CN105037555A - 缀合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种缀合物，包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。这种缀合物中，辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。本发明还公开了上述缀合物的制备方法及应用。

Description

缀合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别是涉及一种缀合物及其制备方法和应用。

背景技术

梅毒是一种慢性系统性传染病，其病原体是梅毒螺旋体，亦称苍白螺旋体(Treponemapallidum,TP)，主要通过性接触和血液传播。梅毒可产生多种多样的症状和体征，且时隐时显，病程可持续很长，几乎可侵犯全身各器官，是仅次于艾滋病的严重危害我国人民身体健康的性传播疾病。近年来梅毒发病率在我国有上升的趋势，据2014年梅毒重点疫情报告，2009年以来梅毒位于乙类传染病报告发病数的第三，尤其是在产前门诊筛查出的梅毒抗体阳性的孕妇显著增加，给我国的公共卫生带来危害。

目前，国内外对梅毒的发病机制和诊断方式进行了大量的研究，梅毒的诊断和治疗后效果评价一直是利用体液免疫学指标。我国对血源筛选部分采用快速血浆反应素环状卡片试验(rapidplasmareagin,RPR)和甲苯胺红不加热血清试验(tolulizedredunheatedserumtest,TRUST)方法，RPR和TRUST的主要缺点是敏感性和特异性不高，许多非梅毒性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性迁延性肝炎等均可呈阳性反应。另外一种方法，荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验和梅毒螺旋体血凝试验虽然可提高检测的特异性，但是需制备大量病原体，且质量难以控制，也不利于大规模的血液筛查工作。因此，研制快速、简便、灵敏且特异的诊断试剂是当前的主要任务。

免疫检测(immunoassay,IA)是应用免疫学技术测定标本，通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质，是一种敏感的测定的方法。抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达5-10μg/mL。但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，导致检测受限。目前市场上大多梅毒检测产品采用标记法，将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物可提高敏感度。标记物有多种，包括酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质等，均可提高免疫检测的灵敏度，比直接测定沉淀物提高数百至数千倍，达到肉眼可分辨的水平或者机器可读出的水平。在免疫检测时，为了提高灵敏度，标记比例越高越好，但是，标记比例提高会影响抗原活性。

发明内容

基于此，有必要提供一种标记比例提高并且不影响抗原活性的缀合物，以及其制备方法和应用。

一种缀合物，其特征在于，包括融合蛋白和标记物，所述融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，所述标记物标记在所述辅助蛋白上。

在一个实施例中，所述梅毒检测抗原为梅毒螺旋体抗原。

在一个实施例中，所述辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白。

在一个实施例中，所述大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

在一个实施例中，所述大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

在一个实施例中，所述标记物为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质和胶体中的至少一种。

一种上述缀合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达融合蛋白，所述融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白；

步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞；

步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达液；

步骤四、在所述表达液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20％，充分静止后收集上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为40％，充分静止后收集沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗产物；

步骤五、利用Ni-NTA亲和柱纯化所述粗产物，得到所述融合蛋白；

步骤六、对所述融合蛋白进行标记，使得标记物标记在所述辅助蛋白上，得到所述缀合物。

一种梅毒检测试剂，包括上述缀合物。

一种梅毒检测试剂盒，包括上述梅毒检测试剂。

上述缀合物在制备梅毒诊断试剂领域中的应用。

这种缀合物中，辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为一实施方式的缀合物的制备方法的流程图；

图2为一实施方式的基因表达载体的构建过程。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对缀合物及其制备方法和应用做进一步的解释说明。

本发明中使用的术语除非另有说明，否则具有以下含义：

缀合物

本发明中使用的术语“缀合物”包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。

融合蛋白

本发明中使用的术语“融合蛋白”是指辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端形成的蛋白。

标记物

本发明中使用的术语“标记物”是指免疫检测中可被检测到的物质，具体的，标记物可以为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质、胶体中的至少一种。

在传统的免疫检测时，由于标记物直接标记在抗原上面，其存在的固有缺陷是：为了提高灵敏度，标记比例越高越好，但是比例过高会使抗原被更多的标记物包裹，抗原表位被包埋，导致抗原活性降低，因此为了兼顾抗原活性标记比例无法无限制提高，造成灵敏度提高有限。本发明发现，在梅毒检测抗原的N端嵌合辅助蛋白可以有效的解决上述问题。

因此，本发明提供一种缀合物，包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。

缀合物中的标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用，因此不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。

具体的，梅毒检测抗原可以为梅毒螺旋体抗原。在一个实施方式中，梅毒检测抗原为梅毒螺旋体17Kda(TpN17)基因(GeneBankNo：M74825)的63aa～156aa所对应的DNA区段表达得到的梅毒螺旋体抗原。

在其他实施方式中，梅毒检测抗原还可以选择其他种类的梅毒螺旋体抗原。

具体的，辅助蛋白可以为大肠杆菌周质蛋白。

大肠杆菌周质蛋白(OSMY)能促进蛋白溶解性及细胞定位，而周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。通过梅毒螺旋体抗原与大肠杆菌周质蛋白融合表达，得到的融合蛋白可溶性增强，蛋白活性高。另外，经分子生物学软件分析，OSMY等电点为酸性，亲水性较好，赖氨酸含量较高，且分布均匀，利于标记物的标记。

一实施方式中，大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

特别的，大肠杆菌周质蛋白包括与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少99％同源性的多核苷酸编码得到的多肽。

另一个实施方式中，大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

特别的，大肠杆菌周质蛋白包括与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少99％同源性的多肽。

由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的蛋白或上述氨基酸序列组成的多肽，如果大肠杆菌周质蛋白没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

具体的，标记物可以为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质、胶体中的至少一种。

本实施方式中，标记物选择辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶与大肠杆菌周质蛋白容易发生偶联作用，利于标记。

此外，本发明还提供如图1所示的上述缀合物的制备方法，包括如下步骤：

S110、提供基因表达载体，用于表达融合蛋白，该融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白。

一般的，基因表达载体的构建过程如下：选取一段辅助蛋白的基因片段，设计引物，引物上带有酶切位点，PCR扩增辅助蛋白基因片段，连接到用相应酶切处理后的表达载体中，得到重组质粒。选取一段梅毒检测抗原的基因片段，设计引物，引物上带有酶切位点，PCR扩增梅毒检测抗原基因片段，连入到用相应酶切好的重组质粒中，得到可表达融合蛋白的基因表达载体。

一般的，可根据梅毒检测抗原的基因和大肠杆菌周质蛋白的基因特点及常规的分子克隆实验指南，选用各种常规标准表达载体，例如：pET-26b(+)(Novagen公司，货号：VYN0166)、pET-24a(Novagen公司，货号：69864-3)等。一般的，酶切方式有BamHI/EcoRI双酶切和EcoRI/HindⅢ双酶切。

具体的，梅毒检测抗原可以为梅毒螺旋体抗原。

具体的，辅助蛋白可以为大肠杆菌周质蛋白。

一实施方式的基因表达载体的构建过程如图2所示。选取一段用BamHI/EcoRI双酶切处理的大肠杆菌周质蛋白(OSMY)基因，连接到同样用BamHI/EcoRI双酶切处理后的表达载体中pET-26b(+)中，得到重组质粒pET-26b(+)-OSMY。再选取一段用EcoRI/HindⅢ双酶切处理的梅毒检测抗原(TpN17)的基因片段，连入同样用EcoRI/HindⅢ双酶切处理的pET-26b(+)-OSMY重组质粒中，得到可表达融合蛋白的基因表达载体pET-26b(+)-OSMY-TP17。

一实施方式中，大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

另一个实施方式中，大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

S120、将S110中的基因表达载体转化到宿主细胞中。

宿主细胞一般选择原核细胞，例如：大肠杆菌。

一般的，基因表达载体转化操作参见试剂盒生产厂家推荐的方法实现，宿主细胞为感受态细胞，例如大肠杆菌感受态细胞，将构建好的基因表达载体加入感受态细胞，热激处理，使感受态细胞的细胞膜结构扰动，细胞膜上出现空隙以便基因表达载体进入细胞，之后恒温培养，使宿主细胞复苏。

一般的，基因表达载体转化到宿主细胞后，还需要对转化后的宿主细胞进行抗性筛选，如在培养基中加入氨苄西林钠或卡那霉素。

S130、对转化了基因表达载体的宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达液。

一般的，可在一定温度条件下，加入诱导剂对转化了基因表达载体的宿主细胞进行诱导表达，诱导剂可以为一定浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

本实施例中，诱导条件为0.5mM的IPTG，37℃诱导4小时。

一般的，诱导表达后收集菌体，用裂解缓冲溶液重悬菌体后破碎，再分离破碎后的沉淀和上清，用分子生物学的方法鉴定目的蛋白分布在裂解后沉淀或裂解后上清中。如在上清中，则上清为最终的表达液，如在沉淀中，则需加入缓冲液处理后得到最终的表达液。

本实施例中，裂解缓冲液配方为：50mMTirs-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl。目的蛋白大部分分布在裂解液上清中，因此选择上清为最终的表达液。

S140、在S130得到的表达液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20％，充分静止后收集上清，接着在上清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为40％，充分静止后收集沉淀，将沉淀重新溶解，得到粗产物。

一般的，在表达液中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为20％，静止一段时间后，离心收集上清。之后在收集的上清中继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为40％，静止一段时间后，离心收集沉淀，用平衡缓冲液将收集沉淀溶解，得到粗产物。

本实施例中，平衡缓冲液的配方为：25mMTris，200mMNaCl，25mM咪唑，pH8.0。

S150、利用Ni-NTA亲和柱纯化粗产物，得到融合蛋白。

一般的，纯化粗产物的操作如下：先用平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱，将粗产物加入Ni-NTA亲和柱中，粗产物中的蛋白与Ni-NTA亲和柱中的金属离子Ni²⁺结合，留在Ni-NTA亲和柱中，之后再加入一定洗脱缓冲液冲洗Ni-NTA亲和柱，使蛋白液流出，收集纯化了的融合蛋白。

本实施例中，洗脱缓冲液为含咪唑的缓冲液，利用咪唑竞争性的与Ni²⁺结合，将蛋白洗脱下来，得到纯化了的融合蛋白。洗脱缓冲液的配方为：25mMTris，200mMNaCl，200mM咪唑，pH8.0。

一般的，收集纯化了的融合蛋白后，还需测定蛋白浓度。

S160、对融合蛋白进行标记，使得标记物标记在辅助蛋白上，得到缀合物。

一般的，标记操作如下：将标记物溶解，加入一定量的融合蛋白，在缓冲溶液中透析，由于辅助蛋白易于与标记物结合，标记物一般标记在融合蛋白的辅助蛋白上，之后加入酶保护剂，得到缀合物。

具体的，标记物可以为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质、胶体中的至少一种。

本实施例中，采用NaIO₄氧化法对融合蛋白标记，将辣根过氧化物酶(HRP)溶解，加入NaIO₄溶液，混匀后乙二醇溶液，之后再加入纯化好的融合蛋白，融合蛋白中包含的辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白，大肠杆菌周质蛋白易于与HRP结合，标记物标记在大肠杆菌周质蛋白上，PBS缓冲液透析后加入酶保护剂，得到缀合物。

该方法制备的缀合物，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用，因此不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。

本发明还提供一种包括上述缀合物的梅毒检测试剂。

本发明还提供一种包括上述梅毒检测试剂的梅毒检测试剂盒。

梅毒检测试剂盒还可以包括包被抗原包被的酶标板、洗涤液、显色液、终止液、样品稀释液、阴性对照品和阳性标准品。

酶标板可作为抗原的支持物。

包被抗原可以为梅毒螺旋体特异性抗原。在一个实施方式中，包被抗原采用如下操作制得：PCR扩增梅毒螺旋体17Kda(TpN17)基因(GeneBankNo：M74825)的22aa～156aa所对应的DNA区段，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点且EcoRI位点之前带有6个His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA，PCR的片段经回收之后，用BamHI和EcoRI酶切，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(Novagen公司，货号：69864-3)中，得到重组质粒pET-24a-TP17，转化后表达得到的包被抗原记为TP018。

上述缀合物还可以应用于制备诊断试剂领域。

下面为具体实施例部分。

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。

实施例1、包被抗原重组质粒的制备

选取梅毒螺旋体17Kda(TpN17)基因(GeneBank序号M74825)的63aa-156aa所对应的DNA区段，设计引物，上游引物序列如SEQIDNo.3所示，下游引物序列如SEQIDNo.4所示。其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点且EcoRI位点之前带有6个His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA。

PCR扩增，PCR条件为：94℃变性5min；(94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s)×30个循环；最后72℃延伸10min。回收PCR的片段(本发明所使用的分子生物学提取和回收试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司)，之后用BamHI和EcoRI酶切(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司)，回收酶切产物，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(Novagen公司，货号：69864-3)中，得到重组质粒pET-24a-TP17，即本发明的包被抗原的重组质粒。

实施例2、包被抗原的表达与纯化

将pET-24a-TP17质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技有限公司，货号CB105)，涂布于含100μg/mL硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号KB0286)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号KB0286)的500mLLB培养基37℃振荡培养至OD600＝1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(生工，货号IB0168)37℃诱导4小时。4℃，5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl)重悬，超声破碎，4℃，12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液(广东光华化学试剂公司，货号：7783-20-2，调pH7.4)至硫酸铵终浓度为35％，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集上清，继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为60％，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集沉淀，用5ml平衡缓冲液(25mMTris，200mMNaCl，25mM咪唑pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(25mMTris，200mMNaCl，200mM咪唑pH8.0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，-20℃保存备用，pET-24a-TP17质粒表达纯化后得到包被抗原命名为TP018。

实施例3、融合蛋白重组质粒的制备

选取OSMY基因(GeneBank序号NC_007779.1)的全长CDS，设计引物，上游引物序列如SEQIDNo.5所示，下游引物序列如SEQIDNo.6所示。其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点。

用PCR扩增，PCR条件为：PCR条件为：94℃变性5min；(94℃，30s，57℃30s，72℃，40s)×30个循环；最后72℃延伸10min，通过AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen，货号：AP-GX-50)回收PCR扩增的DNA产物，之后用BamHI/EcoRI酶切，得到如即SEQIDNo.1序列所示的DNA片段，连接到用BamHI和EcoRI双酶切处理之后的表达载体pET-26b(+)(Novagen公司，货号：VYN0166)中，得到重组质粒pET-26b(+)-OSMY，用EcoRI/HindⅢ酶切pET-26b(+)-OSMY重组质粒，作为大肠杆菌周质蛋白的终载体。

PCR扩增梅毒螺旋体17Kda(TpN17)基因(GeneBank序号M74825)的63aa-156aa所对应的DNA区段，设计引物，上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示。上游引物带有EcoRI位点，下游引物带有HindⅢ位点，用PCR扩增，PCR条件为：PCR条件为：94℃变性5min；(94℃，30s，56℃，30s，72℃，25s)×30个循环；最后72℃延伸10min，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen，货号：AP-GX-50)回收PCR片段，之后用EcoRI/HindⅢ酶切PCR回收片段，连入酶切好的大肠杆菌周质蛋白的终载体pET-26b(+)-OSMY中，即本发明的融合蛋白的重组质粒，以下简称pET-26b(+)-OSMY-TP17。

实施例4、融合蛋白的表达与纯化

将pET-26b(+)-OSMY-TP17质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技有限公司，货号CB105)，涂布于含100μg/mL氨苄西林钠(生工，货号A0339)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度的500mlLB培养基37℃振荡培养至OD600＝1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG37℃诱导4小时。4℃5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液(50mMTirs-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl)重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，80％目的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为20％，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集上清，继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为40％，4℃静置30min，4℃12000g离心20分钟，收集沉淀，用10ml平衡缓冲液(25mMTris，200mMNaCl，25mM咪唑pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液(25mMTris，200mMNaCl，200mM咪唑pH8.0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，-20℃保存备用，pET-26b(+)-OSMY-TP17质粒表达后得到的融合蛋白命名为TP045。

上述融合蛋白包含了梅毒螺旋体抗原和大肠杆菌周质蛋白(OSMY)，OSMY蛋白能促进蛋白溶解性及细胞定位，而周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。通过梅毒螺旋体抗原与OSMY蛋白融合表达，得到的融合蛋白可溶性增强，蛋白活性高。

实施例5、梅毒检测试剂盒的制备

对基因工程重组制备的包被抗原、融合蛋白，进行有条件的优化选择后，建立本发明的双抗原夹心ELISA检测方法。

(1)支持物的制备

将纯化好的包被抗原(TP018抗原)用碳酸盐缓冲液(50mM，PH9.51)稀释至1μg/Ml，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)，4℃包被24小时，次日用PBST(10mMPB，150mMNaCl，0.05％Tween-20，pH7.4)洗涤液洗板二次，拍干，120μL/孔加入含20％新生牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，8％蔗糖，5‰酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司,货号C-8645)，1‰β-巯基乙醇(生工，货号M0482)，150mMNaCl的pH7.4，10mMPB封闭液，37℃封闭2小时，甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25℃、湿度55％-65％、有通风设备的房间内风干，包被完毕。

(2)缀合物的制备

采用NaIO₄氧化法。称取8mg辣根过氧化物酶(HRP，英国Biozymelaboratories公司，货号：HRP4)溶解于0.4ml超纯水中，再缓慢滴加0.4mL超纯水新鲜配制的20mg/mLNaIO4(生工，货号ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌40分钟后，加入48μL乙二醇(取8μl乙二醇溶于40μl蒸馏水中)溶液，室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入1mL预先在20mM，pH9.51碳酸盐缓冲液中透析2小时，1mg/mL的纯化好的融合蛋白(TP045)，之后，在4℃避光条件下，混合物在20mM，pH9.51碳酸盐缓冲液中透析过夜。次日，向混合物中滴加80μL新鲜配制的5mg/mLNaBH4(生工，货号ST1268)溶液，混匀，4℃静置2小时。将上述液体装入透析袋中，在PBS缓冲液(150mM，pH7.4)中透析，4℃过夜。加入酶保护剂及终浓度50％的甘油混匀后，置于-20℃避光保存备用。融合蛋白标记标记物之后的缀合物在以下的文字中称为TP045-HRP。

(3)检测

在包被抗原包被的酶标板中先加入50μL待测样品，以及50μL一定比例稀释的缀合物(TP045-HRP)，37℃反应1小时，甩掉孔内液体，用PBST洗涤液洗板五次，拍干；所使用的显色系统为含有过氧化氢的拧橡酸盐缓冲液的显色液A和含有四甲基联苯胶(TMB)的拧橡酸盐缓冲液的显色液B各50μL，37℃避光显色15分钟。每孔加50μL，含2M硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值。

截值CutoffValue(COV)计算：COV＝阴性对照平均OD值×2.0(阴性对照OD值低于0.075作0.075计算，高于0.075按实际OD值计算)，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值＜COV为阴性。

实施例6、双抗原夹心法ELISA检测梅毒螺旋体抗体

本发明的梅毒检测试剂盒，采用双抗原夹心法ELISA检测梅毒螺旋体抗体，其灵敏度、特异性、重复性、稳定性、精密性等指标均优于现有商品化试剂盒。

(1)灵敏度：本发明的梅毒检测试剂盒可检出临检中心梅毒螺旋体(TP)ELISA灵敏度质控品，检测临床130例经确认的梅毒螺旋体(TP)阳性血清，结果全部检出。

(2)特异性：本发明的梅毒检测试剂盒检测临床2000份确认梅毒螺旋体(TP)阴性血清，假阳率为0.13％，远低于市场现有TP双抗原夹心法ELISA产品的假阳率0.5％～1.5％，由此可见，本发明的试剂盒特异性好。

(3)重复性：对阴、阳性待测样品各35份，采用不同时不同批次不同操作者进行10次检测，考查试剂盒的重复性，结果显示本发明的梅毒检测试剂盒对阴、阳性判定结果的重复性为100％。由此可见，本发明的试剂盒的再现性好，重复性高。

(4)稳定性：将本发明制成的TP045-HRP缀合物，以及梅毒检测试剂盒分别37℃考核7天，取出后与同时4℃存放的TP045-HRP缀合物和梅毒检测试剂盒在同一条件下检测相同的阴、阳性质控血清，表1表示TP045-HRP缀合物稳定性实验结果，表2表示本发明梅毒检测试剂盒的稳定性实验结果。由此可见，本发明的TP045-HRP缀合物和梅毒检测试剂盒稳定性好。

表1、TP045-HRP缀合物稳定性实验结果

表2、本发明梅毒检测试剂盒的稳定性实验结果

(5)精密性：在用本发明的梅毒检测试剂盒检测同一份已知阳性标本，多次平行做10次重复检测，得到的结果均为阳性，由此可见，本发明的试剂盒精密性较好。

普通的双抗原夹心法，由于标记物直接标记在抗原上面，其存在的固有缺陷是：为了提高灵敏度，标记比例越高越好，但是比例过高会使抗原被标记物包裹，抗原表位被包埋而导致抗原活性降低，因此，为了兼顾标记比例提高过程中抗原的活性损失造成的灵敏度下降，标记比例无法无限制提高，造成灵敏度提高有限。

本发明公开的缀合物包括梅毒检测抗原、辅助蛋白和标记物，辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端形成融合蛋白，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。

特别的，当辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白(OSMY)时，由于OSMY亲水性较好，赖氨酸含量较高，且分布均匀，利于HRP的标记，避免了抗原的抗原决定簇与标记物直接结合造成的抗原活性降低，尽可能保持了抗原的活性，从而提高试剂盒的灵敏度。

此外，本发明提供的包含上述缀合物的梅毒检测试剂盒，在免疫检测时，以“支持物-梅毒检测抗原-待测梅毒螺旋体抗体-缀合物-可识别信号”的形式完成检测，标记物标记在缀合物中的辅助蛋白上，避免了抗原的抗原决定簇与标记物直接结合造成的抗原活性降低，尽可能保持了抗原的活性，从而提高试剂盒的灵敏度。该试剂盒具有灵敏度高、特异型好、重复性好、稳定性高、精密性好的优点。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种缀合物，其特征在于，包括融合蛋白和标记物，所述融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，所述标记物标记在所述辅助蛋白上。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述梅毒检测抗原为梅毒螺旋体抗原。

3.根据权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白。

4.根据权利要求3所述的缀合物，其特征在于，所述大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

5.根据权利要求3所述的缀合物，其特征在于，所述大肠杆菌周质蛋白包括：

(a)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90％同源性的多肽；或

(c)、由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

6.根据权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述标记物为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质和胶体中的至少一种。

7.一种权利要求1～6中任一项所述缀合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达融合蛋白，所述融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白；

步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞；

步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达液；

步骤四、在所述表达液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20％，充分静止后收集上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为40％，充分静止后收集沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗产物；

步骤五、利用Ni-NTA亲和柱纯化所述粗产物，得到所述融合蛋白；

步骤六、对所述融合蛋白进行标记，使得标记物标记在所述辅助蛋白上，得到所述缀合物。

8.一种梅毒检测试剂，其特征在于，包括权利要求1～6中任一项所述的缀合物。

9.一种梅毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的梅毒检测试剂。

10.根据权利要求1～6中任一项所述缀合物在制备梅毒诊断试剂领域中的应用。