JP3404035B2 - イムノアッセイにおいて利用するためのシステインチオール保護ペプチド - Google Patents

イムノアッセイにおいて利用するためのシステインチオール保護ペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はイムノアッセイにおける利用のためのエピト
ープに擬態するペプチド組成物に関し、そしてより詳し
くは天然タンパク質との応答において生成した抗体との
高められたエピトープの付与及び高められた特異的な免
疫反応性を有する改良ペプチド組成物に関する。
発明の背景 近年、ヒト免疫栓ウィルス（HIV）と反応する抗体を
有する個体が常用のサンドイッチELISA形式のイムノア
ッセイにより検定されている。これらのアッセイは固定
化したウィルスのリゼイトをHIV抗体を含むと予想され
る血液又は血清と接触させることを含んで成る。現在市
販されている試験用品は有意に血液製品を介してのHIV
の伝染性が低められていることが明らかであるが、しか
しながらウィルスのリゼートをベースとする試験は複数
の明らかなる欠点を有する。このような欠点には、大量
の生存感染性ウィルスを育成且つ操作すること：生存ウ
ィルスが試験材料に混入するおそれがあること；もたら
されるリゼートの種々の性質；及び更なる組合せ試験、
例えばウェスタンブロットを必要とする誤陽性と誤陰性
の実質的に大量な数、が含まれることがこれらに限定さ
れない。
本明細書に参考文献として組入れているCosandの共有
の米国特許第4,629,783号において、免疫的反応性ウィ
ルスタンパク質エピトープを擬態する複数の合成ペプチ
ドが開示されている。これらの中で、ペプチド39で表示
されているgp41の26個のアミノ酸の配列を含んで成るペ
プチドが、試験した全てのHIV−１陽性として分ってい
る血清と反応性であり、且つ試験したすべての陰性サン
プルと反応性でないことが見出せた。その後、複数のグ
ループがCosandにより定義されたペプチド39領域の重要
性がドミナント抗原性決定基を含むものとして認識し
た。Wang,J.J.G.らのProc.Natl.Acad.Sci.83;6159（198
6）、Shoeman,R.L.らのAnalyt.Biochem.161:370（198
7）、Gnann,J.W.らのJ.Virol.61:2639（1987）、及びGn
ann,J.W,らのJ.Infect.Dis.156261（1987）を参照のこ
と。
合成ペプチドはウィルスリゼートよりも有意なる利点
を提供する。利点には、特異性、純度、製造の容易さ等
が含まれるがそれらに限定されない。潜在的な欠点に
は、全てのウィルス株を検定するためには複数のペプチ
ドの利用が必要であること；及びもとから小さいペプチ
ドは固相への固定化に基づいて免疫的反応性を失うこと
が含まれる。
免疫アッセイによって固定化抗原として利用される小
さなペプチドは一般に固相方法により合成される。ここ
で該ペプチドを占める各アミノ酸は、成長するペプチド
鎖を不溶性の樹脂支持体上に固定しながら、保護されて
いる形において遂次的に加えていく。合成工程の際中、
成長する鎖を占める一定のアミノ酸の側鎖は保護されて
いる。これらは種々の化学基によりブロックされ、これ
は完成したペプチドを通常濃フッ化水素酸又はトリフル
オロ酢酸との反応により不溶性樹脂支持体から除去する
迄残り続ける。分離にわたり、ほとんど保護基が除去さ
れ、そして完成したペプチドは当業界に既知の種々の方
法のいづれかによって精製される。
粗製又は精製ペプチドを次に種々の方法によって固相
上に固定化せしめる。これらの方法には、直接のコンジ
ュゲーション、可溶性の非免疫的反応性タンパク質もし
くはその他の不活性分子とのコンジュゲーション、又は
固相への直接吸着によることが含まれる。米国特許第4,
629,783号に複数のこれらの方法の例が開示されてい
る。
HIV−２のgp36タンパク質由来のエピトープを擬態す
るペプチド、HIV−１のgp41のレトロウィルス機能に相
当すると思われるグリコプロティンが、本明細書に参考
文献として組入れている共同米国特許出願USSN 030,403
号及びUSSN 035,408号（それぞれ1987年３月25日及び19
87年４月７日に出願）に開示されている。この中で、41
−２−１として表示されているペプチドであって、HIV
−１におけるペプチド39と類似する領域をコード化する
26個のアミノ酸を含んで成るものが、試験した全てのHI
V−２陽性と分かっている血清と反応し、且つ試験した
陰性サンプルとは適当なカットオフ値を越えて反応する
ことはなかった。ペプチド41−２−１の短い型であって
41−２−３で表示され、ペプチド41−２−１のカルボキ
シル側のアミノ酸残基を含んで成るものも、HIV−２血
清と反応性であることが見出され、そしてあるケースに
おいてはそれらはペプチド41−２−１よりも優れてい
た。
ペプチド39、41−２−１及び41−２−３のそれぞれは
そのアミノ酸配列の中に２個のシステイン残基を含む。
ペプチド配列中にシステイン残基があることは分子内及
び分子外のジスルフィド結合の形成を、脱保護したペプ
チドの精製、固定化及び長期保存にわたり可能とする。
従って、このようなペプチド組成物は通常、種々のサイ
ズのモノマー、ダイマー及びポリマーを含む種々の酸化
型の混合体として固相上に固定化されている。固相上に
固定化するペプチドの酸化の型を調節するための予備注
意は一般にされない。Rosen,J.I.ら（WO87/06005）は、
Cosandにより同定されたHIV−１の高い抗原性領域由来
の一定のペプチド（前記）であって複数のシステイン残
基を含むものは、種々の酸化型の混合として固定されて
いるものと認識し、そしてペプチド、特にポリマーの酸
化の型はあるペプチドの反応性のためには重要でありう
ることを示唆している。Rosen、らはある場合におい
て、一定のペプチドの環状型はポリマー型に比べて固形
表面への結合が効率的でないことを開示している。これ
らのペプチドの種々の酸化型は感度を有するイムノアッ
セイにおける多彩性の起源となることができ、そしてこ
れはそれらのアッセイに基づく結果にも影響を及ぼすこ
とがある。
従って当業界においては、反応性を良くする、そして
できるだけわずかな誤陰性及び誤陽性結果を提供するペ
プチド組成物の要求が顕著に存在する。
発明の概略 HIVウィルス又はHIVウィルスに対する抗体の検出にお
いて有用な改良ペプチド組成物を提供する。ペプチドの
酸化型をコントロールすることが可能な改良ペプチド組
成物の製造のための方法も提供し、この方法は、イムノ
アッセイ方法における抗原として、前記の組成物を、固
相への固定化の前後に含んで成る。酸化の型のコントロ
ールは特異的且つ高感度に測定される改良された免疫反
応性を有するペプチド組成物を提供する。ペプチドは標
準の固相ペプチド合成方法を利用して合成されるが、た
だし通常用いられるシステインチオール基のＳ−ジンベ
ルブロッキングの代わりに高い酸性分解条件に耐性の化
学的可逆性保護手段を利用している。化学的可逆性の保
護基には、例えばエチルカルバモイル、アセタミドメチ
ル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフィニル、ジフェニ
ル−４−ピリジル−メチル等が含まれる。
アミノ酸配列の組立後のシステインチオール基の可逆
性保護を提供する際には異なる態様がある。ペプチドの
保護の前のペプチド組成物の還元が、保護前にジスルフ
ィド結合が残っていないことを確実にするために必要で
ある。また、システインチオール保護基は固定化前に除
去することがあり、ここではペプチドの脱保護及び酸化
は、この酸化されたペプチド組成物の固相への固定化の
前に溶液中において行われる。酸化のための条件は、分
子内ジスルフィド結合の形成が好ましいように選ばれ、
即ち、それは非常に希薄であって中性から弱アルカリ性
の条件である。
本発明のある態様において、該ペプチドは一般に以下
のアミノ酸配列を含んで成る。： ここでＸはOH又はNH2であり、Ｙは該ペプチドの反応
性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含ん
で成り、そしてCys＊は化学的可塑性手段により保護さ
れているチオール基を含んで成るシステン残基である。
特に好ましい態様はＹがCys−Gly−Glyの配列の場合で
ある。
広範囲のイムノアッセイプロトコールがペプチド組成
物を利用でき、ここでペプチドは溶液中か又は固相上に
固定化されうる。種々の固相が利用でき、それにはシリ
カ、セルロースフルオロカーボンポリマー、ポリアクリ
ルアミド及びポリスチレンのラテックス（微粒子）が含
まれる。固相、例えばシリカ、セルロース、フルオロカ
ーボンポリマー、ナイロン、ポリアクリルアミド及びポ
リスチレンを含んで成る固相も利用できうる。固相への
固定化は吸着又は共有結合のいづれかにより行われう
る。
体液におけるHIVウィルス又はHIVウィルスの抗原に対
する抗体の存在を検出するための本発明において開示す
る第１のイムノアッセイプロトコールは一般に以下の段
階、 （ａ）固相と、以下のアミノ酸配列： （ここでＸはOH又はNH2であり、Ｙは該ペプチドの反
応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含
んで成り、そしてCys＊は化学的可逆性手段により保護
されているチオール基を含んで成るシステイン残基であ
る）を含んで成る少なくとも一種類のペプチド組成物と
を、固定化が可能な条件のもとで接触させ；（ｂ）該化
学的可逆性の手段をこの固定ペプチドのシステインチオ
ール基から除去し；（ｃ）該固定化ペプチドをジスルフ
ィド結合の形成を行うための条件下にてインキュベート
し；（ｄ）反応混合物を作るために体液と該固定化ペプ
チドとを免疫学的特異的結合を可能とする条件のもとで
接触させ；（ｅ）該固定化ペプチドと該体液の抗体成分
との間に免疫学的特異的結合が生じたかどうかを検出す
ることであって、この免疫学的特異的結合の検出は該体
液中のHIVウィルスに対する抗体の存在を示すこと；を
含んで成る。
第２のイムノアッセイ形式は、以下の段階、（ａ）シ
ステインチオール基の化学的可逆性保護基を除去し；
（ｂ）脱保護せしめたペプチドを、ペプチド組成物を形
成するために分子内ジスルフィド結合の形成を行う条件
のもとでインキュベートし；（ｃ）該ペプチド組成物を
固相上に固定化し；（ｄ）反応混合物を作るために体液
と該固定化ペプチド組成物とを免疫学的特異的結合を可
能とする条件のもとで接触させ；そして（ｅ）該固定化
ペプチドと該体液の抗体成分との間に免疫学的特異的結
合が生じたかどうかを検出することであって、この免疫
学的特異的結合の検出は該体液中のHIVウィルスに対す
る抗体の存在を示す；ことを含んで成る。
免疫学的特異的結合は、未結合の成分を該免疫反応混
合物において形成された反応生成物から除去し、該免疫
反応混合物に標識抗体を加えることにより検出すること
ができ、該標識抗体は該反応生成物の成分に免疫学的特
異的に結合することが可能てあり、そしてこの標識は検
出可能なシグナルを提供する。未結合の成分は濾過によ
り該反応混合物から除去されることができる。
本発明の他の態様は以下の詳細を説明及び添付した請
求の範囲の参照に基づいて明らかとなるであろう。
IV.特定の態様の説明 本発明は抗体又は抗原の定量及び／又は検出のための
イムノアッセイ方法において利用するための改良ペプチ
ド組成物に関する。ある態様においてこのペプチドはウ
ィルス抗原又はそれに対する抗体、より詳しくはレトロ
ウィルス、例えばHIV−１及びHIV−２並びに関連するレ
ンチウィルスの科に関連する抗原又は抗体の検出におい
て利用される。本発明に従って作られるその他の具体的
なペプチドはHTLV−Ｉ及びHTLV−IIのエピトープ領域を
擬態する。
ペプチドは、タンパク質を異種の宿主に導入すること
により作られ、抗体と結合可能なことによって同定され
うる。複数の例において、Cys残基は抗体を認識し且つ
結合するペプチドのエピトープの一部を占める。ペプチ
ドの合成の際中でのCys残基の保護基は該ペプチドの酸
化型の形成を妨げ、そして例えば高い感度及び／又は特
異性により測定される改良されたペプチド免疫反応性を
提供する。
本発明のペプチド組成物はその配列内に化学的に修飾
されたシステイン残基を有し、従って反応、例えば酸化
から可逆的に保護されている。従って、本発明において
有用なペプチドは一般に少なくとも２個のCys残基を有
し、これは天然タンパク質により作られた抗体に結合可
能なペプチドの形態に貢献する。分子内結合を形成する
ために、Cys残基は少なくとも１個のアミノ酸残基によ
り、一般には少なくとも２個、そしてより通常には約３
から約15個以上のアミノ酸残基により離されている。あ
る好ましい態様において、このCys残基は約５〜８個の
残基により離されている。鎖内ジスルフィド結合の形成
により、連結したCys残基は輪又は環状ペプチド領域を
表わし、これは高い免免反応性において重要でありう
る。
本発明のペプチドは広範囲の方法において作られう
る。このペプチドは一般に約６個から約50個のアミノ酸
残基に範囲し、より典型的には約６個から約35個のアミ
ノ酸残基に範囲する。それらが比較的短い長さであるた
め、それらは常用の技術に従って溶液中又は固形支持体
上にて合成されうる。例えばStewartとYoung,Solid Ph
ase Peptide Synthesis,第２版、Pierce Chemical
Company,1984;及びTamらの1983,J.Am.Crhem.Soc.105:64
42であって本明細書に参考文献として組入れているもの
を参照のこと。
他方、形質転換真核宿主細胞又は原核宿主細胞におけ
る所望ペプチドの発現のためにハイブリドDNA技術も利
用できるる。例えば、Maniatisらの、MolecularClonin
g.Alaboratory Manual,Cold Spirng Harbor Press,
N,Y.1982（本明細書に参考文献として組入れている）を
参照のこと。むろん、ペプチドは少なくとも６個のアミ
ノ酸、典型的には10個以上から200個以上程度の配列を
意味し、全くのタンパク質を含むことが理解されるであ
ろう。発現されたペプチドを、次に本明細書に詳細の通
りに単離且つ保護できる。
本ペプチドのシステインチオール側鎖の可逆性の化学
的保護は、該ペプチド組成物の化学合成によるペプチド
配列の組立の間に実施することもできる。本ペプチド組
成物を標準的な固相技術により組立てる際、アミノ酸の
付加サイクルの間に利用される条件に対する耐性のた
め、そして該ペプチドを樹脂系の固相から分離させるた
めに利用する高濃度の酸に対する耐性のために化学的可
逆性の保護手段が選ばれる。複数の有用なチオール保護
基の中で、特定の合成のための選択は合成すべきペプチ
ドの構造及びその他の合成すべき保護又はブロッキング
基の性質、並びに該樹脂から該ペプチドを分離するため
に選ばれる特定の試薬に依存しがちである。本発明にお
いて利用するために適切な保護手段には、例えばアセタ
ミドメチル（StewartとYoung（前記））、３−ニトロ−
２−ピリジンスルフィニル（Matsuedaらの、1986、Int.
J.Peptide Res.28:167:Ridge,R.J.らの1986、Int.J.Pe
ptide Res.19:490）及びジフェニル−４−ピリジルメ
チル（Coyle.S.らの、1976、J.Chem.Soc.Chem.Comm.pg
・980）が含まれる。特に好ましい保護基はＳ−（Ｎ−
エチルカルバモイル）である。St.Gutmann（Helv.Chei
m.Acta.（1966）49:83）及びStorey H.T.ら（J.Amer.Ch
em.Soc.（1972）94:6170）を参照のこと。以上の論文は
それぞれ本明細書において参考文献として組入れてい
る。
他方、該システインチオール基はアミノ酸配列の構成
後に可逆的に保護してもよい。この態様において、精製
されているかでなければ豊富な、環状もしくはポリマー
型のペプチドを、あったとしてもわずかのジスルフィド
結合を残すことを確実にするために該ペプチドの保護の
前に還元せしめる。
チオール保護されているペプチドをイムノアッセイに
おける利用のために脱保護する。該ペプチドは溶液にお
いて、遊離もしくは担体と結合しているいづれかにおい
て、固相へ吸着している状態において利用されうる。該
ペプチドを固相に結合させる場合にはシステインチオー
ル保護基を固定化前に除去することがあり、ここで該ペ
プチドの脱保護及び酸化は溶液中にて行われる。脱保護
の手段は利用する広範囲の特定の保護基に関連し、これ
は当業者に周知である。他方、脱保護及び酸化は固定化
の際中又は後に行うこともある。酸化のための条件は好
ましい分子内ジスルフィド結合の形成のために選ばれ、
即ち、それは非常に希薄であり且つ中性から弱アルカリ
性の条件である。
HIV、特にHIV−１に対する抗体の検出及び／又は定量
のため、HIV−１グリコプロテインgp41を擬体すること
が可能な例示的ペプチドは以下のペプチド配列を含む
（ここでこの配列における少なくとも約７個以上、約50
個未満のアミノ酸のオルゴペプチドが含まれる）： （ここでＸはOH又はNH2であり、Ｙは該ペプチドの反
応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含
んで成り、そしてCys＊は化学的可逆性な手段により保
護されているチオール基を含んで成るシステイン残基で
ある）。
HIV−２に対する抗体の検出及び／又は定量のため、H
IV−２グリコプロテインgp36を擬態することが可能な例
示的ペプチドは以下のペプチド配列を含む（ここでこの
配列における少なくとも約７個以上、約50個の未満のア
ミノ酸のオリゴペプチドが含まれる）： （ここでＸはOH又はNH2であり、Ｙは該ペプチドの反
応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含
んで成り、そしてCys＊は化学的な可逆性な手段により
保護されているチオール基を含んで成るシステイン残基
である）。
HTLV−Ｉ及びHTLV−IIに対する抗体の検出及び／又は
定量のため、HTLV−Ｉ及び−IIのトランスメンブラング
リコプロティン（共にgp21で表示されている）を擬態す
ることが可能な例示的ペプチドは以下のペプチド配列を
含む（ここでこの配列において少なくとも約７個以上、
約50個未満のアミノ酸のオリゴペプチドが含まれる）： （ここでＸはOH又はNH2であり、Ｙは該ペプチドの反
応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含
んで成り、そしてCys＊は化学的可逆性手段により保護
されているチオール基を含んで成るシステイン残基であ
る）。
本発明のペプチド組成物は、本組成物がエピトープを
擬態でき、従って天然タンパク質例えば少なくとも１種
類の株のHIV−１のgp41グリコプロテイン又は少なくと
も１種類の株のHIV−２の天然gp36グリコプロテインと
ある程度の免疫学的競合を提供できる限り、任意のタン
パク質又はレトロウィルス配列と同一である必要はな
い。
例えば、注目のペプチドをその中に保存性又は非保存
性置換基を導入することにより改質されうる。通常この
アミノ酸の数の20％より少ない数、より通常には10％よ
り少ない数が交換される。天然タンパク質、例えば異種
のレトロウィルス株の異なったエピトープをより効果的
に擬態するために１又は複数の特定のアミノ酸を変える
ことが望ましいことがある。
従って本ポリペプチドは種々の変化、例えば挿入、欠
失及び保存性又は非保存性のいづれかによる置換であっ
てこのような変化がその利用において一定の利点を提供
するような変化にかけることがある。保存性による置換
は例えばgly,ala;val,ile,leu;asp,glu;asn,gln;ser,th
r;lys,arg;及びphe,tyr;の組合せを意図する。通常、該
配列はHIVに基づく少なくとも１株の配列より20％以上
相違しないことが必要であるが、ただし本ペプチドを例
えば容易に固定化する「アーム」を提供せしめるために
いづれかの末端に更なるアミノ酸を付加することがあ
る。
更に、本ペプチド配列は、アシル化、例えばアセチル
化による末端NH2の修飾、又はチオグリコール酸アミド
化、末端カルボキシアミド化例えばアンモニア、メチル
アミン等により天然配列と異なることがある。ある場合
において、これらの修飾は支持体又はその他の分子のた
めの部位を提供しうる。
上記の通り、アミノ酸アームを該ペプチド又はオリゴ
ペプチドのＣ−及び／又はＮ−末端に付与することがあ
る。必要ならば、該アームは１個から50個（又はそれ以
上）のアミノ酸、より通常には１〜10個のアミノ酸、そ
して好ましくは合成の容易さのために５個より少ないア
ミノ酸でありうる。該アームは種々の目的、例えばスペ
ーサー、として、ペプチドを担体に結合させる、ペプチ
ドを固相に固定させる等のために働く。担体、固相と結
合するため又は高次構造、例えばダイマー、トリマーも
しくはその他の複合体のために有用な機能を提供するた
め、アミノ酸例えばチロシン、システイン、アスパラギ
ン酸等を該アーム又はペプチドのＣ及び／又はＮ−末端
に導入せしめる。特に注目されるエピトープを高める手
段は、Ｃ−及び／又はＮ−末端での１〜10個のアミノ酸
の存在、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の存在、そ
して最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の存在である。
本明細に詳細のあるペプチドの特に好ましい態様は、３
個のアミノ酸がアームとして一般にＮ末端にて付加さ
れ、そして該アームのＮ−末端残基が好ましくはCysで
ある場合に得られる。例示的な態様において該ペプチド
と末端官能基との間のスペーサー残基はGlyである。従
って特に好ましいペプチドはCys−Gly−Glyを含んで成
るアームを有し、ここでCysはＮ−又はＣ−末端残基で
ある。末端Cys酸基はジスルフィド結合を介してジチオ
もしくはチオ官能性支持体、又はトリオエーテル結合を
介して活性化オレフィン支持体と結合することもでき
る。
HIV−１に対する抗体を検出するために特に注目され
ているペプチド配列は前記のCosandにより定義されてい
るペプチド39の配列に由来する。ペプチド39GCは前記の
ペプチド39の26個のアミノ酸を含んで成り、ここでＹは
Cys−Gly−Gly−の配列を含んで成りそしてＸは−NH2を
含んで成る。従ってこのペプチドは以下のアミノ酸配列
を含んで成る。
（ここでCys＊は化学的可逆性手段により保護されて
いるシステイン残基である。） 同様にHIV−２に対する抗体を検出するために特に注
目されているペプチド配列はペプチド41−２−１の配列
に由来し、ここでＹは配列Cys−Gly−Glyを含んで成
り、そしてＸは−NH2を含んで成る。このペプチドは従
って以下のアミノ酸配列により表わされる： （ここでCys＊は化学的可逆性手段により保護されて
いるシステイン残基である。） ペプチド41−２−3GCは前記の41−２−３の配列を含
んで成り、ここでＹは配列Cys−Gly−Glyであり、そし
てＸはNH2であり、以下のアミノ酸配列により表わされ
る： （ここでCys＊は化学的可逆性手段により保護されて
いるシステイン残基である。） HLV−Ｉに対する抗体を検出するために特に注目され
ているペプチド配列はペプチドIVのgp21配列に由来す
る。好ましい態様におけるペプチド121−1GC1におい
て、Ｙは配列Cys−Gly−Gly−を含んで成り、そしてＸ
は−NH2を含んで成る。従ってこのペプチドは以下のア
ミノ酸配列で表わされる： （ここでCys＊は化学的可逆性手段により保護された
システイン残基である）。
HTLV−IIに対する抗体を検出するために特に注目され
ているペプチド配列はペプチドＶのgp21配列に由来す
る。好ましい態様におけるペプチド221−1GC1におい
て、ＹはCys−Gly−Gly−を含んで成り、そしてＸは−N
H2を含んで成る。従ってこのペプチドは以下のアミノ酸
配列により成る： （ここでCy＊は化学的可逆性手段により保護されてい
るシステイン残基である）。本明細書記載ほHTLV−Ｉと
−IIペプチドとの実質的な配列の同一性に基づき、ある
程度の交叉反応がこれらペプチドの間に予想されること
が理解できる。
本発明に従って作られたペプチドにおけるイムノアッ
セイについての形式は抗体か抗原を測定するかに依存し
て利用される。抗体又は抗原を検出するためにデザイン
されているイムノアッセイ形式は当業界において周知で
ある。しかしながら、サンプルを該ペプチドと反応させ
る前又はその際中に、該ペプチドの化学保護基を除去
し、そしてこの脱保護ペプチドをジスルフィド結合の形
成が行なえる条件のもとでインキュベートする。該ペプ
チドを固相に固定化せしめるアッセイ形式においては、
固定化の前又は後に該ペプチドのシステイン残基は分子
内ジスルフィド結合の形成を行なえる条件のもとで溶液
中にて脱保護することができうる。
該ペプチド組成物はその用途に基づき標識しないか又
は標識することがある。（標識は検出可能なシグナルを
直接又は間接的に提供する分子による。）種々の標識が
利用でき、例えば放射性核種、酵素、蛍光物質、化学ル
ミネッセンス、酵素基質、補助因子もしくは阻害剤、粒
子例えば磁性粒子、リガンドとリセプターとの組合わせ
例えばアビジンとビオチン等がある。他に、このポリペ
プチドを表層例えばマイクロタイタープレート、ガラス
もしくはラテックスビーズ、チューブ、フィルター、ク
ロマトグラフィー表層例えば紙、セルロース、シリカゲ
ル等と結合させるため、種々の方法において改質しうる
ことがある。ペプチドを他の成分又は固相表面に結合せ
しめる特定の方法が常用されており、そして論文におい
て広範囲にわたる例が見い出せる。例えば米国特許第4,
371,515号；第4,487,715号及びその中の引用特許を参照
のこと。試薬、例えばＰ−マレイミド安息香酸、Ｐ−メ
チルジチオ安息香酸、無水安息香酸、無水コハク酸、グ
ルタルアルデヒド、ヘテロ二官能性架橋剤等がこのよう
な目的のために常用されている。
種々のアッセイプロトコールがレトロウィルスタンパ
ク質に対する抗体又はレトロウィルスタンパク質そのも
ののいづれかの存在を検出するために利用しうる。該ペ
プチドは標識剤として利用でき、この場合該標識は検出
可能なシグナルを出す。他方、該ペプチドを表層に直接
又は間接的に固定化することができ、この場合サンプル
中の該ペプチドに対する抗体は該表層上に該ペプチドに
結合するであろう。該ペプチドに結合するヒト抗体の存
在は、ヒトイムノグロブリン（通常ヒトIgG及びIgM）に
対して特異的な異種抗体又は免疫複合体に対して特異的
な標識タンパク質、例えばRf因子もしくはS.アウレウス
（S.aureus）プロテインＡの利用により検出されうる。
種々の異なるプロトコールであって競合的又は非競合
的なプロトコールが利用できる。ペプチドを表層又は支
持体に結合させ、そして標識抗体はサンプル中の抗体
と、一定量の結合ペプチドに対して競合することができ
る。支持体に結合する標識物の量はサンプル中の競合抗
体の量に関連するであろう。
抗体を支持体に結合させ、そしてサンプルを標識ペプ
チドと混合することもできる。この反応混合物と結合抗
体を接触させた後、支持体に結合する標識物の量はサン
プル中の同類抗体の量に関連するであろう。
異種抗ヒト抗体、例えばIgG及びIgM（イムノグロブリ
ン）のFcに対する抗体を支持体に結合させることもでき
る。サンプルをイムノグロブリンと標識ペプチドに接触
させ、これにより該支持体に結合する標識ペプチドの量
は同類抗体の存在の指標となるであろう。
アッセイ技術の例として、免疫濃縮（イムノコンセン
トレーション）例えば濾過があり、ここでは課題のペプ
チド組成物又はそれらのコンジュゲートを固相例えばラ
テックスビーズに、共有的又は非共有的に吸着せしめ
る。サンプル、即ち、生物学的流体のサンプル例えば唾
液、尿、脳脊髄（Cerebrals pinal）流体、血液、血漿
又は血清を、アッセイ媒体であって通常種々の緩衝剤例
えばリン酸、トリス等のうちの１種を利用している水溶
性緩衝化媒体中に希釈する予備処理を施したものを、フ
ィルター膜を有する容器中にて抗原被覆されたラテック
スビーズと、該ペプチドとサンプル中の任意の同類抗体
との間の複合形成のために十分な時間混合せしめる。こ
の上清液をこのフィルターに通過させ、そして被覆ビー
ズが固定化されているこのフィルターを洗浄して非特異
的に結合しているタンパク質を除去する。
この複合体と特異的に結合している、標識された特異
的に結合しているタンパク質を検出のために利用する。
この免疫反応膜にヒトイムノグロブリン、特に抗−（ヒ
トIgG及びIgM）に対する異種抗血清であって適当な緩衝
化媒体中のものを加えることがある。該異種抗血清は通
常検出可能な標識剤、例えば酵素又は放射性核種により
標識されている。抗血清の代わりに免疫複合体に対する
特異的なタンパク質、例えばS.アウレウスプロテインＡ
が利用できるうる。次にこの標識剤を検定する。例えば
酵素の場合、非特異的に結合している酵素標識剤を除去
した後、デベローパー（developer）溶液を加える。該
デベローパー溶液は酵素基質そしておそらく酵素補助因
子、色素原等を含むことがあり、反応により比色的又は
蛍光的に検出されうる比色生成物又は蛍光生成物のそれ
ぞれを提供する。
以下の例は例示であって限定でない目的で提供する。
例１ HIV−１及びHIV−２に対する抗体のチオール脱保護ペプ
チド検定ペプチドの合成 ペプチド39の誘導体を、0.40ミリモルのＰ−メチルベ
ンズヒドリルアミン樹脂（Applied Biosystems Inc.,Fo
ster City,CA）上でｔ−ブチロキシカルボニル保護アミ
ノ酸の遂次的なカップリングにより組立てた。アミノ酸
側鎖の保護は標準のベンジルをベースとする基による。
トリプトファンはホルミル成分により保護した。システ
イン残基の化学的可逆性保護が必要とされる場合、保護
はエチルカルバモイル保護の利用により提供されそして
カップリングはグルタミン又はアスパラギンのために利
用されるのと同様に標準のヒドロキシベンゾトリアゾー
ルエステル化学の利用により達成された。
Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−Ｓ−エチル−カルバ
モイルシステインはＳ＋,GutmannとStoreyら（前記）に
記載の通りに作った。簡単に述べると、15.3mlのトリフ
ルオロ酢酸を24.2gのＬ−システイン（遊離塩基）と200
mlのジメチルホルマミド（DMF）の混合物の中に、０℃
で攪拌しながら滴下した。次にエチルイソシアネート
（17.8ml）を滴下し、そしてこの混合物を室温で18時間
攪拌し続けた。得られる混合物を真空のもとでエバポレ
ートし、そしてこの残留物を180mlの水に溶かした。２
つに分けたエーテル（各100ml）を０℃に冷やし、この
水溶液を洗浄するために用い、そしてpHは水酸化ナトリ
ウムの添加によって、pH7.0に調整した。無水アルコー
ル（550ml）を加え、そしてこの生成物を４℃で一夜結
晶化させた。この結晶化固形物を冷やした20％のエタノ
ール／と水とエーテルで洗浄し、濾過後18.9gのＳ−エ
チルカルバモイルシステインが得られた。
Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル誘導体を作るため、23
gの固形ジ−ｔ−ブチルジカルボネートを、18.9gのＳ−
エチルカルバモイルシステイン、180mlのジメチルスル
ホキシド及び16.4mlのジイソプロピルエチルアミンの混
合物に強く攪拌しながらゆっくりと加えた。この混合物
を室温で２時間攪拌し、その後400mlの氷冷水と100mlの
飽和塩化ナトリウムを加えた。塩酸を加えてこの混合物
のpHを2.0に調整し、そしてこの水性混合物を２つに分
けた200mlのエチルアセテートにより洗浄した。この有
機抽出物を混合し、真空のもとでエバポレートした。こ
の残留物をエチルアセテート／ヘキサンにより再結晶化
させ、その後20％のエタノール／水に再結晶化させた。
19.4gのＮ−ｔ−ブチロキシカルボニル−Ｓ−エチルカ
ルバモイル結晶が得られた。
この最終生成物はシリカゲル上のクロロホルム／酢酸
（15:1）の溶液による薄層クロマトグラフィーにより均
一であることが見い出された;Rf0.25。この生成物の融
点は144〜146℃であり、先に報告されている139〜140℃
と似ている（Storey（前記））。
完成ペプチドを脱保護し、そしてTamら（J.Amer.Che
m.Soc.105:6442,1983）の標準的な高HF工程又は低−高H
F工程により樹脂から分離した。ペプチドを50％の酢酸
中でこの樹脂から抽出し、そしてＧ−25セファデックス
（Sephadex）上での20％の酢酸におけるゲルクロマトグ
ラフィーにかけた。ペプチドを含む画分をプールし、凍
結乾燥した。
免疫学的反応性 ペプチド39及びその類似体を試験管による免疫反応性
についての試験を行い、ここで該ペプチドはラテックス
ビーズ上に吸着又は共有結合により固定化されている。
ラテックスビーズ上でのペプチド39GCの吸着及びペプ
チド39GCの脱保護は、まずこのビーズ（5mg＞IDC＞Inte
rtacial Dynamics Corporation,Portland Oregon,直径
１μｍ）を蒸留水で洗浄し、そして強く攪拌しながら0.
5mlの0.1MのHEPES、pH7.4に再懸濁することにより実施
した。4mg/mlの6MのGuHClストック溶液からの希釈ペプ
チドをこの洗浄ビーズに最終容量550μｌとなる迄加え
た（25〜200μｇのペプチド）。この混合物を30秒間強
く攪拌し、次にやや弱く一夜攪拌し続けた。このビーズ
を1mlの蒸留水で２回洗浄し、次に100μｌの蒸留水に懸
濁し、そして吸着しているペプチドのシステイン残基の
脱保護のために100μｌの0.5NのNaOHを加え直ちに攪拌
した。脱保護は1mlの0.25NのHEPES、pH7.4を加えること
により停止させた。
該ペプチド／ビーズ溶液の空気酸化を室温で一夜行っ
た。フェリシアン化カリウムをこのペプチド／ビーズ溶
液に加え、酸化を完全にした。このチューブを遠心し、
そしてこのビーズを1mlの蒸留水で３回洗浄した。ペプ
チド／ビーズ複合体は直ちに使用することができ、又は
４℃で水性懸濁物として６ケ月迄その反応性を有意に失
うことなく保存できる。
ペプチド39（ここでＸは−OH、Ｙは−NH2そしてシス
テインチオール基はEC保護されていない）をラテックス
ビーズに吸着させる。これは0.9mlの0.2Mのトリス、pH
8.0に再懸濁している洗浄ラテックスビーズ（上記によ
り調製された）に、6Mのグアニジン−HCl中のペプチド3
9の2mg/mlのペプチドストック溶液0.1mlを加えることに
よる。このペプチドラテックスビーズ懸濁物を湯浴で45
℃にて一夜インキュベートさせた。インキュベート後、
このビーズを遠心により回収し、そして0.01NのPBS、pH
7.0で一回洗浄した。
必要ならばペプチド被覆ビーズを非特異的結合の防止
のためにブロックすることがあり、これは0.84％［w/
V］の被覆ビーズの懸濁物20μｌを１％牛血清アルブミ
ン（BSA）1mlに加え、強く攪拌することによる。このビ
ーズは遠心により集められ、そして上清液を除去した。
洗浄段階は遂次的に２回繰り返した。
試験すべき血清又は血漿をサンプル希釈緩衝液（25％
［w/v］の脱脂粉乳、15ppmのカソン（Kathon）CG、0.01
％の消泡法Ａ、0.01Mのリン酸ナトリウムpH7.2、0.15M
の塩化ナトリウム）に1:80で希釈し、そして100μｌを
ブロックしたペプチド／ラテックスビーズコンジュゲー
トにボルテックスにより混合しながら加えた。このサン
プルをペプチド／ラテックスビーズコンジュゲートと15
分間室温でインキュベートし、次に0.9mlの洗浄溶液
（トリス生理溶液、1mM塩化マグネシウム中の0.05％の
ツイーン（Tween）20）を加え、混合し、そして遠心し
てこのペプチド／ビーズコンジュゲートを集めた。ペプ
チド／ビーズコンジュゲートを再度洗浄し、そして遠心
により集め、希釈緩衝液中の1/100希釈抗ヒト1gG、Ａ及
びＭ−アルカリホスファターゼコンジュゲート100μｌ
を室温で15分間にわたり加えた。このペプチド／ビーズ
コンジュゲートを前記と同様再度洗浄した。
このペプチドの免疫反応性をアルカリホスファターゼ
活性により間接的に検出した。酵素用緩衝液（0.1Mのト
リス−HCl/0.1MのNaCl/5mMのMgCl2、pH9.5、0.8ml）を
加え、次に100μｌの基質（酵素用緩衝液中の9mgのＰ−
ニトロフェニルホスフェート）を加えた。基質を37℃で
15分間インキュベートし、そしてこの反応は3Nの水酸化
ナトリウム100μｌの添加により停止させた。このビー
ズを遠心によりペロット状にし、そしてこの上清の分光
光度計において405nmで吸収を測定した。ペプチド39GC
及び脱保護39GCはこのアッセイ形式においてペプチド39
よりも実質的な改良を示した。
一方、ペプチドをカルボキシル末端を介してラテック
スビーズ上に共有結合的に固定化した。カルボキシル末
端コンジュゲーションは39−Ｉで表示されているペプチ
ド39類似体であって、以下の配列： を含んで成るものによって実施した。
システイン残基をエチルカルバモイル保護し、そして
このペプチドを前記の通りに合成した。完成したペプチ
ドを、真空のもとで、攪拌しながら、90％のヒドロフル
オロ酢酸/10％のアニソールを利用して、固相から分離
させた。ヒドロフルオロ酢酸おエバポレートし、そして
この残留物をエチルアセテートで洗浄し、次にこの粗ペ
プチドを6MのGu−HCl/0.4Mのリン酸カリウムに溶かし
た。この粗ペプチドをBlakeらの方法（Int.J.Peptide
Res.1981、17:273、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、78:4055
（両方とも本明細書に参考文献として組入れている））
によりシトラコニル化せしめ、次に炭酸水素アンモニウ
ムにおいてゲル濾過した。得られるペプチド39−1Xはシ
トラコニル化されたアミノ末端とリジン残基、ホルミル
トリプトファン、エチルカルバモイル−システイン及び
Ｃ−末端チオグリシン残基を含んで成る。ペプチド39−
1Xを、カルボジイミド活性を介してカルボキシル化ラテ
ックスビーズ（セラジン（Seradyne、直径1.1μｍ、0.0
1m ez/g）にコンジュゲートされているペンタリジンの
遊離アミノ基とコンジュゲートせしめた。ビーズ懸濁物
のアリコート（0.3ml）を遠心してビーズを集めた。ビ
ーズを蒸留水で１回洗浄し、集め、そして水中のＨ−Ly
s−Lsy−Lys−Lys−Lys−アミドの溶液に懸濁させた。
このpHを5.0〜5.5の間に調整し、次に１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ED
C）を加えた。一夜放置後、このビーズを集め、そして
前記の通り蒸留水で洗浄した。
得られるビーズの半分を硝酸銀と0.1Mのヒドロキシス
トシニミドの水溶液中のペプチド39−1Xのビーズ（37μ
g/mg）により室温で２時間処理した。このビーズを0.2M
のシアン化成で洗浄し、そしてシトラコニル基を除去す
るために一夜15％の水性酢酸に保存した。エチルカルバ
モイル及びホルミル保護基を0.2Nの水酸化ナトリウムに
よる簡単な処理で除去した。システイン残基を一夜空気
酸化し、次にフェリシアン化カリウムによる反応で酸化
を完全にした。
残ったペンタリシンのコンジュゲートしているラテッ
クスビーズを前記と同じ方法であるが但し硝酸銀を加え
ない方法により処理した。得られるビーズは比較のため
のブランクとして働く。
ペプチド39の誘導体もそのアミノ末端により、カルボ
ジイミド活性を介してカルボキシ修飾ラテックスビーズ
（Polysciences）に共有結合的に固定化した。8mgのラ
テックスビーズをマイクロフューズチューブに入れ、そ
して0.5mlの蒸留水を加えた。このビーズを遠心により
集め、そしてその上清を除去した。活性化は0.5mlの0.2
MのEDC（38.2mg/ml）及び0.1MのＮ−ヒドロキシスクシ
ニミド（22mg/ml）を加え、そして90分間室温で回転攪
拌して反応させることにより行った。活性化ビーズを前
記の通りに集め、約50μｌの上清を残しながらこの上清
を除去した。このペレットを分散させ、そして種々の濃
度のペプチド39（190−760μｇ）を含む1MのHEPES、pH
7.5を250μｌ加えた。ペプチドをこの活性化ビーズと室
温で回転攪拌させながら一夜反応させた。前記の通りに
このビーズを集め、そして0.1MのHEPES pH7.5で洗浄し
た。更に２回トリス生理溶液（0.1M、pH7.4）中の１％
のBSAにより洗浄し、そしてこのペプチド／ラテックス
ビーズを１％のBSA/トリス生理溶液0.5mlに再懸濁させ
た。
他方、Ｎ−末端共有結合的固定化をチオエーテル結合
形成を介して行った。ペプチド39−GCをNH2修飾ラテッ
クスビーズ（Pandex,Mundelein,IL）にコンジュゲート
させた。5mgのビーズを蒸留水で１回洗浄し、そして0.1
MのHEPES、pH7.4、200μｌに再混濁させた。Ｎ−スクシ
ニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（SMCC,DMF中にて1mg/100
μl;100μｌ）をこのビーズ懸濁物に加え、そして室温
で常に攪拌しながら２時間反応させた。活性化ビーズを
上記の通りに集め、蒸留水で２回洗浄し、5mMのEDTAを
含む0.1MのHEPES、pH7.4で１回洗浄した。HEPES緩衝液
中の活性化ビーズの懸濁物200μｌを調製し、そして6M
のGuHCl 100μｌ中のペプチド39−GC200μｇを加えた。
コンジュゲーションはローテーターにおいて室温で１夜
行った。ペプチドのコンジュゲートしたビーズを前記の
通りに集め、蒸留水で３回洗浄し、そして蒸留水にて0.
84％に懸濁させた。免疫学的交叉反応を前記の通りに試
験した。
免疫学的交叉反応性を試験する択一的な方法も利用し
た。このような方法の１つにおいて、ペプチド39及び39
GCを米国特許4,629,783号に記載の通りELISAにより試験
した。簡単に述べると、ペプチド39と39−GCのストック
溶液の6MのGu−HCl中にて作り上げた。それぞれの20μg
/ml及び６μg/mlのワーキング溶液を、ストック溶液を
0.05Mの炭酸／重炭酸緩衝液pH9.5で希釈することにより
調製した。マイクロタイターペレートのウエルに該ペプ
チドのワーキング溶液100μｌを加え、室温で一夜放置
した。被覆溶液を除去し、そして0.5Mのエタノールアミ
ンを含む前記のブロッキング溶液300μｌを加え、１時
間室温で放置した。ブロッキング溶液を除去し、そして
このプレートを直ちに使用するか又はその後の使用のた
めに乾燥して保存した。
血漿サンプルをサンプル希釈緩衝液（前記）に希釈し
（表１参照）そして100μｌづつ各ウエルに加えた。サ
ンプルを30分間37℃でインキュベートし、次にこれを除
去し、そしてこれらのウエルを0.15MのNaCl、0.05％の
ツイーン20で６回洗浄した。100μｌのヤギ抗ヒトIg−
西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートをクエン酸
緩衝液、pH7.0、１％の正常ヤギ血清に希釈し、そして
各ウエルに加え、30分間37℃で放置し、前記の通り６回
洗浄した。ELISAアッセイは１ウエル当り100μｌの基質
溶液（クエン酸／リン酸緩衝液pH6.0中における80μg/m
lのテトラメチルベンジニン、0.0015％の水素化ペルオ
キシド）を加え、室温で30分間により行った。反応は１
ウエル当りに100μｌの1NのH2SO4を加えることにより停
止させ、そして630nmに対する450nmの光学密度の比を自
動ELISAリーダーによって測定した。陽性の結果のカッ
トオフ値は、３種類の既知の陰性サンプルから得られる
平均吸光度よりも0.225アブソーバンス単位が高い値に
設定した。表１の結果が示すには、ペプチド39GCはペプ
チド39よりもより高い希釈度で陽性の結果を示すことが
できることがわかった。
別の実験において、チオール保護されているペプチド
39GCは、チオール脱保護ペプチド39GCと比べる際に、ア
ッセイにおいて明らかに低い免疫反応性を示した。同様
の結果がHIV−２ペプチド、41−２−3GCに見られた。
例 II 脱保護されたペプチドを利用するHIV−１に対する抗体
のための 膜濃度（メンブランコンセントレーション）イムノアッ
セイ 種々の既知血清及び血漿サンプルを、本発明の改良方
法及び組成物を利用する改質微粒子アッセイを用い、免
疫学的な交叉反応性についてスクリーンした。本ペプチ
ド組成物をラテックスビーズ上に固定化し、そしてHIV
に対する抗体の検出及び／又は定量のための吸着性材料
の上に置いた微孔性膜上に捕獲せしめた。このようなイ
ムノアッセイ装置及び方法の例は、本明細書に参考文献
として組入れている米国特許4,633,901号及び4,727,019
号に記載されている。この膜濃度イムノアッセイは合計
分間のアッセイ時間を含んで成る３種類のインキュベー
ションを包含する。試験するペプチドを前記の方法によ
りラテックスビーズに収着させた。
各サンプルを、孔径1.2μｍのナイロン膜上において
３点より成る、フィルターユニット上での試験を行っ
た。１点は試験ペプチド／ラテックスビーズ調製品を含
んで成り、１点は陽性の処理コントロールを含んで成
り、そして他は陰性の処理コントロールを含んで成る。
このペプチド／ラテックスビーズ調製品は0.1Mのトリ
ス緩衝液、pH7.2、0.15MのNaCl、0.01MのMgCl2、10％の
スクロース、２％の仔牛血清に懸濁せしめた。膜に0.1
〜0.2％のペプチド／ビーズ調製品の懸濁物をスポット
した。陰性の処理コントロールスポットはBSAの収着に
より被覆されているラテックスビーズを含んで成る。陽
性の処理コントロールスポットはヤギ抗ヒトイムノグロ
ブリンの収着により被覆されているラテックスビーズを
含んで成る。血清又は血漿サンプル（40ml）を希釈緩衝
液（10％の熱処理不活性化正常ヤギ血清、１％の硫酸デ
キストラン、0.2％のツイーン20、2.5％の脱脂粉乳、15
ppmのキヤソンCG、0.005％の消泡剤Ａ、20mMのクエン酸
ナトリウム緩衝液、pH7.4）において1:10で希釈した。
希釈物をこの膜の表面に加え、そして完全に吸着させ
た。添加してから２分経過後、1mlの洗浄緩衝液（0.01M
のトリス−生理溶液、pH6.0、0.05MのNaCl、0.005MのMg
Cl2、0.1％のアジ化ナトリウム、10μg/mlのニトロブル
ーテトラゾリウム、0.5Mのチオシアネートカリウム）を
加え、そして膜にわたって完全に吸収されるようにし
た。約0.150ml（３滴）のヤギ抗−ヒトIg−アルカリホ
スファターゼコンジュゲートを10mMのリン酸緩衝生理溶
液、pH7.4、0.2％のヤギガンマーグロブリン、１％の牛
血清アルブミン、1mMのMgCl2、0.1mMのZnCl2に希釈し、
そしてこの膜に加え、完全に吸収させた。この膜を前記
の通り（2ml）２回洗浄し、そして約0.150ml（３滴）の
基質（1Mの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノー
ル、pH10.3、5mg/mlの３−インドキシルホスフェート）
を加え、そして完全に吸収させた。約５分後、約1mlの
0.5MのEDTA、pH7.4をこの膜に通過させて反応を停止さ
せた。この停止液が完全に吸収された後、このユニット
を反射率によって半定量的又は目視で検定した。
もし陽性コントロールスポットのみが何らかの色の出
現のサインを示し、そして試験スポット及び陰性コント
ロールスポットが全く色の出現を示さなかった場合、結
果は陰性である。陽性の結果は、もし試験スポットがあ
る程度の色の出現を示し（トレース（こくわずか）から
＋４迄）、陽性のコントロールが色の出現を示し、そし
て陰性のコントロールが色の出現を示さない場合に示唆
される。広範囲にわたる陽性、陰性、EIA陽性／ウエス
タンブロット非定形及び免疫感作の検体を、好ましいペ
プチド39類似体、ペプチド39−GCを試験抗原として、試
験を行った。陽性検体は0.5＋から４＋迄の反応性の段
階を示し、そして全ての有効な試験はきれいな白地上に
はっきりと見わけられる色付いたスポットをもたらし
た。陰性のコントロールは全っく色の出現を示せず、そ
して陽性コントロールはおよそ２＋の色調を示した。
1. 自己免疫サンプルは11人のぜん息患者、11人のスジ
ョグレン（Sjogren）症候群患者、７人の全身系紅斑性
狠瘡患者、４人の強直性脊椎炎患者、３人の不明症状及
び15人の雑多な症候群／疾病が含まれている。
2. 黄疸の脂血症の、菌血症の、アルコルビン酸及び種
々の抗凝血処理サンプル。
本発明の種々のペプチド組成物を前記のアッセイ形式
のいくつかを利用して試験した。この結果のまとめを以
下の表に記載した。表３において、非定形サンプルにお
ける、ELISAによるペプチド39と、完全ウィルスELISAで
の膜濃縮イムノアッセイとの比較の結果を示す。11の不
定形サンプルのうちの10個は完全ウィルスELISAにより
陽性と試験され、これらはウエスタンブロットによって
は陽性であると確認できなかった。ペプチド39を固定化
抗原として用いた場合、ELISA及び膜濃縮イムノアッセ
イによりこれら全ては陰性であると見出された。
二種の血清変換（seroconversion）パネルにおける、
完全ウィルスELISAと、ELISA及び膜濃縮イムノアッセイ
によるペプチド39GCナトリウム浴びにELISAによるペプ
チド39Cの結果を表４に示す。ペプチド39GC及びペプチ
ド39は完全ウィルスELISAよりも早く陽性の結果を示し
た。ペプチド39GCはペプチド39よりも早く陽性の結果
を、この血清変換パネルの１種において示した。
例 III 脱保護ペプチドを利用するHIV−２に対する抗体の検出 保護されているシステインチオール基を伴って合成し
たHIV−２ペプチドの免疫反応性を測定した。HIV−２ペ
プチド41−２−３を例１に記載の通りに合成した。Cys
群は保護し、そしてＮ−末端Cys−Gly−Glyを有するペ
プチド41−２−3GCが得られた。EIAを、HIV−１とHIV−
２のウィルスリゼート及びペプチド39GC（HIV−１）と4
1−２−3GCを用い、前記の通り行った。２種のHIV−２
の陽性血清、F504282であってニューヨークにおける患
者及びパスツール研究所（Institut Pasteur）から供給
された「GOM」由来のものの希釈液についての反応性を
調べた。表５において示す結果は、合成ペプチドが明ら
かにHIV−１とHIV−２の相違を区別し、完全ウィルスリ
ゼートEIAから得られる結果に比べ高い特異性の免疫反
応性を特に提供した。
非保護HIV−２ペプチド41−２−３の反応性を、Ｎ−
末端にCys−Gly−Gly延長部を有する脱保護型（41−２
−3GC）及びHIV−２完全ウィルスリゼートと比較した。
このアッセイはHIV−２陽性検体の希釈率を変えたもの
による、前記の一般的なEIAにより行った。代表的な血
清の結果を表６に示す。
例 IV 脱保護ペプチドを用いたHTLV−１に対する抗体の検出 HTLV−１トランスメンブラングリコプロテイン、gp21
の領域は、HIV−１とHIV−２のトランスメンブラン領域
に相当すると同定されており、従って潜在的にイムノド
ミナントである。HTLV−１の既知のアミノ酸配列に基づ
き、合成ペプチドを作った。ペプチドは例１に一般的に
概略した方法に従い合成且つ保護せしめた。アッセイは
例１に一般的に記載の方法に従って行った。その結果を
表６に示す。
ペプチド121−1GC1によるアッセイの結果を、その他
のHTLV−1/II試験例えばポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）、放射性免疫沈殿（RIP）、ウエスタンブロット（W
B）及びウィルスリゼートEIAとの結果と比較した。例II
に記載の方法をペプチド121−1GC1のために利用した
が、ただし２滴のサンプルを離２葉し、そしてコンジュ
ゲートは２倍高い濃度で用いた。このアッセイは、HIV
−１及び／又はHIV−IIに対する抗体を含むと予想され
る10種の血清サンプルにより行った。HTLV−IIのための
PCRアッセイはH.A.EhrlischのPCR Techndogy,Principle
s and Applications for DNA Amplification,Stockton
Press,N,Y,（1989）（本明細書に参考文献として組入れ
ている）に一般的に従って行った。この結果を表７に示
す。
他の実験において、HTLV−I/II陽性個体として予想さ
れている血清パネルに対する種々の型におけるHTLV−Ｉ
ペプチドのスクリーニングは、RIR、ウエスタンブロッ
ト及び市販されているHTLV−Ｉ EIAアッセイにより得
られる結果と比較してよく分からない結果が得られた。
ある試験により陽性となったいくつかのサンプルはペプ
チド121−1GC1により陰性となった。これらの結果は複
数の因子であって、ペプチド121−1GC1により陰性とな
り、その他の評価により陽性となったサンプルは、もと
からウィルスのコア抗原と反応性でありそしてトランス
メンブラングリコプロテイン抗原と反応性でない抗体を
含むこと、を含む要因のためでありうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コールマン，パトリック アメリカ合衆国，ワシントン 98020, エドモンズ，セブンティセブンス アベ ニュ ウエスト 17211 (72)発明者 モンジ，ノブオ アメリカ合衆国，ワシントン 98115, シアトル，ノースイーストナインティエ イス ストリート 3545 (72)発明者 モンタナ，ジョン ピー. アメリカ合衆国，ワシントン 98043, マウントレイクテラス，＃ジェイ―103, トゥ―ハンドレッド トゥエルブス サ ウス ウエスト，4103 (56)参考文献 特開 昭55−162754（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−132900（ＪＰ，Ａ) 特公 昭46−14048（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭60−24120（ＪＰ，Ｂ１) 欧州特許出願公開316769（ＥＰ，Ａ １) Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ｔ．，Ｖｏｌ．30（15），ｐ．1979− 1982（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/155 ZNA C07K 7/08 C07K 7/06 G01N 33/53 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｒ ＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】レトロウィルストランスメンブランタンパ
    ク質に対する抗体と免疫反応性であるペプチドであっ
    て、下記の配列内の８個から26個の連続アミノ酸残基の
    アミノ酸配列から成り、 但し下記の連続アミノ酸配列： を含むことを条件とする、 但し下記の連続アミノ酸配列： を含むことを条件とする、 但し下記の連続アミノ酸配列： を含むことを条件とする、 但し下記の連続アミノ酸配列： を含むことを条件とする、 ここでＸがOH又はNH2であり、Ｙがペプチドの反応性を
    高めるために加えられているアミノ酸を含んで成り、そ
    して該Cys残基のチオール基が高酸性ペプチド切断条件
    に耐性な化学的可逆性手段により可逆的に保護されてい
    る、ペプチド。
  2. 【請求項２】前記ペプチドのCys残基がエチルカルバモ
    イル、アセトアミドメチル、３−ニトロ−２−ピリジン
    スルフィニル又はジフェニル−４−ピリジルメチルによ
    り、酸化から保護されている請求項１に記載のペプチ
    ド。
  3. 【請求項３】Ｎ−末端において高酸性ペプチド切断条件
    に耐性な化学的可逆性手段により可逆的に保護されてい
    ないCys残基を含んで成る、請求項１に記載のペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】前記ペプチドのＮ−末端のアミノ酸配列が
    Cys−Gly−Glyを含んでなる、請求項３に記載のペプチ
    ド。
  5. 【請求項５】前記ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基がア
    ミド化されている、請求項３に記載のペプチド。
  6. 【請求項６】レトロウィルストランスメンブランタンパ
    ク質に対する抗体の免疫学的な検出及び／又は定量のた
    めの、ペプチド被覆されている固相を調製するための方
    法であって、以下のこと： （ａ）請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドを合
    成し； （ｂ）保護されている該ペプチドを固相に固定化し； （ｃ）固定化されている該ペプチドから前記化学的可逆
    性手段を除去し； （ｄ）固定化され、脱保護された該ペプチドを、ジスル
    フィド結合の形成が行われる条件のもとでインキュベー
    トすること； を含んで成る方法。
  7. 【請求項７】前記化学的可逆性保護手段がエチルカルバ
    モイル、アセトアミドメチル、３−ニトロ−２−ピリジ
    ンスルフイニル又はジフェニル−４−ピリジルメチルで
    ある、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記化学的可逆性保護手段がエチルカルバ
    モイルである、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記ペプチドを吸着により固定化する方
    法、請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記ペプチドを共有結合により前記の固
    相に固定化する請求項６に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記固相がラテックス、シリカ、セルロ
    ース、フルオロカーボンポリマー、ナイロン、ポリアク
    リルアミド又はポリスチレンである、請求項６に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】前記固相がシリカ、セルロース、ポリア
    クリルアミド又はポリスチレンのラテックスである、請
    求項６に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記固相がポリスチレンのラテックスで
    ある、請求項11に記載の方法。
  14. 【請求項１４】体液内のHIVウィルスに対する抗体又はH
    IVウィルスの抗原の存在を検出するための方法であっ
    て、以下の段階： （ａ）固相と以下のアミノ酸配列を含んで成る少なくと
    も１種のペプチドとを、固定化が可能な条件のもとで接
    触させ ここで該アミノ酸配列は： であり、ＸはOH又はNH2であり、Ｙは、該ペプチドの反
    応性を高めるために付加されているアミノ酸を含んで成
    り、そしてCys＊は高酸性切断条件に耐性な化学的可逆
    性手段により可逆的に保護されているチオール基を含ん
    で成るシステイン残基である； （ｂ）該固定化されているペプチドの該システインチオ
    ール基から該化学的可逆性保護手段を除去し； （ｃ）該固定化されているペプチドをジスルフィド結合
    の形成の行なわれる条件のもとでインキュベートし； （ｄ）該体液と該固定化されているペプチドとを、反応
    混合物を作るために免疫特異的結合が可能な条件のもと
    で接触させ； （ｅ）免疫特異的結合が該固定化されているペプチドと
    該体液の抗体成分との間に生じたかどうかを検出するこ
    とであって、この免疫特異的結合の検出が該体液内のHI
    Vウィルスの抗体又は抗原の存在を示唆すること； を含んで成る方法。
  15. 【請求項１５】免疫特異的結合が以下の段階： （ａ）前記の免疫反応混合物において形成される反応生
    成物から未結合成分を除去し； （ｂ）該免疫反応混合物に標識した抗体を加える、ここ
    で該標識された抗体は該反応生成物の成分と免疫特異的
    結合が可能であり、そしてこの標識剤は検出可能なシグ
    ナルを提供する；そして （ｃ）該標識した抗体が該反応生成物と結合したかどう
    かを検出すること； により検出される、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記未結合成分の除去の段階が濾過によ
    る、請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記標識剤が、蛍光物質、酵素、ルミネ
    ッセント化合物、ラジオアイソトープ及び粒子より成る
    グループから選ばれる、請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記標識剤が酵素基質の添加により検出
    可能な酵素である、請求項15に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記固相がラテックス、シリカ、セルロ
    ース、フルオロカーボンポリマー、ナイロン、ポリアク
    リルアミド及びポリスチレンより成るグループから選ば
    れる、請求項14に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記固相がポリアクリルアミド、ポリス
    チレン、シリカ及びセルロースのラテックスより成るグ
    ループから選ばれる、請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記固相がポリスチレンのラテックスで
    ある方法、請求項19に記載の方法。
  22. 【請求項２２】HIVウィルスに対する抗体の免疫学的な
    検出及び／又は定量のための抗原被覆固相の調製方法で
    あって、以下の段階： （ａ）請求項１記載のペプチドを合成する； （ｂ）該保護されたペプチドを固相上に固定化する； （ｃ）該保護された固定化ペプチドから該化学的可逆性
    保護手段を除去する；そして （ｄ）該固定化ペプチドを分子内ジスルフィド結合の形
    成が行える条件のもとでインキュベートする； ことを含んで成る方法。
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