JPH04505623A

JPH04505623A - イムノアッセイにおいて利用するためのシステインチオール保護ペプチド

Info

Publication number: JPH04505623A
Application number: JP2510450A
Authority: JP
Inventors: ブレイク，ジェームズ; コール，キャロル―アン; コールマン，パトリック; モンジ，ノブオ; モンタナ，ジョン　ピー．
Original assignee: ジェネティック　システムズ　コーポレイション
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-06-04
Publication date: 1992-10-01
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: KR960013600B1; WO1990015071A1; FI915649A0; DE69032009T2; CA2056381C; DE69032009D1; AU6053290A; FI102834B; EP0474789A1; NO914725D0; ATE162799T1; DK0474789T3; AU652919B2; CA2056381A1; NO914725L; EP0474789B1; KR920701236A; NO304151B1; EP0474789A4; JP3404035B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】イムノアッセイにおいて利用するためのシスティンチオ一本発明はイムノアッセイにおける利用のためのエピトープに擬態するペプチド組成物に関し、そしてより詳しくは天然タンパク質との応答において生成した抗体との高められたエピトープの付与及び高められた特異的な免疫反応性を有する改良ペプチド組成物に関する。

する個体か常用のサンドイッチＥｌ、ＩＳＡ形式のイムノアッセイにより検定されている。これらのアッセイは固定化したウィルスのリゼイトをＨＩＶ抗体を含むと予想される血液又は血清と接触させることを含んで成る。現在市販されている試験用品は有意に血液製品を介してのＨＩＶの伝染性が低められていることが明らかであるが、しかしながらウィルスのリゼートをベースとする試験は複数の明らかなる欠点を有する。

このような欠点には、大量の生存感染性ウィルスを育成且つ操作すること：生存ウィルスが試験材料に混入するおそれがあること；もたらされるリゼートの種々の性質；及び更なる組合せ試験、例えばウェスタンプロットを必要とする誤陽性と誤陰性の実質的に大量な数、が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書に参考文献として組入れているＣｏ５ａｎｄの共有の米特表千４−５０５６２３　（４）国特許第４．６２９．７８３号において、免疫的反応性ウィルスタンパク質エピトープを擬態する複数の合成ペプチドが開示されている。これらの中で、ペプチド３９で表示されているｇｐ４１の２６個のアミノ酸の配列を含んで成るペプチドが、試験した全てのＨＩＶ−１陽性として分っている血清と反応性であり、且つ試験したすべての陰性サンプルと反応性でないことが見出せた。その後、複数のグループがＣｏｓａｎｄにより定義されたペプチド３９領域の重要性がドミナント抗原性決定基を含むものとして認識した。Ｗａｎｇ、Ｊ、Ｊ、Ｇ、らの合成ペプチドはウィルスリゼートよりも有意なる利点を提供する。利点には、特異性、純度、製造の容易さ等が含まれるがそれらに限定されない。潜在的な欠点には、全てのウィルス株を検定するためには複数のペプチドの利用が必要であること；及びもとから小さいペプチドは固相への固定化に基づいて免疫的反応性を失うことが含まれる。

免疫アッセイによって固定化抗原として利用される小さなペプチドは一般に固相方法により合成される。ここで該ペプチドを占める各アミノ酸は、成長するペプチド鎖を不溶性の樹脂支持体上に固定しながら、保護されている形において遂次的に加えていく。合成工程の際中、成長する鎖を占める一定のアミノ酸の側鎖は保護されている。これらは種々の化学基によりブロックされ、これは完成したペプチドを通常濃フッ化水素酸又はトリフルオロ酢酸との反応により不溶性樹脂支持体から除去する迄残り続ける。分離にわたり、はとんど保護基が除去され、そして完成したペプチドは当業界に既知化せしめる。これらの方法には、直接のコンジュゲーション、分子とのコンジュゲーション、又は固相への直接吸着によることが含まれる。米国特許第４．６２９．７８３号に複数のこれらの方法の例が開示されている。

ＨＩＶ−２のｇｐ３６タンパク質由来のエピトープを擬態するペプチド、ＨＩ　Ｖ−１のｇｐ４１のレトロウィルス機能に相当すると思われるグリコプロティンが、本明細書に参考文献として組入れている共同米国特許出願ＵＳＳＮ　０３０，４０３号及びＬＩＳＳＮ　０３５．４０８号（それぞれ１９８７年３月２５日及び１９８７年４月７日に出願）に開示されている。この中で、４１−２−１として表示されているペプチドであって、ＨＩＶ−１におけるペプチド３９と類似する領域をコード化する２６個のアミノ酸を含んで成るものが、試験した全てのＨＩＶ−２陽性と分かっている血清と反応し、且つ試験した陰性サンプルとは適当なカットオフ値を越えて反応することはなかった。ペプチド４１−２−１の短い型であって４１−２−３で表示され、ペプチド４１−２−１のカルボキシル側のアミノ酸残基を含んて成るものも、ＨＩＶ−２血清と反応性であることが見出され、そしであるケースにおいてはそれらはペプチド４１−２−１よりも優れていた。

ペプチド３９．４１−２−１及び４１−２−３のそれぞれはそのアミノ酸配列の中に２個のシスティン残基を含む。ペプチド配列中にシスティン残基があることは分子内及び分子外のジスルフィド結合の形成を、脱保護したペプチドの精製、固定化及び長期保存にわたり可能とする。従って、このようなペプチド組成物は通常、種々のサイズのモノマー、ダイマー及びポリマーを含む種々の酸化型の混合体として固相上に固定化されている。固相上に固定化するペプチドの酸化の型を調節するための予備注意は一般にされない。Ｒｏｓｅｎ、　Ｊ　。

■、ら（ＷＯ８７１０６００５）は、Ｃｏｓａｎｄにより同定されたＨＩＶ−１の高い抗原性領域由来の一定のペプチド（前記）であって複数のシスティン残基を含むものは、種々の酸化型の混合として固定されているものと認識し、そしてペプチド、特にポリマーの酸化の型はるるペプチドの反応性のためには重要でありうることを示唆している。Ｒｏｓｅｎ、らはある場合において、一定のペプチドの環状型はポリマー型に比べて固形表面への結合が効率的でないことを開示している。これらのペプチドの種々の酸化型は感度を有するイムノアッセイにおける多彩性の起源となることができ、そしてこれはそれらのアッセイに基づく結果にも影響を及ぼすことがある。

従って当業界においては、反応性を良くする、そしてできるだけわずかな誤陰性及び誤陽性結果を提供するペプチド組酸物の要求か顕著に存在する。

発明の概略ＨＩＶウィルス又はＨＩＶウィルスに対する抗体の検出において有用な改良ペプチド組成物を提供する。ペプチドの酸化型をコントロールすることが可能な改良ペプチド組成物の製造のための方法も提供し、この方法は、イムノアッセイ方法における抗原として、前記の組成物を、固相への固定化の前後に含んで成る。酸化の型のコントロールは特異的且つ高感度に測定される改良された免疫反応性を有するペプチド組成物を提供する。ペプチドは標準の固相ペプチド合成方法を利用して合成されるが、ただし通常用いられるシスティンチオール基のＳ−ベンジルブロッキングの代わりに高い酸性分解条件に耐性の化学的可逆性保護手段を利用している。化学的可逆性の保護基には、例えばエチルカルバモイル、アセタミドメチル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフィニル、ジフェニル−４−ビリジルーメチル等が含まれる。

アミノ酸配列の組立後にシスティンチオール基の可逆性保護を提供する際には異なる態様がある。ペプチドの保護の前のペプチド組成物の還元が、保護前にジスルフィド結合が残っていないことを確実にするために必要である。また、システィンチオール保護基は固定化前に除去することがあり、ここではペプチドの脱保護及び酸化は、この酸化されたペプチド組成物の固相への固定化の前に溶液中において行われる。

酸化のだめの条件は、分子内ジスルフィド結合の形成が好ましいように選ばれ、即ち、それは非常に希薄であって中性から弱アルカリ性の条件である。

本発明のある態様において、該ペプチドは一般に以下のアミノ酸配列を含んで成る。：（Ｉ）Ｙ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ”− Ｘ　；（ＩＩ）Ｙ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ａ　ｌａ−Ｅ　１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ−Ａｓ　ｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−１，ｅｕ−Ａｓｎ− Ｓｅｔ−Ｔｒｌ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−’Ｃｙｓ”−Ｘ　；又は（ＩＩＩ）Ｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃ）’ｓ” −ＸここてＸはＯＨ又はＮＨ２であり、Ｙは該ペプチドの反応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ”は化学的可塑性手段により保護されているチオール基を含んで成るシスチン残基である。特に好ましい態様はＸがＣｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙの配列の場合である。

広範囲のイムノアッセイプロトコールがペプチド組成物を利用でき、ここでペプチドは溶液中か又は固相上に固定化されつる。種々の固相が利用でき、それにはシリカ、セルロースフルオロカーボンポリマー、ポリアクリルアミド及びポリスチレンのラテックス（微粒子）が含まれる。固相、例えばシリカ、セルロース、フルオロカーボンポリマー、ナイロン、ポリアクリルアミド及びポリスチレンを含んで成る固相も利用できうる。固相への固定化は吸着又は共有結合のいづれかにより行われつる。

体液におけるＨＩＶウィルス又はＨｉＶウィルスの抗原に対する抗体の存在を検出するための本発明において開示する第１のイムノアッセイプロトコールは一般に以下の段階、（ａ）固相と、以下のアミノ酸配列：（Ｉ）Ｙ−Ａｒｇ＝ｆｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ”− Ｘ　；（ＩＩ）Ｙ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ−Ａ　ｌａ−ｒ　１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｒ、、−Ａｓ　ｐ　−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ”−Ｘ　；又は（ＩＩＩ）Ｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　”−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ” −Ｘ（ここでＸはＯＨ又はＮＨ２であり、Ｙは該ペプチドの反応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ”は化学的可逆性手段により保護されているチオール基を含んで成るシスティン残基である）を含んで成る少なくとも一種類のペプチド組成物とを、固定化が可能な条件のもとで接触させ：　（ｂ）該化学的可逆性の手段をこの固定ペプチドのシスティンチオール基から除去し、（Ｃ）該固定化ペプチドをジスルフィド結合の形成を行うための条件下にてインキュベートし：　（ｄ）反応混合物を作るために体液と該固定化ペプチドとを免疫学的特異的結合を可能とする条件のもとで接触させ；　（ｅ）該固定化ペプチドと該体液の抗体成分との間に免疫学的特異的結合が生じたかどうかを検出することであって、この免疫学的特異的結合の検出は該体液中のＨＩＶウィルスに対する抗体の存在を示すこと；を含んで成る。

第２のイムノアッセイ形式は、以下の段階、（ａ）システィンチオール基の化学的可逆性保護基を除去し；　（ｂ）脱保護せしめたペプチドを、ペプチド組成物を形成するために分子内ジスルフィド結合の形成を行う条件のもとてインキュベ −１４，；　（ｃ）該ペプチド組成物を固相上に固定化し；　（ｄ）反応混合物を作るために体液と該固定化ペプチド組成物とを免疫学的特異的結合を可能とする条件のもとで接触させ；そして（ｅ）該固定化ペプチドと該体液の抗体成分との間に免疫学的特異的結合が生じたかどうかを検出することであって、この免疫学的特異的結合の検出は該体液中のＨｒＶウィルスに対する抗体の存在を示す；ことを含んで成る。

免疫学的特異的結合は、未結合の成分を該免疫反応混合物において形成された反応生成物から除去し、該免疫反応混合物に標識抗体を加えることにより検出することができ、該標識抗体は該反応生成物の成分に免疫学的特異的に結合することか可能であり、そしてこの標識は検出可能なシグナルを提供する。未結合の成分は濾過により該反応混合物から除去されることかできる。

本発明の他の態様は以下の詳細を説明及び添付した請求の範囲の参照に基づいて明らかとなるであろう。

■、特定の態様の説明本発明は抗体又は抗原の定量及び／又は検出のためのイムノアッセイ方法において利用するための改良ペプチド組成物に関する。ある態様においてこのペプチドはウィルス抗原又は去れに対する抗体、より詳しくはレトロウィルス、例えばＨＩＶ−１及びＨｒ　Ｖ−２並びに関連するレンチウィルスの科に関連する抗原又は抗体の検出において利用される。本発明に従って作られるその他の具体的なペプチドはＨＴＬＶ−■及びＨＴＬＶ−１１のエピトープ領域を擬態する。

ペプチドは、タンパク質を異種の宿主に導入することにより作られ、抗体と結合可能なことによって同定されつる。複数の例において、Ｃｙｓ残基は抗体を認識し且つ結合するペプチドのエピトープの一部を占める。ペプチドの合成の陣中でのＣｙｓ残基の保護基は該ペプチドの酸化型の形成を妨げ、そして例えば高い感度及び／又は特異性により測定される改良されたペプチド免疫反応性を提供する。

本発明のペプチド組成物はその配列内に化学的に修飾されたシスティン残基を有し、従って反応、例えば酸化から可逆的に保護されている。従って、本発明において有用なペプチドは一般に少なくとも２個のＣｙｓ残基を有し、これは天然タンパク質により作られた抗体に結合可能なペプチドの形態に貢献する。分子内結合を形成するために、Ｃｙｓ残基は少なくとも１個のアミノ酸残基により、一般には少なくとも２個、そしてより通常には約３から約１５個以上のアミノ酸残基により離されている。ある好ましい態様において、このＣｙｓ残基は約５〜８個の残基により離されている。鎖内ジスルフィド結合の形成により、連結したＣｙｓ残基は輪又は環状ペプチド領域を表わし、これは高い免免反応性において重要でありうる。

本発明のペプチドは広範囲の方法において作られうる。このペプチドは一般に約６個から約５０個のアミノ酸残基に範囲し、より典型的には約６個から約３５個のアミノ酸残基に範囲する。それらが比較的短い長さであるため、それらは常用の技術に従って溶液中又は固形支持体上にて合成されうる。

例えばＳ　ｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ、　Ｓ　ｏｌｉｄ　Ｐ　ｈａｓｅ　Ｐ　ｅｐｔｉｄｅＳ　ｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　１９８４；及びＴａｎらの１９８３．　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１０５　：６４４２てあって本明細書に参考文献として組入れているものを参照のこと。

他方、形質転換真核宿主細胞又は原核宿主細胞における所望ペプチドの発現のためにバイブリドＤＮＡ技術も利用できうる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの、Ｍ　ｏ　１ｅｃｕ　ｊａｒ　Ｃｌ　ｏｎ　ｉｎｇ。

Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、　Ｙ、　１９８２　（本明細書に参考文献として組入れている）を参照のこと。むろん、ペプチドは少なくとも６個のアミノ酸、典型的には１０個以上から２００個以上程度の配列を意味し、全くのタンパク質を含むことか理解されるであろう。発現されたペプチドを、次に本明細書に詳細の通りに単離且つ保護できる。

本ペプチドのシスティンチオール側鎖の可逆性の化学的保護は、該ペプチド組成物の化学合成によるペプチド配列の組立の間に実施することもできる。本ペプチド組成物を標準的な固相技術により組立てる際、アミノ酸の付加サイクルの間に利用される条件に対する耐性のため、そして該ペプチドを樹脂系の固相から分離させるために利用する高濃度の酸に対する耐性のために化学的可逆性の保護手段が選ばれる。複数の有用なチオール保護基の中で、特定の合成のための選択は合成すべきペプチドの構造及びその他の合成すべき保護又はブロッキング基の性質、並びに該樹脂から該ペプチドを分離するために選ばれる特定の試薬に依存しがちである。本発明において利用するために適切な保護手段には、例えばアセタミドメチル（Ｓ　ｔｅｗａｒｔ、！：Ｙｏｕｎｇ　（前記））、３−ニトロ−２− ピリジンスルフィニル（Ｍａｔｓｕｅｄａらの、１９８６、Ｉｎｔ。

Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、２８　：　１６７：　Ｒｉｄｇｅ、Ｒ，Ｊ、らの１９８６、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、１且：　４９０）及びジフェニル−４−ピリジルメチル（Ｃｏｙｌｅ、Ｓ、らの、１９７６、Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、ｐｇ　−９８０）が含まれる。特に好ましい保護基は５−（Ｎ−エチルカルバモイル）である。

Ｓ　ｔ、　Ｇｕｔｍａｎｎ　（Ｈｅｌｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　（１９６６）　４９　：　８３　）及び５ｔｏｒｅｙ　Ｈ，Ｔ、ら（Ｊ　、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃ、　（１９７２）　９４　：６１７０）を参照のこと。

以上の論文はそれぞれ本明細書において参考文献として組入れている。

他方、該システィンチオール基はアミノ酸配列の構成後に可逆的に保護してもよい。この態様において、精製されているかてなければ豊富な、環状もしくはポリマー型のペプチドを、あったとしてもわずかのジスルフィド結合を残すことを確実にするために該ペプチドの保護の前に還元せしめる。

チオール保護されているペプチドをイムノアッセイにおける利用のために脱保護する。該ペプチドは溶液において、遊離もしくは担体と結合しているいづれかにおいて、固相へ吸着している状態において利用されつる。該ペプチドを固相に結合させる場合にはシスティンチオール保護基を固定化前に除去することがあり、ここで該ペプチドの脱保護及び酸化は溶液中にて行われる。脱保護の手段は利用する広範囲の特定の保護基に関連し、これは当業者に周知である。他方、脱保護及び酸化は固定化の陣中又は後に行うこともある。酸化のための条件は好ましい分子内ジスルフィド結合の形成のために選ばれ、即ち、それは非常に希薄であり且つ中性から弱アルカリ性の条件である。

ＨＩＶ、特にＨＩＶ−１に対する抗体の検出及び／又は定量のため、ＨＩＶ−１グリコプロティンｇｐ４１を掻体することが可能な例示的ペプチドは以下のペプチド配列を含む（ここでこの配列における少なくとも約７個以上、約５０個未満のアミノ酸のオリゴペプチドが含まれる）：Ｙ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ”−Ｘ　；（ここでＸはＯＨ又はＮＨ２であり、Ｙは該ペプチドの反応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ”は化学的可逆性な手段により保護されているチオール基を含んで成るシスティン残基である）。

ＨＩＶ−２に対する抗体の検出及び／又は定量のため、ＨＩＶ−２グリコプロティンｇｐ３６を擬態することが可能な例示的ペプチドは以下のペプチド配列を含む（ここでこの配列における少なくとも約７個以上、約５０個の未満のアミノ酸のオリゴペプチドが含まれる）：（ＩＦ）Ｙ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｔｈ　ｒ−Ａ　ｌａ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｙ　５ −Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　１−Ａｓ　ｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ”−Ｘ　；又は（ＩＩＩ）Ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　１ｎ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　１ｙ−Ｇｙｓ　”　−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ”−Ｘ（ここでＸはＯＨ又はＮＨ２であり、Ｙは該ペプチドの反応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ” は化学的な可逆性な手段により保護されているチオール基を含んで成るシスティン残基である）。

ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−１１＋ニ一対する抗体ノ検出及ヒ／又は定量のため、ＨＴＬＶ−Ｉ及び−Ｕのトランスメンプラングリコプロティン（共にｇｐ２１で表示されている）を擬態することが可能な例示的ペプチドは以下のペプチド配列を含む（ここでこの配列において少なくとも約７個以上、約５０個未満のアミノ酸のオリゴペプチドか含まれる）。

ＩＶ　（ＨＴＬＶ−１）Ｙ−Ｇ　１ｎ−Ａ　ｓ　ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　”　−Ｌｙｓ　−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ”−Ｘ　；及びＶ　（ＨＴＬＶ−Ｉｆ）Ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓ　ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒ　ｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇｌｙ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　”−Ｌｙｓ−Ａ　Ｌａ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　１ｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ− Ｃｙｓ”−Ｘ　：　禰４ｋ（ここでＸはＯＨ又はＮ　Ｈｚてあり、Ｙは該ペプチドの反応性を高めるために付加されている更なるアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ”は化学的可逆性手段により保護されているチオール基を含んで成るシスティン残基である）。

本発明のペプチド組成物は、本組成物がエピトープを擬態でき、従って天然タンパク質例えば少なくとも１種類の株のＨＩＶ−１のｇｐ４１グリコプロティン又は少なくとも１種類の株のＨＩＶ−２の天然ｇｐ３６グリコプロテインとある程度の免疫学的競合を提供できる限り、任意のタンパク質又はレトロウィルス配列と同一である必要はない。

例えば、注目のペプチドをその中に保存性又は非保存性置換基を導入することにより改質されうる。通常このアミノ酸の数の２０％より少ない数、より通常には１ｏ９６より少ない数が交換される。天然タンパク質、例えば異種のレトロウィルス株の異なったエピトープをより効果的に擬態するために１又は複数の特定のアミノ酸を変えることが望ましいことがある。

従って本ポリペプチドは種々の変化、例えば挿入、欠失及び保存性又は非保存性のいづれかによる置換であってこのような変化かその利用において一定の利点を提供するような変化にかけることかある。保存性による置換は例えばｇｌｙ。

ａｌａ　；　ｖａｌ、ｉｌｅ、　ｌｅｕ　：ａｓｐ、　ｇｌｕ；ａｓｎ、　ｇｉｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、　ａｒｇ＋及びｐｈｅ、　ｔｙｒ；の組合せを意図する。通常、該配列はＨＩＶに基づく少なくとも１株の配列より　２０％以上相違しないことが必要であるが、ただし本ペプチドを例えば容易に固定化する「アーム」を提供せしめるためにいづれかの末端に更なるアミノ酸を付加することがある。

更に、本ペプチド配列は、アシル化、例えばアセチル化による末端ＮＨ２の修飾、又はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシアミド化例えばアンモニア、メチルアミン等により天然配列と異なることがある。ある場合において、これらの修飾は支持体又はその他の分子のための部位を提供しうる。

上記の通り、アミノ酸アームを該ペプチド又はオリゴペプチドのＣ−及び／又はＮ−末端に付与することがある。必要ならば、該アームは１個から５０個（又はそれ以上）のアミノ酸、より通常には１〜１０個のアミノ酸、そして好ましくは合成の容易さのために５個より少ないアミノ酸でありうる。

該アームは種々の目的、例えばスペーサー、として、ペプチドを担体に結合させる、ペプチドを固相に固定させる等のために働く。担体、固相と結合するため又は高次構造、例えばダイマー、トリマーもしくはその他の複合体のために有用な機能を提供するため、アミノ酸例えば千ロジン、システィン、アスパラギン酸等を該アーム又はペプチドのＣ及び／又はＮ−末端に導入せしめる。特に注目されるエピトープを高める手段は、Ｃ−及び／又はＮ−末端での１〜１０個のアミノ酸の存在、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の存在、そして最も好ましくは１〜３個のアミノ酸の存在である。本明細に詳細のあるペプチドの特に好ましい態様は、３個のアミノ酸がアームとして一般にＮ末端にて付加され、そして該アームのＮ−末端残基が好ましくはＣｙｓである場合に得られる。例示的な態様において該ペプチドと末端官能基との間のスペーサー残基はＧｌｙである。従って特に好ましいペプチドはＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含んで成るアームを有し、ここでＣｙｓはＮ−又はＣ−末端残基である。末端Ｃｙｓ酸基はジスルフィド結合を介してジチオもしくはチオ官能性支持体、又はトリオエーテル結合を介して活性化すレフイン支持体と結合することもてきる。

ＨＩＶ−１に対する抗体を検出するために特に注目されているペプチド配列は前記のＣｏｓａｎｄにより定義されているペプチド３９の配列に由来する。ペプチド３９０Ｃは前記のペプチド３９の２６個のアミノ酸を含んで成り、ここでＹはＣｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｔｙ−の配列を含んで成りそしてＸは−ＮＨ２を含んで成る。従ってこのペプチドは以下のアミノ酸配列を含んで成る。

ペプチド　３９ＧＣＣｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ＩＹ−Ａｒｇ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｖａ　Ｉ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−３ｅｒ−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ”−ＮＨｚ（ここでＣｙｓ“は化学的可逆性手段により保護されているシスティン残基である。）同様にＨＩＶ−２に対する抗体を検出するために特に注目されているペプチド配列はペプチド４１−２−１の配列に由来し、ここでＹは配列Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙを含んで成り、そしてＸは−ＮＨ，を含んで成る。このペプチドは従って以下のアミノ酸配列により表わされる：ペプチド　４ｌ−２−ＩＧｃＣｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ａ　ｌａ−ＩＩ　ｅ −Ｇ　１ｕ−Ｌｙ、ｓ　−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　”−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ”−ＮＨ２（ここでＣｙｓ”は化学的可逆性手段により保護されているシスティン残基である。）ペプチド４　ｌ−２−３０Ｃは前記の４１−２−３の配列を含んで成り、ここでＹは配列Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙであり、そしてＸはＮＨ２であり、以下のアミノ酸配列により表わされる：ペプチド　４ｌ−２−３ＧＣＣｙ　ｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇｉｎ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇ　１ｙ−Ｃｙｓ”−Ａｌａ−Ｐｈｅ− Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ”−ＮＨ２（ここでＣｙｓ”は化学的可逆性手段により保護されているシスティン残基である。）ＨＬＶ−Ｉに対する抗体を検出するために特に注目されているペプチド配列はペプチドＩＶのｇｐ２１配列に由来する。

好ましい態様におけるペプチド１２１−ＩＧＣＩにおいて、Ｙは配列Ｃｙｓ　− Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｙ−を含んで成り、そしてＸは−ＮＨ，を含んで成る。従ってこのペプチドは以下のアミノ酸配列で表わされる：１２１−ＩＧｃＩＣｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｎ−Ａ　ｓ　ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｐｈ　ｅ−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙ　ｓ　”−Ｌｙｓ　−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ”−ＮＨ２゜（ここでＣｙｓ”は化学的可逆性手段により保護されたシスティン残基である）。

ＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体を検出するために特に注目されているペプチド配列はペプチドＶのｇｐ２１配列に由来する。

好ましい態様におけるペプチド２２１−ＩＧＣＩにおいて、ＹはＣｙｓ−Ｇｔｙ −ＧＩＹ−を含んで成り、そしてＸは−ＮＨ２を含んで成る。従ってこのペプチドは以下のアミノ酸配列により成る：２２１−ＩＧＣＩＣｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　”−Ｌｙ　ｓ　−Ａ　１ａ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇ］、ｎ−Ｃｙｓ　”−ＮＨ２゜（ここてＣｙｌは化学的可逆性手段により保護されているシスティン残基である）。本明細書記載のＨＴＬＶ−Ｉと−Ｉ！ＩＹチドとの実質的な配列の同一性に基づき、ある程度の交叉反応かこれらペプチドの間に予想されることか理解できる。

本発明に従って作られたペプチドにおけるイムノアッセイについての形式は抗体か抗原を測定するかに依存して利用される。抗体又は抗原を検出するためにデザインされているイムノアッセイ形式は当業界において周知である。しかしながら、サンプルを該ペプチドと反応させる前又はその原生に、該ペプチドの化学保護基を除去し、そしてこの脱保護ペプチドをジスルフィド結合の形成か行なえる条件のもとてインキュベートする。該ペプチドを固相に固定化せしめるアッセイ形式においては、固定化の前又は後に該ペプチドのシスティン残基は分子内ジスルフィド結合の形成を行なえる条件のもとて溶液中にて脱保護することができつる。

該ペプチド組成物はその用途に基づき標識しないか又は標識することがある。（標識は検出可能なシグナルを直接又は間接的に提供する分子による。）種々の標識が利用でき、例えば放射性核種、酵素、蛍光物質、化学ルミネッセンス、酵素基質、補助因子もしくは阻害剤、粒子例えば磁性粒子、リガンドとりセプターとの組合わせ例えばアビジンとビオチン等がある。他に、このポリペプチドを表層例えばマイクロタイタープレート、ガラスもしくはラテックスビーズ、チューブ、フィルター、クロマトグラフィー表層例えば紙、セルロース、シリカゲル等と結合させるため、種々の方法において改質しうろことがある。ペプチドを他の成分又は固相表面に結合せしめる特定の方法が常用されており、そして論文において広範囲にわたる例が見い出せる。例えば米国特許第４、３７１．５１５号：第４．４８７．７１５号及びその中の引用特許を参照のこと。試薬、例えばＰ−マレイミド安息香酸、Ｐ−メチルジチオ安息香酸、無水安息香酸、無水コハク酸、グルタルアルデヒド、ヘテロ三官能性架橋剤等がこのような目的のために常用されている。

種々のアッセイプロトコールかレトロウィルスタンパク質に対する抗体又はレトロウィルスタンパク質そのもののいづれかの存在を検出するために利用しうる。

該ペプチドは標識剤として利用でき、この場合該標識は検出可能なシグナルを出す。他方、該ペプチドを表層に直接又は間接的に固定化することができ、この場合サンプル中の該ペプチドに対する抗体は該表層上に該ペプチドに結合するであろう。該ペプチドに結合するヒト抗体の存在は、ヒトイムノグロブリン（通常ヒトＩｇＧ及びＩｇＭ）に対して特異的な異種抗体又は免疫複合体に対して特異的な標識タンパク質、例えばＲｆ因子もしくはＳ、アウレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡの利用により検出されつる。

種々の異なるプロトコールであって競合的又は非競合的なプロトコールが利用できる。ペプチドを表層又は支持体に結合させ、そして標識抗体はサンプル中の抗体と、一定量の結合ペプチドに対して競合することができる。支持体に結合する標識物の量はサンプル中の競合抗体の量に関連するであろう。

抗体を支持体に結合させ、そしてサンプルを標識ペプチドと混合することもできる。この反応混合物と結合抗体を接触させた後、支持体に結合する標識物の量はサンプル中の同類抗体の量に関連するであろう。

異種抗しト抗体、例えばｒｇＧ及びｒｇＭ（イムノグロブリン）のＦｃに対する抗体を支持体に結合させることもてきる。サンプルをイムノグロブリンと標識ペプチドに接触させ、これにより該支持体に結合する標識ペプチドの量は同類抗体の存在の指標となるであろう。

アッセイ技術の例として、免疫濃縮（イムノコンセントレージョン）例えば濾過があり、ここでは課題のペプチド組成物又はそれらのコンジュゲートを固相例えばラテックスビーズに、共有的又は非共有的に吸着せしめる。サンプル、即ち、生物学的流体のサンプル例えば唾液、尿、脳を髄（Ｃｅｒｅｂｒａｌｓ　ｐｉｎａｌ）流体、血液、血漿又は血清を、アッセイ媒体であって通常種々の緩衝剤例えばリン酸、トリス等のうちの１種を利用している水溶性緩衝化媒体中に希釈する予備処理を施したものを、フィルター膜を有する容器中にて抗原被覆されたラテックスビーズと、該ペプチドとサンプル中の任意の同類抗体との間の複合形成のために十分な時間混合せしめる。この上清液をこのフィルターに通過させ、そして被覆ビーズか固定化されているこのフィルターを洗浄して非特異的に結合しているタンパク質を除去する。

この複合体と特異的に結合している、標識された特異的に結合しているタンパク質を検出のために利用する。この免疫反応膜にヒトイムノグロブリン、特に抗− （ヒトＩｇＧ及びＩｇＭ）に対する異種抗血清であって適当な緩衝化媒体中のものを加えることかある。該異種抗血清は通常検出可能な標識剤、例えば酵素又は放射性核種により標識されている。抗血清の代検定する。例えば酵素の場合、非特異的に結合している酵素標識剤を除去した後、デベローパ−（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）溶液を加える。該デベローパー溶液は酵素基質そしておそらく酵素補助因子、色素原等を含むことかあり、反応により比色的又は蛍光的に検出されつる比色生成物又は蛍光生成物のそれぞれを提供する。

以下の例は例示であって限定でない目的で提供する。

例Ｉペプチド３９の誘導体を、０．４０ミリモルのＰ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、。

Ｆ　ｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、　ＣＡ　）上でｔ−ブチロキシカルボニル保護アミノ酸の遂次的なカップリングにより組立てた。アミノ酸側鎖の保護は標準のベンジルをベースとする基による。トリプトファンはホルミル成分により保護した。

システィン残基の化学的可逆性保護が必要とされる場合、保護はエチルカルバモイル保護の利用により提供されそしてカップリングはグルタミン又はアスパラギンのために利用されるのと同様に標準のヒドロキシベンゾトリアゾールエステル化学の利用により達成された。

Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−３−二チルーカルバモイルシスティンはＳ　＋　、　Ｇ　ｕｔｍａｎｎと５ｔｏｒｅｙら（前記）に記載の通りに作った。簡単に述べると、１５．３ｍｌのトリフルオロ酢酸を２４．２ｇのＬ−システィン（遊離塩基）と２００ｍ１のジメチルホルマミド（ＤＭＦ）の混合物の中に、０° Ｃで攪拌しながら滴下した。次にエチルイソシアネート（１７，８ｍ１）を滴下し、そしてこの混合物を室温で１８時間攪拌し続けた。得られる混合物を真空のもとでエバポレートし、そしてこの残留物を１８０ｍ１の水に溶かした。２つに分けたエーテル（各１００ｍ１）を０℃に冷やし、この水溶液を洗浄するために用い、そしてｐＨは水酸化ナトリウムの添加によって　ｐＨ７，０に調整した。

無水アルコール（５５０ｍｌ）を加え、そしてこの生成物を４℃で一夜結晶化させた。この結晶状固形物を冷やした２０９６のエタノール／水とエーテルで洗浄し、濾過後１８．９ｇのＳ−エチルカルバモイルシスティンが得られた。

Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル誘導体を作るため、２３ｇの固形ジーｔ−プチルジカルボネートを、１８．９ｇのＳ−エチルカルバモイルシスティン、１８０ｍ１のジメチルスルホキシド及び１６．４ｍｌのジイソプロピルエチルアミンの混合物に強く攪拌しながらゆっくりと加えた。この混合物を室温で２時間攪拌し、その後４００ｍ１の氷冷水と１００ｍ１の飽和塩化ナトリウムを加えた。塩酸を加えてこの混合物の　ｐＨを２．０に調整し、そしてこの水性混合物を２つに分けた２００ｍ１のエチルアセテートにより洗浄した。この有機抽出物を混合し、真空のもとでエバポレートした。この残留物をエチルアセテート／ヘキサンにより再結晶化させ、その後２０％のエタノール／水により再結晶化させた。１９．４ｇのＮ−ｔ〜ブチロキシカルボニル−３−エチルカルバモイル結晶が得られた。

この最終生成物はシリカゲル上のクロロホルム／酢酸（１５：１）の溶液による薄層クロマトグラフィーにより均一であることが見い出された；ＲｆＯ，２５゜この生成物の融点は１４４〜１４６°Ｃであり、先に報告されている１３９〜１４０℃と似ている（　Ｓ　ｔｏｒｅｙ　（前記））。

完成ペプチドを脱保護し、そしてＴａｍら（Ｊ、　Ａｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１０５：　６４４２．１９８３”）の標準的な高ＨＦ工程又は低−高ＨＦ工程により樹脂から分離した。ペプチドを５０％の酢酸中でこの樹脂から抽出し、モしてＧ−２５セフアデツクス　（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）上での２０％の酢酸におけるゲルクロマトグラフィーにかけた。ペプチドを含む画分をプールし、凍結乾燥した。

免疫学的反応性ペプチド３９及びその類似体を試験管による免疫反応性についての試験を行い、ここで該ペプチドはラテックスビーズ上に吸着又は共存結合により固定化されている。

ラテックスビーズ上でのペプチド３９０Ｃの吸着及びペプチド３９０Ｃの脱保護は、まずこのビーズ（５ｍｇ＞ＩＤＣ＞Ｉｎｔｅｒｔａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ　Ｏｒｅｇｏｎ。

直径１μｍ）を蒸留水で洗浄し、そして強く攪拌しながら０．５ｍｌの０．１ＭのＨＥＰＥＳ　、　ｐＨ７，４に再懸濁することにより実施した。４ｍｇ／ｍｌの６ＭのＧｕＨＣｌストック溶液からの希釈ペプチドをこの洗浄ビーズに最終容量　５５０μｌとなる迄加えた（２５〜２００μｇのペプチド）。この混合物を３０秒間強く攪拌し、次にやや弱く一夜攪拌し続けた。このビーズを１ｍｌの蒸留水で２回洗浄し、次に１００μｌの蒸留水に懸濁し、そして吸着しているペプチドのシスティン残基の脱保護のために１００μＩの０．５ＮのＮａＯＨを加え直ちに攪拌した。脱保護は１ｍｌの０．２５ＮのＨＥＰＥＳ　、　ｐ　Ｈ７，４を加えることにより停止させた。

該ペプチド／ビーズ溶液の空気酸化を室温で一夜行った。

フェリシアン化カリウムをこのペプチド／ビーズ溶液に加え、酸化を完全にした。このチューブを遠心し、そしてこのビーズを１ｍｌの蒸留水で３回洗浄した。

ペプチド／ビーズ複合体は直ちに使用することができ、又は４°Ｃで水性懸濁物として６ケ月迄その反応性を有意に失うことなく保存できる。

ペプチド３９（ここでＸは−ＯＨ，Ｙは−ＮＨ２そしてシスティンチオール基はＥＣ保護されていない）をラテックスビーズに吸着させる。これは０．９ｍｌの　０．２Ｍのトリス、ｐＨ８，０に再懸濁している洗浄ラテックスビーズ（上記により調製された）に、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中のペプチド３９の２ｍｇ／ｍｌのペプチドストック溶液０．１ｍｌを加えることによる。このペプチドラテックスビーズ懸濁物を湯浴て４５°Ｃにて一夜インキユベートさせた。インキュベート後、このビーズを遠心により回収し、そして０．０１ＮのＰＢＳ、ｐＨ７，０で一回洗浄した。

必要ならばペプチド被覆ビーズを非特異的結合の防止のためにブロックすることかあり、これは０．８４％［ｗ／Ｖ］の被覆ビーズの懸濁物２０μｍを１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｌに加え、強く攪拌することによる。このビーズは遠心により集められ、そしてこの上清液を除去した。洗浄段階は遂次的に２回繰り返した。

試験すべき血清又は血漿をサンプル希釈緩衝液（２５％［ｗ／　ｖ　］の脱脂粉乳、１５ｐｐｍのカソン（Ｋ　ａｔｈｏｎ）　ＣＧ、０．０１％の消泡剤Ａ、０．ＯＩＭのリン酸ナトリウムｐＨ７，２，０゜１５Ｍの塩化ナトリウム）に１：８０で希釈し、そしてｌＯＯμｌをブロックしたペプチド／ラテックスビーズコンジュゲートにポルテックスにより混合しながら加えた。このサンプルをペプチド／ラテックスピースコンジュゲートと１５分間室温でインキュベートし、次に０．９ｍｌの洗浄溶液（トリス生理溶液、１ｍＭ塩化マグネシウム中の０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０　）を加え、混合し、そして遠心してこのペプチド／ビーズコンジュゲートを集めた。ペプチド／ビーズコンジュゲートを再度洗浄し、そして遠心により集め、希釈緩衝液中の１／１００希釈抗ヒトＩｇＧ、Ａ及びＭ−アルカリホスファターゼコンジュゲート１００μｌを室温で１５分間にわたり加えた。このペプチド／ビーズコンジュゲートを前記と同様再度洗浄した。

このペプチドの免疫反応性をアルカリホスファターゼ活性により間接的に検出した。酵素用緩衝液（０，１Ｍのトリス−ＨＣｌ　１０．１　ＭのＮａＣ１／　５　ｍ　ＭのＭｇＣＬ　、ｐ　Ｈ９，５，０，８ｍ１）を加え、次に１００μｌの基質（酵素用緩衝液中の９ｍｇのＰ−ニトロフェニルホスフェート）を加えた。

基質を３７°Ｃで１５分間インキュベートし、そしてこの反応は３Ｎの水酸化ナトリウム１００μｌの添加により停止させた。このビーズを遠心によりペレット状にし、そしてこの上清を分光光度計において４Ｑ５ｎｍて吸収を測定した。ペプチド３９０Ｃ及び脱保護３９０Ｃはこのアッセイ形式においてペプチド３９よりも実質的な改良を示した。

一方、ペプチドをカルボキシル末端を介してラテックスビーズ上に共有結合的に固定化した。カルボキシル末端コンジュゲーシヨンは３９−■で表示されているペプチド３９類似体であって、以下の配列：Ａｒｇ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｖａ　ｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ”− Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−３Ｈを含んで成るものによって実施した。

システィン残基をエチルカルバモイル保護し、そしてこのペプチドを前記の通りに合成した。完成したペプチドを、真空のもとで、攪拌しながら、９０％のヒドロフルオロ酢酸／ｌＯ％のアニソールを利用して、固相から分離させた。ヒドロフルオロ酢酸をエバボレートし、そしてこの残留物をエチルアセテートで洗浄し、次にこの粗ペプチドを６ＭのＧｕ−ＨＣＩｌｏ、４Ｍのリン酸カリウムに溶かした。この粗ペプチによりシトラコニル化せしめ、次に炭酸水素アンモニウムにおいてゲル濾過した。得られるペプチド３９−ＩＸはシトラコニル化されたアミノ末端とりジン残基、ホルミルトリプトファン、エチルカルバモイル−システィン及びＣ−末端チオグリシン残基を含んで成る。ペプチド３９−ＩＸを、カルボジイミド活性を介してカルボキシル化ラテックスビーズ（セラジン（Ｓ　ｅｒａｄｙｎｅ　、直径１．１　μｍ　、　０．０１ｍｅｚ／　ｇ）にコンユゲートせしめた。ビーズ懸濁物のアリコート（０，３ｍ１）を遠心してビーズを集めた。

ビーズを蒸留水で１回洗浄し、集め、そして水中のＨ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−アミドの溶液に懸濁させた。このｐＨを５．０〜５．５の間に調整し、次にｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を加えた。−夜放置後、このビーズを集め、そして前記の通り蒸留水で洗浄した。

得られるビーズの半分を硝酸銀と０．１Ｍのヒドロキシスクシニミドの水溶液中のペプチド３９−ＩＸのビーズ（２７μｇ／ｍｇ）により室温で２時間処理した。このビーズを０．２Ｍのシアン化ナトリウムで洗浄し、そしてシトラコニル基を除去するために一夜１５％の水性酢酸に保存した。エチルカルバモイル及びホルミル保護基を０．２Ｎの水酸化ナトリウムによる簡単な処理で除去した。システィン残基を一夜空気酸化し、次にフェリシアン化カリウムによる反応で酸化を完全にした。

残ったペンタリシンのコンジュゲートしているラテックスビーズを前記と同じ方法であるか担し硝酸銀を加えない方法により処理した。得られるビーズは比較のためのブランクとして働く。

ペプチド３９の誘導体もそのアミノ末端により、カルボジイミド活性を介してカルボキシ修飾ラテックスビーズ（Ｐｏｉｙｓｃ　１ｅｎｃｅｓ）に共有結合的に固定化した。８ｍｇのラテックスビーズをマイクロフユーズチューブに入れ、そして０．５ｍｌの蒸留水を加えた。このビーズを遠心により集め、そしてその上清を除去した。活性化は０．５ｍｌの０．２ＭのＥＤＣ（３８，２ｍｇ／ｍｌ）及び０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシニミド（２２ｍｇ／ｍｌ）を加え、そして９０分間室温で回転攪拌して反応させることにより行った。活性化ビーズを前記の通りに集め、約５０μｍの上溝を残しながらこの上清を除去した。このペレットを分散させ、そして種々の濃度のペプチド３９　（１９０−７６０〃ｇ）を含むＩＭのＨＥＰＥＳ　、ＰＨ７，５を２５０μｌ加えた。ペプチドをこの活性化ビーズと室温で回転攪拌させながら一夜反応させた。前記の通りにこのビーズを集め、そして０．１ＭのＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，５で洗浄した。更に２回トリス生理溶液（０，１Ｍ、ｐＨ７，４）中の１％のＢＳＡにより洗浄し、そしてこのペプチド／ラテックスビーズを１％のＢＳＡ／ｌ−リス生理溶液０．５ｍｌに再懸濁させた。

他方、Ｎ−末端共有結合的固定化をチオエーテル結合形成を介して行った。ペプチド３９−ＧＣをＮＨ２修飾ラテックスビーズ（Ｐ　ａｎｄｅｘ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、Ｉ　Ｌ　）にコンジュゲートさせた。５ｍｇのビーズを蒸留水で１回洗浄し、そして０．１Ｍのｔ（ＥＰＥＳ　Ｓｐ　Ｈ７，４，２００μｌに再混濁させた。Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン− １−カルボキシレート（ＳＭＣＣ，ＤＭＦ中にてｌ　ｍｇ／　１００　ｕ　１、１００μｌ）をこのビーズ懸濁物に加え、そして室温で常に攪拌しながら２時間反応させた。活性化ビーズを上記の通りに集め、蒸留水で２回洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡを含むＯ，ｌ　ＭのＨＥＰＥＳ　、　ｐ　Ｈ７，４で１回洗浄した。ＨＥＰＥＳ緩衝液中の活性化ビーズの懸濁物２００μＩを調製し、そして６ＭのＧｕＨＣｌ　ｔｏ。

μｌ中のペプチド３９−ＧＣ２００μｇを加えた。コンジュゲーシヨンはローチーターにおいて室温で１夜行った。ペプチドのコンジュゲートしたビーズを前記の通りに集め、蒸留水で３回洗浄し、そして蒸留水にて０．８４％に懸濁させた。免疫学的交叉反応を前記の通りに試験した。

免疫学的交叉反応性を試験する択一的な方法も利用した。

このような方法の１つにおいて、ペプチド３９及び３９０Ｃを米国特許４．６２９．７８３号に記載の通りのＥＬＩＳＡにより試験した。簡単に述べると、ペプチド３９と３９−ＧＣのストック溶液を６ＭのＧｕ−ＨＣｌ中にて作り上げた。

それぞれの２０Ｍｇ／ｍｌ及び６　μｇ／ｍｌのワーキング溶液を、ストック溶液を０．０５Ｍの炭酸／重炭酸緩衝液ｐ　Ｈ９，５で希釈することにより調製した。マイクロタイターペレートのウェルに該ペプチドのワーキング溶液１００μ ｌを加え、室温で一夜放置した。被覆溶液を除去し、そして０．５Ｍのエタノールアミンを含む前記のブロッキング溶液３００μｌを加え、１時間室温で放置した。ブロッキング溶液を除去し、そしてこのプレートを直ちに使用するか又はその後の使用のために乾燥して保存した。

血漿サンプルをサンプル希釈緩衝液（前記）に希釈しく表１参照）そしてｌＯＯ μｌづつ各ウェルに加えた。サンプルを３０分間３７°Ｃでインキュベートし、次にこれを除去し、そしてこれらのウェルを０．１５ＭのＮａＣ１，０，０５％のツイーン２０で６回洗浄した。１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートをクエン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，０，１％の正常ヤギ血清に希釈し、そして各ウェルに加え、３０分間３７℃で放置し、前記の通り６回洗浄した。ＥＬＩＳＡアツセイはｌウェル当り１００μｌの基質溶液（クエン酸／リン酸緩衝液ｐ　Ｈ６，０中における８０Ｍｇ／ｍｌのテトラメチルベンジニン、０．００１５％の水素化ペルオキシド）を加え、室温で３０分間により行った。反応はｌウェル当りに１００μｌのＩＮのＩ（、Ｓ０４を加えることにより停止させ、そして６３０ｎｍに対する４５０ｎｍの光学密度の比を自動ＥＬＩＳＡリーダーによって測定した。陽性の結果のカットオフ値は、３種類の既知の陰性サンプルから得られる平均吸光度よりも０．２２５アブソーノくンス単位が高い値に設定した。表１の結果が示すには、ペプチド３９０Ｃはペプチド３９よりもより高い希釈度で陽性の結果を示すことができることがわかった。

別の実験において、チオール保護されているづプチド３９ＧＣは、チオール脱保護ペプチド３９０Ｃと比べる際に、アッセイにおいて明らかに低い免疫反応性を示した。同様の結果かＨＩＶ−２ペプチド、４ｌ−２−３０Ｃに見られた。

表１ＥＬＩＳＡによるペプチド３９とペプチド３９０Ｃの比較の希血漿０（１：４０）　Ｐｏｓ／Ｐｏｓ　Ｙｅｓ　１．４３９　０．８５９〃（１：８０）　Ｐｏｓ／Ｐｏｓ　Ｙｅｓ　１．０１０　０．５４７〃（１：１６０）　Ｐｏｓ／Ｐｏｓ　Ｙｅｓ　Ｏ，７４２０，３５１”　（１：３２０）　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，３９７０，１９７”　（１：６４０）　Ｎｅｇ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，２７９０，１２８”　（１：１２８０）　Ｎｅｇ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，１６５０，０７８血漿Ｇ（１：４０）　Ｐｏｓ／Ｐｏｓ　Ｙｅｓ　Ｏ，８９５０，５８５〃（１：８０）　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，８２００，３２１〃（１：１６０）　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，５７５０，２４１〃（１：３２０）　Ｎｅｇ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，３４９０，１４８〃（１：６４０）　Ｎｅｇ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，１７９０，０９２”　（１：１２８０）　Ｎｅｇ／Ｎｅｇ　Ｙｅｓ　Ｏ，１０７０，０７８カツトオフ値　０．３４８　０．３４１例■ 脱保護されたペプチドを利用するＨＩＶ−１に対する抗体のための膜濃度（メンプランコンセントレージョン）イムノアッセイ種々の既知血清及び血漿サンプルを、本発明の改良方法及び組成物を利用する改質微粒子アッセイを用い、免疫学的な交叉反応性についてスクリーンした。本ペプチド組成物をうテックスビーズ上に固定化し、そしてＨＩＶに対する抗体の検出及び／又は定量のだめの吸着性材料の上に置いた微孔性膜上に捕獲せしめた。

このようなイムノアッセイ装置及び方法の例は、本明細書に参考文献として組入れている米国特許４、６３３．９０１号及び４．７２７．０１９号に記載されている。この膜濃縮イムノアッセイは合計１０分間のアッセイ時間を含んで成る３種類のインキュベーションを包含する。試験するペプチドを前記の方法によりラテックスビーズに収着させた。

各サンプルを、孔径１．２μｍのナイロン膜上において３点より成る、フィルターユニット上での試験を行った。１点は試験ペプチド／ラテックスビーズ調製品を含んで成り、１点は陽性の処理コントロールを含んで成り、そして他は陰性の処理コントロールを含んで成る。

このペプチド／ラテックスビーズ調製品はＯ，ｌ　Ｍのトリス緩衝液、ｐ　Ｈ７，２，０，１５ＭのＮａＣ１，０，０１ＭのＭｇＣｌ２．１０％のスクロース、２％の仔牛血清に懸濁せしめた。膜に０．１〜０．２％のペプチド／ビーズ調製品の懸濁物をスポットした。

陰性の処理コントロールスポットはＢＳＡの収着により被覆されているラテックスビーズを含んで成る。陽性の処理コントロールスポットはヤギ抗ヒトイムノグロブリンの収着により被覆されているラテックスビーズを含んで成る。血清又は血漿サンプル（４０ｍｌ）を希釈緩衝液（１０％の熱処理不活性化正常ヤギ血清、１％の硫酸デキストラン、０．２％のツイーン２０．２．５％の脱脂粉乳、１５ｐｐｍのキヤツジＣＧ、０．００５％の消泡剤Ａ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐ　Ｈ７，４）において１：１０で希釈した。希釈物をこの膜の表面に加え、そして完全に吸着させた。添加してから２分経過後、１ｍｌの洗浄緩衝液（０，ＯＩＭのトリス−生理溶液、ｐＨ６，０，０，０５ＭのＮａＣ１，０，００５ＭのＭｇＣＬ　、０．１％のアジ化ナトリウム、１０Ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、０、５　Ｍのチオシアネートカリウム）を加え、そして膜にわたって完全に吸収されるようにした。約０．１５０　ｍｌ（３、ｉｌりのヤギ抗−ヒトｒｇ−アルカリホスファターゼコンジュゲートを１０ｍＭのリン酸緩衝生理溶液、ｐ　Ｈ７，４，０，２％のヤギガンマ−グロブリン、１％の牛血清アルブミン、１ｍＭのＭｇＣｌ２．０．１ｍＭのＺｎＣ１ｚに希釈し、そしてこの膜に加え、完全に吸収させた。この膜を前記の通り（２ｍｌ）２回洗浄し、そして約０．１５０ｍ１（３滴）の基質（ＩＭの２−アミノ−２−メチル−１ −プロパツール、ｐ　Ｈ１０，３，５ｍｇ／ｍｌの３−インドキシルホスフェート）を加え、そして完全に吸収させた。約５分後、約１ｍｌの０．５ＭのＥＤＴＡ、　ｐ　Ｈ７，４をこの膜に通過させて反応を停止させた。この停止液が完全に吸収された後、このユニットを反射率によって半定量的又は目視で検定した。

もし陽性コントロールスポットのみが何らかの色の出現のサインを示し、そして試験スポット及び陰性コントロールスポットが全く色の出現を示さなかった場合、結果は陰性である。陽性の結果は、もし試験スポットがある程度の色の出現を示しくトレース（ごくわずか）から＋４迄）、陽性のコントロールが色の出現を示し、そして陰性のコントロールか色の出現を示さない場合に示唆される。広範囲にわたる陽性、陰性、ＥＩＡ陽性／ウェスタンプロット非定形及び免疫感作の検体を、好ましいペプチド３９類似体、ペプチド３９−ＧＣを試験抗原として、試験を行った。陽性検体は０．５＋から４＋迄の反応性の段階を示し、そして全ての有効な試験はきれいな白地上にはっきりと見わけられる色付いたスポットをもたらした。陰性のコントロールは全つく色の出現を示せず、そして陽性コントロールはおよそ２＋の色調を示した。

表　２抗原としてのペプチド３９−ＧＣによる膜免疫濃縮イムノアッセイにより試験した種々のタイプのサンプルの結果のまとめ分類　陽性数／全体数正常血液バンク提供　０／１１８７ウエスタンブロブト　陰性几ＡＶ−ＥＩＡ陽性　０／７９ウエスタンプ［ｈ）　ｐ２５　陰ルＡＶ／ＥＩＡ陽　（不定形１）　Ｏ／３９ウェスタンプ０７ト　ｐ２５　陽ルＡＶ−ＥＩＡ陽　（不定形２）　Ｏ／１７０’）ニス９７ブＯｒト　陽／ＬＡＶ−ＥＩＡ　陽　（００＜　１．５　’）　１２０／１２０ウエスタンプロブト　陽／ＬＡＶ−ＥＩＡ　陽　（００＞　１．５　）　２９／２９自己免疫サンプル１　０１５１第２、不定形梅毒血清／ＨＩ　Ｖ陰　０／２６第２、不定形梅毒血清／ＨＩＶ陽　４ｚ４問題のＨｒｖ−１血清陰性サンプル２　０／７２ｎ＝１７７７１、　自己免疫サンプルは１１人のぜん息患者、１１人のスジョグレン（Ｓ　ｊｏｇｒｅｎ）症候群患者、７人の全身系紅斑性根癒患者、４大の強直性を椎炎患者、３人の不明症状及び１５人の雑多な症候群／疾病が含まれている。

Ｚ　黄痕の、脂血症の、脂血症の、アルコルビン酸及び種々の抗凝血処理サンプル。

本発明の種々のペプチド組成物を前記のアッセイ形式のいくつかを利用して試験した。この結果のまとめを以下の表に記載した。表３において、非定形サンプルにおける、ＥＬＩＳＡによるペプチド３９と、完全ウィルスＥＬｆＳＡでの膜濃縮イムノアッセイとの比較の結果を示す。１１の不定形サンプルのうちの１０個は完全ウィルスＥＬｒＳＡにより陽性と試験され、これらはウェスタンプロットによっては陽性であると確認できなかった。ペプチド３９を固定化抗原として用いた場合、ＥＬＩＳＡ及び膜濃縮イムノアッセイによりこれら全ては陰性であると見出された。

二種の血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）パネルにおける、完全ウィルスＢＬＩＳＡと、ＥＬＩＳＡ及び膜濃縮イムノアッセイによるペプチド３９ＧＣ並びにＥＬＩＳＡによるペプチド３９Ｃの結果を表４に示す。ペプチド３９０Ｃ及びペプチド３９は完全ウィルスＥＬ４ＳＡよりも早く陽性の結果を示した。ペプチド３９０Ｃはペプチド３９よりも早く陽性の結果を、この血清変換パネルの１種において示した。

表３ウェスタンプロット不定形血清サンプルに基づく、抗原としてのペプチドと完全ウィルスの酵素結合イムノアッセイの比較Ｙ３４１５０　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，５２６０，０６３ＮｅｇＺ００１３２　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，３０７０，０８３ＮｅｇＨ６２１１１Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，７５１０，０４７ＮｅｇＶ４５７１９　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，５８１０，０４８ＮｅｇＹ４９３００　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，５２３０，０４８ＮｅｇＶ４４９３２　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，６１７０，０６８ＮｅｇＧ１６２１１　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，３８７０，０２７ＮｅｇＧ１５６９４　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，３６７０，０７８ＮｅｇＹ４０６４６　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，６５５０，０５７ＮｅｇＨ６３５４７Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，９０１０，０９２ＮｅｇＹ３８２４８　Ｐｏｓ／Ｎｅｇ　Ｎｏ　Ｏ，３８６０，０４８Ｎｅｇｌ　膜濃縮イムノアッセイ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＩ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）表４２種の血清変換パネルについての、抗原としてペプチドを利用したＢＢｉｌ　陰性　Ｎ　ｏ　０．０６７　０．３４７　０．１２８　−ＢＢＩ−２〃Ｎｏ　Ｏ，０７５０，３１７０，１２９−ＢＢＩ−３Ｐｏｓ／ＮｅｇＹｅｓ　Ｏ，１８００，８４２０，５１４＋ＢＢＩ−４陽性　Ｙｅｓ　Ｏ，８５８１，１０５０，６３２＋＋ＢＢＩ−５〃Ｙｅｓ　１．１６４　１．７５７　１．０９８　＋＋ＢＢＩ−６〃Ｙｅｓ　１．３５９　２．１６０　１．５３１　＋＋ＢＢｒ −７’　Ｙｅｓ　１．４３０　１．９８６　１．３０７　＋＋ＢＢＩ−８’　Ｙｅｓ　１．５５６　２．３１７　１．６８８　＋＋＋ＢＢＩ−９”　Ｙｅｓ　１．５０７　２．３２８　２．１２２　＋＋＋カットオフ値　０．２９１　Ｑ、３８４　０．３４１ＢＢｒ−２０陰性　Ｎｏ　０．０３８　０．１３６　０．０３７　−ＢＢｉ２１　”　Ｎｏ　Ｏ，０５５０，１５８０，０５３−ＢＢＩ−２２Ｐｏｓ／ＮｅｇＹｅｓ　Ｏ，０５７０，４５００，２４４＋ＢＢｉ２３　Ｐｏｓ／ＮｅｇＹｅｓ　Ｑ、１２３　０．８９０　０．５４０　＋ＢＢＩ−２４Ｐｏｓ／ＮｅｇＹｅｓ　Ｏ，１２７１，０６４０，６３６＋ＢＢＩ−２５Ｐｏｓ／ＮｅｇＹｅｓ　Ｏ，２１６０，８４５０，５５３＋＋ＢＢＩ−２６Ｐｏｓ／ＮｅｇＹｅｓ　Ｏ，２５９０，８５２０，４４５＋＋ＢＢｒ−２７陽性　Ｙ　ｅｓ　Ｏ，３３５１，１０４０，５９０＋　＋ＢＢｒ−２８〃Ｙｅｓ　Ｏ，４３１１，１７７０，７６９＋＋ＢＢＩ−２９〃Ｙｅｓ　Ｏ，７１８２，０８５１，５６６＋＋ＢＢＩ−３０〃Ｙｅｓ　Ｏ，８３７２，２１４１，８７１＋＋＋ＢＢＩ−３１” 　Ｙｅｓ　Ｏ，７９８２，２０７１，８１２＋＋＋ＢＢＩ−３２〃Ｙｅｓ　Ｏ，９２０２，２６３１，９２５＋＋十ＢＢＩ−３３〃　Ｙｅｓ　Ｏ，８３３２，２７７１，９６１＋＋＋ＢＢｒ−３４〃Ｙｅｓ　Ｏ，７２８１，６２２１，３６３＋＋＋ＢＢＩ−３５〃Ｙｅｓ　Ｏ，９０２２，１９８１，８６１＋＋＋ＢＢＩ− ３６〃　Ｙｅｓ　Ｏ，８８１２，２６５１，９５９＋＋＋ＢＢＩ−３７〃　Ｙｅｓ　Ｏ，９５３２，１０５１，５３０＋＋＋カットオフ値　０．２９１　０．３８４　０．３４１例■ 脱保護ペプチドを利用するＨＩＶ−２に対する抗体の検出保護されているシスティンチオール基を伴って合成したＨＩＶ−２ペプチドの免疫反応性を測定した。

ＨＩＶ−２ペプチド４１−２−３を例１に記載の通りに合成した。Ｃｙｓ群は保護し、そしてＮ−末端Ｃｙｓ　−Ｇ　ｔｙ　−Ｇ　ｌｙを有するペプチド４ｌ− ２−３０Ｃが得られた。ＥＩＡを、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のウィルスリゼート及びペプチド３９０　Ｃ（ＨＩＶ−１）と４ｌ−２−３０Ｃを用い、前記の通り行った。２種のＨＩＶ−２の陽性血清、Ｆ　５０４２８２であってニューヨークにおける患者及びパスツール研究所（Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）から供給された「ＧＯＭ」由来のものの希釈液についての反応性を調べた。表５において示す結果は、合成ペプチドか明らかにＨＩＶ−１とＨＩ　Ｖ−２の相違を区別し、完全ウィルスリゼートＥＩＡから得られる結果に比べ高い特異性の免疫反応性を特に提供した。

表５：ＨＩＶ−２陽性検体から調製した希釈系列のＥＩＡにおける反応性Ａ″ 原液　０．０７５　３．０００　ＮＤ”　２．０２６１：　５　０．０４９　３．０００　０，４９４　１．８０８１：１０　０．０４２　３．０００　０．２９３目　１．６８７１・２０　０．０３７　３．０００　０．１７０　１．４０５１：４０　０．０３５　２．８２８　０．１０１　１．１８２１：８０　Ｑ、０３３　２．１０７　０．０７２　０．８７６１：１６０　０．０４０　１．４４１　０．０４６　０．５９７１：Ｉ２８０　０．０３９　０．３０２　ＮＤ　ＮＤｌ：２５６０　０．０３０　０．１８０　ＮＤ　ＮＤ１：２　０．０５２　３．０００　０．８３９　２．１１３１：　４　０．０３７　３．０００　０．５１０　１．９５３１：　８　０．０４０　３．０００　０．３１７　１．７０３１：１６　０．０３１　３．０００　０．１７７　１．４３３１：３２　０．０３５　３．０００　０．０９９　１．０８３１：６４　０．０７４　２．５２４　０．０６０　０．７３６１：Ｉ２８　０．０３１　２．２０２　０．０４７　０．５５２１：２５６　０．０３５　１．４５２　ＮＤ　Ｏ，２８０１：５１２　０．０４０　０．８１１　ＮＤ　Ｏ，１７６１：１０２４　０．０３７　０．５７１　ＮＤ　Ｏ，１１４＊Ａは患者Ｆ　５０４２８２からの血清、Ｂは患者ＧＯＭからの血清。

＃ＮＤ＝未測定（Ｎｏｔ　Ｄ　ｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）Ｓ下線はカットオフ値を示し、それより上は陽性、そしてそれより下は陰性と考える。

非保護ＨＩＶ−２ペプチド４１−２−３の反応性を、Ｎ−末端にＣｙｓ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ延長部を有する脱保護型（４１−２−３０Ｃ）及びＨＩＶ−２完全ウイルスリゼートと比較した。

このアッセイはＨＩＶ−２陽性検体の希釈率を変えたものによる、前記の一般的なＥＩＡにより行った。代表的な血清の結果を表６に示す。

表６：脱保護及び保護されていないＨＩＶ−２ペプチドとＨＩＶ−２ウィルスリゼートによる、選ばれたＨＩＶ−２血清の反応性検体　希釈率　４ｌ−２−３０Ｃ４１−２−３リゼート″ＧＯＭ’　Ｉ：２　３．０００　２゜２３９　２．１１３１：４　３．０００　１．９３２　１．９５３１：８　３．０００　１．５１７　１．７０３１：１６　３．０００　１．１４３　１．４３３１：３２　３．０００　０．６９３　１．０８３１：６４　２．５２４　０．３４３ａ　０．７３６１：１２８　２．２０２　０．２２８　０．５５２１：２５６　１．４５２　０．０９２　０．２８０１：５１２　Ｑ、８１１　０．０６９　０．１７６１：１０２４　０．５７１　０．０５８　０．１１４”ＰｒＮ″　１：２　３．０００　２．０８２　１．３３６１：４　３．０００　１．６９５　１．０３５１：８　２．５９６　１．１５４　０．８３４１：１６　１．９４０　０．６０７　０．７１１１：３２　１．２０９　０．３６９　０．３８７■・６４　０．５８２　Ｑ、１８２　０．１８８“ＳＡＭＢ″　ｌ：２　３．０００　１．５３５　’　１．０４７１：４　３．ＱＯＯ１，Ｑ８９　Ｑ、９６８１：８　２．８５４　０．６５９　０．７０８１：１６　２．７１０　０．４３３　０．４８５１：３２　２．１１２　０．２３９　０．３９８１：６４　１．４００　０．１２１　０．２８９１：１２８　０．８３４　０．０８１　０．１４４１＋２５６　０．４０４　ＮＤ”　ＮＤ“Ｓ″　Ｉ：２　３，０００　２．２０８　１．８５５１：４　３．０００　１．９４２　１．８０６１：８　３．０００　１．４４０　１．５９０１＋２６　３．０００　０．９１０　０．９１７１：３２　２．６３２　０．５８１　０．６４７１：６４　２．１５５　０．２７３　０．４５５１：１２８　１．４４２　０．１５９　０．２８９１：２５６　０．７２５　０．０８９　０．１５７１：５１２　Ｑ、５１６　０．０６１　０．１０３＃ＮＤ＝未測定９下線はカットオフ値を示し、それより上は陽性、そしてそれより下は陰性と考える。

例■ ）ＩＴＬＶ−１ｈランスメンプラングリコプロティン、ｇｐ２１の領域は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のトランスメンブラン領域に相当すると同定されており、従って潜在的にイムノドミナントである。ＨＴＬＶ−１の既知のアミノ酸配列に基つき、合成ペプチドを作った。ペプチドは例１に一般的に概略した方法に従い合成且つ保護せしめた。アッセイは例１に一般的に記載の方法に従って行った。その結果を表６に示す。

表６　：　Ｆ（ＴＬＶ−１に対する抗体への反応性についての試験したＨＴＬＶ −１ペプチド血清サンプル１ペプチド９／配列　４０３５９　０４３５　０３２ＥＣ１１２１−ＩＧＩＨ−ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ”ＫＡＬＱＥＱＣ”−ＮＨ２わずか　 −−１２１−ＩＧＣＩＨ−ＣＧＧ−ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ”ＫＡＬＱＥＱＣ”−ＮＨ，３＋　１＋　−１２１−２ＧＩＨ−ＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ”ＫＡＬＱＥＱＣ”−ＮＨ２−−−１２１−２０Ｃ１１（−ＣＧＧ−ＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ”ＫＡＬＱＥＱＣ”−ＮＨ２３＋　０．５＋　−１２１−３ＧＩＨ−ＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ”−ＮＦ（２−−−１２１−３０ＣＩＨ−ＣＧＧ−ＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ”−ＮＨ２ａ＋　−−１２１− ３ＥＧＩＨ−Ｃ”ＧＧ−ＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ“−ＮＨ２ＮＤ−−１２１− ＩＤＩＨ−ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＬＱＥＱＣ−ＯＨＮＤ−−９−ラテックスマイクロ粒子上のペプチドのコーティングレベルは５０μｇのペプチド１５ｍｇのビーズ１５５０μｌ容量である。

＃−血清サンプル４０３５９と０４３５は、希釈していない）ｆＴＬＶ−１ＥＩＡ陽性コントロール血清である。０３２ＥＣ１はＨＴＬＶ〜Ｉ　ＥＩＡ陰性フントロールである。

＊　−Ｃｙｓ残基が、合成中にエチルカルバモイル保護を利用して保護されていることを示す。

ペプチド１２１−ＩＧＣＩによるアッセイの結果を、その他のＨＴＬＶ−Ｉ／Ｔｌ試験例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　、放射性免疫沈殿（ＲＩ　Ｐ）　、ウェスタンプロット（ＷＢ）及びウィルスリゼートＥＩＡとの結果と比較した。例■に記載の方法をペプチド１２１−ＩＧＣＩのために利用したが、ただし２滴のサンプルを利用し、そしてコンジュゲートは２倍高い濃度で用いた。このアッセイは、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−ＩＩに対する抗体を含むと予想される１０種の血清サンプルにより行った。Ｆ（ＴＬＶ４のためのＰＣＢアッセイはＨ，Ａ。

Ｎ、　Ｙ、（１９８９０本明細書に参考文献として組入れている）に一般的に従って行った。この結果を表７に示す。

表７：脱保護ペプチド１２１−ＩＧＣＩによる、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩについてのアッセイの比較８９３６５　＋　＋　ＶＷＪ　Ｉｎｄ’　０．５＋３９２６６　＋　＋　ＶＷ　Ｉｎｄ　わずか８９４３０　＋　＋　＋　Ｉｎｄ　わずか８９４３３　＋　＋　−−ｉｎｄ　ｌ＋８９４４２　＋　Ｉｎｄ　ｌｎｄ　わずか８９２３２　＋　＋　＋　＋　＋　わずか８９２８３　＋　＋　＋　＋　＋　１＋８９３５９　＋　十　＋　＋　＋　１＋被覆レベル：８０μｇのペプチド１５ｍｇのビーズ１５５０μｌの容量ａ−ＶＷは非常に弱い反応＃−Ｉｎｄは不明な状態他の実験において、ＨＴＬＶ−Ｉ／Ｉ［陽性個体として予想されている血清パネルに対する種々の型におけるＨＴＬＶ−■ペプチドのスクリーニングは、ＲＩＲ１ウェスタンプロット及び市販されているＨＴＬＶ−Ｉ　ＥＩＡアッセイにより得られる結果と比較してよく分からない結果が得られた。ある試験により陽性となったいくつかのサンプルはペプチド１２１−ＩＧＣＩにより陰性となった。これらの結果は複数の因子であって、ペプチド１２１−ＩＧＣＩにより陰性となり、その他の評価により陽性となったサンプルは、ちとからウィルスのコア抗原と反応性でありそしてトランスメンプラングリコプロティン抗原と反応性でない抗体を含むこと、を含む要因のためでありうる。

手続補正書（方式コ平成今年　今月　２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．天然のタンパク質に対する抗体と免疫的に反応するペプチド組成物であって、該ペプチドが６個から５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含んで成り、そして該配列が２個のＣｙｓ残基であってそれらが互いに少なくとも約２個、しかしながら２０個より少ない非Ｃｙｓアミノ酸残基により離されているものを含んで成り、そして該Ｃｙｓ残基のチオール基が化学的可逆性手段により可逆的に保護されている、ペプチド組成物。
２．請求項１に記載のペプチドであって、前記Ｃｙｓ残基がエチルカルバモイル、アセタミドメチル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフィニル又はジフェニル− ４−ピリジルメチルにより、酸化から保護されているペプチド。
３．請求項２に記載のペプチドであって、前記Ｃｙｓ残基がエチルカルバモイルにより、酸化から保護されているペプチド。
４．請求項１に記載のペプチドであって、酸化から保護されていないＣｙｓ残基をＮ−末端に更に含んで成るペプチド。
５．請求項４に記載のペプチドであって、前記のＮ−末端のアミノ酸がＣｙｓ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含んで成るペプチド。
６．請求項４に記載のペプチドであって、そのＣ−末端アミノ酸がアミド化されているペプチド。
７．請求項１に記載のペプチドであって、前記のＣｙｓ残基が互いから約４個から６個の非Ｃｙｓ残基により離れているペプチド。
８．請求項１に記載のペプチドであって、レトロウィルスのトランスメンプランタンパク質に対する抗体と免疫的に反応するペプチド。
９．請求項８に記載のペプチドであって、前記のレトロウィルスタンパク質がＨＩＶ−１ｇｐ４１であり、該ペプチドが以下の配列：【配列があります】における少なくとも７個の隣接するアミノ酸を含んで成るペプチド。
１０．請求項９に記載のペプチドであって、そのＮ−末端が免疫特異的反応性を高めるために付加されているアミノ酸を含んで成り、ここで該付加されているアミノ酸の少なくとも１つは酸化から保護されていないＣｙｓ残基である、ペプチド。
１１．請求項１０に記載のペプチドであって、前記の酸化から保護されていないＣｙｓがＮ−末端残基であるペプチド。
１２．請求項１１に記載のペプチドであって、前記のＮ−末端配列がＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであるペプチド。
１３．請求項１１に記載のペプチドであって、そのＣ−末端のアミノ酸がアミド化されているペプチド。
１４．請求項８に記載のペプチドであって、前記のレトロウィルスのタンパク質がＨＩＶ−２ｇｐ３６であり、そして該ペプチドが以下の配列：【配列があります】における少なくとも７個の隣接するアミノ酸を含んで成るペプチド。
１５．請求項１４に記載のペプチドであって、そのＮ−末端が免疫特異的反応性を高めるために付加されているアミノ酸を含んで成り、ここで該付加されているアミノ酸の少なくとも１つが酸化から保護されていないＣｙｓ残基である、ペプチド。
１６．請求項１５に記載のペプチドであって、前記の酸化から保護されていないＣｙｓ残基がＮ末端の残基であるペプチド。
１７．請求項１６に記載のペプチドであって、前記のＮ−末端配列がＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであるペプチド。
１８．請求項１６に記載のペプチドであって、そのＣ末端のアミノ酸がアミド化されているペプチド。
１９．請求項８に記載のペプチドであって、前記のレトロウィルスのトランスメンプランタンパク質がＨＴＬＶ−１ｇｐ２１であり、そして該ペプチドが以下の配列：【配列があります】における少なくとも７個の隣接するアミノ酸を含んで成るペプチド。
２０．請求項１９に記載のペプチドであって、そのＮ−末端が免疫特異的反応性を高めるために付加されているアミノ酸を含んで成り、ここで該付加されているアミノ酸の少なくとも１つが酸化から保護されていないＣｙｓ残基である、ペプチド。
２１．請求項２０に記載のペプチドであって、前記の酸化から保護されていないＣｙｓがＮ−末端残基であるペプチド。
２２．請求項２１に記載のペプチドであって、前記のＮ−末端配列がＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであるペプチド。
２３．請求項２１に記載のペプチドであって、そのＣ末端アミノ酸がアミド化されているペプチド。
２４．請求項８に記載のペプチドであって、前記のレトロウィルスのタンパク質がＨＴＬＶ−ＩＩｇｐ２１であり、そして該ペプチドが以下の配列：【配列があります】における少なくとも７個の隣接するアミノ酸を含んで成るペプチド。
２５．請求項２１に記載のペプチドであって、そのＮ−末端が免疫特異的反応性を高めるために付加されているアミノ酸を含んで成り、ここで該付加されているアミノ酸の少なくとも１つが酸化から保護されていないＣｙｓ残基である、ペプチド。
２６．請求項２５に記載のペプチドであって、前記の酸化から保護されていないＣｙｓ残基がＮ−末端の残基であるペプチド。
２７．請求項２６に記載のペプチドであって、前記のＮ−末端配列がＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであるペプチド。
２８．請求項２６に記載のペプチドであって、そのＣ−末端アミノ酸がアミド化されているペプチド。
２９．タンパク質に対する抗体の免疫学的な検出及び／又は定量のための、ペプチド被覆されている固相を調製するための方法であって、以下のこと：（ａ）ペプチドであって６〜５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含んで成り、そして２個のＣｙｓ残基であってそれぞれが互いから少なくとも約２個しかしながら２０個より少ない非Ｃｙｓアミノ酸残基により離されているものを有するペプチドを合成し；（ｂ）該ペプチド配列内にコード化されているシステイン残基のチオール基を、保護されているペプチド組成物の形成のために化学的可逆性手段により保護し；（ｃ）該保護されているペプチド組成物を固相に固定化し；（ｄ）該固定化されているペプチド組成物から該化学的可逆性手段を除去し；（ｅ）該固定化されているペプチド組成物を、ジスルフィド結合の形成が行なえる条件のもとでインキュベートすること；を含んで成る方法。
３０．請求項２９に記載の方法であって、前記のシステインチオール基を、前記のペプチドの配列の合成前に保護する方法。
３１．請求項２９に記載の方法であって、前記の化学的可逆性保護手段がエチルカルバモイル、アセタミドメチル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフイニル又はジフェニル−４−ピリジルメチルである方法。
３２．請求項３１に記載の方法であって、前記の化学的可逆性保護手段がエチルカルバモイルである方法。
３３．請求項２９に記載の方法であって、前記のペプチドを吸着により固定化する方法。
３４．請求項２９に記載の方法であって、前記のペプチドを共有結合により前記の固相に固定化する方法。
３５．請求項２９に記載の方法であって、前記の固相がラテックス、シリカ、セルロース、フルオロカーボンポリマー、ナイロン、ポリアクリルアミド又はポリスチレンである方法。
３６．請求項２９に記載の方法であって、前記の方法がシリカ、セルロース、ポリアクリルアミド又はポリスチレンのラテックスである方法。
３７．請求項３５に記載の方法であって、前記の固相がポリスチレンのラテックスである方法。
３８．請求項２９に記載の方法であって、前記のペプチド配列が：【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，又は【配列があります】，であり、ここでＸがＯＨ又はＮＨ２、Ｙが反応性を高めるために加えられているアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ＊が化学的可逆性手段により保護されたチオール基を含んで成る、方法。
３９．体液内のＨＩＶウィルスに対する抗体又はＨＩＶウィルスの抗原の存在を検出するための方法であって、以下の段階：（ａ）固相と以下のアミノ酸配列を含んで成る少なくとも１つのペプチドとを、固定化が可能な条件のもとで接触させ（ここで該アミノ酸配列は：【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，又は【配列があります】，であり、ＸがＯＨ又はＮＨ２であり、Ｙは該ペプチドの反応性を高めるために付加されているアミノ酸を含んで成り、そしてＣｙｓ＊は化学的可逆性手段により保護されているチオール基を含んで成る）；（ｂ）該固定化されているペプチドの該システインチオール基から該化学的可逆性保護手段を除去し；（ｃ）該固定化されているペプチドをジスルフィド結合の形成の行なわれる条件のもとでインキュベートし；（ｄ）該体液と該固定化されているペプチドとを、反応混合物を作るために免疫特異的結合が可能な条件のもとで接触させ；（ｅ）免疫特異的結合が該固定化されているペプチドと該体液の抗体成分との間に生じたかどうかを検出することであって、この免疫特異的結合の検出が該体液内のＨＩＶウィルスの抗体又は抗原の存在を示唆すること；を含んで成る方法。
４０．請求項３９に記載の方法であって、免疫特異的結合が以下の段階：（ａ）前記の免疫反応混合物において形成される反応生成物から未結合成分を除去し；（ｂ）該免疫反応混合物に標識した抗体を加え、（ここで該標識された抗体は該反応生成物の成分と免疫特異的結合が可能であり、そしてこの標識剤は検出可能なシグナルを提供する）；そして（ｃ）該標識した抗体が該反応生成物と結合したかどうかを検出すること；により検出される方法。
４１．請求項４０に記載の方法であって、前記の未結合成分の除去の段階が濾過による方法。
４２．請求項４０に記載の方法であって、前記の標識剤が、蛍光物質、酵素、ルミネッセント化合物、ラジオアイソトープ及び粒子より成るループから選ばれる方法。
４３．請求項４２に記載の方法であって、前記の標識剤が酵素基質の添加により検出可能な酵素である方法。
４４．請求項３９に記載の方法であって、前記の固相がラテックス、シリカ、セルロース、フルオロカーボンポリマー、ナイロン、ポリアクリルアミド及びポリスチレンより成るグループから選ばれる方法。
４５．請求項４４に記載の方法であって、前記の固相がポリアクリルアミド、ポリスチレン、シリカ及びセルロースのラテックスより成るグループから選ばれる方法。
４６．請求項４４に記載の方法であって、前記の固相がポリスチレンのラテックスである方法。
４７．ＨＩＶウィルスに対する抗体の免疫学的な検出及び／又は定量のための抗原被覆固相の調製方法であって、以下の段階：（ａ）ペプチド組成物を合成すること、（ここでその中に一体化されているシステインチオール基は保護されたペプチド組成物を作るために化学的可逆性手段により保護されている）；（ｂ）該化学的可逆性保護手段を該保護されたペプチド組成物から、分子内ジスルフィド結合の形成が行える条件のもとで除去し；（ｃ）該ペプチド組成物を固相に固定化して抗原被覆固相を形成せしめること；を含んで成る方法。