JPH02500590A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペ　プ　チ　ド 本発明の分野 本発明は、ヒト免疫不全ウィルスタイプ１（）ＩＩＶ−１）の免疫学的検出に関 する。特に本発°明は検出に使用される新規なポリペプチドに関する。

本発明の背景 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の最初の症例は１９８１に報告された。疫学 的研究は、この死に至る障害の原因が、現在ではヒト免疫不全ウィルスタイプ１ 　（ＨＩＶ−１）として（Ｐｏｐｏｖｉｃ　Ｍ、　ｅＩａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ 　１９８４，２２４：４９７−５００）知られるヒトレトロウィルスであること を示している。

レトロウィルスの種々のタンパク質が記載され、い（つかのグループにより配列 されてきた。（Ｍｙｅｒｓ　Ｇ、　ｅｔ。

ａｌ、、ヒユーマンレトロウィルス及びＡＩＤＳ：核酸及びアミノ酸配列の編集 及び分析、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＧｒｏｕｐ 、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、　１９８７．ｐ、１］−５３）大部分の感染を受けた 個体において、エンベロープタンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１と反応性の抗体 が製造される。

今までのところ、ＨＩＶ−１に対する抗体の検出は主にａ）全ウィルスの免疫学 的分析 ｂ）遺伝子工学で製造されたウィルスタンパク質の免疫学的分析、または Ｃ）慣用のイムノブロッティング技術を用いて、最初に５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（遺 伝子工学的に生産されたウィルスタンパク質または）ＩＩＶ−ウィルスのコカル チベーシコンにより生産されたウィルスタンパク質）中でウィルスのタンパク質 を分離することにより、及び分離されたタンパク質をニトロセルロースシートに 移し、その後分離されたタンパク質をＩ（ＩＶ−１抗体陽性血清で検出すること により、イムノブロッティングする。

しかしながら、公知の分析方法はいくつかの欠点があるニ 一完全なウィルスを使用する分析においては、試験試薬のための供給材料として 大量のウィルスを培養しなければならない、安全な測定方法であるにもかかわら ず、大きなスケールの培養に伴う危険がある。また、不活性化したウィルスで製 造した試験試薬が生きているウィルスで汚染されうる危険性も存在する。

−遺伝子技術により製造されたタンパク質を使用するＥｌ＾にもあてはまるもう 一つの欠点は、偽陽性試験結果の出現である。これら部分的にはこれらの標本中 の細胞成分の存在に起因する。これは確認試験の実行を必要とする。

一本発明の分析は高価な実験装置または熟練された技術者を要求する。従って、 これらの分析は未発達の国で使用するのにはあまり通さない。

ウィルスタンパク質の保存された“イムノドミナント（ｉ−ｍｕｎｏｄｏｍｉｎ ａｎｔ）″エピトープは、ウィルス誘導抗原に対する魅力的なアルターナティブ （ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）を提供する。複数のそのようなペプチドが、例えば ＬＩＳ　４６２９７８３号に提真されている（ＷＯ−８６１０６４１４に相当） 。

日の−　・な１ 本発明はアミノ酸配列５ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ（−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ− Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｉｃｅ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ　−ν ａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｔｒｐ　−Ａｓｎ　−Ａｌａ−５ｅｒ）に対応するｅｎｖ− ペプチド、該ペプチドの製造のための方法、及び該ペプチドの使用法、特にＨｌ シー１ウィルスに対する抗体の検出のだめの方法に関する。

該ペプチドがＨｌシー１にＩＩシー１に感染された血清に対して高感受性であり 、特異的に免疫学的反応性であることが見出されている。このペプチドを使用す る試験の怒受性及び特異性は、完全なウィルスを使用する試験のものと同じレベ ルである。

新規なペプチドは、慣用的な合成方法により、感染の危険性もなく、便利に製造 されうる。ペプチドの短さのために、配列の組換え技術は使用される必要がない 。

免疫学的研究は、発明されたペプチドが、ＨＩＶ−１中のトランスメンブランタ ンパク質ｇｐ４１の°　イムノドミナント′エピトープＳＲ＋’Ｊから発達した エンベロープペプチドであることを示した。

正確なリクエンス（ｒｅｑｕｅｎｃｅ）が免疫化学的に獲得された等価の配列を 得るためにある程度まで修飾されうることも明らかである。

の　な量゛ 本発明に従って、小さな合成ｅｎシーペプチド５ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰ讐ＮＡＳ が合成されてきた。

該ペプチドはＨＩＶ−１のトランスメンプランプロティンｇｐ４１のｅｎｖ　− 残基５９９−６１３から誘導される。該エピトープはｇｐ４１の疎水性ドメイン に位置するが、それにもかかわらずＩＩＩＶ−１に対する免疫応答を導くことに おいて、高度に免疫原性のエピトープであることが判明した。特に、感染初期の 段階において第一の応答を引き出すようであり、生じた抗体は感染の異なる段階 を通じて存続する。

従って、該ペプチドはＩＩＩＶ−１感染の検出に非常に通している。

検出は、適当な免疫化学的技術、例えば酵素イムノアッセ−（ＥＩＡ）　、ラジ オイ・ムノアッセー（ＲＩＡ）　またはフルオロイムノアッセ−（ＦＩＡ）のい ずれによって行うこともできる。

特に、ｅｎｖ−ペプチドはプロティンキャリアー、例えばアルブミンまたはトラ ンスフェリンに結合されうる。このペプチド抱合体は、該ペプチドに対するウサ ギの抗体またはＩＩＩＶ−１抗体陽性ヒト血清により、免疫化学的に同定されう る。該試験の怒受性及び特異性は、完全なウィルス酵素−結合イムノソルベント アッセーまたは完全なウィルスのイムノブロッティングのものと同様である。

反応の特異性は、抱合されていないｅｎシーペプチドをサンプルのインキュベー ション混合物に添加することにより確認されうる。試験結果は肉眼で読み取り可 能である。

上記のｅｎシーペプチドの代わりに、その免疫化学的に等価な相同物を使用する ことができる。これらの関連するペプチドは、ｅｎシーペプチドに対することを 目的としたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または）ＩＩＶ−１抗体 陽性血清により容易に検出されうる。そのような関連ペプチドは、例えばＳＧＩ ＜ＬＩＣＴＡＶＰＷＮＡＳ　テある。

ｅｎシーペプチドは、個々のアミノ酸から出発して、慣用の方法により合成する ことができる。そのような方法は、例えばＢａｒａｎｙ　Ｇ、、　Ｍｅｒｒｉｆ ｊｅｌｄ　Ｂ、による丁ｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。

ｅｄ、に、及びＧｒｏｓｓ　Ｅ、及びＭｅｉｅｎｋｏｆｆｅｒ　Ｊ、によるＡｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９７９＋　ｐ、　１−２ ８４　に記載されている。

次に、ｅｎｖ−ペプチド、その製法及びその適用性、並びにＨＩＶ−１を検出す るための使用をさらに例示する。

添付された図面において、 Ｆｉｇ、１　は参考ポリュレーション（ｐｏｌｕｌａｔｉｏｎ）及びＨｌシー１ 惑染した患者におけるｅｎシーペプチドＥＩＡの反応性を示し、 Ｆｉｇ、２はＨＩＶ−１感染の異なる段階におけるｅｎシーペプチドＥＩＡの反 応性を示し、 Ｆｉｇ、３Ａ及び３ＢはｅｎシーペプチドＥＩＡの完全なウィルスＥｌＡとの怒 受性の比較を示し、そして Ｆｉｇ、４　はｉｌｌシー１プロティン及びｅｎシーペプチド−ＢＳＡ抱合体の 異なる抗体サンプルを用いてのイムノブロッティング分析を示す。

ｅｎｖ−ペプチドのム ｅｎｖ−ペプチド５ＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ　（後のＥＰ−ペプチド）及 び関連ペプチド５ＧＸＬＩＣＴＡＶＰＷＮＡＳ（後のｐｐ−ペプチド）は、第三 ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）　−メチルベンジル−システィン−フェニル −アセトアミドメチル（ＰＡＭ）ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）上で、化学的に合成される。

ベンジルベースの側鎖保護及びα−アミノ基第三ブチルオキシカルボニル（ｔ− ＢｏＣ）保護が、アミノ酸（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｔｅｍ）　に使用される。

ペプチドは樹脂から引き離され、保護基は慣用方法により除去される０合成ペプ チドは逆相高性能液体クロマトグラフィーで精製される。アミノ酸配列は自動化 されたＥｄｍａｎ分解により、ガス相シーケンサ−を用いて確認される　（Ｍｏ ｄｅｌ　４７０Ａ、　ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　、ペプチドの純 度は、アミノ酸配列データをベースとして約９９％である。

ブローインに・するｅｎｖ−ペプチドのカップリング化学的に合成されたＥＰ− ペプチド及びＲＰ−ペプチドはキャリヤープロティン、例えばヘテロ三官能性架 橋剤、例えばｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ ＭＢＳ）　（ｌｊｕ　Ｆ、−↑、、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１９７９、１８：６９０−６９７）を用いることによりアルブミンに結合する。

Ｎ単に言えば、ナトリウムホスフェートｌｏｓＭ（ｐＨ７，２）中のウシ血清ア ルブミン１■をジメチルホルムアミド中、２５°Ｃで３０分間、１１Ｂｓ　４０ ■とインキュベートする。

未反応の？ｌＢＳ及び溶媒を、ナトリウムホスフェート緩衝液（ｐＨ６，０）中 で平衡させたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　ＰＤ−１０（ＴＭ）カラム により除去した。担体プロティンに比較して１００モル過剰のペプチドを、反応 混合物に添加し、さらに２５°Ｃで３時間インキュベートする。カップリングし ないペプチドは、繰り返されたジアシルにより除去さカップリングされたＥＰ− ペプチド及びＲＰ−ペプチド（１００μｌ中、約１μｇのペプチド１５μｇ　Ｂ ＳＡ　）をＥＴＡの製造に使用した。ポリスチレン微小滴定板を、燐酸塩緩衝Ｗ ７．（ＰＢＳ　；　１０ｍＭナトリウムホスフｓ　）、０．１ＭのＮ　ａ　Ｃ１ ＋ｐＨ１，４）　中のＢＳＡ　にカップリングする。コートされたプレートを３ ７℃で２時間、血漿検体（１％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０　（ＴＭ） を含有するＰＢＳ中、１：４０に希釈）とともにインキュベートし、未結合の抗 体を０．０２％のＴｗｅｅｎ　２０を用いて３回の洗浄（２００μりにより除去 した。その後、該プレートを５ｈｉｎ　抗−ヒト　ＩｇＧ　アルカリ性　ホスフ ァターゼ　コンジュゲー）　（Ｌａｂｓｙｓｔｅｓｓ　Ｏｙ）と３７℃で１時間 反応させ、続いて、上記のように３回洗浄し、基材としてのパラニトロフェニル ホスフェート（シグマ）に暴露する。吸収価を微小滴定板リーダー（Ｍｕｌｔｉ ｓｋａｎ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　）を用いて測定した。

合成ペプチドは１５個のランダムに選択されたＨＩＶ−１抗体−隅性血清により 、並びに１０個の旧Ｖ−１抗体−陰性血清により、上記の酵素イムノアッセーを 用いて、それらの特異的に認識される能力について試験される。結果を第１表に 示す。

第１表：１５個のＨＩＶ−１抗体陽性血清サンプルの抗ペプチドＥＴＡ−滴定 血清　ＥＰ−ペプチド　Ｉ’ＩＰ−ペプチド−選択された血清サンプルの陽性及 び陰性が、二つの抗体ＥＴＡ試験、Ｖｉｒｏｎｏｓｔｉｋａ　）ＩＴＬＶ　−ｍ 　（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）及びラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓ　ｔ ｅ＋＊ｓ）の完全なウィルスリセードキットにおいて研究され、そしてラブシス テムズにより製造された完全なウィルス抗原ストリップを用いてイムノプロッテ ィングにより確認された。各ペプチドと血清との反応性は、半飽和血清希釈にお いて、抗体希釈の逆数として定義された。ＥＰ−ペプチド及びＲＰ−ペプチドは 全ての抗体−陽性血清と反応した。陽性反応はＥＰ−ペプチドのインキュベーシ ョン混合物への添加（１００８８７紙） により総合的に抑制されるであろう。

参考のために、試験は、同様に製造され、結合された非関連のペプチド？ｌＤ］ ＰＱＴＫＱＤＬＥＬＰＫＬＡＧ（後のＵＰ−ペプチド）でも行われた。ｔｌＰ− ペプチドとのインキュベーションは反応性に影響しなかった。υＰ−ペプチドは ＨＩＶ−１抗体−隅性血清との反応は与えなかった。　Ｈｌシー１抗体−陰性血 清は、いずれのペプチドも認識しなかった。

上記の免疫学的反応の特異性は、１００ないし２００　μｇ／ｄの遊離のＥＰ− ペプチドを研究された血清サンプル（または血液サンプルまたは他の体液）へ添 加し、サンプルとのＥＰ−抱合体を含む固体支持体をインキュベートすることに より確認することができる。

Ｅｌ＾　いての、　、　力 ｌ０００のＨＩＶ−１抗体−陰性血液供与者及び種々の［Ｖ−１感染段階の１４ ４の固体を用いて、イムノブロッティング及び完全なウィルスＥＩＡにおいてセ ロポジティブであるＥＰ−ペプチドＥＩＡの臨床的評価を行った。結果を第１図 に示す、異なるＥＩＡ決定の間でバリエーションの効果を避けるために結果を計 重し、Ｆｉｇ　ｌ　に示した等式による酵素イムノアッセー担体（ＥＩＵ）　と して表わした。

１０００のＨＩＶ−１抗体−陰性血液供与者の血清は、ＥＰ−ペプチドＥＴＡに おいて、０．９　ＥＩＵの平均値及び１．２　ＥＩＵの標準偏差（＋ＬＳＤ）を 与えた。カットオフ値（４，２Ｅｌｔｌ）は平均値十標準偏差×２の２倍になる ように合わせた。

血液供与者の血清の中で、カットオフ値より高いＥＩＡ値を示すものはなかった 。　ＨＩＶ−１に感染し、そして完全なウィルスＥＲＡ　及びイムノブロッティ ングにおいて陽性の１４４人の患者のうち、１４３人がカット−オフレベルを超 えた価を有し、４３％が測定範囲（１５０Ｅｌｌｌ）を超えた値を有した。

ＨＩＶ−１感染の異なる段階の抗体の反応性も比較された。

結果をＦｉｇ　２に示す、　ｅｎシーペプチドＥＩＡは、全部で９４人の無症候 性の愚者（ＡＳＸ）全て、ＬＡＳを有する患者２９人のうち２８人、８人のＡＲ Ｃ！Ａ者全て、及び研究されている１３人のＡ　Ｊ　ＩＩ　Ｓ　患者全てを検出 した。

ＥＰ−ペプチドＥ４Ａの偽陽性の割合は容易に陽性反応を示す血清のパネルにお いて研究された。結果を第２表に示す。

患者群　ＥＰ−ペプチド　完全なウィルＥＩＡにおいて　スＥＩＡ”にお 陽性　いて陽性 腎臓移植　０／２０（１００％）　Ｏ／２０（１００％）血液透析下の患者　０ ／２０（１００％）　Ｏ／２０（１００％）種々の感染　２１５０（９６％）　 １３１５０（７４％）本ピロノステイカ　（Ｖｉｒｏｎｏｓｔｉｋａ）　ＨＴＬ Ｖ　−ｍ　（オルガノン（ｏｒｇａｎｏｎ）　キットが使用された。

ＥＰ−ペプチドアンセーの偽陽性の割合は２．２％であり、完全なウィルスＥＴ Ａにおいては１４．４％であった。

容易に感染を検出する試験の感度は、性的感染によりＨＩＶ弓に暴露されること が知られているが、最初の試験におけるイムノブロンティング及び完全なウィル スＥＩＡの両方においてセロネガティブである二人の患者Ａ及びＢにおいて先を 見越して研究された。結果をＦｉｇ　３Ａ及びＦｉｇ　３Ｂに示す。ＥＰ−ペプ チド抗体は、完全なウィルスＥＩＡにおけるイムノブロッティング　プリサイデ ィング（ｐｒｅｃｉｄｉｎｇ）反応によりセロコンバージョンが見うれる時間に 、明らかに検出可能であり、カットオフレベルの２ないし３倍である。（患者Ａ ）、シかしながら、イムノブロンティングにおいて、ｇｐ４１に対する抗体はそ れらがペプチドＥｌ／ｌにおいて検出可能である時間には現れない。

ｅｎシーペプチドに・するヒト　の　１ＥＰ−ペプチドは、カップリング剖とし て―−＋ｍａｌｅ−イミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（？ ｌＢＳ。

Ｓｔｇｗａ）を用いて、カルボキシ末端システィン残基を通して、ＡＨ−セファ ロース−４８（Ｐｂａｒ＋５ａｃｉａ）にカップリングされた。セファロース（ ｌｏＯ＋ｍｇ）　は最゛初にｐＨ７，４の１０１１０１Ｉ１／！のＫｚＨＰＯ， 及び１５０ｍｍｏｌ／　ｌのＮａＣ］緩衝液（ＰＢＳ）中で膨張させた。ジメチ ルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）中の３％のＭＢＳｉｎ（５０μりを１−のセファ ロース懸濁液に添加し、その後、室温で３０分分間中かに撹拌した。該セファロ ース懸濁液をＰＢＤで２回洗浄し、１１ｇのペプチドを添加した。カップリング 後、ペプチド−セファ０−スを２ｄのセファロース−４８（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉ ａ　）　と混合し、アフィニティカラムの製造に使用した。全てがペプチドＥＩ Ａに高度に免疫反応性である１０の）ＩＩＶ−１抗体−陽性血清のプール清を、 カラムからＰＢＳで溶離した後、１０ｒａｍｏｌ／　１２のリン酸塩緩衝液（ｐ Ｈ７，４）中の５００　＋ａｍｏｌ／　４２のＮａＣ１で洗浄した。

カラム−結合Ｉｇ分子を１００ｉ＊＊ｏｌ／　１２のＧｌｙ−ＨＣＩ緩衝液（ｐ Ｈ２，８）で溶離し、その後、酸緩衝液を、セファデックスＧ２５（ＴＭ、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）カラムを用いてＰＢＳに変えた。

ｅｎｖ−ペブ　ド　びアフィニー　したｅｎシーペプチドにるヒト　いたイムノ プロ・ティング イムノブロッティングのために、ＭＢＳを経てＢＳＡに結合したＥＰ−ペプチド （３μｇ）を、１０％（賀ハ）のポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） を用いて、還元下（１％のβ−メルカプトエタノール）で走らせた０分離後、ペ プチドをニトロセルロースに移し、１：１００に希釈されたＨＩＶ−１−陽性ま たはｆＩＩＶ−１−陰性血清との、または精製された抗ペプチドＩｇフラクショ ンとの免疫反応性を試験した；これらの希釈物はＥＰ−ペプチドＥＩＡに対して 等しい吸収価を示した。さらに、ＥＰ−ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを、そ のウサギ抗−ＢＳＡ抗血清（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　との 免疫反応性について試験した。結合抗体はウサギ　抗−ヒトＩｇ−パーオキシダ ーゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ）により、並びにスワイン抗−ウサギＩｇ−パー オキシダーゼコンジュゲート（Ｌｉｕ　Ｆ、−Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９、１８：６９０〜６９７）により検出された。

ｅｎｖ−ペプチドを　いたＲＩＰＡ ラジオイムノ沈降分析（ＲＩＰ＾）抗原の製造のために、ＨＩＶ−１−感染した ＣＩＯ／？ＩＴ２細胞の対数増殖期の培養液を使用した。飢餓の後、２Ｘ１０’ 個の細胞を懸濁液中の’３ＳＳ−システィン（０，５ｍ　Ｃｉ）で、３７°Ｃで ２２時間代謝的に標識した。細胞リセートは、細胞をペレット化し、ＰＢＳ中で 洗浄し、リシス（ｌｙｓｉｓ）緩衝液（０，５＋１）　（１４０ｍＭのＭｇＣＩ ｚを含存する１０１トリス−！’ｌｃ１．１ｍＦ　のＰＭＳＦ、及び０．５　％ のＮＰ−４０ｐＨ８，０）を含有する非イオン性界面活性剤を使用することによ り、製造された。沈降分析のために、この抗原標本が血清サンプル１５μ！あた り３０μ！使用された。沈降物は、タンパク質Ａセファロース（Ｐｂａｒｍａｃ ｉａ）　に集められ、広範囲にわたる洗浄の後、５ＤＳ−β−メルカプトエタノ ール（１％）と共に煮沸され、５Ｏ５−ＰＡＧＥ（１２％）中で分析され、その 後オートラジオグラフィーが行われた。

分析の結果をＦｉｇ　４に示す。

ｅｎｖ−ペプチドを　いた　法 Ｈｌシー１−怒染Ｈ９細胞を、ポリーＬ−リジン　（シグマ）をコートしたガラ ススライドに付ける。細胞をＰＢＳ中の３．５％のバラホルムアルデヒド（リー プルーデーバーン）に固定する。固定した細胞を、ＰＢＳ中の０．０５％のサポ ニン（Ｍｅｒｃｋ）で透過させ、ＰＢＳ−サポニンのウサギ血清で処理した。細 胞は分画されていない旧Ｌｌ血清プールで、または１：５０に希釈されたＨＩＶ −１−ネガティブビト血清で、または抗−ペプチド１ｇフラクション（２３μｇ ／ｄ）で、まで３０分間染色した。細胞はＰＢＳ−サポニンで３回洗浄し、結合 抗体をビオチン化したヒツジ抗ヒ）ＩｇＧ　と、３７℃で３０分間インキュベー トすることによりフルオレセインーストレブトビジン抱合体（Ａｍｅｒｓｂａｍ ）で検出した。

−肱」Ｌ弐ｙ謬λ圀− 下記の方法はＨＴシー１抗体陽性血清の診断試験に適する。

カップリングしたＥＰ−ペプチド（１００ｐｌ中、約１μｇＥＰ−ペプチド７５ μｇ　ＢＳＡ）及びさらにＵＰ−ペプチドが例えば小さなスポットとして固体の 支持体、例えばニトロセルロースに吸収される。°未吸収のペプチド抱合体を、 例えば５０−ＨのナトリウムホスフェートｐＨ７，２（ＰＢＳ）を用いて洗浄す る。その後、固体の支持体を、０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ＴＭ）を 含有する、５０−Ｈのナトリウムホスフェート＋ｐＨ７−２中のタンパク１ｉｉ Ｓ液、例えばアルブミン（約５ｍｇ／１００　ｄ）中で、約１時間インキュベー トする。その後、ＥＰ−抱合体及びＵＰ−ペプチドを、研究した血清サンプルと ともに約１時間インキュベートする。未結合のサンプルをＰＢＳで洗浄する。Ｅ Ｐ−ペプチド抱合体に吸収された抗体は、その後、固体支持体をその存在を酵素 基材の添加により決定することができる酵素マーカーに結合した抗ヒトＩｇＧ　 と共にインキュベートすることにより検出することができる。マーカーとしては 、例えば、例えば０−フェニレンジアミンを添加することにより決定されうる、 ホースラディツシュパーオキシダーゼ（）ＩＲＰ）が使用されうる。（当然なが ら、抗−ＩｇＧ　ｆｃ標議する他の方法は多数ある。）陽性の結果は、肉眼によ る試験により、ＥＰ−ｍ合体を含有するスポットが着色された反応を生じるが、 ｕｐ−ｍ合体が未着色のままであるときに、決められる。陰性の結果は、ＥＰ− 抱合体を含有するスポットが着色反応を生じないか、またはＵＰ−抱合体と同じ 色を生したときに決められる。

ＦＩＧ、１゜ ＦｔＧ、２゜ ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、４゜ ．４１４ 針、４１　″“１ °”園　１ ニー °′］暮＝　ヒ）ｒｌｌ 国際調査報告 ｈｍ岬嗜−−ｍｌＡＩ＋ｍＪ１＃”’ＰｃＴ／ＦＩ８Ｂ１０００［１３

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列が、配列ＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳに相当することを特 徴とするポリペプチド及びその免疫化学的に等価な相同物。
2. ２．配列が、ＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳであることを特徴とする請求項１ 記載のペプチド。
3. ３．配列がＳＧＫＩＣＴＡＶＰＷＮＡＳであることを特徴とする請求項１記載の ペプチド。
4. ４．ペプチドの配列が配列ＳＧＫＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳに相当し、該ペプチド が対応するアミノ酸から出発して合成されることを特徴とするポリペプチドの製 造方法。
5. ５．ペプチドのアミノ酸配列が配列ＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳに相当する ことを特徴とする、ＨＩＶ−１に対する抗体との免疫化学的な複合体を形成する ことのできるポリペプチド、またはその免疫化学的に等価な相同物を、サンプル とともにインキュベートし、免疫化学的な複合体の形成を調べることからなるサ ンプル中のＨＩＶ−１ウイルスに対する抗体の検出方法。
6. ６．ペプチドがプロテインキャリアーに結合されることを特徴とする請求項５記 載の方法。
7. ７．免疫複合体形成の特異性が、インキュベーション混合物に結合しないペプチ ドの添加により確認されることを特徴とする請求項５項または６項記載の方法。