代为半胱氨酸而进行合成，作为连接反应的结合部位。

肽的合成反应或连接反应的前后的工序中也可包括分离和/或纯化工序。纯化方法使用即可公知的方法，可举出柱层析等。作为柱层析的例，可举出顺相层析、逆相层析、凝胶过滤层析、亲和性层析等，但不特别限定。对应于期望分离纯化的对象物，溶剂、柱的填充剂、分离对象物及纯化对象物的检测方法、温度条件、压力条件等可适宜选择。

在肽的合成反应、连接反应或分离和/或纯化工序的前后也可含适宜、公知的清洗、干燥、稀释、及浓缩工序等。

在多肽未被正确地折叠时，优选重折叠。重折叠可例如使纯化的多肽溶解于含尿素、胍盐酸盐等的变性缓冲液等，或向融合多肽的粗纯化液添加尿素、胍盐酸盐等的变性剂而溶解融合多肽的凝集后，例如，由非专利文献(Arakawa et al.，Antibodies232(2014))中记载的稀释重折叠法、透析重折叠法、固相重折叠法、尺寸排除层析重折叠法、表面活性剂重折叠法等进行。优选为透析重折叠法。

【4.测定方法】

本实施方式的测定方法是使用固定上述的多肽或其多聚体的固相和固定于上述固相的捕获体，在体外测定受试体中的受试物质的方法。

作为捕获体，可使用特异性地结合于受试物质的物质。捕获体上直接或间接附加有L-生物素或其修饰体。作为捕获体的例，可举抗体、抗原、适体、凝集素、核酸、酶等，但不特别限定。

作为捕获体或后述的检测体使用的“抗体”，可为全长的抗体或其片段。抗体的类可为IgG、IgA、IgM、IgD及IgE之任一者，但优选为IgG。IgG的亚类不特别限定，也可为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之任一者。作为抗体的片段，可举出例如还原型IgG(rIgG)、Fab、Fab'、F(ab')、F(ab')2、Fv、单链抗体(scFv)、双抗体、三体抗体等。调制这些抗体片段的方法本身是公知的。抗体可为单克隆抗体及多克隆抗体之任一者，但优选为单克隆抗体。单克隆抗体也可为嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体等。另外，抗体也可为来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼、羊驼、鸡等之任一者的动物的抗体。

受试物质是本实施方式的测定方法的检测对象的物质，只要是能由捕获体捕获的物质即可。作为受试物质的例，可举细胞、细胞外囊泡、蛋白质、核酸、多糖类、糖蛋白质、磷脂等，但不特别限定。

受试体是含受试物质的试样或疑似含受试物质的试样。作为受试体的例，可举出来源于生物的试样或环境样品、对这些实施预处理的试样等。作为来源于生物的试样，可举出体液、排泄物。作为体液的例，只要是从生物体采集的试样，就不特别限定，可举出血清、血浆、血液、髓液、精液、组织、组织液、淋巴液、唾液、鼻咽头拭液、咳痰、支气管肺泡清洗液等。作为排泄物的例，不特别限定，可举出尿、粪便等。作为环境样品的例，可举出排水、河川水、海水、土壤等。

上述的多肽或其多聚体固定于固相。该固定的实施方式不特别限定。例如，可将上述的多肽或其多聚体和固相直接键合，也可间接结合。作为直接的结合，可举出例如，物理吸附等。间接的结合是指上述的多肽或其多聚体和固相之间介有别的物质的实施方式。例如，在固相表面被牛血清白蛋白或聚乙二醇等的封闭剂覆盖时，通过将上述的多肽或其多聚体、固相和该封闭剂结合而可在固相上固定上述的多肽或其多聚体。

在本实施方式的测定方法中，捕获体和固相可分别提供于使用者，也可在捕获体和固相预先固定于固相的状态下提供于使用者。在捕获体和固相分别提供于使用者时，本实施方式的测定方法也可包括使受试体、固相和捕获体接触的工序。在该工序中，受试体、固相和捕获体的接触的顺序不特别限定。优选为，使受试体和捕获体接触而形成受试体中的受试物质和捕获体的复合体，其后，使该复合体和固相接触而在固相上形成复合体。此时，即使受试体中含D-生物素，在固相上固定的上述多肽或多聚体也可与D-生物素基本上不结合，与含L-生物素基的捕获体结合。本实施方式的测定方法中，捕获体和固相分别提供于使用者在可对于多种受试物质使固相共同化的点优选。

本实施方式的测定方法也可包括在固相上形成含捕获体、受试物质和检测体的复合体(以下，也称为“夹心复合体”)的工序(以下，也称为“复合体形成工序”)，及对基于此复合体中所含的检测体的信号进行测定的工序(以下，也称为“测定工序”)。

在复合体形成工序中，通过使固相、捕获体、含受试物质的受试体和检测体接触，可在固相上形成夹心复合体。固相、捕获体、受试体和检测体的接触顺序不特别限定。优选为，使受试体和捕获体接触而形成受试体中的受试物质和捕获体的复合体，其后，使该复合体和固相接触而在固相上形成复合体，其后，使该复合体和检测体接触而在固相上形成夹心复合体。此时，即使受试体中含D-生物素，在固相上固定的上述的多肽或多聚体也可与D-生物素基本上不结合，与含L-生物素基的捕获体结合。优选在固相上形成受试物质和捕获体的复合体之后、接触检测体之前进行除去未反应的成分的B/F分离。在复合体形成工序中的各成分的反应条件(例如，溶剂、温度、压力、反应时间等)可由本领域技术人员适宜选择。

检测体优选含结合于受试物质的物质和标记物质。结合于受试物质的物质可举出例如抗体、抗原、适体、凝集素、核酸等。另外，检测体也可含结合于受试物质的第一次物质和含标记物质而结合于第一次物质的第二次物质。第一次物质及第二次物质可举出例如抗体、抗原、适体、凝集素、核酸等。在第一次物质及第二次物质均为抗体时，各自称为第一抗体及第二抗体，在本领域中广泛使用。在使用第一抗体及第二抗体时，通过使受试物质结合第一抗体，使该第一抗体结合第二抗体，可形成含标记物质的夹心复合体。作为具体例，第一次物质是来源于小鼠、兔等的动物的，是特异性地结合于受试物质的第一抗体，第二次物质是含标记物质，特异性地结合于该动物的抗体的第二抗体。

标记物质不特别限定，可举出例如，其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)、及，催化其他物质的反应而发生信号的物质。作为信号发生物质，可举出荧光物质、放射性同位素、显色物质等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，可举出例如酶。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、Alexa Fluor(注册商标)等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素，可举出¹²⁵I、¹⁴C、³²P等。作为显色物质，可举出金纳米胶体等的金属胶体。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。优选的标记物质是酶，特别优选碱性磷酸酶。

在测定工序中，通过对基于检测体的信号进行测定，可对受试物质进行测定。可基于由测定工序得到的值而进行受试物质的定量、定性检测或半定量检测。其中，半定量检测是指将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。

检测信号的方法本身在该技术中公知。在本实施方式中，只要是适宜选择对应于来源于上述的标记物质的信号的种类的方法即可。信号的检测装置，例如，可使用吸光度计、分光光度计、荧光光度计、红外光光度计、拉曼分光光度计、SPR测定装置、化学发光酶联免疫测定装置等，但不特别限定。

在一实施方式中，对受试体中的受试物质进行免疫学测定。作为免疫学测定法，可举出ELISA法、免疫层析仪法、特开平1-254868号公报中记载的免疫复合体转移法等。

在别的实施方式中，作为受试物质，测定受试体中的目标核酸。例如，可使用固定上述的多肽或多聚体的固相和作为捕获体与目标核酸杂交的核酸探针。该核酸探针由L-生物素标记，与固相上的本实施方式的多肽或多聚体结合。通过使固相、目标核酸和受试体接触，受试体中的目标核酸固定在固相上。在固相上以目标核酸作为模板，以核酸探针作为引物，由DNA聚合酶及dNPTs进行DNA的延伸反应。DNA的检测可由公知的方法进行。例如，可对于合成的扩增子作为检测体用嵌入剂(例如SYBR(商标)GreenI染料、溴化乙锭等)标记，对荧光进行测定。或者，可作为检测体结合能结合于延伸链的荧光探针，对荧光进行测定。另外，也可使用TaqMan(商标)法。参照图1，对本实施方式的测定方法的一例进行说明。

首先，向容器90分注含受试物质81的受试体和R1试剂。由第1试剂分注部551，R1试剂被分注于容器90中，由受试体分注部530向容器90中分注受试体。R1试剂含有附加L-生物素的捕获体84，与受试物质81反应而结合。通过在分注受试体和R1试剂后，在反应部580中容器90内的试样被加温到指定温度，捕获体84和受试物质81结合。

接下来，由第2试剂分注部552向容器90分注R2试剂。R2试剂含有固相82。固相82固定了本实施方式的多肽或其多聚体。R2试剂的分注后，在反应部580中容器90内的试样被加温到指定温度。结果，通过上述L-生物素和上述固相上的本实施方式的多肽或其多聚体结合，受试物质81和捕获体84固定于固相82。

也可将在固相82上形成的受试物质81及捕获体84和未反应的捕获体84由利用BF分离装置100的第1次BF分离处理分离。由第1次BF分离处理，未反应的捕获体84等的不需要成分从容器90中除去。

接下来，由第3试剂分注部553向容器90分注R3试剂。R3试剂含有检测体83，与受试物质81反应而结合。R3试剂的分注后，在反应部580中容器90内的试样被加温到指定温度。结果，在固相82上形成含受试物质81、检测体83和捕获体84的夹心复合体85。在图1的例中，检测体83是酶标记抗体。

在固相82上形成的夹心复合体85和未反应的标记物质83由利用BF分离装置100的第2次BF分离处理分离。由第2次BF分离处理，未反应的检测体83等的不需要成分从容器90中除去。

其后，由第4试剂分注部554及第5试剂分注部555各自向容器90分注R4试剂及R5试剂。R4试剂含有缓冲液。与固相82结合的夹心复合体85分散于缓冲液中。在图1的例中，R5试剂含有化学发光底物。R4试剂中所含有的缓冲液具有促进被夹心复合体85中所含的检测体83标记的酶和R5试剂中所含的化学发光底物的反应的组成。R4、R5试剂的分注后，在反应部580中容器90内的试样被加温到指定温度。通过使检测体83与底物反应而发光，将发生的光由检测部520的光检测器521检测。基于检测的光的强度而测定受试物质81。

再者，在本测定方法中，R1试剂和R2试剂分别分注于容器90，但也可在将R1试剂和R2试剂预先混合，捕获体84固定于固相82的状态下分注于容器90。

【5.含固相及固相的试剂盒】

本实施方式的固相是固定上述的多肽或其多聚体的固相。

本实施方式的固相是指用于固定捕获体的不溶性的载体。上述的多肽或其多聚体的固定于固相的实施方式如在上所述。固相可从公知的固相对应于目的选择。作为固相的原料，可选自例如高分子化合物、无机物等。固相的原料也可将多个原料适宜组合。

高分子化合物含有机高分子化合物、无机高分子化合物、半有机化合物。高分子化合物可举出例如乳胶、橡胶、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯基、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚缩水甘油基甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅酮、不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖等。

无机物含无机化合物及金属。作为无机化合物，可举出例如磁性体(氧化铁、氧化铬、钴、镍、铁素体、磁铁矿等)、玻璃、氧化硅、氧化铝等。金属可举出例如金、银及含它们的物质等。本实施方式的试剂盒含结合有上述的多肽或其多聚体的固相和附加L-生物素的捕获体。

本实施方式的试剂盒的一例示于图2。在图2中，11表示试剂盒，12表示收容含将上述的多肽或其多聚体结合的粒子的试剂的第1容器，13表示收容含附加L-生物素的捕获体的试剂的第2容器，14表示捆包箱，15表示附带文书。在附带文书中，也可记载各试剂的组成、使用方法、保存方法等。在试剂盒中可含其他试剂，可举出例如缓冲溶液、校准物、检测体等。

【实施例】

接下来，基于实施例更详细地对本发明进行说明。但是，不能解释为本发明限定于实施例。

【1.实施例1：D-链霉亲和素的调制】

【1-1.方法】

为合成由SEQ ID NO:1所示的多肽的第13位～第139位氨基酸构成的多肽(D-核心链霉亲和素)，合成由SEQ ID NO:1的第13位～第71位氨基酸构成的肽硫酯、及由将第72位丙氨酸残基取代为半胱氨酸的多肽至第139位氨基酸构成的多肽。

(1)向HMPB-ChemMatrix树脂(0.49mmol/g、Bιge制)(820mg、400μmol)加DCM，于室温膨润1小时以上。接下来，向DCM(12mL)加作为用保护基保护侧链的氨基酸的Fmoc-D-Thr(tBu)-OH(795mg、2.0mmol)、作为缩合剂加MSNT(593mg、2.0mmol)、作为5'末端羟基的封端剂加1-甲基咪唑(160μL,2.0mmol)而进行混合。向膨润的树脂加此混合溶液，于室温搅拌3小时。

(2)除去反应溶液之后，用DCM、DMF充分地清洗树脂。接下来，向DMF(12mL)加无水醋酸(2.0mL、20mmol)和吡啶(1.6mL、20mmol)，充分混合，使其与树脂混合而于室温搅拌。30分钟后，除去溶液，将树脂用DMF充分地清洗。

(3)对于使Fmoc-D-Thr(tBu)-OH缩合的树脂(100μmol)加Fmoc-Gly-OH(500μmol)、活化剂的DIC(500μmol)、表化防止剂的Oxyma Pure(商标)(500μmol)(Merck KGaA制)、溶剂的N-甲基吡咯烷酮(NMP)(4mL)而进行缩合。将以同样的程序用保护基保护侧链的氨基酸变更为Fmoc-D-Ser(tBu)-OH(500μmol)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-(Hmb)-Gly-OH(第1次：150μmol、第2次：100μmol)，由手动合成缩合。Fmoc-D-Asp(OtBu)-(Hmb)-Gly-OH由双偶联缩合。

(4)使用微波支援自动肽合成机(LibertyBlue、CEM制)延伸至39L-66T的28个残基。在微波支援自动肽合成机中使用Fmoc-D-氨基酸(500μmol)、DIC(500μmol)、Oxyma Pure(商标)(500μmol)及DIPEA(50μmol)，在缩合反应及树脂的清洗中使用DMF，在Fmoc基团的除去中使用20％哌啶/DMF。在缩合反应和Fmoc基团的除去反应时，通过照射微波来促进反应。

(5)回收树脂，再由手动合成使Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Asp(OtBu)-(Hmb)-Gly-OH与(3)在同样的反应条件下，使肽延伸。其中以100μmol进行2次Fmoc-D-Asp(OtBu)-(Hmb)-Gly-OH的双偶联。向树脂结合的多肽向NMP(7mL)加无水醋酸(167μL、1.8mmol)、DIPEA(78.8μL、0.45mmol)及Oxyma Pure(商标)(5.3mg、37μmol)，混合，于室温搅拌15分钟之后，用NMP充分地清洗。

(6)使用微波支援自动肽合成机延伸至13A-35A的23个残基，最终调制树脂结合的13A-71T的59个残基的多肽。

(7)将树脂结合的59个残基的多肽在除去N末端的Fmoc基团的状态下从合成机回收。向回收的树脂(100μmol)加Boc₂O(115μL、500μmol)、DIPEA(87μL、500μmol)、NMP(3mL)，于室温搅拌。1小时后，除去溶液，用NMP充分地清洗树脂。将此Boc化的操作重复2次。

(8)向树脂结合的59个残基的多肽(100μmol)加1％TFA/DCM溶液(3mL)，搅拌5分钟之后，放入吡啶(585μL)的茄型瓶中回收滤液。将此操作重复13次之后，用三氟乙醇/DCM(3:5)溶液(3mL)清洗树脂3次，将洗液回收到相同的茄型瓶中。减压馏去溶剂之后，向得到的固体加H₂O(40mL)而进行搅拌。离心10分钟(10000rpm)，除去上清。通过将此操作重复3次，清洗个体之后，将得到的固体冷冻干燥来得到保护肽(171mg、20μmol)。

(9)将得到的保护肽(116mg、13.5μmol)溶于NMP(5mL)，一边搅拌，一边于-15℃冷却。向其加硫代苯酚(42μL、405μmol)、PyBOP(36.7mg、67.5μmol)、DIPEA(12μL、67.5μmol)，一晚搅拌。反应完结后，将反应溶液注入冰冷的二乙基醚(40mL)中而进行搅拌。离心10分钟(10000rpm)，除去上清。通过将此操作重复3次之后，风干发生的沉淀来得到保护粗生成肽硫酯(苯硫基酯体)(113mg)。向得到的粗生成物加TFA:H₂O:三异丙基硅烷(TIPS):乙烷二巯基(EDT)(92.5:2.5:2.5:2.5、v/v/v/v)混合液(3mL)，于室温搅拌。3小时后，向冰冷的二乙基醚(40mL)加反应液，使发生的沉淀风干而得到脱保护粗生成肽(85.6mg)。向得到的脱保护粗生成肽加含8M的胍盐酸盐、0.2M的2-巯基乙磺酸钠(MESNA)的0.2M的磷酸缓冲液(pH7.0)(3mL)，于室温搅拌。搅拌1小时以上之后，由RP-HPLC(Proteonavi C1、4.6×250mm、Linear gradient of B：17.5-21.5、1.0mL/min、12min、60℃、220nm、A：aqueous solutioncontaining 0.1％TFA、B：90％MeCN、10％H₂O containing 0.09％TFA、资生堂制)纯化，得到59个残基的肽硫酯(13A-71T、MESNA硫酯体)(6.6mg、1.09μmol)。

(含半胱氨酸的多肽的合成)

(1)向HMPB-ChemMatrix树脂(0.49mmol/g)(612mg、300μmol)加DCM，于室温膨润1小时以上。接下来，向DCM(9mL)加Fmoc-D-Ser(tBu)-OH(575mg、1.5mmol)、MSNT(444mg、1.5mmol)及1-甲基咪唑(120μL、1.5mmol)，充分混合。向膨润的树脂加此混合溶液，于室温一晚搅拌。除去反应溶液，用DCM及DMF充分地清洗树脂。接下来，向DMF(9mL)加无水醋酸(1.5mL、15mmol)和吡啶(1.2mL、15mmol)，与树脂混合，于室温搅拌30分钟。其后，将树脂用DMF充分地清洗。

(2)使用微波支援自动肽合成机，使Fmoc-D-Ser(tBu)-OH缩合的树脂(100μmol)延伸在72C-139S的68个残基。在缩合反应中使用的各试剂的量是Fmoc-D-氨基酸(500μmol)、DIC(500μmol)、Oxyma Pure(商标)(500μmol)、DIPEA(50μmol)。在缩合反应及树脂的清洗中DMF、在Fmoc基团的除去中使用20％哌啶/DMF，在缩合及Fmoc基团的除去反应时，通过照射微波来促进反应。

(3)向树脂结合的68个残基的多肽(100μmol)加TFA:H₂O:TIPS:EDT(92.5:2.5:2.5:2.5、v/v/v/v)混合液(10mL)，于室温搅拌。3小时后，向冰冷的二乙基醚(80mL)加反应液，使发生的沉淀风干而得到脱保护粗生成肽(396mg)。

(4)由RP-HPLC(Triart-C18、20×250mm、Linear gradient of B：30-45、9.9mL/min、30min、60℃、220nm、A：aqueous solution containing 0.1％TFA、B：90％ MeCN、10％H₂O containing 0.09％ TFA、YMC制)纯化，得到68个残基的肽区段(72C-139S)(37.2mg、5.03μmol)。

(多肽的连接)

向0.2M的磷酸缓冲液(含8M的胍盐酸盐、40mM的4-巯基醋酸、40mM的抗坏血酸钠、40mM的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)，pH 7.1)(546μL)加肽硫酯(13A-71T)(6.0mg、0.933μmol)、肽区段(72C-139S)(9.3mg、1.26μmol)，于室温过夜搅拌。反应完结后，用0.2M的磷酸缓冲液(含8M的胍盐酸盐、0.2M的2-巯基乙磺酸钠，pH7.0)稀释为2倍，于室温搅拌。1小时以上的搅拌之后，由RP-HPLC(Proteonavi C1、4.6×250mm、Linear gradient of B：15-35、1.0mL/min、30min、60℃、220nm、A：aqueous solution containing 0.1％ TFA、B：90％MeCN、10％H₂O containing 0.09％TFA、资生堂制)纯化，得到全长127个残基的[Cys60]-(1-127)肽(6.7mg、0.504μmol)。

(脱硫反应)

使[Cys60]-(1-127)肽(4.7mg、0.354μmol)溶解于含8M的胍盐酸盐、0.25M的TCEP的0.2M的磷酸缓冲液(pH 7.1)707μL，依次加tert-丁烷巯基(40μL)、VA-044/H₂O(250mg/mL、27μL)之后，将容器遮光于室温搅拌。4小时后，加1.4mL的含8M的胍盐酸盐、0.25M的TCEP的0.2M的磷酸缓冲液(pH 7.1)而良好混合。向此混合液加二乙基醚(1.7mL)，良好搅拌之后静置，回收水相。从将其重复3次而回收的水相充分地飞二乙基醚之后，由RP-HPLC(Proteonavi C1、4.6×250mm、Linear gradient of B：15-45、1.0mL/min、30min、60℃、220nm、A：aqueous solution containing 0.1％TFA、B：90％ MeCN、10％H₂O containing0.09％TFA、资生堂制)纯化，得到全长127个残基的多肽(2.6mg、0.196μmol)。

(4聚体的调制)

将全长127个残基的多肽溶解于变性缓冲液(50mM Tris-HCl、6M胍-HCl、1mMEDTA、200mM NaCl、pH8.0(4℃))中至成为1mg/mL，于85℃加热45分钟。将加热的溶液5mL用含3M的胍HCl的缓冲液1(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、pH8.0)于4℃透析12小时。接下来，用含2M的胍HCl的缓冲液1于4℃透析36小时。用含0.4M的L-精氨酸HCl和1M的胍HCl的缓冲液1于4℃透析12小时。用含0.4M的L-精氨酸HCl和0.5M的胍HCl的缓冲液1于4℃透析36小时。最后将用缓冲液1于4℃透析4小时重复2次，进行用缓冲液1于室温透析一晚。

(凝胶过滤层析解析)

将透析后的多肽用Amicon Ultra-15 10K离心式滤器装置(Merck KGaA制)浓缩后，使用AKTA Prime系统(Cytiva制)向Superde×200 10/300GL(Cytiva制)供各500μL，使缓冲液1以流速0.4mL/分流动，进行以波长280nm的吸光度的经时变化作为溶出性的指标的凝胶过滤层析。再者，为了分子量的推定，对于市售的4聚体的天然体核心链霉亲和素(Roche制)也同样地进行凝胶过滤层析。

【1-2.结果】

在上述调制的多肽的凝胶过滤层析的，波长280nm的吸光度的经时变化示于图3。级分8是凝集体的峰。级分14～级分18在市售的4聚体核心链霉亲和素中，也由于是见到同样的峰的级分，推定为4聚体多肽的峰。回收此级分14～级分18，使用Amicon Ultra-15 10K离心式滤器装置(Merck KGaA制)进行浓缩，调制由D-氨基酸残基构成的4聚体的D-链霉亲和素(以下，为方便起见，在实施例中简称为“D-链霉亲和素”)。

【2.实施例2：由SPR解析的D-链霉亲和素的生物素结合性评价】

【2-1.方法】

对于在实施例1中得到的D-链霉亲和素，将对于作为天然型的D-生物素及作为D-生物素的旋光异构性体的L-生物素的结合能力由以SPR作为测定原理的分子间相互作用解析装置(Biacore T200)评价。

L-生物素由非专利文献(Journal of the American Chemical Society 1978、100、1558-1563)中记载的方法合成D-生物素和L-生物素的混合物之后，向Daicel公司委托利用液相层析的光学分割而调制。柱使用CHIRALPAK IG(Daicel制、Φ46×50mm)，在移动相中，作为甲醇:醋酸混合溶剂(100:0.1(v/v))，在流速1.0mL/分、柱温度40℃、检测波长205nm的条件下进行光学分割。

(1)生物素标记白蛋白的调制

向50mg/mL的牛血清白蛋白/0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)2.8mL加含10mg/mL的D-生物素-AC5-OSu(同仁化学公司制)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(16.3μL)，搅拌后，35℃静置、1小时。其后，由用0.1M的磷酸缓冲液(pH7.5)平衡化的PD-10(Cytiva制、17085101)实施脱盐，回收D-生物素标记白蛋白。由HABA法的白蛋白每1分子的D-生物素标记数是0.4。同样地使用L-生物素-AC5-OSu[参照上述实施例3中记载的(L-生物素的酰胺化)]而调制L-生物素标记白蛋白。

(2)固定于传感器芯片

对于Biacore T200系统的CM5传感器芯片(Cytiva制)的流动池1及3，将牛血清白蛋白由利用胺偶联试剂盒(Cytiva公司)的胺偶联法以靶水平400RU固定化。再者，对于流动池2、4同样地由胺偶联法，使各自L-生物素标记白蛋白、D-生物素标记白蛋白以靶水平400RU固定化。任何流动池均用1M乙醇胺溶液、pH8.5(Cytiva制)实施封闭。

(与生物素的相互作用测定)

作为电泳缓冲液，使用HBS-EP+(Cytiva制)，作为分析物而使实施例1中调制的D-链霉亲和素由单循环法，以10pM～100nM的范围内以流速30μL/min流经各流动池。

【2-2.结果】

D-链霉亲和素和L-生物素标记白蛋白的分子间相互作用的传感图示于图4A，D-链霉亲和素和D-生物素标记白蛋白的分子间相互作用的传感图示于图4B。天然体核心链霉亲和素和D-生物素标记白蛋白的分子间相互作用的传感图示于图5。

从天然体核心链霉亲和素和D-生物素标记白蛋白的传感图与D-链霉亲和素和L-生物素标记白蛋白的传感图的比较得知本实施例的D-链霉亲和素和L-生物素标记白蛋白与天然体核心链霉亲和素和D-生物素标记白蛋白的组合同样地非常强固地结合。

在图4中，D-链霉亲和素和D-生物素标记白蛋白确认不到因作为分析物的D-链霉亲和素的结合导致的特异性的传感图的变化。当考虑专利文献1中所示的链霉亲和素变体和天然型的D-生物素标记白蛋白的解离常数Kd＝3.48×10^-7时，本实施例的D-链霉亲和素和D-生物素的结合性极其低，可称为基本上不结合。

【3.实施例3：对于ELISA法中的D-生物素的测定系的影响的评价】

【3-1.方法】

(链霉亲和素结合固相的制作)

将96孔ELISA板(Thermo Fisher Scientific制)用PBS清洗3次之后，加实施例1中调制的D-链霉亲和素(1μg/mL、PBS、100μL)，于4℃一晚静置。用PBS清洗3次之后，添加含2％牛血清白蛋白的PBS缓冲液(200μL)，于25℃、以旋转速度600rpm进行振荡搅拌2小时，制作D-链霉亲和素固定化板。对于L-链霉亲和素(Roche制)也进行同样的处理，制作L-链霉亲和素固定化板。

(L-生物素的酰胺化)

使生物素(43mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(24.3mg)溶解于DMF(1.2mL)，将乙基(二甲基氨基丙基)羧基二酰亚胺(EDC)(40.5mg)加于室温搅拌23小时。馏去溶剂而将得到的残留物从乙醇:醋酸:水(95:5:1)再结晶，得到6-(5-((3aR,4R,6aS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊烷酰胺)己酸6-氨基己酸(化合物2)(63.9mg)。

【化1】

使6-氨基己酸(24.2mg)溶解于0.25M的碳酸钠水溶液(0.4mL)。向化合物2的DMF(1mL)溶液加此溶液，于室温搅拌23小时。馏去溶剂后，水洗残留物。用4M盐酸调至酸性，滤取生成的固体而得到6-(5-((3aR,4R,6aS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊烷酰胺)己酸(化合物3)(68.5mg)。

【化2】

使化合物3(68.5mg)和NHS(40.5mg)溶解于DMF(3.3mL)，于室温加EDC(67.5mg)，于35℃搅拌21小时。向硅胶柱层析附馏去溶剂得到的残留物，从DCM-甲醇溶出部得到2.5-二氧代吡咯烷-1-基5-((3aR,4R,6aS)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸酯(化合物4)(47.6mg)。

【化3】

(生物素标记抗体的调制)

向5.1mg/mL的甲状腺刺激激素抗体(TSH抗体)(T2-194)(北山LABES制)(25μL)加含16.7mg/mL的L-生物素-AC5-OSu的DMSO溶液(1.3μL)，搅拌后，35℃静置、1小时。其后，供于用0.1M的磷酸缓冲液(pH7.5)平衡化的PD-10(Cytiva制、17085101)，分取各500μL的级分，回收280nm波长的吸收峰级分，制作L-生物素标记TSH抗体。对于D-生物素-AC5-OSu(同仁化学制)也进行同样的处理，制作D-生物素标记TSH抗体。

(D-生物素存在下的对测定系的影响的评价)

(1)向1.5mL管作为受试体添加HISCL(商标)TSH calibrator C3(Sysmex制)400μL及，HISCL(商标)TSH R1试剂(Sysmex制)400μL，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。再者，为了对于受试体评价D-生物素影响度，添加0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL或100ng/mL的D-生物素而与R1试剂反应。

(2)对于封闭后的D-链霉亲和素固定化板，用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗3次，向各孔添加各60μL的在1.5mL管中反应完成的溶液。在37℃、600rpm的条件下反应20分钟。添加上述制作的L-生物素标记TSH抗体，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。

(3)反应后将板用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗5次，添加各50μL的HISCL(商标)R4试剂(Sysmex制)，接下来，添加各100μL的HISCL(商标)R5试剂(Sysmex制)，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。反应后用酶标仪(TECAN制、Infinite 200PRO)进行发光检测。另外，对于封闭后的L-链霉亲和素固定化板和D-生物素标记TSH抗体也同样地进行测定。

【3-2.结果】

D-生物素存在下的由ELISA法的TSH的检测结果示于图6。在图6中，显示各测定系中将测定D-生物素浓度是0ng/mL的受试体之时的信号测定值设为100％之时的各受试体的信号测定值的百分率。在受试体中存在D-生物素时，在D-生物素/L-链霉亲和素的测定系中依赖于D-生物素的添加浓度而信号减少。一方面，在L-生物素/D-链霉亲和素的测定系中几乎见不到D-生物素添加导致的影响。D-链霉亲和素/L-生物素的测定系基本上不受存在于受试体的内源性的D-生物素的影响。

【4.实施例4：测定系的定量性的确认】

【4-1.方法】

(1)向1.5mL的管中作为受试体添加HISCL(商标)TSH calibrator C0～C5(Sysmex制)至成为0μIU/mL、2μIU/mL、10μIU/mL、50μIU/mL、120μIU/mL或200μIU/mL。其后，添加400μL的添加HISCL(商标)TSH calibrator C0～C5(Sysmex制)的HISCL(商标)TSH R1试剂(Sysmex制)，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。

(2)对于与实施例3同样地制成的封闭后的D-链霉亲和素固定化板，用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗3次，向各孔添加各60μL在1.5mL管中反应完成的溶液。在37℃、600rpm的条件下反应20分钟。添加上述制作的L-生物素标记TSH抗体，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。

(3)反应后，将板用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗5次，添加各50μL的HISCL(商标)R4试剂(Sysmex制)，接下来，添加各100μL的HISCL(商标)R5试剂(Sysmex制)，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。反应后，用酶标仪(Infinite 200PRO)进行发光检测。

【4-2.结果】

在实施例4中测定的结果示于表1及图7。图7是显示TSH浓度0～120μIU/mL的计数值的坐标图。如图7所示，L-生物素/D-链霉亲和素的系与R²＝0.998显示良好的相关性。从TSH的参考基准范围在0.34～4.22μIU/mL得知是在测定范围内具有良好的直线性的系统。

【表1】

TSH浓度(μIU/mL)	校准品	计数值
			0	C0	1,010
2	C1	17,272
			10	C2	80,448
50	C3	442,005
			120	C4	967,485
200	C5	1,264,387

另外，准备5个TSH浓度50μIU/mL试样，对于各自进行TSH浓度的测定。结果示于表2。变动系数是约5％。得知，本实施例的测定系在再现性的观点也无问题。

【表2】

	计数值
		平均	409652.4
标准偏差	20773.11
		变动系数	5.07

【5.实施例5：涉及结构维持的氨基酸残基的L-氨基酸残基取代】

【5-1.方法】

SEQ ID NO:1所示的D-链霉亲和素的氨基酸序列之中，探讨将一部分的氨基酸残基变更为L体对立体结构的影响。在探讨时，进行由Discovery Studio(Dassault公司制)的计算机模拟解析。

首先，从蛋白数据银行(PDB)取得天然型核心链霉亲和素四聚体的结晶结构(PDBID：3RY2)，从四聚体提取一个单体结构。通过基于提取的结构，在Discovery Studio上将全部氨基酸残基变换为D-氨基酸残基，构建D-链霉亲和素的单体结构。其后，确认构成D-链霉亲和素单体结构的氨基酸残基的溶剂接触度。D-链霉亲和素的核心序列的氨基酸残基之中，甘氨酸以外的氨基酸残基，确定溶剂接触度25％以下的氨基酸残基。结果，该氨基酸残基是依溶剂接触度低的顺序，SEQ ID NO:1的第21位、第29位、第77位、第104位、第130位、第54位、第56位、第39位、第43位、第27位、第75位、第31位、第92位、第90位、第128位、第102位、第33位、第79位、第71位、第73位、第106位、第23位、第60位、第96位、第81位、第122位、第28位、第86位、第88位、第50位、第45位、第108位、第38位、第110位、第132位及第42位的计36个氨基酸残基。这些氨基酸残基被认为特别涉及处于D-链霉亲和素的单体内部的结构维持。将上述的氨基酸残基之中之一取代为L-氨基酸残基时，关于取代的氨基酸残基，取代的氨基酸残基的与N侧邻接的氨基酸残基和与C侧邻接的氨基酸残基，利用Clean Geometry功能进行化合物的结构优化。其后，从立体结构确认D-链霉亲和素的内部的原子间的冲击的有无。

【5-2.结果】

实施例5的结果，对于36个氨基酸残基之任一者的氨基酸残基，从D-氨基酸残基取代为L-氨基酸残基时发生的原子间的冲击也通过利用Clean Geometry功能进行结构优化来解除。作为其1例，在将作为第21位氨基酸残基的D-色氨酸残基取代为L-色氨酸残基之时发生的原子的冲击被解除的样式示于图8A～C。将第21位D-色氨酸残基取代为L体之前的结构示于图8A。在将第21位D-色氨酸残基取代为L-色氨酸残基时，在D-链霉亲和素内发生原子间的冲击的样式示于图8B(用椭圆强调的圆柱表示原子间的冲击)。通过利用CleanGeometry功能进行结构优化，D-链霉亲和素内的原子间的冲击被解除的样式示于图8C。

在计算机模拟解析中得知，对于涉及结构维持的氨基酸残基之任一者的氨基酸残基，也在从D-氨基酸残基取代为L-氨基酸残基时发生的原子间的冲击被解除。在体外的状态中，也在将涉及结构维持的氨基酸残基的一部分取代为L-氨基酸残基时，被认为存在D-链霉亲和素内的原子移动而原子间的冲击解除的结构。从而，即使涉及单体的结构维持的氨基酸残基的一部分变成L-氨基酸残基，也被认为能结合于生物素的结构被维持。

【6.实施例6：由D氨基酸构成的来源于榆木茸(Pleurotus cornucopiae)的亲和素样蛋白质的合成】

合成由D氨基酸构成的来源于榆木茸(Pleurotus cornucopiae)的亲和素样蛋白质(以下，D-Tamavidin(商标)2)。将具有SEQ ID NO:4的第2位～第141位氨基酸序列的多肽分为5个肽区段，将各自由肽自动合成机(Prelude、Protein Technologies，Inc.)合成。所述5个区段是含SEQ ID NO:4的第2位～第23位的序列的区段1、含第24位～第49位的序列的区段2、含第50位～第76位的序列的区段3、含第77位～第105位的序列的区段4、及含第106位～第141位的序列的区段5。接下来，通过将区段1和2由化学连接连接而调制区段1-2，将区段3和4由化学连接连接而调制区段3-4，将区段5由化学连接连接到区段3-4而调制区段3-4-5，将区段1-2和区段3-4-5由化学连接连接，生成具有SEQ ID NO:4的第2位～第141位氨基酸序列的D-Tamavidin(商标)2。

(4聚体的调制)

将D-Tamavidin(商标)2溶解于变性缓冲液(80mM Tris-HCl、6M胍-HCl、1mM DTT、pH8.0)中至成为20mg/mL，于85℃加热45分钟。对于加热的溶液而添加5倍量缓冲液(80mMTris-HCl、1mM DTT、pH8.0)，室温静置30分钟。接下来，将该溶液用缓冲液(80mM Tris-HCl、1mM DTT、pH8.0)稀释50倍之后，4℃O/N静置。其后，将溶液用Amicon Ultra-4(30k)(MerckMillipore公司)进行浓缩之后，作为D-Tamavidin(商标)2蛋白质溶液回收。

【7.实施例7：由SPR解析的D-Tamavidin(商标)2的生物素结合性评价】

【7-1.方法】

(1)生物素标记白蛋白的调制

向50mg/mL的牛血清白蛋白/0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)2.8mL加含10mg/mL的D-生物素-AC5-OSu(同仁化学公司制)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(16.3μL)，搅拌后，35℃静置、1小时。其后，由用0.1M的磷酸缓冲液(pH7.5)平衡化的PD-10(Cytiva制、17085101)实施脱盐，回收D-生物素标记白蛋白。由HABA法的白蛋白每1分子的D-生物素标记数是0.4。同样地使用L-生物素-AC5-OSu[参照上述实施例3中记载的(L-生物素的酰胺化)]而调制L-生物素标记白蛋白。

(2)固定于传感器芯片

对于Biacore T200系统的CM5传感器芯片(Cytiva制)的流动池1及3，将牛血清白蛋白由利用胺偶联试剂盒(Cytiva公司)的胺偶联法以靶水平400RU固定化。再者，对于流动池2、4同样地由胺偶联法，使各自L-生物素标记白蛋白、D-生物素标记白蛋白以靶水平400RU固定化。任何流动池均用1M乙醇胺溶液、pH8.5(Cytiva制)实施封闭。

(3)与生物素的相互作用测定

作为电泳缓冲液，使用HBS-EP+(Cytiva制)，使调制的D-Tamavidin(商标)2由单循环法，以100pM～100nM的范围以流速30μL/min流经各流动池，由Biacore T200 EvaluationSoftware(Cytiva制)评价对于D-生物素或L-生物素的结合及解离。

【7-2.结果】

D-Tamavidin(商标)2和L-生物素标记白蛋白的分子间相互作用的SPR信号的变化示于图9A。确认到对应于D-Tamavidin(商标)2的添加量而SPR信号的升高。

D-Tamavidin(商标)2和D-生物素标记白蛋白的分子间相互作用的SPR信号变化示于图9B。确认不到依赖于D-Tamavidin(商标)2的添加的SPR信号的升高。

这些结果表明，D-Tamavidin(商标)2与D-生物素标记白蛋白基本上不结合，与L-生物素标记白蛋白结合。

【8.实施例8：对于使用D-Tamavidin(商标)2固定化板的ELISA法中的D-生物素的测定系的影响的评价】

【8-1.方法】

(1)向1.5mL管作为受试体添加HISCL(商标)TSH calibrator C3(Sysmex制)200μL及HISCL(商标)TSH R1试剂(Sysmex制)200μL，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。再者，为了对于受试体评价D-生物素影响度，添加0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL或100ng/mL的D-生物素与R1试剂反应。

在96孔ELISA板(Thermo Fisher公司)中将D-Tamavidin(商标)2(1μg/mL、PBS、50μL)与4℃静置一晚而固相化，用2％ BSA/PBS实施封闭。

(2)对于在(1)中制成的封闭后的D-Tamavidin(商标)2固定化板，用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗3次，向各孔添加各60μL在1.5mL管中反应完成的溶液。在37℃、600rpm的条件下反应20分钟。添加参照上述实施例3中记载的(生物素标记抗体的调制)制作的L-生物素标记TSH抗体，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。

(3)反应后，将板用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗5次，添加各50μL的HISCL(商标)R4试剂(Sysmex制)，接下来，添加各100μL的HISCL(商标)R5试剂(Sysmex制)，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。反应后，用酶标仪(SpectraMAXiD3分子装置公司)进行发光检测。

【8-2.结果】

D-生物素存在下的由ELISA法的TSH的检测结果示于图10。在图10中，显示各测定系中将测定D-生物素浓度是0ng/mL的受试体之时的信号测定值设为100％之时的各受试体的信号测定值的百分率。在L-生物素/D-Tamavidin(商标)2的测定系中几乎见不到D-生物素添加导致的影响。

这提示，D-Tamavidin(商标)2/L-生物素的测定系基本上不受存在于受试体的内源性的D-生物素的影响。

【9.实施例9：使用D-Tamavidin(商标)2固定化板的测定系的定量性确认】

【9-1.方法】

(1)向1.5mL的管中作为受试体添加200μL的HISCL(商标)TSH calibrator C0～C5(Sysmex制)至成为0μIU/mL、2μIU/mL、10μIU/mL、50μIU/mL、120μIU/mL或200μIU/mL。其后，添加200μL的添加HISCL(商标)TSH calibrator C0～C5(Sysmex制)的HISCL(商标)TSH R1试剂(Sysmex制)，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。

(2)对于在实施例8(1)中制成的封闭后的D-Tamavidin(商标)2固定化板，用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗3次，向各孔添加各60μL在1.5mL管中反应完成的溶液。在37℃、600rpm的条件下反应20分钟。添加上述制作的L-生物素标记TSH抗体，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。

(3)反应后，将板用HISCL(商标)wash solution(Sysmex制)清洗5次，添加各50μL的HISCL(商标)R4试剂(Sysmex制)，接下来，添加各100μL的HISCL(商标)R5试剂(Sysmex制)，在37℃、600rpm的条件下反应30分钟。反应后，用酶标仪(SpectraMAXiD3分子装置公司)进行发光检测。

【9-2.结果】

测定的结果示于表3及图11。见到浓度依赖性的信号变化。

【表3】

TSH浓度(μIU/mL)	校准品	计数值
			0	C0	363
2	C1	35344
			10	C2	149809
50	C3	699577
			120	C4	1315798
200	C5	1576566

另外，准备5个TSH浓度50μIU/mL试样，对于各自进行TSH浓度的测定。结果示于表4。变动系数是约5％。表明本实施例的测定系在再现性的观点也无问题。

【表4】

	计数值
		平均	667878.6
标准偏差	32615.67
		变动系数	4.88

【10.实施例10：计算机模拟解析】

对于D-慢生根瘤亲和素(Bradavidin)及D-亲和素各自，将对于L-生物素或D-生物素的结合性由计算机模拟解析探讨。

【10-1.方法】

在解析中使用的L-生物素的结构示于图12A，D-生物素的结构示于图12B。在L-生物素或D-生物素的结构的准备及计算中使用Discovery Studio2018。在解析中，对于天然体链霉亲和素-D-生物素复合体结晶结构数据(PDB ID：3RY2 Biological Assembly1)、天然体慢生根瘤亲和素(Bradavidin)-D-生物素复合体结晶结构数据(PDB ID：4BBOBiological Assembly1)、或者天然体亲和素-D-生物素复合体结晶结构数据(PDB ID：2AVIBiological Assembly1)，在4聚体的状态下，除去D-生物素以外的配体。其后，使用Prepareprotein命令赋予氢原子，从结构除去D-生物素。对于各自的结构，由L/D Convesion命令各自生成由D-氨基酸构成的旋光异构性体蛋白质的结构，在作为相当于天然体中的生物素结合位点的坐标设定半径

的结合位点，在D-生物素、L-生物素的配体停靠预测中使用。

在Discovery Studio上由CDOCKER功能进行配体停靠结构的预测的同时，得到相互作用评分(CDOCKER ENERGY)的数值。天然体链霉亲和素和各生物素的旋光异构性体之间的相互作用评分成为结合性的基准。

【10-2.结果】

结果如下所述。均单位是kcal/mol。

【a.D-链霉亲和素】

L-生物素	33.5867
		D-生物素	29.2717

【b.D-慢生根瘤亲和素(Bradavidin)】

L-生物素	30.6423
		D-生物素	25.9508

【c.D-亲和素】

L-生物素	31.5848
		D-生物素	27.6185

任何旋光异构性体均与显示与D-生物素的结合性的评分比较而显示与L-生物素的结合性的评分低至3.9～4.7kcal/mol左右。结果提示，D-慢生根瘤亲和素(Bradavidin)及D-亲和素与D-链霉亲和素同样地，基本上不结合于D-生物素，对于L-生物素强力地结合。

序列表

<110> SYSMEX CORPORATION

<120> 多肽、多聚体、固相、受试物质的测定方法及试剂盒

<130> 20-019PCT

<150> JP 2020-174961

<151> 2020-10-16

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> 亲和素链霉菌（Streptomyces avidinii）

<400> 1

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 2

<211> 128

<212> PRT

<213> 鸡（Gallus gallus）

<400> 2

Ala Arg Lys Cys Ser Leu Thr Gly Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Gly Ala Val Asn Ser Arg Gly Glu Phe Thr Gly Thr

20 25 30

Tyr Ile Thr Ala Val Thr Ala Thr Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro

35 40 45

Leu His Gly Thr Gln Asn Thr Ile Asn Lys Arg Thr Gln Pro Thr Phe

50 55 60

Gly Phe Thr Val Asn Trp Lys Phe Ser Glu Ser Thr Thr Val Phe Thr

65 70 75 80

Gly Gln Cys Phe Ile Asp Arg Asn Gly Lys Glu Val Leu Lys Thr Met

85 90 95

Trp Leu Leu Arg Ser Ser Val Asn Asp Ile Gly Asp Asp Trp Lys Ala

100 105 110

Thr Arg Val Gly Ile Asn Ile Phe Thr Arg Leu Arg Thr Gln Lys Glu

115 120 125

<210> 3

<211> 143

<212> PRT

<213> 榆木茸（Pleurotus cornucopiae）

<400> 3

Met Lys Asp Val Gln Ser Leu Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu

1 5 10 15

Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly

20 25 30

Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser

35 40 45

Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ser Gly Gln Gly Val Thr Leu Gly

50 55 60

Trp Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Ser Ala Asn Val His Ser Val Ser

65 70 75 80

Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Glu Pro Ala Glu Val Ile Leu Thr

85 90 95

Gln Trp Leu Leu Ser Arg Ser Ser Glu Arg Glu Asp Leu Trp Gln Ser

100 105 110

Thr His Val Gly His Asp Glu Phe Ser Lys Thr Lys Pro Thr Lys Glu

115 120 125

Lys Ile Ala Gln Ala Gln Leu Leu Arg Arg Gly Leu Lys Phe Glu

130 135 140

<210> 4

<211> 141

<212> PRT

<213> 榆木茸（Pleurotus cornucopiae）

<400> 4

Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu

1 5 10 15

Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly

20 25 30

Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser

35 40 45

Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly

50 55 60

Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile

115 120 125

Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

130 135 140

<210> 5

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含修饰的氨基酸序列

<400> 5

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ala Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Ala Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Ala

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 6

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含修饰的氨基酸序列

<400> 6

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Thr Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Arg Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Thr Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Arg Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含修饰的氨基酸序列

<400> 7

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Ser Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Thr Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Asn Leu Thr Gly Gln Tyr Glu

20 25 30

Asn Arg Ala Gln Gly Thr Gly Cys Gln Asn Ser Pro Tyr Thr Leu Thr

35 40 45

Gly Arg Tyr Asn Gly Thr Lys Leu Glu Trp Arg Val Glu Trp Asn Asn

50 55 60

Ser Thr Glu Asn Cys His Ser Arg Thr Glu Trp Arg Gly Gln Tyr Gln

65 70 75 80

Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Asn Leu Thr Tyr Glu

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Pro Ala Thr Glu Gln Gly Gln Asp Thr Phe Thr Lys

100 105 110

Val Lys

<210> 8

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含修饰的氨基酸序列

<400> 8

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Lys Ser Thr Leu Val Gly Asp Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser

115 120 125

Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn

130 135 140

Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150

<210> 9

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含修饰的氨基酸序列

<400> 9

Glu Ala Asn Ala Lys Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr

1 5 10 15

Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Gly

20 25 30

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

35 40 45

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

50 55 60

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

85 90 95

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

100 105 110

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

115 120 125

Gly Thr Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn

130 135 140

Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val

145 150 155 160

Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr

180 185 190

Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ser Ala Glu

195 200 205

Val Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile

210 215 220

Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala

225 230 235 240

Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser

245 250 255

Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His

260 265 270

His

Claims (15)

1.属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽，其中

所述多肽的甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基含D-氨基酸残基，

具有对于L-生物素的结合能力，

基本上不具有对于D-生物素的结合能力。

2.权利要求1所述的多肽，其含与下列之任一者的氨基酸序列具有90％以上的相同性的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第19位～第133位序列、

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第2位～第128位序列、

SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第4位～第129位序列、及

SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的第4位～第127位序列。

3.属于亲和素-链霉亲和素家族的多肽，其中所述多肽的甘氨酸以外的氨基酸残基仅由D-氨基酸残基构成。

4.权利要求3所述的多肽，其含下列之任一者的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第19位～第133位序列、

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第2位～第128位序列、

SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第4位～第129位序列、及

SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的第4位～第127位序列。

5.权利要求1～4任一项所述的多肽，其含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第19位～第133位氨基酸残基。

6.权利要求1～5任一项所述的多肽，其含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第13位～第139位氨基酸残基。

7.多聚体，其以权利要求1～6之任一项所述的多肽作为单体单元。

8.权利要求7所述的多聚体，其中所述多聚体是四聚体。

9.固相，其上固定有权利要求1～6之任一项所述的多肽和/或权利要求7或8所述的多聚体。

10.使用固定有多肽和/或多聚体的固相和与受试体中的受试物质结合的捕获体测定受试物质的方法，其中

所述多肽是这样的多肽：

属于亲和素-链霉亲和素家族，

甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基含D-氨基酸残基，

具有对于L-生物素的结合能力，

基本上不具有对于D-生物素的结合能力，

所述多聚体是以所述多肽作为单体单元的多聚体，

所述捕获体附加L-生物素，

通过所述L-生物素与所述固相上的所述多肽或所述多聚体结合，在所述受试物质的检测时，所述捕获体固定于所述固相。

11.权利要求10所述的测定方法，其中所述捕获体含抗体、抗原、凝集素、核酸、酶或者底物。

12.权利要求10或11所述的测定方法，其包括：

使所述固相、所述捕获体、结合于所述受试物质的检测体和所述受试物质接触，形成含所述固相、所述捕获体、所述检测体和所述受试物质的复合体的工序，及

基于所述复合体中所含的所述检测体，测定所述受试物质的工序。

13.权利要求12所述的测定方法，其中所述检测体含荧光物质或酶。

14.受试物质测定用的试剂盒，其含固定多肽和/或多聚体的固相及附加L-生物素的捕获体，其中

所述多肽是这样的多肽：

属于亲和素-链霉亲和素家族，

甘氨酸以外的氨基酸残基之中90％以上的氨基酸残基含D-氨基酸残基，

具有对于L-生物素的结合能力，

基本上不具有对于D-生物素的结合能力，

所述多聚体是以所述多肽作为单体单元的多聚体。

15.权利要求14所述的试剂盒，其用于权利要求10～13之任一项所述的测定方法。

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