CN109613240A

CN109613240A - 一种用于检测hiv的试剂盒

Info

Publication number: CN109613240A
Application number: CN201910006772.9A
Authority: CN
Inventors: 于秀玲; 李瑞净; 潘少丽; 欧阳岁燕; 龚航; 池朗山; 武云波; 陈尘; 陈一尘; 程珍珠; 黄荣生
Original assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Guangdong Peng Peng Biological Co Ltd
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: CN109613240B

Abstract

本发明涉及分子检测领域，具体而言，涉及一种用于检测HIV的试剂盒。一种用于检测HIV的试剂盒，包括固相支持物包被的抗原、生物素标记的抗原、亲和素与吖啶酯结合物中的任一种或多种；和/或固相支持物包被的抗体、生物素标记的抗体、亲和素与吖啶酯结合物中的任一种或多种；所述试剂盒以“固相支持物包被的抗原‑待检测抗体‑生物素标记的抗原‑亲和素与吖啶酯结合物”形式和/或以“固相支持物包被的抗体‑待检测抗原‑生物素标记的抗体‑亲和素与吖啶酯结合物”形式完成检测。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、测试范围宽、检测自动化程度高等优点。

Description

一种用于检测HIV的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体而言，涉及一种用于检测HIV的试剂盒。

背景技术

HIV(Human immunodeficiency virus)的感染在全球广泛流行，严重威胁着人们的生命健康，给社会带来极大的隐患，研发出精准、快速的检测产品，对于早发现及杜绝艾滋病的传播有着非常大的意义。

目前国内外用于检测艾滋病的方法有免疫学检验、核酸检测技术等。免疫学检测优势在于操作简单、高灵敏度、特异性好、成本低、耗时短，是目前应用最广的检测技术。

免疫学检测基于抗原抗体的特异性反应，可利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大处理，常用于检测蛋白质、激素等物质。

免疫分析经历了放射免疫检验、荧光免疫检验、酶标免疫检验等不同时期，化学发光免疫检验是免疫分析发展的一个新阶段，拥有快熟、精准、自动化程度高的优点。化学发光免疫法(CLIA)20世纪90年代导入中国，产品进入成长期；国际上兴起于20世纪80年代，仪器自动化程度高，试剂系列化，应用较为普遍。

化学发光免疫分析根据发光原理不同，分为直接化学发光、酶促化学发光、电化学发光。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶(AP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光信号强而稳定，且发光时间较长，成本较低。

目前，对于HIV的检测，最常用的有ELISA法、胶体金，核酸检测等，随着科技的不断进步迭代，微粒子化学发光免疫分析法(CMIA)开始用于HIV抗原抗体检测。相较于ELISA法，1)CMIA法的灵敏度更高：其灵敏度可达10-16mol/L，减少漏检的发生；2)CMIA发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系、具有更宽的线性范围；3)光信号持续时间长：辉光型(glow type)的CLIA产生的信号可持续十几个小时之久。4)使用期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，有效期约为30天，而酶联的底物稳定性差，效期长的产品可提高使用效率，利于推广应用。5)CMIA法免自动化程度高，便于大量标本的快速、精准检测。

微粒子化学发光免疫分析，临床应用十分普遍，仪器自动化程度高；20世纪90年代导入中国，目前正处于成长期。HIV抗原抗体检测(CMIA)国产试剂盒(吖啶酯发光)活性低、特异性差、抗原吖啶酯标记物工作液稳定性较差，进口产品价格昂贵，基于目前我国国情很难大范围应用。另外，由于HIV的重组抗原的蛋白比较特殊，存在以下几个特点：

1、很多表达出的蛋白为包涵体表达、其空间结构较复杂不利于标记物的结合和偶联稳定性；

2、HIV重组抗原多数需要在pH在8-9的碱性环境下才能稳定保存、蛋白等电点多数在5-7之间。而吖啶酯稳定的条件为pH在6.0左右，在偏酸性的环境中较稳定。

故将两者直接偶联往往出现蛋白沉淀、偶联效率低、偶联后物质不稳定等现象。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测HIV的试剂盒，借助生物素亲和素系统来做的间接标记过程，将HIV抗原或者HIV抗体标记在生物素上，亲和素标记在吖啶酯上，这个过程是间接标记弥补直接标记AE不稳定和标记物活性低的问题，对灵敏度起到更大放大效果，相较于SA用于包被端，得到更高的信号值，更好的本底，阴阳拉的更开，更利于结果的判定。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测HIV的试剂盒，包括固相支持物包被的抗原、生物素标记的抗原、亲和素与吖啶酯结合物中的任一种或多种；

和/或

固相支持物包被的抗体、生物素标记的抗体、亲和素与吖啶酯结合物中的任一种或多种；

所述试剂盒以“固相支持物包被的抗原-待检测抗体-生物素标记的抗原-亲和素与吖啶酯结合物”形式和/或以“固相支持物包被的抗体-待检测抗原-生物素标记的抗体-亲和素与吖啶酯结合物”形式完成检测。

本发明涉及微粒子化学发光在HIV抗原抗体检测上的应用，是将吖啶酯标记链霉素上，磁珠包被后的抗原、抗体与血清中的抗原、抗体、生物素标记后的抗原、抗体结合物在激发液的作用下，光子从激发态回到基态，通过光电倍增管读取信号。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、测试范围宽、检测自动化程度高等优点。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明采用基因工程技术手段，通过大量的分子生物学分析软件分析筛选出HIV gp41、gp36的优势表位区段，采用原核表达体系，优化表达出具有高活性HIV-I和HIV-II抗原。

(2)本发明还提供了相应的高活性HIV-I和HIV-II抗体。

(3)本发明以BSA间接偶联将蛋白的空间结构做延伸，减少空间位阻，增加偶联效率及偶联物的稳定性；同时借助链霉素亲和素系统，避免抗原直接偶联造成的不稳定因素。

(4)本发明提供的试剂盒，检测灵敏度和稳定性均有显著提升。

具体实施方式

本发明先提供用于检测HIV的抗原基因序列，如SEQ ID NO.1-4所示。

本发明提供的用于检测HIV的抗原基因序列，采用基因工程技术手段，通过大量的分子生物学分析软件分析筛选出HIV gp41、gp36的优势表位区段，采用原核表达体系，优化表达出具有高活性HIV-I和HIV-II抗原。

其中，SEQ ID NO.1所示的抗原与SEQ ID NO.3所示的抗原配对使用；SEQ ID NO.2所示的抗原与SEQ ID NO.4所示的抗原配对使用。

本发明还提供一种表达载体，包含上述的抗原基因序列。用于表达上述的抗原蛋白。

上述的表达载体经转化，得到的转化体表达得到抗原蛋白。

本发明还提供一种转化体，包含上述的表达载体的宿主。

进一步地，所述宿主为原核生物。

进一步地，所述原核生物为大肠杆菌或枯草杆菌。

本发明还提供了用于检测HIV的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5-8所示。

本发明提供了用于检测HIV的抗原蛋白，由上述的抗原基因序列表达得到。

进一步地，所述表达为原核表达。

本发明采用原核表达体系，得到有高活性HIV-I和HIV-II抗原。

本发明还提供了一种用于检测HIV的试剂盒，包括固相支持物包被的抗原、生物素标记的抗原、亲和素与吖啶酯结合物；

和/或

固相支持物包被的抗体、生物素标记的抗体、亲和素与吖啶酯结合物；

进一步地，所述固相支持物包被的抗原包括SEQ ID NO.1-2所示的序列原核表达的蛋白中的任一种或两种；

所述生物素标记的抗原包括SEQ ID NO.3-4所示的序列原核表达的蛋白中的任一种或两种；

所述固相支持物包被的抗体来自杂交瘤细胞株P24-3B9产生的抗体；

所述生物素标记的抗体来自杂交瘤细胞株P24-2F4产生的抗体；

其中，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3所示的序列原核表达的抗原配对使用；SEQ IDNO.2与SEQ ID NO.4所示的序列原核表达的抗原配对使用。

也就是说，固相支持物包被的抗原为SEQ ID NO.1所示的序列原核表达的蛋白时，生物素标记的抗原为SEQ ID NO.3所示的序列原核表达的蛋白；固相支持物包被的抗原为SEQ ID NO.2所示的序列原核表达的蛋白时，生物素标记的抗原为SEQ ID NO.4所示的序列原核表达的蛋白。

这两对抗原可以单独使用，也可以同时应用。同时使用时，固相支持物包被的抗原为SEQ ID NO.1和2所示的序列原核表达的蛋白时，生物素标记的抗原为SEQ ID NO.3和4所示的序列原核表达的蛋白。

本发明既保护一种抗原或两种抗原存在的情况；也保护单独抗体存在的情况，即单独采用双抗原夹心检测抗体或双抗体夹心检测抗原；也保护抗原和抗体复合存在的情况，如一种抗原和抗体存在形式、两种抗原和抗体存在的形式。

进一步地，所述固相支持物为磁珠。

本发明经试验筛选发现，磁珠采用EDC作为偶联剂效果较好。进一步地，所述磁珠包被抗原或抗体采用EDC进行偶联。

进一步地，所述偶联在活化缓冲液中进行，所述活化缓冲液为MES缓冲液，所述MES缓冲液的浓度为50±5mM，pH为5.5±0.1。

进一步地，所述偶联步骤如下：

抗原或抗体透析至活化缓冲液中，得到第一溶液；

磁珠用活化缓冲液进行分散，得到磁珠分散液；

所述磁珠分散液与EDC的活化缓冲液混合，磁分离，去上清，加入所述第一溶液，结合反应后，弃上清，经洗涤、封闭、洗涤，即得。

进一步地，所述磁珠分散前还用所述活化缓冲液进行洗涤。

进一步地，所述磁珠在活化缓冲液中的浓度为10±2mg/mL。

进一步地，所述EDC的活化缓冲液在，EDC的浓度为10±1mg/mL。

进一步地，所述EDC溶解于所述活化缓冲液的温度为2-8℃。

进一步地，磁珠分散液与EDC的活化缓冲液的体积比为4-6:1。

进一步地，所述混合为室温下以转速为30±2rpm旋转30-60min。

进一步地，所述结合反应采用室温下以转速为30±2rpm旋转结合30±2min。

进一步地，所述结合反应中，抗原或抗体的浓度为1±0.1mg/mL。

进一步地，所述抗原或抗体和EDC的质量比例为1:1±0.1。

进一步地，所述磁珠的羧基含量与EDC的摩尔比例在1:10-20。

进一步地，所述亲和素为链霉素。

进一步地，所述亲和素与所述吖啶酯偶联的中间物质为BSA。

进一步地，先通过侨联工艺将所述BSA偶联到吖啶酯上。

进一步地，所述BSA与所述吖啶酯的质量比例为2-3:1。

进一步地，所述BSA与所述吖啶酯偶联完成后，加入终止反应的溶剂。

进一步地，所述终止反应的溶剂为赖氨酸溶液。

进一步地，所述赖氨酸溶液的浓度为1±0.1M。

进一步地，终止反应后进行脱盐。

进一步地，所述脱盐柱缓冲液为浓度为20±2mM的PB，所述PB的pH为7.2±0.2。

进一步地，所述BSA与所述吖啶酯的偶联物与EDC溶液混合，反应，然后加入经前处理后的亲和素溶液，反应，最后经透析后得到亲和素与吖啶酯结合物。

进一步地，经前处理后的亲和素溶液采用以下步骤制备：

所述亲和素采用15kD的透析袋进行透析，所述透析所用的溶液为浓度为20±2mM、pH为7.2±0.2的PB。

进一步地，亲和素与BSA-吖啶酯的重量比例为1:1-2。

进一步地，所述生物素采用以下方法与抗原或抗体结合：

抗原或抗体经前处理后，得到抗原或抗体溶液；

NHS和生物素分别配置成溶液，得到NHS溶液和生物素溶液；

所述抗原或抗体溶液于所述NHS溶液混匀后，加入所述生物素溶液，反应后，经后处理得到生物素标记的抗体；

进一步地，所述抗原或抗体采用15kD的透析袋进行透析，所述透析所用的溶液为浓度为20±2mM、pH为7.2±0.2的PB；

进一步地，所述抗原或抗体溶液中，抗原或抗体的浓度为1.5mg/mL；

进一步地，所述NHS溶液中，NHS的浓度为10±2mg/mL；

进一步地，所述生物素溶液终，生物素的浓度为10±2mg/mL；

进一步地，制备生物素标记的抗体或抗原中，反应的温度为2-8℃，反应时间为2-2.5h；

进一步地，所述后处理为：反应完成后的混合物放入15KD的透析袋中，浓度为20±2mM、pH为7.2±0.2的PB透析液透析4小时，换3-4次液。

本发明还提供了上述的试剂盒在检测Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病毒中的应用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、抗原的制备

采用基因工程技术手段，通过大量的分子生物学分析软件分析筛选出HIV gp41、gp36的优势表位区段，基因序列为SEQ ID No.1(命名为I14)，其对应氨基酸序列为SEQ IDNo.5；基因序列为SEQ ID No.2(命名为I35)，其对应氨基酸序列为SEQ ID No.6；基因序列为SEQ ID No.3(命名为II21)，其对应氨基酸序列为SEQ ID No.7；基因序列为SEQ ID No.4(命名为II7)，其对应氨基酸序列为SEQ ID No.8。设计引物扩增gp41、gp36所对应的DNA区段，上游引物分别带有BamHI酶切位点，下游引物带有EcoRI酶切位点。具体地，基因序列为SEQ ID No.1对应的引物序列如SEQ ID No.9-10所示，基因序列为SEQ ID No.2对应的引物序列如SEQ ID No.11-12所示，基因序列为SEQ ID No.3对应的引物序列如SEQ ID No.13-14所示，基因序列为SEQ ID No.4对应的引物序列如SEQ ID No.15-16所示。

PCR的片段经回收后(购自上海华舜生物工程有限公司)，用BamHI和EcoRI酶切(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司)。

(1)HIV-AgI包被抗原的制备：

酶切后的I14、II21分别连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(Novagen公司，货号：69864-3)中，得到重组质粒pET-24a I14,pET-24aII21。

上述阳性克隆用含100μg/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号KB0286)的500mL LB培养基37℃振荡培养至OD600＝1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(生工，货号IB0168)37℃诱导4小时。4℃5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20mL裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH 8.0)重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白分布在包涵体中。收集包涵体，用2M尿素溶解除杂，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集沉淀，继续用6M尿素溶解，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集上清；用10倍柱床体积的平衡缓冲液(25mM Tris+150mM NaCl+6M尿素+25mM咪唑(美国Sigma-Aldrich公司，货号I5513)，pH8.0)平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(25mM Tris+150mM NaCl+6M尿素+200mM咪唑)，洗脱目的蛋白，目的蛋白梯度透析置换缓冲(透析缓冲25mM Tris+0.1％SDS)，测定蛋白浓度，-20℃保存备用。

(2)HIV标记抗原的制备：

酶切后的I35,II7片段分别连接到用BamHI和EcoRI处理之后的表达载体pGEX-6P-1(Phamacia公司，货号：27-4597-01)中得到重组质粒pGEX-6P-1-I35,pGEX-6P-1-II7，即本发明的标记抗原的重组质粒，以下简称6P-I35,6P-II7。

上述阳性克隆，接种于含100μg/ml氨苄西林钠(生工，货号A0339)的500ml LB培养基37℃振荡培养至OD600＝1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG 37℃诱导4小时。4℃5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，60％目的蛋白分布在包涵体中。收集沉淀，用2M尿素溶解除杂，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集沉淀，继续用6M尿素溶解，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集上清；用10倍柱床体积的平衡缓冲液(25mM Tris+150mM NaCl+6M尿素，pH8.0)平衡GSTrap亲和柱(Amersham公司，货号：17-5130-02)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(25mMTris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽(Amresco公司，货号：0399)，pH8.0)，洗脱目的蛋白，目的蛋白梯度透析置换缓冲(透析缓冲25mM Tris+0.1％SDS)，测定蛋白浓度，-20℃保存备用。

采用原核表达体系，做出有高活性HIV-I和HIV-II抗原。

2、P24抗体的制备

小鼠腹水表达的P24抗体。

(1)、选健壮的BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心：广东省佛山市南海黄岐鄱阳路119号，6周龄雌性)，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后分别腹腔注射以下杂交瘤细胞：

1×10⁶个P24-2F4杂交瘤细胞(杂交瘤细胞株P24-2F4于2016年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016211，分类命名：杂交瘤细胞株P24-2F4。)、

1×10⁶个P24-3B9杂交瘤细胞(杂交瘤细胞株P24-3B9分泌的单克隆抗体记为抗P24单克隆抗体。杂交瘤细胞株P24-3B9于2016年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016213，分类命名：杂交瘤细胞株P24-3B9)。

(2)、接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。收集腹水，离心取上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱(GE公司)。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸附值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的抗体立即用1.5MTris(pH8.8)中和，跑SDS-PAGE胶，检测抗体纯度。分别得到用于包被的P24抗体和用于标记的P24抗体。

实施例2

用于HIV抗原抗体检测的方法—微粒子化学发光免疫分析法(CMIA)。

原料的筛选：通过基因工程手段及重组抗原制备方式找到适合磁微粒包被、生物素标记及与链霉亲合素反应性最佳的抗原、抗体，见实施例1；

通过磁珠偶联用活化试剂种类(主要为单向偶联剂EDC、DSS双向偶联剂SMCC、)及相对应的使用方式的对比、活化缓冲液、活化比例、活化时间、活化温度对比，选出利用EDC作为活化试剂及相应的高包被活性，低本底，低非特异性的包被条件。

筛选参数如表1所示。

表1筛选参数

注：磁珠的羧基含量是70nmol/mg。

不同的条件下检测发光值，得到的结果如表2所示。

表2检测结果

其中，阳性发光值和阴性发光值分别代表阳性标本的反应性和阴性标本的反应性，两个做比值反应的是阴阳比，这个值越大，说明灵敏度越高，这是试剂盒的一个指标。

上述内容可知，EDC作为偶联剂效果最佳，并且，磁珠羧基含量与活化剂的摩尔比例在1:10-20均有较好的灵敏度。

在实际应用中，选用以下步骤进行偶联，抗原和磁微粒采用化学交联法进行偶联的步骤如下(以HIV-I抗原原料为例)：

1)HIV-I 2mg/mL×1.0mL透析至活化缓冲液(50mM MES pH 5.5)；

2)取Merk EM1-100/40即1μm左右的磁珠0.1mL(100mg/mL)，用活化缓冲液(50mMMES pH5.5)洗涤3次，每次2mL，最后加1mL活化缓冲液，超声分散；

3)称取3mg EDC，用0.3mL活化缓冲液(2-8℃预冷)溶解至10mg/mL。立刻在振荡条件下往含有磁珠的混合液中加入0.2mL EDC溶液，充分混匀。室温旋转(30rpm)反应0.5～1小时，磁分离，弃去上清；

4)加入透析后的HIV-I，用50mM MES pH5.5补足2ml，室温旋转(30rpm)结合30分钟，弃去上清。

5)用洗涤液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl+0.05％Tween-20+0.1％ProClin300,pH7.4)洗2次，每次5mL；加5mL封闭液(洗涤液+1％BSA)，室温旋转(30rpm)反应4小时；

6)用洗涤液洗3次，每次5mL，最后加1mL磁珠保存液重悬，终浓度10mg/mL固体含量。2～8℃保存。

另外，HIV-II抗原、上述得到的用于包被的P24抗体也采用同上步骤与磁微粒偶联。

实施例3

通过吖啶酯标记在标记偶联物(BSA、casein等)、标记比例，标记缓冲液(pH值5.5-11)、标记前后原料纯化方式、标记物存储方式等条件的对比分析，选到BSA作为偶联中间物质的标记活性高、标记本底低、标记物稳定的吖啶酯标记条件。具体筛选参数如表3所示。

表3筛选参数

不同的条件下检测发光值，得到的结果如表4所示。

表4检测结果

注：BSA与AE的摩尔比值是按照克数除以KDa得到，其中，BSA以66KDa计算，AE以0.6KDa计算。

链霉素(SA)与吖啶酯标记物制备

采用马来酰胺法

1)通过侨联工艺将牛血清白蛋白(BSA)偶联到吖啶酯(AE)上：称取BSA粉末10mg，高压水配置成10mg/ml的水溶液备用，量取75μL的10mM的AE到PE管中，加入上述100μL的BSA溶液，迅速混匀，闭光，在混匀状态下反应30分钟。

2)在上述BSA-AE混合物中加入1M赖氨酸5μL，混匀闭光，在混匀状态下反应30min。

3)将上述终止的后样品用洗脱好的脱盐柱进行脱盐，脱盐柱缓冲液为20mM PBpH7.2，规格为0.5ml。

4)将脱盐后样品用脱盐缓冲液定容至5mg/ml

5)SA的前处理：浓度为2.0mg/ml量取1ml,放入孔径为15KD的透析袋中，透析缓冲液为20mM PB pH7.2,透析约18小时，换3-4次液，换液体积为1L。将透析后的SA取出，用紫外分光光度计测量浓度，用透析缓冲液定容至1.5mg/ml。

6)称取EDC 2mg用20mM PB配置成20mg/ml，取50μL加入BSA-AE混合液中，迅速混匀，在闭光混匀状态下反应30min。

7)取透析后的SA 0.75ml，加入100μlEDC活化后的BSA-AE混合液，迅速混匀，在闭光下，混匀状态下反应2小时。

8)将反应结束后的上述混合物放入洁净的15KD的透析袋中，在20mM PB pH7.2的透析液中透析约18小时，换5-6次液，换液体积为每次1L。取出透析袋中的液体，收集到PE管中，量取体积，加1％BSA，50％甘油混匀，存放于-20℃条件下闭光保存备用。

实施例4

Bio标记抗原的制备

采用马来酰胺法。具体步骤如下(以HIV-I抗原原料为例)：

1)HIV-I抗原的前处理：浓度为2.0mg/ml量取1ml，放入孔径为15KD的透析袋中，透析缓冲液为20mM PB pH7.2，透析约18小时，换3-4次液，换液体积为1L。将透析后的抗原取出，用紫外分光光度计测量浓度，用透析缓冲液定容至1.5mg/ml。

2)称取NHS 5mg，用透析缓冲液20mM PB pH7.2配置成10mg/ml。称取生物素5mg，用透析缓冲液20mM PB pH7.2配置成10mg/ml。

3)取透析后的HIV-I型抗原1ml，加入0.1ml NHS溶液，迅速混匀，加入0.1ml上述生物素溶液，迅速混匀，在混匀状态下2-8℃反应2小时。

4)将上述反应完成后的混合物放入洁净的15KD的透析袋中，20mM PB pH7.2的缓冲液条件下透析4小时，换3-4次液。

5)收集透析后的样品，加入1％BSA，50％甘油混匀，-20℃存放备用。

另外，HIV-II抗原、上述得到的用于标记的P24抗体也采用同上步骤将生物素标记。

实施例5

本发明用长光华医AE-180检测，根据以下加样及反应时间设定程序。

1)在反应容器中依次加入样品100μL，按照实施例2方法制备的磁微粒悬浮液50μL，其中，I型抗原磁珠0.25μg/ml，II型抗原磁珠是0.05μg/ml，P24抗体磁珠是0.1μg/ml。按照实施例4方法制备的生物素标记物工作液50μL，其中，I型抗原标记生物素0.2μg/ml，II型抗原标记生物素0.05μg/ml，P24抗体标记生物素0.1μg/ml。混匀后37℃条件下反应15min。

2)用洗涤缓冲液：20mM PB+0.05％吐温20，PH7.5洗3次。

3)加入100μL稀释后的SA标记物，反应10min。

4)用洗涤缓冲液：20mM PB+0.05％吐温20，PH7.5洗2次。

5)设定仪器依次加入激发液A液(0.5％-15％硝酸+0.2％-20％过氧化脲)100μL、加入激发液B液(1％-10％氢氧化钠溶液+0.1％-10％的吐温-20)100μL、读值时间为0.4秒/孔。

6)系统读值。

需要说明的是，该实验中，磁微粒悬浮液为两种抗体和两种抗原做的磁微粒悬浮液，生物素标记物工作液为两种抗体和两种抗原做的生物素标记物工作液。

实验例1

1、灵敏度、特异性比较

a)分别选取了知名的国外(公司A-雅培)和国内(公司B-万泰)各一家HIV第四代检测试剂产品(均为利用双抗原、双抗体夹心法，将样本中的HIV抗原和抗体同时检测的方法)为对照，对HIV三代国家标准盘同时进行了如下比较，本发明的检测方法按照实施例5进行。其S/CO值结果如下表所示。S/CO值代表的是阳性S与临界值cut off的比值。

表5 S/CO值结果

b)为了进一步考查本试剂盒在临床上的表现，选择日本Dainabot有限公司(公司C)生产的免疫层析法试剂盒(Determine HIV-1/2)验证之后的300份阳性以及5000份阴性标本，进行检测。结果如表6所示。

表6检测结果

以上结果表明本发明的HIV第四代检测试剂与国内外同类产品的灵敏度、特异性均有一定优势。

2.对HIV-1P24检测的比较

为了验证三种试剂对HIV-1P24标本的检测效果，用上述三种HIV第四代检测试剂对P24中检所盘进行了检测，阳性反应性均高于公司A和B其结果(S/CO值)如表7。

表7检测结果

3.稳定性比较

配套进行稳定性考核，本发明新开发出的配套稳定性明显优于其他两家公司(活性下降百分比)

表8稳定性比较

考核条件	本发明	公司A	公司B
				2-8℃1年	下降10％	下降50％	下降47％
37℃-3天	下降5％	下降40％	下降30％
				37℃-7天	下降12％	下降58％	下降56％

本发明使HIV抗原抗体的检测优于公司A和公司B的以SA包被系统的灵敏度的3-4倍，同时本底仅为SA包被体统的25％，并有效改善AE标记物的稳定性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东菲鹏生物有限公司

<120> 一种用于检测HIV的试剂盒

<130> 2019

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaagttgtta aaatcgaacc gctgggtgtt gctccgacca aagctaaacg tcgtgttgtt 60

cagcgtgaaa aacgtgctgt tggtatcggt gctctgttcc tgggtttcct gggtgctgct 120

ggttctacca tgggttgcac ctctatgacc ctgaccgttc aggctcgtca gctgctgtct 180

gacatcgttc agcagcagaa caacctgctg cgtgctatcg aagctcagca gcacctgctc 240

cagctgaccg tgtgggggat caaacagctg caggctcgta tcctggctgt tgaacgttac 300

ctgaaagacc agcagctgct gggtatctgg ggttgctctg gtaaactgat ctgcaccacc 360

gctgttccgt ggaacgcttc ttggtctaac aaatctctgg aacagatctg gaacaacatg 420

acctggatgg aatgggaccg t 441

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaagttgtta aaatcgaacc gctgggtgtt gctccgacca aagctaaacg tcgtgttgtt 60

cagcgtgaaa aacgtgctgt tggtatcggt gctctgttcc tgggtttcct gggtgctgct 120

ggttctacca tgggtgctgc ttctatgacc ctgaccgttc aggctcgtca gctgctgtct 180

gacatcgttc agcagcagaa caacctgctg cgtgctatcg aagctcagca gcacctgctc 240

cagctgaccg tgtgggggat caaacagctg caggctcgta tcctggctgt tgaacgttac 300

ctgaaagacc agcagctgct gggtatctgg ggttgctctg gtaaactgat ctgcaccacc 360

gctgttccgt ggaacgcttc ttggtctaac aaatctctgg aacagatctg gaacaacatg 420

acctggatgg aatgggaccg t 441

<210> 3

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgaaagacc aggctcagct gaactcttgg ggttgcgctt tccgtcaggt ttgccacacc 60

accgttccgt gggctaacga ctctctgacc ccggactgga acaacatgac ctggcaggaa 120

tgggaacaga aagttcgtta cctggaagct aacatctctc agtctctgga acaggctcag 180

atccagcagg aaaaaaacat gtacgaactg cagaaactga actcttggga cgttttcggt 240

aactggttcg acctggcttc ttggatcaaa tacatccagt acggtgttta catcgttgct 300

ggt 303

<210> 4

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtaccctgc tggctggtat cgttcagcag cagcagcagc tgctggacgt tgttaaacgt 60

cagcaggaaa tgctgcgtct caccgtctgg gggaccaaaa acctgcaggc tcgtgttacc 120

gctatcgaaa aatacctgaa agaccaggct cagctgaact cttggggttg cgctttccgt 180

caggtttgcc acaccaccgt tccgtgggct aacgactctc tgaccccgga ctggaacaac 240

atgacctggc aggaatggga acagaaagtt cgttacctgg aagctaacat ctctcagtct 300

ctggaacagg ctcagatcca gcaggaaaaa aacatgtacg aactgcagaa actgaactct 360

tgggacgttt tcggtaactg gttcgacctg gcttcttgga tcaaatacat ccagtacggt 420

gtttacatcg ttgctggtat c 441

<210> 5

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys

1 5 10 15

Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu

20 25 30

Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Cys Thr Ser

35 40 45

Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Asp Ile Val Gln

50 55 60

Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala

85 90 95

Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys

100 105 110

Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp

115 120 125

Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu

130 135 140

Trp Asp Arg

145

<210> 6

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys

1 5 10 15

Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu

20 25 30

Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser

35 40 45

Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Asp Ile Val Gln

50 55 60

Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala

85 90 95

Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys

100 105 110

Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp

115 120 125

Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu

130 135 140

Trp Asp Arg

145

<210> 7

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Leu Lys Asp Gln Ala Gln Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln

1 5 10 15

Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp Ala Asn Asp Ser Leu Thr Pro Asp

20 25 30

Trp Asn Asn Met Thr Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Val Arg Tyr Leu

35 40 45

Glu Ala Asn Ile Ser Gln Ser Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu

50 55 60

Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp Val Phe Gly

65 70 75 80

Asn Trp Phe Asp Leu Ala Ser Trp Ile Lys Tyr Ile Gln Tyr Gly Val

85 90 95

Tyr Ile Val Ala Gly

100

<210> 8

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ile Val Gln Gln Gln Gln Gln Leu Leu Asp

1 5 10 15

Val Val Lys Arg Gln Gln Glu Met Leu Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr

20 25 30

Lys Asn Leu Gln Ala Arg Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Lys Asp

35 40 45

Gln Ala Gln Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His

50 55 60

Thr Thr Val Pro Trp Ala Asn Asp Ser Leu Thr Pro Asp Trp Asn Asn

65 70 75 80

Met Thr Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn

85 90 95

Ile Ser Gln Ser Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met

100 105 110

Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp Val Phe Gly Asn Trp Phe

115 120 125

Asp Leu Ala Ser Trp Ile Lys Tyr Ile Gln Tyr Gly Val Tyr Ile Val

130 135 140

Ala Gly Ile

145

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaaggatcca aagttgttaa aatcgaaccg ct 32

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccggaattca cggtcccatt ccatccagg 29

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaggatcca aagttgttaa aatcgaaccg ct 32

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccggaattca cggtcccatt ccatccagg 29

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaaggatccc tgaaagacca ggctcagctg aa 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccggaattca ccagcaacga tgtaaacacc gt 32

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaaggatccc gtaccctgct ggctggtatc g 31

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccggaattcg ataccagcaa cgatgtaaac ac 32

Claims

1.用于检测HIV的抗原基因序列，其特征在于，如SEQ ID NO.1-4所示。

2.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的抗原基因序列。

3.一种转化体，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体的宿主；

进一步地，所述宿主为原核生物；

进一步地，所述原核生物为大肠杆菌或枯草杆菌。

4.用于检测HIV的抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5-8所示。

5.用于检测HIV的抗原蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的抗原基因序列表达得到；

进一步地，所述表达为原核表达。

6.一种用于检测HIV的试剂盒，其特征在于，包括固相支持物包被的抗原、生物素标记的抗原、亲和素与吖啶酯结合物；

和/或

所述试剂盒以“固相支持物包被的抗原-待检测抗体-生物素标记的抗原-亲和素与吖啶酯结合物”形式和/或以“固相支持物包被的抗体-待检测抗原-生物素标记的抗体-亲和素与吖啶酯结合物”形式完成检测；

所述生物素标记的抗体来自杂交瘤细胞株P24-2F4产生的抗体；

其中，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3所示的序列原核表达的抗原配对使用；SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4所示的序列原核表达的抗原配对使用。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述固相支持物为磁珠；

进一步地，所述磁珠包被抗原或抗体采用EDC进行偶联；

进一步地，所述偶联在活化缓冲液中进行，所述活化缓冲液为MES缓冲液，所述MES缓冲液的浓度为50±5mM，pH为5.5±0.1；

进一步地，所述偶联步骤如下：

抗原或抗体透析至活化缓冲液中，得到第一溶液；

磁珠用活化缓冲液进行分散，得到磁珠分散液；

所述磁珠分散液与EDC的活化缓冲液混合，磁分离，去上清，加入所述第一溶液，结合反应后，弃上清，经洗涤、封闭、洗涤，即得；

进一步地，所述磁珠分散前还用所述活化缓冲液进行洗涤；

进一步地，所述磁珠在活化缓冲液中的浓度为10±2mg/mL；

进一步地，所述EDC的活化缓冲液在，EDC的浓度为10±1mg/mL；

进一步地，所述EDC溶解于所述活化缓冲液的温度为2-8℃；

进一步地，磁珠分散液与EDC的活化缓冲液的体积比为4-6:1；

进一步地，所述混合为室温下以转速为30±2rpm旋转30-60min；

进一步地，所述结合反应采用室温下以转速为30±2rpm旋转结合30±2min；

进一步地，所述结合反应中，抗原或抗体的浓度为1±0.1mg/mL；

进一步地，所述抗原或抗体和EDC的质量比例为1:1±0.1；

进一步地，所述磁珠的羧基含量与EDC的摩尔比例在1:10-20。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素为链霉素；

进一步地，所述亲和素与所述吖啶酯偶联的中间物质为BSA；

进一步地，先通过侨联工艺将所述BSA偶联到吖啶酯上；

进一步地，所述BSA与所述吖啶酯的质量比例为2-3:1；

进一步地，所述BSA与所述吖啶酯偶联完成后，加入终止反应的溶剂；

进一步地，所述终止反应的溶剂为赖氨酸溶液；

进一步地，所述赖氨酸溶液的浓度为1±0.1M；

进一步地，终止反应后进行脱盐；

进一步地，所述脱盐柱缓冲液为浓度为20±2mM的PB，所述PB的pH为7.2±0.2；

进一步地，所述BSA与所述吖啶酯的偶联物与EDC溶液混合，反应，然后加入经前处理后的亲和素溶液，反应，最后经透析后得到亲和素与吖啶酯结合物；

进一步地，经前处理后的亲和素溶液采用以下步骤制备：

所述亲和素采用15kD的透析袋进行透析，所述透析所用的溶液为浓度为20±2mM、pH为7.2±0.2的PB；

进一步地，亲和素与BSA-吖啶酯的重量比例为1:1-2。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素采用以下方法与抗原或抗体结合：

抗原或抗体经前处理后，得到抗原或抗体溶液；

NHS和生物素分别配置成溶液，得到NHS溶液和生物素溶液；

进一步地，所述NHS溶液中，NHS的浓度为10±2mg/mL；

进一步地，所述生物素溶液终，生物素的浓度为10±2mg/mL；

10.权利要求6-9任一项所述的试剂盒在检测Ⅰ型和Ⅱ型艾滋病毒中的应用。