KR101809135B1

KR101809135B1 - 형광면역측정용 키트 및 이를 이용하여 질병을 진단하는 방법

Info

Publication number: KR101809135B1
Application number: KR1020120047152A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 정구민; 장승훈
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2017-12-15
Also published as: KR20130123770A

Abstract

본 발명은 표적 분자가 결합되어 있는 고체 지지체; 및 상기 표적분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 함유하는 검출 시약을 포함하는 형광면역 측정용 키트를 제공한다. 또한, 상기 결합물을 이용하여 형광 면역분석 (FLISA)법으로 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 항체를 대신하여 용해성 및 생산성이 높으며 표적 분자에 효과적으로 결합하는 비항체 단백질 골격인 크링글 도메인 변이체와 형광물질을 결합시킨 결합물을 이용하는바 기존 방법에 비해 더욱 간단하면서 저비용으로 질병을 효과적으로 진단할 수 있으므로 유용하다.

Description

형광면역측정용 키트 및 이를 이용하여 질병을 진단하는 방법 {Fluorescence-linked Immunosorbent Kit and Method for Dignosing Diseases Using the Same}

본 발명은 형광면역측정용 키트 및 이를 이용하여 질병을 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적 분자가 결합되어 있는 고체 지지체; 및 상기 표적 분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 함유하는 검출 시약을 포함하는 형광면역측정용 키트 및 이를 이용하여 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

의약 연구의 많은 진보에도 불구하고 암은 여전히 전세계적인 주요 사망 원인이므로, 외과 절제술, 방사선 요법, 화학요법 또는 기타 공지된 치료 방법에 의한 적절한 치료 작용을 용이하게 하기 위하여 암의 초기 진단을 위한 신속하고 간단한 방법이 요구되고 있다. 현재, 암 세포에서 선택적으로 발현하는 단백질(항원) 및 그에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유래물질을 진단 탐침 (detection probe)으로 사용하는 단백질 진단 칩 (protein diagnosis chip)을 이용하여 암을 진단하는 방법이 널리 사용되고 있다. 항체는 항원에 대한 특이적 결합력이 강력하여 질병 마커 (disease marker)를 정확히 검출할 수 있다는 장점이 있다. 또한 진단 기판 위에 이들을 배열할 수 있는 기술과 항원을 검출하는 방식이 다양하게 확보되어 있어 항체를 이용한 진단 기술의 응용 범위는 상당히 넓다. 그 중에서도, 항원-항체를 이용한 암 진단용 시스템으로 기존의 효소결합 면역 흡착검사 (Enzyme-linked immunosorbent assay)가 많이 사용되고 있는데, 이는 간단한 과정을 거쳐 질병의 진단이 가능하다는 점에서 이득이 있으나 효소가 결합된 항체를 통한 2차 반응이 필요하기 때문에 시간적 손해가 야기되며 2차 반응시 사용되는 효소결합 항체의 생산 비용도 높아서 금전적인 면에서도 부담이 된다는 문제점이 있었다. 또한, 1차 반응에서 성공적으로 반응이 진행되더라도 2차 반응에서 일부의 반응이 진행되지 않을 수 있기 때문에 진단의 민감도 (sensitivity) 측면에서도 문제점이 있다.

상기 ELISA 측정법의 문제점을 극복하기 위하여 개발된 것이 형광면역측정법 (FLISA: fluorescence-linked immunosorbent assay)이다. 형광면역 측정법은 표적 물질에 결합할 수 있는 항체에 형광을 결합시켜 항체-항원 반응이 일어난 정도에 따라 형광의 강도를 측정하는 검사 방식으로, 초기에는 항체에 형광 물질을 화학적으로 결합시킨 것을 진단 탐침으로 사용하였다 (Magnusson K.E. 등, Immunol. Invest., 16:227-40, 1987). 하지만 항체는 세포 내에서의 생산성 및 용해도가 떨어지고 열적 안정성이 낮으며 탐침으로의 사용을 위해서는 화학적 수정이 필요하다는 불편함이 있다.

이에, 본 발명자들은 크링글 도메인 변이체와 형광물질을 결합시킨 결합물은 생산성, 용해도가 우수할뿐 아니라 열적 안정성이 높으며 표적 분자에도 특이적으로 결합하므로 형광면역측정법에서 기존의 항체를 대체할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 질병 진단을 위한 개선된 형광면역측정용 키트 및 상기 키트를 이용하여 질병을 진단하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 분자가 결합되어 있는 고체 지지체; 및 상기 표적 분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 함유하는 검출시약을 포함하는 형광면역 측정용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 형광면역측정용 키트를 이용하여 질병을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 비항체 단백질 골격인 크링글 도메인 변이체와 형광물질이 결합되어 있는 결합물은 항체에 비하여 생산성 및 용해도가 우수하며 표적 분자에도 효과적으로 결합하므로 기존 방법에 비해 더욱 간단하면서 저비용으로 질병을 효과적으로 진단할 수 있으므로 유용하다.

도 1은 GFP, KD548이 GFP의 N-말단에 결합된 결합물 (N-형광체), KD548이 GFP의 C-말단에 결합된 결합물 (C-형광체), 세포사멸수용체 5를 각각 코딩하는 발현 시스템을 나타낸 것이다.
도 2는 대장균에서 발현 및 정제시킨 세포사멸수용체 5, GFP, N-형광체, C-형광체, KD548을 쿠마시 브릴리언트 블루 (coomassie brilliant blue) 염색 (도 2의 (a), 도 2의 (c))과 웨스턴 블로팅 (western blotting) 방법 (도 2의 (b), 도 2의 (d))으로 확인한 것으로, 도 2의 (a)와 도 2의 (b)는 DR5의 발현 및 정제를 나타낸 것이다 (1: 총 단백질 (total protein), 2: 용해 단백질 (soluble protein), 3: 정제된 단백질 (purified protein)). 도 2의 (c)와 도 2의 (d)는 GFP, N-형광체, C-형광체의 발현 및 정제를 나타낸 것이다 (1: GFP의 총 단백질, 2: GFP의 용해 단백질, 3: GFP의 정제된 단백질을, 4: N-형광체의 총 단백질, 5:　N-형광체의 용해 단백질, 6: N-형광체의 정제된 단백질, 7: C-형광체의 총 단백질, 8: C-형광체의 용해 단백질, 9: C-형광체의 정제된 단백질).
도 3은 동일 농도의 GFP, N-형광체 및 C-형광체의 형광 강도를 측정하여 나타낸 것이다.
도 4은 일반적인 효소결합 면역 흡착검사와 일반적인 형광결합 면역 흡착검사에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 5는 N-형광체(a)와 C-형광체(b)를 이용하여 일반적인 형광결합 면역 흡착검사를 수행한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사 및 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 결합물을 이용하여 수행한 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사 (도 7의 (a))와 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사 (도 7의 (b))에 의한 세포사멸수용체 5의 검출 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서, “크링글(Kringle)”은 인간을 포함한 다양한 생명체의 여러 단백질에 독립적으로 3차 구조를 가지고 존재하는 도메인 (domain) 또는 모듈 (module)로서, 전형적인 크링글 도메인은 약 80 여개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 3개의 다이설파이드본드 (S-S bond)로 연결된 3차 구조를 가지고 있으며, 이 3개의 다이설파이드본드 결합이 구조적으로 단단한 여러 루프구조를 제공하고 있다 (Castellino 등, J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino 등, Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti 등, Biochemistry, 38:15741-15755, 1999). 전형적인 크링글 도메인의 다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5 인데, 즉 시스테인1번과 80번 잔기사이에, 시스테인 22번-63번 잔기사이에, 시스테인 51-75번 잔기사이에 형성된다 (Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino 등, Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti 등, Biochemistry, 38:15741-15755, 1999).

본 발명에서,“크링글 도메인”은 자연계의 생명체에 존재하는 893개 이상의 (사람에는 31개의 이상) 단백질에 존재하는 것으로, 구조적 안정성을 부여하기 위한 일부 아미노산이 보존되어 있고, 나머지 부분은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 수준에서는 보존되어 있지 않다. 따라서 이러한 크링글 도메인의 전형적인 구조적 특성을 부여하는 아미노산 서열은 보존하여 구조골격 (예, 3개의 분자내 다이설파이드본드 결합 (다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5) 및 이로 인해 생성되는 루프구조)를 이루게 하고, 구조적으로 유연한 루프구조 부분에 의도적인 또는 무작위로 돌연변이를 도입하여 다양한 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열 조합을 갖도록 변이체 라이브러리를 구축하는 방법과 디자인된 라이브러리에서 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 변이체를 분리하여, 동정하고 특성을 규명할 필요가 명백하다. 또한 크링글 도메인 구조기반 변이체는 표적분자의 생물학적 활성을 조절하여, 다양한 질환의 예방, 탐지, 진단, 치료또는 경감하기 위한 방법 및 조성물로 개발될 수 있으므로, 본 발명에서는 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연벼이가 유도되도록 하여 표적분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 제조하여 이의 형광면역 측정법에의 적용 가능 여부를 검토하였다.

본 발명에서, “크링글 도메인 변이체”또는 "크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체"는 특정의 표적 분자에 대하여 특이적인 결합능을 갖도록 크링글 도메인을 변형시킨 돌연변이체를 의미하는 것으로, 하기 아미노산 서열을 갖는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체이며,

CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC (서열번호 14)

상기 서열에서 여기서 X는 세린, 타이로신, 프로린, 히스티딘, 쓰레오닌, 아스파라긴, 알라닌, 또는 아스파테이트인 것을 특징으로 하고, x는 글루타민, 알기닌, 라이신, 글루탐산 또는 글라이신인 것을 특징으로 한다. 이러한 크링글 도메인 구조기반 단백질 변이체는 자연계에 존재하는 크링글 도메인이 결합하는 단백질 외에도, 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절할 수 있는데, 본 발명의 일 구체예에서는 표적 분자로서 세포사멸수용체 5 (DR5)에 대하여 특이적인 크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체로서 KD548을 사용하였다. 이의 제조방법은 국내 공개특허 제10-2010-0019964에 기재된 바와 같다.

본 발명에서, “KD548"은 DR4 및 DR5에 특이적으로 결합하는 비항체 단백질 골격인 크링글 도메인 (Kringle domain) 구조 기반 단백질 변형체로서 (Lee C.H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107:9567-71, 2010)를 의미한다. KD548은 인간 플라스미노젠 크링글도메인 2 (human plasminogen Kringle domain 2)의 노출된 7개의 루프 (loop)들의 아미노산 서열을 임의화 (randomization)하여 제작된 효모 (yeast) 라이브러리 (library)에서 얻어진 단백질 골격으로 78개의 아미노산으로 구성 (서열번호 13) 되며 세포 사멸 수용체 4 (death receptor 4; DR4)와 세포사멸수용체 5 (death receptor 5; DR5)에 대하여 특이적인 결합력을 갖는다.

KD548:CHQTQGPKYDGNKDKTHKGHKCQSWTKNRPHHHGNKIENEDENRFQKNYCRNPDNKHEPWCFTHGHRDKHELCHEPRC (서열번호 13)

KD548은 단백질 골격의 일반적인 성질을 가지므로 세포 내에서의 생산성과 용해도가 매우 우수하므로 본 발명에서는 세포 내에서의 항체를 대체할 물질로서 KD548을 선정하였다.

본 발명에 있어서, “세포사멸 수용체 4 (DR4) 단백질”은 TNF 수용체 패밀리의 일원으로서 TRAIL 에 결합하고, C-말단에 세포 내 죽음 도메인 (death domain)을 갖는 수용체이다 (Pan 등, Science 276:111-113, 1997). DR4이 TRAIL에 결합하는 경우 다양한 암세포주에 대하여 생체외 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo)에서 아폽토시스를 유도한다 (Pan 등, Science 276:111-113, 1997). 본 발명에 있어서, DR4는 상기한 바와 같은 특성을 갖는 단백질이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들어 국제특허 제 W099/02653호의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DR4 발현에 의해 야기되는 암은 인체의 각종 암, 부인과 종양, 내분비계 암, 중추신경계 종양, 수뇨관 암 등이 있으며, 구체적으로는 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "세포사멸 수용체 5 (DR5) 단백질"은 종양괴사인자(TNF) 수용체 패밀리의 일원이고 TRAIL에 결합하며, C-말단에 세포내 죽음 도메인(death domain)을 갖는 수용체를 의미한다 (Pan 등, Science, 277:815-818,1997). DR5가 TRAIL에 결합하는 경우 다양한 암세포주에 대하여 생체외 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo)에서 아폽토시스를 유도한다. 본 발명에 있어서, DR5는 상기한 바와 같은 특성을 갖는 단백질이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들어 미국특허 제 6,872,568호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 DR5 발현에 의해 야기되는 암은 유방암, 결장암, 뇌종양, 신경교종, 난소암, 자궁내막암, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활액암, 췌장암, 육종암 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 "링커"는 크링글 도메인 변이체와 형광물질을 연결하거나 결합하는 부위 또는 부위군을 의미하는 것으로, 바람직하게는 폴리펩타이드, 폴리핵산 및 그 유사체를 포함한다. 또한, 탄소 골격에 삽입된 하나 이상의 산소 원자를 가지는 선택적으로 치환된 알킬렌을 포함할 수 있으며 링커는 자연적으로 존재하거나 합성된 것, 또는 이들의 조합일 수 있으며 원래 서열의 일부, 그것의 변이체 또는 합성 서열일 수 있다.

본 발명에서 "벡터"는 숙주에서 숙주 염색체와 독립적으로 복제될 수 있는 폴리뉴크레오타이드를 의미한다. 벡터들의 예는 플라스미드를 포함한다. 벡터들은 전형적으로 복제 오리진을 가지고, 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열 및 특정 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "결합물" 또는 “결합물질”이란 크링글 도메인 변이체와 형광물질이 결합된 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는, KD548을 형광 단백질인 GFP의 N-말단 또는 C-말단에 결합하여 제조한 결합물로서 N-형광체, C-형광체를 개시하였다. 상기 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합에는 링커를 이용할 수 있다.

본 발명에서, “검출 시약”은 표적 분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 분석 대상 시료와 혼합한 혼합물을 의미하는 것이다. 분석 대상 시료가 특정 질병과 관련된 표적 분자를 함유하는 경우, 크링글 도메인 변이체와 형광물질을 결합시킨 결합물은 시료 내의 표적 분자와 결합하게 되므로, 형광 면역분석용 고체 지지체에 고정되어 있는 표적 분자와는 결합하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 결합물을 함유하는 상기 검출 시약을 이용하면 분석 대상 시료 내의 표적 분자의 유무와 농도를 분석할 수 있다.

본 발명에서, “암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법”은 암 마커의 존재 유무를 확인함으로써 암의 존재 유무를 판단할 수 있는 정보를 제공하는 것을 의미하는 것으로써, 본 발명에서는 발현되는 형광의 강도와 유무를 확인하여 분석 대상 시료 내의 암 마커의 존재와 농도를 판단함으로써 암을 진단하는 것을 의미할 수 있다.

종래의 단백질 진단 칩은, 암 세포에서 선택적으로 발현하는 단백질(항원)에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유래물질을 진단 탐침으로 사용하였으나, 항체를 탐침으로 사용하기 위해서는 화학적 수정이 필요하다는 불편함이 있다. 이에, 최근에는 아미노산 서열 수정이 비교적 쉬운 항체 절편을 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein) (이하 GFP)과 융합하여 탐침을 제작한 바 있다 (Sakamoto S. 등, Protein. Expr. Purif., 77:124-30, 2011; Sakamoto S. 등, Analyst, 136:2056-63, 2011). 하지만 연구에서 보고된 바에 따르면 항체 절편을 이용한 형광결합 면역 흡착검사의 민감도는 다른 진단 시스템에 비하여 크게 개선된 바 없다고 알려져 있다. 또한, 항체 또는 항체 절편은 생산성, 용해도, 그리고 엔지니어링의 용이성 측면에서 문제점이 있다. 구체적으로, 항체는 4개의 단백질 절편이 조립되어 만들어진 4합체 (tetrameric) 단백질로서 일단백질에 비하여 크기가 매우 크며 세포 내에서의 생산성 및 용해도가 확연하게 떨어진다는 단점이 있다. 올바른 형태의 4합체를 생성하기 위해서 4개의 독립적인 단백질이 발현되어야 하고 원하는 결합 조합을 이루어야 특유의 결합 활성을 지니기 때문에 그 생산 효율이 크게 떨어질 수밖에 없기 때문이다. 또한 상대적으로 크기가 큰 항체는 단백질 칩 표면에 고정할 때 다른 크기가 작은 단백질들에 비하여 고정 밀도가 떨어지며, 특이성 또는 다른 아미노산 서열 추가에 대한 엔지니어링 (engineering)이 어려워 새로운 항체를 개발하기 위해서는 상당한 시간이 소요된다.

이에, 항체를 효율적으로 대체하기 위한 물질을 제조하기 위한 기술이 개발되고 있다. 그 중 하나가, 비항체 단백질 골격 (non-antibody protein scaffold) (이하 단백질 골격)의 개발이다. 비항체 단백질 골격은 작은 크기, 단일 아미노산 서열을 가지는 단백질로 높은 열적, 화학적 안정성을 지니며 항체와 같이 표적 분자 (target molecule)로의 강력한 특이적 결합이 가능한 것을 말한다 (Skerra A, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304, 2007; Gebauer M, Skerra A, Curr. Opin. Biotechnol., 13:245-55, 2009). 단백질 골격은 그 생산성과 용해도 측면에서 기존의 항체에 비하여 큰 장점을 가지며 항체와 비슷하게 표적 분자로의 특이적 결합이 가능하므로 항체의 효과적인 대체물질로서 각광받고 있다. 또한, 이들은 크기가 작아서 엔지니어링이 용이하므로 진단 탐침으로의 사용 가치 또한 주목받고 있다. 진단 탐침으로 사용하기 위해서는 화학적 또는 아미노산 서열상의 수정이 불가피한데, 기존에 사용되는 항체의 경우 그와 같은 수정을 가할 경우 구조상의 변형 등이 야기되어 특유의 결합 활성을 잃는 현상이 일어날 수 있는데, 단백질 골격의 경우 아미노산 서열 또는 화학적인 수정을 하여도 특유의 활성을 잃는 일이 거의 없어 진단 칩으로의 응용에 필요한 엔지니어링이 용이하기 때문이다.

그러나, 아직까지 이러한 비항체 단백질 골격을 이용한 진단 시스템에 대한 연구는 이루어진 바 없으며, 진단 시스템에서 비항체 단백질 골격이 항체를 대신할 수 있는지에 대한 검증도 이루어진 바 없다.

본 발명은 일 관점에서, 표적 분자가 결합되어 있는 지지체; 및 상기 표적 분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 함유하는 검출시약을 포함하는 형광면역 측정용 키트를 제공한다.

본 발명에서 표적 분자는, 특정 질병의 마커가 될 수 있는 것이면 제한 없이사용할 수 있다. 그 예로, 세포사멸수용체 4, 세포사멸수용체 5, 종양괴사인자 알파, 당단백질 IIβ/IIIα 수용체(Glycoprotein IIb/IIIa receptor) 또는 당단백질 IIβ/IIIα (Glycoprotein IIβ/IIIα), 혈관내피세포성장인자(VEGF;vascular endothelial growth factor), 혈관내피세포성장인자 수용체(VEGFR, vascular endothelial growth factor receptor), 타이로신 카이네이즈 억제제 (tyrosin kinase inhibitor), 표피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor), 혈소판유래 생장인자 (platelet-derived growth factor, PDGF), 혈소판유래 생장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptor, PDGFR), 줄기세포인자수용체 (c-kit), Fms-양 티로신키나제-3 (Flt-3), 인터루킨 1 (interleukin 1), 인터루킨 6 (interleukin 6),인터루킨 32 (interleukin 32), 인터루킨 2 수용체 (interleukin 2 receptor), CD3, CD11a, CD14, CD15, CD16, CD20 CD32, CD64, 또는 Raf인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 일 실시예에서는 표적 분자로 세포사멸수용체 5를 사용하였으나 암 이외의 질병을 진단하기 위해서는 다른 표적 분자를 사용할 수 있음은 당업자에게 명백하다. 본 발명에서 항체를 대신하여 사용되는 비항체 단백질 골격인 KD548은 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것이나 이에 한정되지 않으며 세포사멸수용체 4 (DR4) 또는 세포사멸수용체 5 (DR5)에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 보유하는 범위 내에서의 서열이 변형되거나 수정된 것도 포함된다.

본 발명에서, 형광 물질은 형광면역측정법 (FLISA)에서 일반적으로 사용되는 형광체를 의미하는 것으로, 바람직하게는 GFP (green fluorescent protein; 녹색 형광 단백질)을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 결합물은 진단하고자 하는 질병의 마커가 되는 표적 분자에 대하여 특이적인 결합능을 갖도록 변이된 크링글 도메인 변이체가 형광물질과 결합된 것을 의미하는 것으로, 일 실시예에서는 서열번호 13으로 표시되는 비항체 단백질 골격인 KD548이 GFP (green fluorescent protein)의 N-말단, 또는 C-말단에 결합된 것을 개시하였다. 이때, KD548과 GFP 단백질의 결합은 링커(flexible linker)에 의해 이루어질 수 있다. 실시예에서는, GFP에 KD548이 결합된 위치에 따라, 링커에 의해 KD548 단백질이 GFP의 N-말단에 결합된 것(N-형광체), 링커에 의해 KD548 단백질이 GFP의 C-말단에 결합된 것 (C-형광체)을 제조하기 위하여 상기 단백질 각각을 발현하는 발현 벡터를 제공하였다. 링커로는 유연성과 높은 화학적, 열적 안정성을 가지는 2개의 Glycine-Glycine-Glycine-Glycine-Serine 반복 서열을 사용할 수 있다. 상기 발현 벡터를 대장균에 도입하여 N-형광체와 C-형광체를 생산 및 정제할 수 있다. 발현되는 N-형광체와 C-형광체의 아미노산 서열은 하기와 같다.

N-형광체 아미노산 서열:

N-terminus-MHHHHHHEECHQTQGPKYDGNKDKTHKGHKCQSWTKNRPHHHGNKIENEDENRFQKNYCRNPDNKHEPWCFTHGHRDKHELCHEPRCTTPPGGGGSGGGGSSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELSKVD-C-terminus

C-형광체 아미노산 서열:

N-terminus-MHHHHHHSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELSKVDGGGGSGGGGSEECHQTQGPKYDGNKDKTHKGHKCQSWTKNRPHHHGNKIENEDENRFQKNYCRNPDNKHEPWCFTHGHRDKHELCHEPRCTTPP-C-terminus

KD548은 암 마커로 알려져 있는 세포사멸수용체 4 (DR4), 세포사멸수용체 5 (DR5)에 특이적으로 결합 가능하나, 형광물질인 GFP와 KD548의 결합물을 형광 면역 측정법에 적용하기 위해서는 상기 결합물도 DR4 또는 DR5에 특이적으로 결합하며 GFP의 여기 파장(Excitation)에서 여기되어 형광을 발현할 수 있어야 한다. 따라서 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따라 제조된 결합물 (N-형광체, C-형광체)을 대장균 내에서 발현 및 정제하고(실시예 2, 도 2 참조), 이들의 형광 강도를 GFP의 형광 강도와 비교하였다 (실시예 3, 도 3 참조). 또한, 상기 결합물이 종래의 FLISA 시스템에서도 작동 가능하는지 실험을 수행하였다 (실시예 4, 도 5 참조). 이를 통하여, 본 발명에 따라 제조된 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물은 형광 면역 측정법에 적용될 수 있을 뿐 아니라, 대장균에서 용이하게 생산 및 정제 가능하므로 종래의 항체 또는 항체 절편을 이용한 형광체보다 우수한 용해도와 생산성이 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 결합물을 이용한 형광 면역분석 (FLISA)법에 의하면, 시료 용액 중의 세포사멸수용체 5의 농도를 정량적으로, 그리고 민감하게 검출할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 세포사멸수용체 5 또는 세포사멸수용체 4이 고정되어 있는 형광 면역분석용 고체 지지체에, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KD548과 형광물질의 결합물과 분석 대상 시료의 혼합물을 가하는 단계, 및 여기 파장 (Excitation)에서 형광물질을 여기시킨 후 발현하는 형광을 측정하는 단계를 포함하는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KD548 단백질과 형광물질의 결합물을 이용하여 형광 면역분석(FLISA)법으로 암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 표적 분자를 고정화하기 위하여 사용되는 “고체 지지체”는 예를들어 표면, 입자, 다공성 기질 등의 형태의 지지체를 포함하며, 필수적으로 수불용성이고 면역분석 측정법에서 유용한 불활성 지지체 또는 담체일 수도 있다. 통상적으로 사용되는 지지체의 예는 작은 시트, 세파덱스, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비이드, 및 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 포함하여 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 분석 플레이트 또는 시험관, 뿐만 아니라 여과지, 아가로스, 가교된 덱스트란 및 기타 다당류와 같은 입상 물질을 포함한다. 대안적으로, 시아노겐 브로마이드-활성화 탄수화물과 같은 반응성 수-불용성 기질 및 미국 특허 3,969,287호; 3,691,016호; 4,195,128호; 4,247,642호; 4,229,537호; 및 4,330,440호에 기재된 반응성 기질이 포획 시약 고정화를 위해 적절히 사용할 수 있다. 바람직하게는, 표적 분자는 마이크로타이터 플레이트 위에 코팅되어 고정시킬 수 있다.

본 발명에서, 형광물질은 FLISA법에 적용 가능한 것으로, 파장에 의하여 형광을 발현할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 GFP를 형광물질로 사용하였다. 사용된 GFP의 여기 파장은 488 nm이고, 발광 파장은 535 nm이다.

본 발명에서는, 표적 분자를 형광 면역분석용 고체 지지체에 먼저 고정시키고, 표적분자에 대하여 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 분석 대상 시료와 혼합한 혼합물을 상기 표적분자가 고정되어 있는 형광 면역분석용 고체 지지체에 가한다. 그 후, 사용된 형광물질에서 발현하는 형광을 측정함으로써 분석 대상 시료 내의 표적 분자의 존재 여부, 존재하는 표적 분자의 농도를 정량적으로 검출함으로써 질병의 유무를 진단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 결합물을 이용하여 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사와 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사를 수행하였다. 본 발명에 따른 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사에 의하면 민감하게 암을 진단할 수 있을 뿐 아니라 시료 내의 세포사멸수용체 5의 농도를 정량적으로도 검출할 수 있었다 (실시예 7, 도 7 참조).

상기 방법에 의하면 DR5의 발현에 의해 야기되는 암, 구체적으로는 유방암, 결장암, 뇌종양, 신경교종, 난소암, 자궁내막암, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활액암, 췌장암 및 육종암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암을 진달할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 DR4 또는 DR5 마커의 존재로 인하여 확인할 수 있는 암이면 모두 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: N-형광체와 C-형광체 및 GFP 의 발현을 위한 플라스미드의 제작

6개의 히스티딘 (histidine) 반복 서열, 2개의 Glycine-Glycine-Glycine-Glycine-Serine 반복 서열, KD548, GFP를 코딩하는 DNA 서열을 사용하여, N-형광체와 C-형광체를 코딩하는 유전자를 제작하였다. N-형광체, C-형광체, 그리고 GFP의 발현을 위한 발현 시스템 (expression system)을 도 1에 나타내었다. 추가적으로 표적 분자인 세포사멸수용체 5의 발현 시스템도 함께 나타내었다 (도 1 참조). 세포사멸수용체 5의 발현 시스템은 pET23d 백터를 기반으로 하였고 (Lee C.H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107:9567-71, 2010), N-형광체, C-형광체, 그리고 GFP 발현 시스템의 모 백터로는 pMopacI (Andrew Hayhurst, 미국)을 사용하였다.

N-형광체, C-형광체, 그리고 GFP를 코딩하는 유전자 절편은 PCR (polymerase chain reaction)을 사용하여 제작하였다. PCR을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드들의 중간 녹는 온도 (T_m)는 모두 55 ℃ 이상이 되도록 하였다.

우선 GFP를 코딩하는 유전자 절편을 제조하기 위하여, GFP를 코딩하는 DNA를 주형 (template)으로 하고 정방향 프라이머 (foward primer) (서열번호 1~4)와 역방향 프라이머 (reverse primer) (서열번호 5)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과, 표지분자인 6xHistidine tag을 N-말단에 가지는 GFP를 코딩하는 DNA 서열과, 시작 코돈 (start codon) 앞쪽에 UTR (untranslated region)과 리보솜 부착 부위 (ribosom binding site)까지의 DNA 서열을 가지는 DNA 절편을 얻었다.

서열번호 1:

5'-acagaattcatgcatcaccatcaccatcacagtaaaggagaagaacttttcactg-3'

서열번호 2:

5'-tctagaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcatcaccatcacca-3'

서열번호 3:

5'-acatctagaataattttgtttaactttaagaaggagata-3'

서열번호 4:

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서열번호 5:

5'-tgtaagcttctattagtcgaccttggatagttcatcca-3'

N-형광체를 코딩하는 유전자는, GFP을 코딩하는 DNA를 주형으로 한 PCR과 KD548을 코딩하는 DNA를 주형으로 한 PCR의 결과물을 overlap PCR 방법을 수행하여 얻었다. KD548쪽을 코딩하는 유전자 절편을 얻기 위해서는 정방향 프라이머 (서열번호 6, 7)와 역방향 프라이머 (서열번호 9), GFP쪽을 코딩하는 유전자 절편을 얻기 위해서는 정방향 프라이머 (서열번호 8)와 역방향 프라이머 (서열번호 10)를 사용하여 PCR을 수행하여 2가지 결과물을 얻었다. 상기 1단계 PCR의 결과물은 일정 부분의 염기 서열을 공유하므로 정방향 프라이머 (서열번호 7)와 역방향 프라이머 (서열번호 10)를 상기 2가지 결과물과 함께 PCR을 수행하면 N-형광체를 코딩하는 유전자와 6 x histidine tag, UTR, 리보솜 부착 부위까지의 DNA 절편을 얻을 수 있다.

서열번호 6:

5'-aagaaggagatatacatatgcatcaccatcaccatcacgaggaatgtcaccagaccca-3'

서열번호 7:

5'-atattctagaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcatcacca-3'

서열번호 8:

5'-agtaaaggagaagaacttttcactggag-3'

서열번호 9:

5'-ctccagtgaaaagttcttctcctttactagaaccaccaccaccagaaccaccaccacctgg

aggtgttgtgcagc-3'

서열번호 10: 5'-atataagcttctattagtcgaccttggatagttcatcca-3'

C-형광체를 코딩하는 유전자도 N-형광체와 마찬가지로, KD548을 코딩하는 DNA와 GFP를 코딩하는 DNA를 주형으로 하여 overlap PCR 방식을 수행하여 제조하였다. C-형광체를 코딩하는 유전자의 제조방법은 상기 N-형광체의 제조방법과 매우 유사하며 정방향 프라이머 (서열번호 1~4)와 역방향 프라이머 (서열번호 11, 12)를 사용하여 제조하였다.

서열번호 11:

5'-agaaccaccaccaccagaaccaccaccaccgtcgaccttggatagttcat-3'

서열번호 12:

5'-acaaagcttctattatggaggtg-3'

상기 PCR을 수행하여 얻은 GFP, N-형광체, C-형광체를 코딩하는 유전자 절편들과 모 백터 pMoPacⅠ은 제한효소 XbaⅠ 과 HindⅢ 으로 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 라이게이션 (ligation)하여 도 1과 같은 발현 시스템을 완성하였다.

실시예 2: N-형광체와 C-형광체, GFP 및 세포사멸수용체 5의 발현 및 정제

실시예 1에서 제작된 결합물의 발현을 위하여 실시예 1에서 제작한 N-형광체, C-형광체, GFP의 플라스미드를 대장균 균주 XL1-Blue로 transformaion 하였다. N-형광체, C-형광체, GFP의 플라스미드를 포함하는 대장균들을 2%의 포도당을 함유하는 LB (Luria-Bertani) 배지에 접종하여 약 12시간 동안 37 ℃, 200 RPM 에서 배양한 후 신선한 LB 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일 조건에서 OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때까지 배양하였다. OD₆₀₀이0.6에 도달할 때 상기 결합물의 생산을 유도하기 위하여 1mM의 IPTG (isopropyl-ß -thiogalactoside)를 첨가하였고, 이후 4시간 동안 동일 조건에서 대장균을 배양하였다.

세포사멸수용체 5의 플라스미드는 대장균 균주 BL21(DE3)로 형질전환 (transformation)하였다. 이 발현 균주도 2%의 포도당을 함유하는 LB 배지에 접종하여 약 12시간 동안 37 ℃, 200 RPM에서 길러진 후 신선한 LB 배지에 1/100의 부피만큼 옮긴 뒤, 동일 조건에서 OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때 까지 배양하였다. OD₆₀₀이0.6에 도달할때 단백질의 생산을 유도하기 위하여 1mM의 IPTG (isopropyl-ß -thiogalactoside)를 첨가하였고, 이후 16시간 동안 25 ℃, 200 RPM의 조건에서 배양하였다.

상기 배양된 대장균들을 4 ℃, 6000 RPM, 10분 조건의 원심분리에 적용하였고 상층액을 제한 세포만을 수득하였다. 원심분리 후 수득한 세포는 바인딩 버퍼 (binding buffer) (50 mM phosphate-KOH, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 재현탁 (resuspension)하고 초음파 세포 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 파쇄가 완료된 세포 현탁액은 4 ℃, 10000 RPM, 10분 조건의 원심분리를 수행하여 상층액만을 수득하였다. 상층액은 Ni-NTA 수지를 포함하는 IMAC (immobilized metal affinity column) 으로 적용되었다. 이 과정에서 표적 단백질이 아닌 불순물들은 컬럼을 통과하여 빠져나가게 되고 6 x Histidine tag을 가지는 표적 단백질만이 Ni-NTA 수지에 부착되어 컬럼에 남아있게 된다. GFP, N-형광체, C-형광체 및 세포사멸수용체 5은 6xHistidine tag을 가지므로 Ni-NTA 수지에 부착될 수 있다. 이 때, 세척 버퍼 (washing buffer) (50 mM phosphate-KOH, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8.0)로 비선택적으로 (non-specifically) 부착된 단백질을 제거한 후 일루션 버퍼 (elution buffer) (50 mM phosphate-KOH, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)를 컬럼에 적용하여 Ni-NTA 수지에 부착되어있던 표적 단백질들이 컬럼 바깥으로 빠져나오게 하였다. 상기 빠져나오는 표적 단백질을 모으게 되면 순수하게 정제된 표적 단백질을 얻을 수 있다. 정제 직후의 단백질 용액은 일루션 버퍼의 조성을 따르게 되어 이미다졸 등 단백질-단백질 작용에 악영향을 미칠 수 있는 성분이 있으므로 투석막을 통한 PBS (phosphate buffer saline)으로의 버퍼 교환을 거쳐 보관하였다. 생산 및 정제된 단백질의 품질 및 상태는 환원 환경의 12 % SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-poly acraylamide gel electrophoresis)분석을 통하여 확인할 수 있었다. 환원 환경의 12 % SDS-PAGE를 쿠마시 브릴리언트 블루 염색, 웨스턴 블로팅의 방법으로 확인하였다 (도 2). 도 2로부터, 본 발명에 따라 생산된 GFP, N-형광체, C-형광체, 세포사멸수용체 5의 용해도 및 정제 품질이 우수함을 확인할 수 있었다.

또한 브래포드 단백질 정량법을 이용하여 단백질의 양을 정량하였을 때 일반 플라스크 생산에서 1L의 생산 부피당 10~30 mg에 이르는 형광체를 얻을 수 있다는 결론이 얻어져 생산성 측면에서도 매우 우수한 성능을 가짐을 확인할 수 있었다 (도면에 도시하지는 않았음).

실시예 3: 생산 및 정제된 N-형광체, C-형광체, GFP 의 형광 강도 비교

생산 및 정제된 N-형광체, C-형광체의 형광 강도가 진단 탐침으로 사용하기에 적합한지 판단하기 위하여 상기 N-형광체, C-형광체의 형광 강도를 GFP의 형광 강도와 비교하는 실험을 수행하였다. 이를 위하여 브래포드 단백질 정량법을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였고, N-형광체, C-형광체, GFP의 농도가 각각 100 μg/ml이 되도록 단백질 용액을 PBS에 희석하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료는 96-well black plate에 각 well당 50 μl씩 적용시켜 488 nm의 파장을 가지는 빛에 의하여 여기시킨 후, 535 nm의 파장에서 형광 강도를 검출하였다. 그 결과, N-형광체와 C-형광체의 형광 강도가 GFP의 형광 강도에 비해 조금 낮았다. 그러나 N-형광체와 C-형광체의 형광 강도는 GFP의 형광 강도의 1/2 이상의 강도를 나타내므로 KD548가 결합된 GFP도 진단 탐침에서 충분한 활성을 나타냄을 알 수 있었다 (도 3 참조).

실시예 4: 일반적인 형광결합 면역 흡착검사 시스템에서의 진단 탐침 작동 여부 조사

실시예 2에서 생산 및 정제한 N-형광체, C-형광체 및 세포사멸수용체 5를 일반적인 형광결합 면역 흡착검사 시스템에 적용하여 이들이 진단 탐침으로의 역할을 수행할 수 있는지 실험하였다. 도 4는 일반적인 효소결합 면역 흡착검사 방법과 일반적인 형광결합 면역 흡착검사 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 일반적인 효소결합 면역 흡착검사 방식과 달리 일반적인 형광결합 면역 흡착 방식은 GFP가 결합된 진단 탐침을 사용하고 이에 따라 2차 반응 및 비색반응 없이 1차 반응만을 거쳐 진단이 가능하였다. 본 발명에서는 1차 반응을 위한 탐침으로, KD548과 GFP가 결합된 N-형광체와 C-형광체를 사용하였다.

본 실험을 수행하기 위하여 몇 가지 조건을 도입하였다. 초기 코팅을 위해 정제된 결합물(N-형광체 또는 C-형광체)은 carbon-bicarbonate buffer (pH 9.6)에 희석하였고, 37 ℃에서 50 μl/well의 부피로 1시간 동안 반응을 진행하였다. 코팅 과정을 제외한 단백질-단백질 반응을 위한 단계에서, 정제된 결합물 (N-형광체 또는 C-형광체)은 PBS에 희석하고 마찬가지로 37 ℃에서 50 μl/well의 부피로 1시간 동안 반응을 진행시켰다. 세척 단계에서는 200 μl/well 부피의 PBS-T (0.05 % Tween-20)의 첨가 및 제거를 4회 반복하여 비선택적인 결합 및 반응 후 남은 물질을 최소화하였다. 블로킹 단계에서는 비선택적인 결합을 최소화하기 위하여 10 무게%의 탈지 분유를 PBS에 녹인 PBS-M을 200 μl/well의 부피로 적용하여 1시간 동안 반응을 진행하였다.

본 실험에서 상기 조건들을 이용하여 형광결합 흡착 면역검사를 실시하였다. 먼저, 50 μg/ml 농도의 세포사멸수용체 5와 대조군인 BSA (bovine serum albumin)를 96-well black plate에 코팅하였다. 비선택적 결합 및 남아있는 반응물을 제거하기 위하여 세척 단계를 거쳐 블로킹을 진행시켰다. 이후 다시 세척 단계를 거쳐 N-형광체 또는 C-형광체가 최대 농도 200 ug/ml에서 1/5씩 순차적으로 희석되어 각 well에 적용되었다. 반응 후, 세척 단계를 수행하고 50 μl/well의 PBS를 적용하여 488 nm의 파장을 가지는 빛으로 여기시켜서 535 nm의 파장에서 형광을 검출하였다 (도 5 참조). 각 형광체의 농도가 증가함에 따라 형광 강도 또한 강력해지는 양상을 나타내는바, 본 발명에 따라 생산 및 정제된 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물이 형광결합 면역 흡착반응에서 진단 탐침으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 암 진단을 위한 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사와 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사

암 진단을 위한 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사와 기존의 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사를 실시하여 실시예 2에서 생산 및 정제된 N-형광체와 C-형광체가 경쟁적 면역 흡착검사에 적용될 수 있는지를 확인하고 기존의 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사와의 성능 비교를 수행하였다.

본 실시예에서 코팅, 단백질-단백질 반응, 블로킹, 세척과정 등의 경쟁적 면역 흡착검사를 실시하기 위한 기본적인 조건은 실시예 4에서의 일반적인 면역 흡착 검사를 실시하기 위한 조건과 동일하게 하였다.

(1) 형광결합 면역흡착검사

60 μg/ml의 농도를 가지는 세포사멸수용체 5가 96-well black plate에 코팅하고 이를 세척하였다. 블로킹 과정과 다시 한 번의 세척 과정을 거친 후 형광체-세포사멸수용체 5 혼합 용액을 처리하였다. 형광체-세포사멸수용체 5의 혼합 용액은 최종 농도 200 μg/ml의 형광체와 최대농도 200 μg/ml로부터 1/5씩 순차적으로 희석된 세포사멸수용체 5를 혼합하여 제작하였다. 이와 같은 혼합 용액으로 처리된 well을 다시 한 번 세척하였고 50 μl/well의 PBS를 첨가한 후 488 nm의 파장을 가지는 빛으로 여기시키고 535 nm의 파장에서 형광을 검출하였다. 상기 실험에서 대조군으로는 세포사멸수용체 5가 혼합되지 않은 형광체를 처리한 시료를 사용하였으며 이 시료의 형광 강도를 초기형광강도로 설정하였다.

(2) 효소결합 면역 흡착검사

형광결합 면역 흡착검사의 성능 비교를 위하여 실시한 효소결합 면역 흡착검사의 구체적인 과정은 다음과 같다. 먼저, 35 μg/ml의 농도를 가지는 세포사멸수용체 5를 96-well transparent plate에 코팅하고 이를 세척하였다. 블로킹 과정과 다시 한 번의 세척 과정을 거친 후 형광체-세포사멸수용체 5 혼합 용액을 처리하였다. 형광체-세포사멸수용체 5의 혼합 용액은 최종 농도 18.5 μg/ml의 형광체와 최대농도 200 μg/ml로부터 1/5씩 순차적으로 희석된 세포사멸수용체 5를 혼합하여 제작하였다. 이와 같은 혼합 용액으로 처리된 well을 세척한 후 다시 한 번 블로킹 하였다. 블로킹된 well은 세척 과정을 거친 후 PBS-T에 1:2000 비율로 희석된 anti-GFP-HRP 항체와 반응하였다. 이 때 반응 부피는 100 μl/well이다. 이후 세척 과정을 거쳐 50 μl/well의 TMB (3,3’,5,5’ - tetramethylbenzidine) 기질을 처리하여 발색 반응을 진행시킨 후 50 μl/well의 물에 희석된 황산 (물:황산=2:1, 부피비)처리를 하여 발색반응을 중지시켰다. 모든 처리가 완료된 시료는 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험에서 대조군으로는 세포사멸수용체 5가 혼합되지 않은 형광체를 처리한 시료를 사용하였으며 이 시료의 흡광도를 초기흡광도로 설정하였다.

도 7은 상기 수행된 형광결합 면역흡착검사와 효소결합 면역흡착검사의 결과를 나타낸 것이다. 도 7의 (a)는 N-형광체와 C-형광체의 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사의 결과와 그에 관한 검량선 (calibration curve)을, 도 7의 (b)는 N-형광체와 C-형광체의 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사의 결과와 그에 관한 검량선 (calibration curve)이다. 검량선의 방정식을 통하여 실제 시료의 세포사멸수용체 5의 농도를 측정할 수 있고, 이를 통하여 암의 진단이 가능하였다. 도 7의 (a)와 도 7의 (b)의 면역 흡착검사 결과에서 상대적 신호 강도 (측정흡광도/초기흡광도 또는 측정형광강도/초기형광강도)가 급감하기 시작하는 시점을 민감도라 하였을 때, 경쟁적 효소결합 면역 흡착검사의 민감도는 약 300 nM로 계산되었고, 경쟁적 형광결합 면역 흡착검사의 민감도는 약 60~300 pM로 계산되었다.

이를 통해, KD548과 GFP의 결합물, 즉 표적 분자에 특이적 결합능을 갖는 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 이용한 형광결합 면역 흡착검사를 통한 암 진단 시스템이 효과적으로 작동함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Fluorescence-linked Immunosorbent Kit and Method for Dignosing Diseases Using the Same <130> P12-B084 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 acagaattca tgcatcacca tcaccatcac agtaaaggag aagaactttt cactg 55 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 tctagaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcatcac catcacca 58 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 acatctagaa taattttgtt taactttaag aaggagata 39 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 tggtggtggt ggttctgagg aatgtcacca gacc 34 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 tgtaagcttc tattagtcga ccttggatag ttcatcca 38 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 aagaaggaga tatacatatg catcaccatc accatcacga ggaatgtcac cagaccca 58 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 atattctaga ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca tcacca 56 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 8 agtaaaggag aagaactttt cactggag 28 <210> 9 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 ctccagtgaa aagttcttct cctttactag aaccaccacc accagaacca ccaccacctg 60 gaggtgttgt gcagc 75 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 atataagctt ctattagtcg accttggata gttcatcca 39 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 11 agaaccacca ccaccagaac caccaccacc gtcgaccttg gatagttcat 50 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 acaaagcttc tattatggag gtg 23 <210> 13 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KD548 <400> 13 Cys His Gln Thr Gln Gly Pro Lys Tyr Asp Gly Asn Lys Asp Lys Thr 1 5 10 15 His Lys Gly His Lys Cys Gln Ser Trp Thr Lys Asn Arg Pro His His 20 25 30 His Gly Asn Lys Ile Glu Asn Glu Asp Glu Asn Arg Phe Gln Lys Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Lys His Glu Pro Trp Cys Phe Thr His 50 55 60 Gly His Arg Asp Lys His Glu Leu Cys His Glu Pro Arg Cys 65 70 75 <210> 14 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant <400> 14 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Cys Gln Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Pro His Xaa 20 25 30 His Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Cys Phe Thr Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Leu Cys Xaa Xaa Pro Arg Cys 65 70 75

Claims

표적 분자가 결합되어 있는 지지체; 및 상기 표적 분자에 특이적 결합능을 갖는 비항체 단백질 골격인 크링글 도메인 변이체와 형광물질의 결합물을 함유하는 검출시약을 포함하는 형광면역 측정용 키트:
여기서, 상기 크링글 도메인 변이체는 하기 아미노산 서열을 갖는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체이고,
CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC (서열번호 14)
상기 서열에서 여기서 X는 세린, 타이로신, 프로린, 히스티딘, 쓰레오닌, 아스파라긴, 알라닌, 또는 아스파테이트인 것을 특징으로 하고, x는 글루타민, 알기닌, 라이신, 글루탐산 또는 글라이신인 것이 특징임.
제1항에 있어서, 상기 형광물질은 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 형광면역 측정용 키트.
제2항에 있어서, 비항체 단백질 골격인 크링글 도메인 변이체는 형광 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 형광 면역측정용 키트.
제2항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (green fluorescent protein)인 것을 특징으로 하는 형광 면역 측정용 키트.
제2항에 있어서, 비항체 단백질 골격인 크링글 도메인 변이체와 형광 단백질의 결합은 링커에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 면역 측정용 키트.
세포사멸수용체 5 또는 세포사멸수용체 4가 결합되어 있는 고체 지지체; 및 상기 세포사멸수용체 5 또는 세포사멸수용체 4에 특이적 결합능을 가지며 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 비항체 단백질 골격인 KD548 단백질과 형광물질의 결합물을 함유하는 검출 시약을 포함하는 암의 형광면역 측정용 키트.
제6항에 있어서, 상기 형광물질은 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 암의 형광면역 측정용 키트.
제7항에 있어서, 비항체 단백질 골격인 KD548 단백질은 형광 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 암의 형광 면역측정용 키트.
제7항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (green fluorescent protein)인 것을 특징으로 하는 암의 형광 면역 측정용 키트.
제7항에 있어서, 비항체 단백질 골격인 KD548 단백질과 형광 단백질의 결합은 링커에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 암의 형광 면역 측정용 키트.
하기 단계를 포함하는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 비항체 단백질 골격인 KD548 단백질과 형광물질의 결합물을 이용하여 형광 면역분석(FLISA)법으로 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
세포사멸수용체 5 또는 세포사멸수용체 4이 고정되어 있는 형광 면역분석용 고체 지지체에, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KD548과 형광물질의 결합물과 분석 대상 시료의 혼합물을 가하는 단계, 및
여기 파장 (Excitation)에서 형광물질을 여기시킨 후 발현하는 형광을 측정하는 단계.
제11항에 있어서, 형광물질은 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 형광 면역분석(FLISA)법으로 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 비항체 단백질 골격인 KD548 단백질은 형광 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 형광 면역분석(FLISA)법으로 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 형광 단백질은 GFP (green fluorescent protein)인 것을 특징으로 하는 형광 면역분석(FLISA)법으로 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 비항체 단백질 골격인 KD548 단백질과 형광 단백질의 결합은 링커에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 면역분석(FLISA)법으로 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.