JPH03504165A

JPH03504165A - Ｈｔｌｖ‐１抗体に対する免疫反応性を有する合成ペプチド組成物

Info

Publication number: JPH03504165A
Application number: JP2503823A
Authority: JP
Inventors: ワン，チャン・イ
Original assignee: ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-01-13
Filing date: 1990-01-16
Publication date: 1991-09-12
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: DE69015708D1; DE69015708T2; ATE116660T1; EP0404935B1; CA2025019C; WO1990008162A1; EP0404935A1; EP0404935A4; JP2643598B2; CA2025019A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＴＬＶ−ｒ抗体に対する免疫反応性を有する合成ペプチド組成物本出願は、１９８９年１月１３日付けの係属中の米国特許出願第０７／２９７６３５号の一部継続出願であり、後者の出願は１９８９年５月２３日に米国特許第４８３３０７１号として発行された１９８７年１月９日付けの米国特許比ｇ第０７１００１８８５号の一部継続出願である。

ヒトＴ細胞白血病ウィルスはある種の成人リンパ様悪性疾患、特に成人工細胞白血病−リンパ腫（ＡＴＬ）およびヘアリー・Ｔ細胞白血病（ＨＴ　Ｌ　）に関連している（ｌ−３，２４および２５）。２つのサブグループ、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−■が確認されている。今日に至るまで、この研究のほとんどは日本でＡＴＬ患者に広まっているＨＴＬＶ−Ｉに集中している。

しかしながら、最近の研究により、ＨＴＬＶ−ＴＩが米国の主要都市で静脈内薬物常用者の間により多く広まっていることが分かった（２７．２８）。ＨＴＬＶ蛋白と反応する抗体はＡＴＬ患者の血清中に見いだされた。これらのＨＴＬＶ抗体はこのウィルスのｇａｇコア抗原とエンベロープ蛋白の両方を認識する（４．５．２７）。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）の原因となるレトロウィルスである。ＨＩＶ蛋白と反応する抗体はＡ　Ｉ　０５８よびＡＲＣ患者の血清中ｌこ見いだされた。

これらのＨＩＶ抗体はＨＩＶウィルスのｇａｇコア抗原とエンベロープ蛋白の両方を認識する。米国では、ＡＩＤＳがＡＴＬよりもかなり多く広まっており、ＨＩＶに対して血清陽性を示すヒトの一部はＨＴＬＶに対しても血清陽性である。

本発明は、合成ペプチド組成物を使用して体液中のＨＴＬＶ−■および／またはＨＴＬＶ−ｎに対する抗体を検出するための非常に感度のよい方法に関する。本発明はさらに、合成ペプチド組成物を使用して体液中のＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ −Ｉ［およびＨＩＶに対する抗体を同時に検出するための高感度方法に関する。

１つのペプチド組成物は、ＨＴＬＶ−ＩおよびＴ（ＴＬＶ−Ｔｌｅｎｖ蛋白の外側ｃｍ胞外）部分（ｇｐ４６と呼ばれる）のセグメントに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを含み、ざらにＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−１［ｅｎｖ蛋白のトランスメンプラン部分（ｇ、ｐ２１と呼ばれる）のセグメントに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。これらの配列はＡＴＬまたはＨＴＬ患者の血清中の抗体と高度に免疫反応性であることが判明した。また、この種のペプチド組成物は、ｉ！康な哺乳類（ヒトヲ含ム）ニおけるＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−Ｉ［感染症に対して防御を賦与する、ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−１１抗体の生産を刺激することによってＡＴＬまたはＨＴＬＶ−ＩＩ惑感染を予防するためのワクチンの製造に有用である。さらに、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−１１エンベロープ蛋白の部分に対応するアミノ酸配列をもつペプチドを含むペプチド組成物は’、ＨＩＶエンベロープ・コア蛋白の部分に対応するアミノ酸配列をもつペプチドを含むペプチド組成物と共に使用して、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ｎおよびＨＩＶに対する抗体を同時に検出することができる。

より詳細には、本発明は、指定した配列で約３４．４０．３８．２０．２４８よび１６ｆｆｌｌのアミノ酸またはそれらの類縁体を含む化学合成ペプチド；その類縁体、セグメント、混合物、複合体および重合体より成る群から選ばれるペプチドを含む、ＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の検出に有用なペプチド組成物に関する。本発明はさらに、指定した配列で約２１．１９．１１および１６個のアミノ酸を含む化学合成ペプチド；その類縁体、セグメント、混合物、複合体および重合体より成る群から選ばれるペプチドを含むＨＩＶペプチド組成物と共にＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ−ＩＦペプチド組成物を使用して、ヒト体液中のＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩおよびＨＩＶに対する抗体を同時に検出することに関する。また、本発明はＨＴＬＶ感染症、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−［５染症、の診断方法を提供する。

検出方法には酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、ニトロセルロースペーパー上でのマルチ−ドツト、マルチ−ラインまたはマルチ−スクエアブロッティング、および固相抗原としてペプチドを使用する間接赤血球凝集反応アッセイが含まれる。

好適な検出方法はＥＬ　Ｉ　ＳＡである。

発明の背景ヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウィルス（ＨＴＬＶ）は、Ｔ細胞リンパ腫および皮膚疾患ををする患者から初めて分離された関連レトロウィルスのｌ属である。この属の特定サブグループである■型（ＨＴＬＶ−Ｉとして知られている）は、日本（６−９）、カリブ海諸島（１０，１１）および米国南西部（１２）の地域に発生する成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫（ＡＴＬ）と呼ばれる疾患と臨床的・疫学的特徴を共有する悪性疾患の病原体と同定された。ＨＴＬＶ−Ｉｔについては既知風土病の地方が存在せず、またＨＴＬＶ−ＩＩと特定疾患との既知因果関係も存在しない。静脈内薬物常用者に感染したＨＴＬＶ−Ｉ［ウィルスの起源は分かっていない。ＨＴＬＶ−ｎに関する広範な血清罹患率の研究は行われていない。

ＨＴＬＶ−ｎはＨＴＬＶ−Ｉと構造的に極めて類似している。

２つのウィルスは約５０％の配列相同を共有する（２９）。ＨＴＬＶ−ｎはへアリ−・細胞性白血病の患者から分離されたが、因果関係は分からなかった。ＨＴＬＶ−Ｉ［のｅｎｖ蛋白のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の６９％がＨＴＬＶ− Ｉと同一であり、さらに追加の１４％のアミノ酸が保存的置換を示す（３０，３１）。Ｘおよびｐａ１遺伝子はｅｎｖ遺伝子よりも一層高度に保存されている（３２）。

ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩ間の高度な相同性のために、全ウイルスリゼイトまたは組換え蛋白に基づいたＨＴＬＶ−１についてのＥＬ　Ｉ　ＳＡによる標準試験アッセイはＨＴＬＶ−ＩＩとも交差反応する。米国特許第４８３３０７１号に開示されたペプチドもＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｎと交差反応性である。ＨＴＬＶ−ｉとＨＴＬＶ−ｎのｅｎｖ蛋白を識別するのに効果的な血清学的ア、ンセイは存在しないが、２つのウィルス間の抗原的差異は水痘性ロ内炎つィルス偽型の中和により検出された（５）。ＨＴＬＶ−Ｉ酵素イムノアッセイにおいて反応性のサンプル中にＨＴＬＶに対する抗体が存在することを確かめるために、２つの補足的方法が使用された。ＨＴＬＶ−Ｉについてのウェスターンプロント法は、コア蛋白ではｐ１５、ｐ１９、ｐ２４、ｐ２８、ｐ　３２、ｐ　３６およびｐ５５に、そしてエンベロープ蛋白ではｇｐ４５とｇｐ６１にバンドを与える（３２）。ＨＴＬＶ−Ｉについてのラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩ　ＰＡ）は、ｅｎｖ蛋白ではｇｐ４５とｇｐ６１に、コア蛋白ではｐ２４とｐ５５に、モしてＸ領域ではｐ４０ｘにバンドを与える（３１）。しかしながら、どちらの試験も２つのウィルスを識別しない。

最近、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩを識別するため４：　Ｐ　ＣＲが使用された。ＰＣＲ法は明確な結果をもたらす（２８）。しかしながら、その鋭敏な感度ゆえに、この方法は誤った陽性の結果を出しがちである。その上、この試験は非常に時間がかかり、しかも多くの費用を要する。

現在のところ、ＨＴＬＶ−Ｉの伝播機構は未知であるが、分子および疫学的分析によりＨＴＬＶの水平伝播が明らかに関係していると分かった（１３．１４）。

ＡＴＬを風土病とする地域でのＨＴＬＶ−Ｉ血清陽性は全住民において上昇しており、さらに患者の近親者および輸血を受けた者の間で上昇している（１５．１６）。ＨＴＬＶ−ＩＩ血清陽性は米国の主要都市の静脈内薬物常用者において確認されている（２７．２８）。

このことは、血液サンプルが血液銀行に入る前にそれをスクリーニングするために、そしてＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ｎ感染者に由来する献血を分離して輸血を受けなければならない患者（例えば、血友病者および手術患者）の間にウィルスが広がるのを避けるために、安全で、信頼できる、感度の高い試験法が早急に必要とされていることを意味する。

ＨＴＬＶ−Ｔ感染とＨＴＬＶ−ＩＩ感染を識別するための迅速で、安価な試験法も早急に望まれている。１９８８年以来、ＨＴＬＶ−ｒについての全ドナーの強制的スクリーニングが実施されており、ＨＩＶだけでなくＨＴＬＶ−Ｉに対しても反応性のドナーにはそれらの結果を通知しなければならない。ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ７Ｉ［のどちらのウィルスが血清陽性の原因になっているかが不確かであると、ＡＴＬまたはＨＴＬＶ−Ｉの神経学的合併症にかかる危険性について正確にドナーに助言することが非常に難しくなる。また、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ −■とを区別する方法は、ＨＴＬＶ−Ｉ［の風土病地域を定めるための血清学的研究および両ウィルスの病原性研究にとっても重要である（３３）。

ＨＴＬＶ−Ｉウィルスの完全なヌクレオチド配列は１９８３年に報告された（１７）。この報告はＨＴＬＶ−Ｉウィルスの構造をＤＮＡレベルと推定された蛋白レベルの両方で明らかにし、ＨＴＬＶ−１ウイルスに存在しうる異なるエピトープの血清学的研究を可能にした。ＨＴＬＶ−Ｉ［ウィルスのヌクレオチド配列は１９８４．１９８５および１９８６年に報告された（３０．３１１３２）。

１９８３年の５ｅｉｋｉ　ｅｔ　ａｌの報告と同時に、国立がん研究所のＣａｒｌ　Ｓａｘｉｎｇｅｒ博士は、アフリカの人々のＨＴＬＶ−Ｉ抗体を検出する酵素イムノアッセイの開発において、単離したＨＴＬＶ−Ｉウィルスの固相免疫吸着剤としての使用を報告した（１８）。

さらに、Ｓａｎ＋ｕｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９）は、ＡＴＬ患者由来の血清中の抗体と免疫学的に反応するＨＴＬＶ−Ｉ　　ＤＮＡコード化糖蛋白を同定するために、Ｅ、ｃｏｌｉ内のクローニング・発現ベクターが使用されたと報告した。エンベロープ蛋白をコードするＨＴＬＶ−Ｉ　　ＤＮＡは切断して断片となし、発現ベクターに挿入した。この発現ベクターは形質転換によりＥ、ｃｏｌｉ宿主に導入した。ｐＫｓ４００と呼ばれる１つのクローンがエンベロープ蛋白産物を生産し、この蛋白は１群２８の血清をスクリ−ニングするための免疫吸着剤として適していることが判明した。細菌が合成したＨＴＬＶ−１工ンベロープ蛋白配列を認識する抗体は、破壊ヴイリオンを抗原として用いたＥＬＩＳＡアッセイで調べたときＨＴＬＶ抗体を含んでいた、すべての血清中に存在していた（１８）。

Ｓｌａｍｏｎ　ｅＬ　ａｌ、の出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１８０３　（１９８６年３月２７日に公開番号ＷＯ３６１０１８３４とシテ発表された）は、ＨＴＬＶ−ＩのＸ領域（このウィルスのｅｎｖと３’　ＬＴＲの間にある高度に保存された領域）の発現産物としてＨＴＬＶ−Ｉの免疫原部位と関係したポリペプチドを開示した。分子量３７〜４０ｋｄのこれらの蛋白はクローン化して、Ｅ、ｃｏｌｉにより融合蛋白として発現させた。得られた産物は精製し、血清をスクリーニングするための液相免疫沈降試験において使用した。これらの結果は約７７〜８７％の正確さを示した（２０）。上記の方法はすべて、免疫反応性を検出する際に使用した抗原のために、ＨＴＬＶ−１感染とＨＴＬＶ−ＩＦ感染を識別することができなかった。

蛋白の表面にある抗原または免疫原部位をマツピングするために、あるいは可能なワクチンとして、合成ペプチドが次第に使用されるようになった。以前に、本発明者と共同研究者は、ＨＩＶ　（以前にはＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ［ｒと呼ばれた）のエンベロープ蛋白上の高度に抗原性のエピトープを同定するために、モしてＨＴＶ抗体を検出する高感度の特異的イムノアッセイを開発するために、この手法を用いた（２１）。１９８８年４月５日付けの米国特許第４７３５８９６号および１９８９年１１月７日付けの米国特許第４８７９２１２号も参照されたい；これらの特許の開示内容は参照によりここに引用するものとする（２２．２３）。本発明では、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩの高度に抗原性のエピトープを選択・同定するために、類似の手法が使用される。エピトープ分析のためのエンベロープ蛋白の領域を選択する際に、いくつかの戦略が用いられた。第一に、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩとの間でアミノ酸配列の比較的高い保存を示す領域が検索された。第二に、ＨＴＬＶエンベロープ蛋白のトランスメンブラン部分（第１図参照）、ｇｐ２１の全領域をカバーする多重複線状ペプチドが合成され、特性決定された。第三に、ＨＴＬＶエンベロープ蛋白の外側部分（第１図参照）、ｇｐ４６の全領域をカバーする多重複線状ペプチドが合成され、特性決定された。以下の配列をもつトランスメンプラン部分からの３種のペプチド（第２図参照）およびそれらの混合物は、ＡＴＬ患者由来の血清と高度に免疫反応性であることが分かった：ＧＬＤしＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＬＱＥＱＣ−ＮＯ２（Ｉ）ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＩ、ＣＫＡＬＱＥＱＣ−Ｎ１４２　（ＩＩ）ＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ−Ｎ１１２　（Ｉ　Ｉ　Ｉ　）また、次の配列をもつ外側部分からの３種のペプチドおよびそれらの混合物も、ＡＴＬ患者由来の血清と高度に免疫反応性であることが判明した（第３図参照）：ＡＰＰＬＬＰＨ５ＮＬＤＨＩＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶＱＬＴＬＱＳ−ＮＯ２（ＩＶ）ＳＳＴＰＬＬＹＰＳＬＡＬｒ’ＡＰＩｌＬＴＬＰＦＮＷＴＨＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨ−ＮＯ２（Ｖ）ＣＦＤＰＱＺＱＡＩＶＳＳＰＣＨＮＳＬＩＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲＳＲＲＡ−Ｎ１４２（ＶＩ）ここで：Ａ＝Ａ　Ｉ　ａ−アラニン　　　　Ｇ−Ｇｌｙ−グリシンＲ−Ａｒｇ−アルギニン　　　ｌ−１１ｅ−インロイシンＤ＝Ａｓｐ−アスパラギン酸　Ｆ−Ｐｈｅ− フェニルアラニンＮ＝Ａｓｎ−アスパラギン　　Ｓ−５ｅｒ−セリンＱ−Ｇ　ｌ　ｎ−グルタミン　　　Ｗ−Ｔｒｐ＝トリプトファンＥ−Ｇｌｕ−グルタミン酸　　Ｙ−Ｔｙｒ−チロシンＬ−Ｌｅｕ−ロイシン　　　　Ｖ−Ｖａｌ−バリンに＝Ｌｙｓ−リシン　　　　　Ｃ−Ｃｙｓ−システィンＨ−Ｈ４ｓ−ヒスチジン　　　Ｐ−Ｐｒｏ−プロリンＴ−Ｔｈｒ−）レオニンＨＴＬＶ−Ｉのペプチド■に対応し、ＨＴＬＶ−Ｉ［の同一領域に存在する類似ペプチドの例は次の配列を含む：ペグチドエ、■および■は米国特許第４８３３０７１号として発行された親出願に開示されている。

化学合成ペプチドを土台としたＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ−Ｕ抗体のアッセイは、破壊した全ウィルスまたは細菌が生産した免疫吸着剤を用いるアッセイと比べていくつかの利点を示す。これらのペプチドは自動固相合成法を使ってダラム量で簡単に合成することができ、こうして再生産可能な同一抗原が一貫した収量で得られる。生物学的系からの抗原の分離はこのような再生産を妨げる。より重要なこととして、非ＨＴＬＶ−Ｔまたは非ＨＴＬＶ−ＩＩ感染者に見られる非特異的反応は、アッセイに使用した調製物の異成分によると思われる。これは特に免疫吸着剤として全ウィルスまたはＥ、ｃｏｌｉ誘導組誘導度物を用いたアッセイの場合に当てはまる。これらの方法では、宿主細胞の内因性細菌蛋白または主要組織適合抗原がしばしば目的の抗原ウィルスまたは蛋白と一緒に精製される。これらの汚染抗原に対する抗体は往々にして正常な人々にも見られるので、一般に行われている抗原分離法では偽陽性結果を排除することができない。

従って、本発明のアッセイは、他の方法が直面する偽陽性反応を明らかに排除すると同時に、実質的に増大したシグナル対ノイズ比によって真に陽性の血清に対して高い感度を示す。この増大したシグナル対ノイズ比は免疫吸着剤の純度から生じると思われる。また、本発明アッセイは、ペプチド■およびそのＨＴＬＶ− ｎ類似体（ペプチドＸ）がＨＴＬＶ−１まｆ：　ハＨＴＬＶ−ＩＩ感染血清を識別するのに有用であるという点で高度に特異的である。換言すると、ペプチド■ はＨＴＬＶ−１に対する抗体を優先的に検出してＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を検出せず、この逆も言える。

さらに、今日まで、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉ［感染症に対して防御を賦与する生ワクチンまたは方法がまったく報告されていない。不活化ウィルスの利用は病気にかかる恐れを誘発し、その許容性および使用を妨げる。

それ故に、本発明の目的は、テスト試薬としてウィルスまたはそのリゼイトの使用を必要としない検出・診断方法を開発することである。

別の目的は、感度と精度の高いテスト方法を開発することである。

他の目的は、化学的手段によりテスト試薬を製造することである。合成試薬はその後体液中のＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の存在を検出しかつＡＴＬを診断するために使用され、これによりウィルスまたはそのセグメントにさらされる危険およびウィルスの不必要な増殖を回避することができる。

また、本発明の目的は、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩ感染症を識別できるテスト試薬および方法を提供することであり、これによりＨＴＬＶ−ＩＩウィルスが原因で起こる病気、ＨＴＬＶ−■感染症の病因を研究することが可能になり、さらにＨＩＶとＨＴＬＶ−Ｉｔの両方に感染した患者におけるＨＩＶ感染症の発生に対するその影響を研究することが可能となる。

他の目的は、健康な哺乳類（ヒトを含む）に注入したとき、ＨＴＬＶ−Ｉ抗体の生産を刺激してＨＴＬＶ−ｒ感染症に対して防御を賦与するワクチンを開発することである。

別の目的は、ＨＴＬＶ−１に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を開発するために、哺乳類に使用することのできる非ウィルス免疫原を提供することである。

他の目的は、ＨＴＬＶ　（Ｉおよび■）抗体とＨＩＶ抗体を同時に検出するための診断方法を開発することである。

話１、　１１．Ｊ、　Ｐｏ１ｅｓｚ、、　ｅＬａ　］、　、　、　ＦＱ−」１ｕ、ＬＡｃｉｄ　」Ｌ」砧、　’、　７７　：　７４　ｔ　５（１９８０）。

２、　　　Ｂ、　　Ｊ、　　Ｆ’ｏｉｅＳｚ、、　　Ｆ、Ｗ、　　Ｒｕ５ｃｅｔｔ：ｉ、Ｍ、、　　Ｓ、　　ＲｅｉヒＺ、。

Ｖ　−Ｓ　−Ｋ　ａ　ＩＹａ　ｎ　ａ　ｒ　ａ　ｍａ　ｎ　ｒ　ＲＧａ　１１０　ｒ　ｌ１ＬＩ＋ｕＬＡ　（ＬＯｎ　ｄＯｎ　）　２９４　F　２　Ｇ　８　（１９Ｂ１　）３、　　　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　　ｅヒ　ａｌ、、　　ＰＫ、Ｏ，Ｃ，７−ｄ− １−５Ｃ（エニμＳＡ、、　　１９：５Ｇ８０（１９８２）。

４、　　　Ｍ、Ｅｓ５ｅｘ　　ｅヒ　ａｌ、、　　ミＱ支（ＨＢｇ６．　２２１：１０６１　　（１９８３）。

５、　　Ｐ、　Ｃｌａｐｈａｍ、　Ｋ、　Ｎａｐｙ、　Ｒ，Ａ−Ｗｅｉｓｓ、　Ｌ匹ｚ−Ｊｔａｌ：、Ｌ、ｗＡ９Ｊｊ工社辷８１：２８８６　　（］すＢ８）。

６、、　　　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　　ｅヒ　ａｌ、、　　Ω１ａΩ旦Ｉ−Ｒ旦旦１．　４３：　　３Ｂ９２　　（１９８３）。

７、　　　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　　　　　　　　　　　　ｖ　　　　、　　Ｌ、　　Ｍ、　　Ｆｒａｎｋｓ　ｅヒ　ａｌ、　　Ｅｄｓ。

（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐｒｅｓｓ、　　０ｘｆｏｒｄ、　　ｉｎ　　ｐｒｅｓｓ）。

８、　　　Ｗ、　　Ａ、　　Ｂｉａｔｔｎｅｒ、　　Ｋ、　　Ｔｏｋａ七５ｕｋｉ、　　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　　Ｊユｌ■Ｉ２−呂ｅｔコj ＮＩ釘＆、２５０：１０７４　　（１９８３）。

９、　　　Ｋ、　　Ｔａｋａヒ５ｕｋｉ、　　Ｊ、　　Ｕｃｈｉｙａ＋ｎａ、　　Ｋ、　　Ｓａｇａｗａ、　　Ｊ、　　Ｙｏｄｏｉ、　　工■Q夫Ω互−よ］ｔｉｊＪＴｌｍｌ　Ｓ、　５ｅｎＯＩ　Ｆ、　Ｔａｋａｋｕ、　ｓ、　Ｉｒ１ｎｏ、　Ｅｄｓ、（Ｅｘｃ、ｅ−ハａＭ−ｉ本ｒ　Ａｍｓ七ｅｒｄａｍ、　１９７７）　ｐ７３゜１０、　　Ｗ、　　Ａ、　　Ｂｌａｔｔｎｅｒ　　ｅｔ、　　ａｌ、、　　　　　　　　　　　　　　　　　　、　　３０：２５７　　（１XＢ２）１１、　　Ｄ、　　Ｃａヒｏｖｓｋｙ　　ｅヒ　ａｌ、、　　Ｌａｎｃｇ上、、　　１９Ｂ２−Ｉ、　　６３９　　（１９８２）。

１２、　　Ｄ、　　Ｗ、　　Ｂｌａｙｎｅｙ　　ｅ七　ａｌ、、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、　　２５０：１０４Ｒ（P９８］）１３、　　Ｍ、　　ＲｏｂｅｒＬ−Ｇｕｒｏｆｆ、　　Ｆ、　　Ｗ、　　Ｒｕ５ｃｅヒ七ｉ、　　Ｌ、　　Ｗ、　　Ｐｏ１ｅｓｚ　　８゜Ｊ、Ｐｃ１ｅｓｚ、　Ｒ，、Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　　　　　　　　、　１５４：　１９５７　（１９８１）。

１４、　　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　　ｅ七　ａｌ、、　　Σ−【工υ；、１−１工」」；」１４−１八工；息≦１ユーー二ｉ＝ｊ、エーーリ１Pハ、、、　　７９：５６ＢＯ（１９８１）　。

１５、　　Ｍ、　　ＲｏｂｅｒＬ−Ｇｕｒｏｆｆ　　ｅヒ　ａｌ、、　　−！４ −」３ノ【ｐ−１−」つＩＩコツ−、１５７：２４Ｂ　　（P９８３）。

１６、　　Ｍ、　　Ｓｈｉｍｏｙａｍａ　　ｅｔ　　ａｌ、　　−」≧１Ｌ４− ．コニ、−３＝」、ｉｎ、−Ωｍ１．、　１２：１０９　　i１９８２）１７、　Ｍ、　５ｅｉｋｉ、　Ｓ、　Ｈａｔｔｏｒｉ、　Ｙ、　Ｈｉｒａｙａｍａ、　Ｍ、　Ｙｏｓｈｉｄａ　汀匹、ムｔｌΔＣ」σ１一旦Ωｉよ−リ５へよ、　　８０：：１６１８　　（１９０：ｌ）。

１Ｂ、　　Ｓａｘｉｎｇｅｒ、　　Ｃ，Ｗ、　　ｅ七　ａｌ、、　　ｓ二ｊＪ１（Ｈ，Ｂ、　　２２５二１４７３　　（１９８４）。

１９、　　Ｓａｍｕｅｌ、　　Ｋ、ｆ’、　　ｅ七　ａｌ、、　　５＝ｑｎｃ、ｅ、　　ｕｈ、　　１０９４−１０９７　　（ＮＯＶ、　　lｏ。

１９８４）。

２０、　　Ｓｌａｍｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　ＰＣＴ　　Ｐａヒｅｎｔ　　Ｐｕｂｌｉｃａしｉｏｎ　　Ｎｏ、　　ＷＯ３６１０１８：P４゜２１、　　Ｗａｎｇ、　　Ｊ、Ｊ−Ｇ、　　Ｓｌ：ｅｅｌ、　　Ｓ、、　　Ｗｉｓｎｉｅｗｏｌｓｋｉ、　　Ｒ，ａｎｄ　　Ｗａ＋＋ｇ、　@Ｃ，ＹＥ−ｄニ一旦Ωｉ、−ｕ５八、　　ｆｉ３．　　ｐｐ　　６１５９−６１６３　　（Ａｕｇｕｓヒ　１９ａ＆）。

２２、　　ｔＪ、ｓ、　　Ｐａｔｅｎヒ　ＮＯｌ　４，７３５，８９６．　１ｓｓｕｅｄ　　Ａｐ【ｉｌ　　５．　１９８８　　ヒＯＣｈａ獅早@　’／ｗａｎｇ　ａｎｄ　ＪａｍｅＳ　Ｇ、ｗａｎｑ。

２３、　　Ｕ、Ｓ、　　ｒ’ａ七ｅｎｔ　　Ｎｏ、　　４，８７９，２１２　１ｓｓｕｅｄ　　Ｎｏｖ、　　７．　１９１１９　　七ｏ　　bｈａｎｑ　　°ｆ。

Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｊａｍｅｓ　Ｇ、Ｗａｎｇ。

２４、　　Ｌｉｕ＋　　Ｆｕ−Ｔｏｎｇ　　ｅｔ：　　ａｌ、＋　　旦１ｑＱｈｅｍｉｓ上」コ５１旦、　　ｐｐ、　　６９０−６９７　　i１９７９）。

２５、　　Ｖ、Ｓ、　　Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、　　Ｍ、Ｇ、　　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　　Ｍ、　　ＲｏｂｅｒＬ−Ｇｕｒｏｆ■@　ｅヒａｔ、、　５−ｃＬｅｎｃｘ、　２ユ旦：　　５７１　　（１９８２）２Ｇ、　　Ｊ、Ｄ、　　Ｒｏｓｅｎｂｌａヒヒ　ｅ七　ａｌ、、　　比」ｅＡ、、　　３１５：３７２　　（１９８６）。

２７、　　Ｍ、　　ＲｏｂｅｒＬ−Ｇｕｒｏｌ’ｆ、　　Ｓ、Ｈ，Ｗｅｉｓｓ、　　Ｊ、Ｈ，Ｇｉｒｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｌ−へ〇hＬＭｃｉｄ工込ミ３四−，２５５：３１３３　　（１９８６）。

２Ｂ、　　Ｉｆ、　　Ｌｅｅ、　　Ｐ、　　Ｓｗａｎｓｏｎ、　　Ｖ、Ｓ、　　５ｈｏｒ七ｙｅヒ　ａｌ、、　　Ｓ！ｃｉｉｎｃａ、　　２S４：４７１（１９Ｂ９）。

２９、　Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　Ｍｅ止、迦に立１．．ユ辺■匝」小ｕ囮ＧσＪ」二、　　３：２６５　（１９８６）。

３０、　　Ｋ、　　Ｓｈｉｍｏｔｏｌｉｎｏ、　　Ｙ、　　Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　　ｅ七　ａｌ、、ＥＮＡ旦−ｕ旦Δ、　旦２゜：１ｌＯ１−３１０５（Ｍａｙ　１９８５）。

３１、　　Ｊ、　　５ｏｄｒｏｓｋｉ、　　Ｒ，Ｐａ七ａｒｅａ＋　　Ｄ、　Ｐｅｒｋｘｎｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　ＳΩｉ旦ｎΩ旦ｒ２２５：４２１　　（１９８４）。

３２、　Ｇ、Ｍ、　Ｓｈａｗ、　Ｍ、Ａ、　Ｇｏｎｄａ、　Ｇ、Ｈ，Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ　ｅＬａ１．、　ＰＭＳ−ＭＳΔ。

８１：４５４４　　（１９８４）。

３３−　　Ｓ、Ｇ−５ａｎｄｉｅｒ、Ｃ−Ｆａｎｑ＋　　ｉｎ　　　　　　　　 ’　　　−ＣＪＬｎ５ヱｍｊ上ｎｃＬ、ｌＵ　ｃ　ａ　１ｔｕ旦旦盈五監、ＡｒｌＬｎｇｔｏｎ、ＶＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ａｓ５ｎ、　　ａｔ　　Ｂｌｏｏｄ　　Ｂａｎｋｅｒｓ。

９．１９　　（１９８７）発明の詳細な説明本発明によれば、４種のペプチド（それぞれ特定の配列をもつ）が固相ペプチド合成法により製造された。これらのペプチドは、血清および体液中のＨＴＬＶ− Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の高感度・精度検出法に、あるいはＡ、　Ｔ　Ｌの診断に、有用であることが見いだされた。高い免疫反応性のために、これらのペプチドはＢａ１ｂ／ｃマウスのような健康な哺乳類によるＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ− Ｉｆ抗体の生産を刺激するのに有用であることが期待される。

本発明によれば、ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−Ｉｆ抗体の検出オよびＡＴＬの診断に有用なペプチド組成物は、次のペプチド：ＡＰＰＬＬＰＨ５ＮＬＤ）ＩＩＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（ＩＶ）ＳＳＴＰＬＬＹＰＳＬＡＬＰＡＰＨＬＴＬＰＦＮＷＴＨＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨ−Ｘ　（Ｖ）ＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨＮＳＬＩＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲ５ＲＲＡ−Ｘ　（ＶＩ）ＳＰＰＬＶ）ＩＤＳＤＬＥＩ（ＶＬＴＰＳＴＳｌｆｒＴＫＩＬＫＦＩＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（Ｘ）（ここでＸは−ＯＨまたは−Ｎ　Ｈｔである）より成る群から選ばれるペプチド、その類縁体、セグメント、混合物、複合体または重合体を含有する；ただしＡ−Ａｌａ−アラニン　　　　Ｇ−Ｇ　Ｉ　Ｆ〜グリシンＲ−Ａｒｇ−アルギニン　　　ｌ−１１ｅ−インロイシンＤ−Ａｓｐ−アスパラギン酸　Ｆ−Ｐｈｅ− フェニルアラニンＮ−Ａｓｎ−アスパラギン　　５＝Ｓｅｒ−セリンＱ−Ｇｌｎ −グルタミン　　　Ｗ−Ｔｒｐ−トリプトファンＥ−Ｇｌｕ−グルタミン酸　　Ｙ−Ｔｙｒ−チロシンＬ−Ｌｅｕ−０イシン　　　　Ｖ−Ｖａｌ−バリンに−Ｌｙｓ−リシン　　　　　Ｃ＝Ｃｙｓ−システィンＨ＝Ｈｉｓ−ヒスチジ７　　　　Ｐ−Ｐ　ｒ　ｏ−プロリンＴ−Ｔｈｒ−トレオニン体液中のＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ｎ抗体を検出しかつＡＴＬを診断するための感度・精度の高い方法は、次の段階から成っＡＰＰＬＬＰＨ６ＮＬＤＨＩＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（ＩＶ）ＳＳＴＰＬＬＹＰＳＬＡＬＰＡＰＨＬＴＬＰＦＮＷＴ）ＩＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨ−Ｘ　（Ｖ）ＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨＮＳＬＩＬ、ＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲ８ＲＲＡ−Ｘ　（ＶＩ）ＳＰＰ［、ＶＨＤＳＤＬＥＨＶＬＴＰＳＴＳＳｆｒＴＫＩＬＫＦＩＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（Ｘ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ，である）を有する群から選ばれるペプチド、その類縁体、セグメント、混合物、複合体または重合体を含有するペプチド組成物を調製する段階；およびＢ、イムノアッセイ法において抗原として約ｐＨ７〜ｌＯの緩衝液中の約０．０１９ｇ〜約２０μ ｇ／テストのペプチド組成物を使用する段階。

さらに、本発明によれば、ペプチドそれら自体、または蛋白や高分子キャリアーに結合されたペプチド、またはシスティン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモまたはへテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合されたペプチド、またはホモまたはへテロ官能性多価架橋剤の使用によりホモまたはへテロダイマーもしくは高級オリゴマーに重合されたペプチド、あるいは多価リシン樹脂上で直接合成されたペプチドを使用して、健康体の生産を刺激することができる。この方法は、ヒト血清アルブミンのようなキャリアーに結合された、または重合体としての、有効量のこれら６種のペプチドの混合物を含むペプチド組成物を、腹腔内または皮下注射によりｉａ＊な哺乳類の体内に導入することから成っている。

ペプチドＩ〜■の類縁体はＨＴＬＶ−ＩＩにも存在する。第１図を参照されたい。この種の配列は次のものである：ＧＬＤＬＬＦ％ＩＩＥＱＧＧＬＣＫＡＸＱＥＱＣ−Ｘ　（ＶＩＩ）ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＸＱＥＱＣ−Ｘ　（ＶＨＩ）ＮＲＲＧＬＤＬＩＪ％ＩＪＥＱＧＧＬＣ−Ｘ　（ＩＸ）（ＨＴＬＶ −Ｉと相違する残基には下線が引いである。）ペプチド■〜■は体液中のＨＴＬＶ−ｎ抗体を検出するのに有用である。これらの配列を再検討すると、ペプチド ■はペプチド■と同一であり；ペプチド■および■は１個のアミノ酸を除いてペプチドＩおよび■と同一である：が、ペプチドＸ、　ＸＩおよび■は対応するＨＴＬＶ−Ｕアミノ酸配列に従ってアミノ酸が置換されている部位を多数含み、ペプチド■、ｖ８よび■とかなり相違することが分かる。

ペプチド■およびＸはそれぞれＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ｎに特有であることが判明した。すなわち、ペプチド■はＨＴＬＶ−ｎに対する抗体と反応性でなく、そしてペプチドＸはＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体と反応性でない。このために、ペプチド■およびＸはＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−Ｉ［の血清陽性を識別するために使用される。

さらに、本発明によれば、ペプチド■〜■の混合物は体液中のＨＴＬＶ−Ｉ／Ｕの存在を検出するために使用することができる。また、ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ −ｎに対する抗体の検出に有用なペプチド組成物は、ＨＴＬＶ−Ｉ／Ｉ［とＨＩＶ−１／２の両方による感染を同時に検出するために、ＨＩＶ−１８よびＨＩＶ −２に対する抗体の検出に有用なペプチド組成物と共に使用される。ＨＩＶ−１およびＨＩ　Ｖ−２に対する抗体の検出に有用なペプチド組成物は、特定配列（ＨＩＶ−２の配列はペプチド■およびペプチド■の類縁体である）の以下のアミノ酸またはそれらの類似体の化学合成ペプチド：ＨＩ　Ｖ−１ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＣＩＱＬｔｌａＧＩｍ−Ｘ　　（ＸＩＩＩ）Ｉ弧厳ＧＫＬＩ（ＴＴＡＶＰＷＮＡＳ−Ｘ　（ＸＩＶ）ＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬ−Ｘ　（ＸＶ））（ＩＶ−２ＤＱＡＲＬ、Ｎ５Ｉ（ＡＦＲＱＶＣ（ＸＶＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ！である）、その類縁体、セグメント、混合物、または重合体を含有する；ただしＡ＝ＡＩａ−アラニン　　　　Ｇ−Ｇｌｙ−グリシンＲ−Ａｒｇ−アルギニン　　　ｌ−１１ｅ−インロイシンＤ−Ａｓｐ−アスパラギン酸　Ｆ＝Ｐｈｅ−７エニルアラニンＮ−Ａｓｎ−アスパラギン　　Ｓ−５ｅｒ−セリンＱ−Ｇｉｎ− グルタミン　　　Ｗ−Ｔｒｐ＝）リプトファンＥ−Ｇｌｕ−グルタミン酸　　Ｙ −Ｔｙｒ−チロシンＬ−Ｌｅ　ｕ−ロイシン　　　　Ｖ−Ｖａｌ−バリンに−Ｌｙｓ−リシン　　　　　Ｃ−Ｃｙｓ−システィンＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン　　　Ｐ−Ｐ　ｒ　ｏ−プロリンＴ＝Ｔｈｒ−）レオニンＭ＝Ｍｅｔ−メチオニン下線を引いたアミノ酸は種々の単離物の間で共有される残基を表す。ＨＴＶ−２のペプチドＸＶＩでは、ヌクレオチド配列から推定される対応ＨＩＶ−２エンベロープ蛋白アミノ酸配列において置換が行われた。

図面の簡単な説明第１図は、ＨＴＬＶ−Ｉｔ；よびＨＴＬＶ−ｆｌｘｙベロープ蛋白のアミノ酸配列の比較を示す。

第２図は、本明細書中で開示した化学合成ペプチドのアミノ酸配列を示す。

第３図は、ＡＴＬ患者由来の血清とここに開示したペプチドとの免疫反応性を示すヒストグラムである。

第４図は、ＨＩＶ感染患者、ＡＴＬ患者、および無作為に抽出した供血者由来の血清とここに開示したペプチドとの免疫反応性を示すヒストグラムである。

第５図は、ここに開示した７種の化学合成ペプチドの混合物を使用する酵素イムノアッセイによるＨＴＬＶ−１３よびＨＩＶ（１および２）に対する抗体の同時検出を示すヒストグラムである。

垣浬Ｉυ艷遡ｊ］組盟本発明によれば、体液中のＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−１［抗体の検出、ＡＴＬの診断、およびＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１１に対する抗体の生産を刺激することによる健康な哺乳類のワクチン接種のために、６種のペプチドが化学的に合成された。これらのペプチドは次の配列を有する：ＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＬＱＥＱＣ−Ｘ　　（１）ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＬＱＥＱＣ−Ｘ　　（Ｉ　Ｉ　）ＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ−Ｘ　　　（ＩＩＩ）ＡＰＰＬＬＰＨＳＮＬＤＨＩＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（ＩＶ）ＳＳＴＰＬＬＹＰＳＬＡＬＰＡＰＨＬＴＬＰＦＮＷＴＨＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨ−Ｘ　　（Ｖ）ＣＦＤＰＱＩＱＡ４ＶＳＳＰＣＨＮＳＬＩＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧｓＲ５ＲＲＡ−Ｘ　（Ｖｌ）ＳＰＰＬＶＨＤＳＤＬＥＨＶＬＴＰＳＴＳＷＴＴＫＩＬＫＦＩＱＬＴＴ７ＱＳ−Ｘ　（Ｘ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ，である）。

これらのペプチドは類縁体またはセグメント、すなわち、上記配列の末端アミノ酸（例えば、−ｃｙ＋ｙ−１−Ｇｌｎ−１−Ａｓｎ−１および−Ｃｙｓ−）に１以上のアミノ酸が付加された、あるいは末端からアミノ酸が除去された、より長いまたはより短いペプチド鎖、でありうる。例えば、ペプチドＸはペプチド■の類縁体である。

また、これらのペプチドは複合体であってもよく、すなわち、それらはウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）またはヒト血清アルブミン（Ｉ　Ｓ　Ａ）のようなキャリアー蛋白に結合させることができる。さらに、これらのペプチドは重合体であってもよく、すなわち、それらは分校オクタマーリシン樹脂のような高分子樹脂上で合成することができる。ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−Ｉ［抗体により認識されるペプチドの免疫反応性が保持される限り、合成ペプチドの類縁体は上記配列のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含みうることが期待される。

さらに、異なる単離物間の株による変異を適応させるために、保存的置換についての調節および非保存的置換を伴うもの間の選択が上記の特定配列において行われる。例えば、ＨＴＬＶ−殖「存在するペプチドＸ〜■も使用することができる。

体液中のＨＴＬＶ−ｉまたはＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の検出およびＡＴＬの診断のためのテスト試薬として有用なポリペプチドのアミノ酸配列は、ｇｐ２１と呼ばれるＨＴＬＶウィルスのアミノ酸配列の部分セグメント、およびｇｐ４６と呼ばれるＨＴＬＶウィルスのアミノ酸配列の部分セグメント（両方ともＨＴＬＶ−Ｉ　ｔｆ二はＨＴＬＶ−４ウィルスのエンベローフ蛋白を規定するｇｐ６１の一部である）に対応するように選ばれる。

抗体ＨＴＬＶ−Ｉを検出するための固相免疫吸着剤として有用なペプチドは、側鎖保護ｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸を用いる“古典的”なＭｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ固相ペプチド合成法により、以下のアミノ酸配列に一致するように合成した：ＡＰＰＬＬＰＨ５ＮＬＤＨＩＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＬＬＴＬＶＱｆ、’Ｉ°ＬＱＳ−Ｘ　（ＩＶ）ＳＳＴＰＬＬＹＩ”ＳＬＡＬＰＡＰＨＬＴＬＰＦＮｗＴＨＣＦＤＰＱｆＱＡＩＶＳＳＰＣＨ−Ｘ　（ｖ）ＣＦＤＰＱＩＱＡＩＶＳＳＰＣＨＮＳＬＩＬＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲ５ＲＲＡ−Ｘ　（ＶＩ）ＳＰＰＬＶＨＤＳＤＬＥＨＶＴ、ＴＰＳＴＳＷＴＴＫＩＬＫＦＩＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（Ｘ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ，である）。

これらのペプチドの他の類縁体は、所望のｔ−Ｂｏｃ−アミノ酸を付加、置換または欠失してアミノ酸配列を変えることにより製造することができる。

例えば、次の配列を有する類縁体ペプチド■〜■も製造することができる：ＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＪ’４ＱＥＱＣ−Ｘ　（ＶＩＩ）ＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣＫＡＩＱＥＱＣ−Ｘ　（ＶＩＩＩ）ＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ−Ｘ　（ＩＸ）Ｓ、ＰＰＬＭＩＳＱＬＨＨＶＬｍｆ’；ＬＭＩＴ：ＫＩＬＫＥＩＱＬＴＬＱＳ−Ｘ　（Ｘ）Ｓ兆ｎＬ［ＰｓＩ、ＡＬＰＡＰ囚Ｐ甚町ＨＣ舊Ｐ肚ＱＡＩ買皿ｃｌ−ｘ　（ｘｇＣＸＱＰＲＬＱＡＩＩ画Ｃ１！Ｎ５１１ＬＰＰＦＳＬＡＰＶＥＬＡＸｌ’ｌＢ、ＲＲＡ−Ｘ　（ＸＩＩ）樹脂上での目的の保護ペプチドの合成が完了した後、ペズチドー樹脂を無水フッ化水素酸で処理して、樹脂からペプチドを切断する。ベンジル誘導保護基で合成の間中保護されるアミノ酸の官能基も同時にペプチドから切断される。その後、遊離ペプチドは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）で精製して、アミノ酸分析により生化学的に特性決定される。

上記方法により合成されたペプチドはＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ−Ｉｔに対する抗体と高度に反応性であり、ＨＴＬＶ−１および／またはＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ［抗体を検出するための高感度の特異的免疫吸着剤として使用することができる。

第３図は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法（ウェルプレートはそれぞれ１．０μｇのペプチド ■、■および■で被覆する）を使ってＡＴＬ患者由来の血清から得られたデータを示す。表工は、ウェルプレートを重量比ｔｏｏ、２５：ｌ：ｌ　（ｎ：■：Ｖ：ＶＩ）（７）ペプチド■、■、■および■の混合物で被覆したＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を使つて、ＡＴＬ患者由来の血清から得られたデータを示す。表■は、赤血球（ＲＢＣ）をペプチドＶｌ−ＢＳＡ複合体で被覆した凝集法を利用して、ＡＴＬ患者由来の血清から得られたデータを示す。表■および■は、ペプチド■およびペプチドＸと関連した唯一の特異的免疫反応性、並びにＨＴＬＶ−１感染者とＨＴＬＶ−■感染者を識別する際のそれらの有用性を示す。

ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩｎ抗体の免疫反応における本発明ペプチド組成物の高感度および特異性に基づいて、これらのペプチド組成物はＡ、　Ｔ　Ｌ−Ｊ３よび／またはＨＴＩ、Ｖ−ｍ感染症のためのワクチンとして、あるいは哺乳類（ヒトを含む）にＨ”ｌ”ＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬ、Ｖ−１１に対するモノクロ−、ナルおよびポリクローナル抗体を発生させるための免疫原として有用であると考えられる。また、ペプチド組成物は、蛋白に結合されたまたは高分子キャリアー樹脂（例、オクタマーリシン樹脂）上で合成されたもの、またはシスティン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合されたもの、あるいはホモまたはへテロ官能性多価架橋剤の使用によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーに重合されたものも、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ｎ抗体の生産を刺激しかつ健康な哺乳類にＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−Ｕ感染症に対する防御を賦与するために、正常個体に導入することができる。本発明のペプチド組成物はウィルスから生化学的に誘導されるものではないので、予防接種を受けようとする正常個体がこの病気にさらされる危険はない。

本発明ペプチドを使用することの利点は数多く存在する。

本発明ペプチドは化学的に合成される。このことは、テスト試薬やワクチンの製造過程でＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−４ウイルスと接触しないことを意味する。ワクチン製造中または予防接種時に、ワクチン製造者や医師はＨＴＬＶ−１または■（ＴＬＶ−ＩＩウィルスにさらされる危険がない。さらに、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を検出するテスト（この場合、テスト試薬を血清または体液のサンプルにさらす）の最終段階まで、実験室の研究者がＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩウィルスにさらされる危険はない。

本発明方法によって回避される別の問題は、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｕウイルスリゼイ）Ｉｌｌ製物と一緒に精製された宿主ａ７胞からの抗原物質、あるいは発現されたウィルス断片と一緒に＊ｉされたＥ、ｃｏｌｉ誘導蛋白の存在により生ずる偽陽性結果の可能性である。正常個体のうちの何人かは、宿主細胞由来の抗原物質と交差反応するＥ、ｃｏｌｉまたはヒト白血球抗原（例、ＨＬＡ）に対する抗体をもっている。これらの正常個体からの血清サンプルはＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　ＡまたはＩ　ＲＭＡテストにおいて陽性の応答を示すかもしれない。

さらに、適当なアミノ酸類似体の置換により、上記の特定アミノ酸配列に基づいた種々のペプチド類縁体が合成され、これらのペプチドはより低いバックグラウンド読み取り、あるいはＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ｍ抗体スクリーニングアッセイにを用な固相への良好な吸着能を示す特性をもつことが期待される。

さらに、本発明のペプチド組成物は合成的に製造されるので、品質をコントロールすることができ、その結果、テスト結果の再現性が保証される。また、各テスト法に必要なペプチドの量はごくわずかであり、しかもペプチドの製造経費は比較的少ないので、ＨＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−Ｕ抗体について体液をスクリーニングするコスト、ＡＴＬおよび／またはＨＴＬＶ−■感染症の診断コスト、およびワクチンの製造コストが比較的低い。

本発明により製造されたペプチドは、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬ、、ｌ５Ａ）、酵素イムノドツトアッセイ、凝集アッセイ、ラジオイムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、または他の公知イムノアッセイにおいてテスト試薬として用いることにより、）ｒＴＬＶ−ｒおよび／またはＩ（ＴＬＶＩＩ感染を検出しかつＡＴＬを診断するために使用される。好適な方法はＥＬＩＳＡである。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法は実施例１および２に、Ｉ　ＲＭＡ法は実施例５に、そして凝集アッセイは実施例３および６に示しである。

以下の方法において、プレートまたはビーズへのペプチドの結合を容易にするために、被覆緩衝液中に０．２５重量％のグルタルアルデヒドが加えられることに注意すべきである。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウスモノクローナル抗ヒ）ＩｇＧ抗体が第二抗体トレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトｒｇＧの代わりに用いられる。

これらの方法で用いるゼラチンはウシ皮膚ゼラチン、ブタ皮膚ゼラチン、類ゼラチンまたは既知の入手可能なゼラチン蛋白であり、アルブミン蛋白と置き換えることができる。

実施例１０には、ペプチド■がＨＴＬＶ−Ｔ抗体と優先的に反応し、ＨＴＬＶ− ＩＩ抗体と反応せず、従ってＨＴＬＶ−１感染とＨＴＬＶ−Ｉ［感染を区別するために使用しうろことが示しである。

同様に、実施例１１には、ＨＴＬＶ−４（ＨＴＬＶ−１の変異型）のアミノ酸配列から誘導された類縁体ペプチドであるペプチドＸがＨＴＬＶ−Ｉｆ抗体とのみ反応し、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染を特異的に検出するために使用できることが示しである。

実施例１酵素免疫吸着アッセイによるＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−１１抗体の検出９６−ウェルプレートのウェルに、上記のように製造した３種のペプチド■、■ 、■を１００μｌのｌｏｍＭＮａＨｃＯｓ緩衝液ｐＨ９−５中の各々１．０μｇ／ウェルのペプチドで４°Ｃにて一晩（または室温で３時間）被覆した。ウェルはリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で３回洗い、その後ＰＢＳ中の３重量％ゼラチン２５０μｍと３７℃で１時間インキュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、統いて０．０５容量％７ｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで３＠以上洗った。

テスト血清（患者または正常個体から採取した血液）は２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０を含むＰＢＳを用いて１：２０（容量：容量）の希釈率で希釈した。各ウェルに２００μｍの希釈血清を加え、３７℃で１時間反応させた。その後、ウェルを０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで３回洗い、未結合抗体を除いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを第二抗体トレーサーとして使用して、陽性ウェルに形成されたＨＴＬＶ−Ｉ抗体−抗原複合体と結合させた。

１容量％正常ヤギ血清および０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０を含むＰＢＳでＩ　：　３０００に希釈した１００μｍのペルオキシダーゼｍ識ヤギ抗ヒト丁ｇＧを各ウェルに加えて、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。

ウェルは０，０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで５回洗って未結合抗体を除き、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，０中に０．０４重量％オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）および０゜０１２容量％過酸化水素を含む基質混合物１００μｍと反応させた。この基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキシダーゼ標識を検出するために使用された。反応は１００μｌのｌ。

ＯＭＨｔ　ｓ　ｏ　ａを加えて停止させ、ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダーを使って４９２ｎｍ（すなわちＡ４□）で吸光度を測定した。アッセイは正常個体またはＨＴＬＶ−Ｉ感染症に無関係の病気をもつ患者からの血清サンプルの希釈物（１：２０）を陰性対照として用いて２通り行った。ＡＨ−０，１２（正常血清対照の平均Ａ４９．値の約３倍）の閾値より大きい吸光度読み取りを陽性として採用した。これらの結果を＄３１３！ｆｆに示す。

実施例２酵素免疫吸着アッセイによるＨＴＬＶ抗体の検出９６−ウェルプレートのウェルに、ＩＩ：ｌＶ：Ｖ：Ｗ−１：Ｑ。

２５：ｌ：１の重量比の上記のように製造した４種のペプチドの混合物を１００ μｌのｌ　ＯｍＭ　ＮａＨＣＯ，緩衝液ｐＨ９゜５中の３．２５μｇ／ウェルの混合物で４℃にて一晩（または室温で３時間もしくは３７℃で１時間）被覆した。ウェルはリン酸緩衝溶液ＣＰＢＳ）で３回洗い、その後ＰＢＳ中の３重量％ゼラチン２５０μ■と３７℃で１時間インキュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、統いて０５０５容量％丁ｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回以上洗った。テスト血清（ヒト患者または正常個体から採取した血液）は２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳを用いて１：２０（容量：容量）の希釈率で希釈した。各つ工ルに２００μｍの希釈血清を加え、３７℃で１時間反応させた。

その後、ウェルを０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで３回洗い、未結合抗体を除いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒ）ＩｇＧを第二抗体トレーサーとして使用して、陽性ウェルに形成されたＨＴＬＶ抗体−抗原複合体と結合させた。

１容量％正常ヤギ血清および０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで１　：　３０００に希釈した１００μＩのベルオキンダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに加えて、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。

ウェルは０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで５回洗って未結合抗体を除き、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，０中に０６０４重量％オルトフェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）および０゜０１２容量％過酸化水素を含む基質混合物１００μＩと反応させた。この基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキシダーゼ標識を検出するために使用された。反応は１００μｌのｌ。

ＯＭ　Ｈ！Ｓｏ、を加えて停止させ、ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダーを使って４９２ｎｍで吸光度（すなわちＡ４□）を測定した。アッセイは正常個体またはＨＴＬＶ感染症に無関係の病気をもつ患者からの血清サンプルの希釈物（１：２０）を陰性対照として用いて２通り行った。Ａ４９．−正常対照のＡ＜＊ｔ＋０−１（反応性対照のＡ４．！値）の閾値より大きい吸光度読み取りを陽性として採用した。これらの結果を表■および第４図に示す。

固相免疫吸着剤として４種のペプチドの混合物を用いるＥＩｊＳＡ＊によるＨＴＬＶ抗体の検出１、ＡＴＬ患者（ロット５）（ＨＴｔｖウェスターンプロット陽性）　　　　　９４／９４　　　　　　１００２、ＡＴＬ患者（ロット５）（ＨＴＬＶウェスターンプロット陰性）　　　　　０／６　　　　　　　　０３、　ＡＫＤｓ／ＡＲＣ患者またはＨＩＶに感染したことが知られた患者　　　　１０／１６１　　　　　　　６４、正常個体　　　　　　　　　　　　　　　　　　０／２００　　　　　　　　Ｑネアッセイは緩衝液で１　：　２０　（Ｖ／Ｖ）に希釈した血清を用いて行った。

［：ＡＴＬ患者由来の血清は親切にも日本赤十字社から提供され、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ。

−次免疫不全症、白血病／リンパ腫の患者からの血清はカリフォルニア大学のＳ、ＧｕｐＬａ博士、コロンビア大学のり、Ｍ、Ｋｎｏｖｌｅｓ博士、およびロングアイランドユダヤ人病院のＦ、Ｄ、Ｓｉｅｇａｌ博士により親切にも提供された。

表Ｉの結果は、血清サンプルを用いた本発明によるＥＬＩＳＡテスト法が非常に正確で、高度に特異的であることを示している。正常個体からの血清には免疫反応が全く見られなかった。

血液銀行からウィルスに汚染された血液を除くスクリーニングテストにおいて、所望により、陽性反応を規定する基準をより厳重にすることができる点に留意されたい。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法により合成された本発明のＨＴＬＶペプチドは、本質的にＦｕ−Ｔｏｎｇ　Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ、　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ　１８：６９０−６９７　（１９７９）に記載されるように、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）で誘導体化したウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）に結合させた。０．０１３ｍ１のＭＢＳ溶液（ジメチルホルムアミド中０．０２５ｍｇ／ｍ１）を室温で０．３２ｍ１のＢＳＡ溶液（０，０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０中１００ｍｇ／ｍ＋）に加えた。ＢＳＡ溶液に加えるＭＢＳの量は、研究する特定の複合体について決定されたＢＳＡ対ＭＢＳの最適モル比により変化しうる。この混合物は室温で１時間撹拌し、その後遠心して沈澱アルブミンを除いた。次に、澄明混合物をセファデックスＧ−２５のゲル濾過にかけ、２８０ｎｍでのそれらの吸光度により検出した蛋白含有画分をプールし、必要になるまで一７０℃で凍結保存した。

ペプチドはＨ，Ｏ中に１０ｍｇ／ｍｌで溶解した。予め定められた量の各ペプチド溶液は活性化ＢＳＡ−ＭＢＳ溶液に滴下し、室温で３時間撹拌した。最終ペズチドーＢＳＡ複合体はゲル濾過または十分な透析により遊離ペプチドから分離した。ペプチド対ＢＳＡの比は慣用方法に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。

一例として、ペプチドＶＩ−ＢＳＡ複合体はその後二重アルデヒド固定化ヒトＯ赤血球にｐＨ４，０で吸着させた。次に、ペプチド−複合体被覆赤血球はＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４で処理して非特異的蛋白結合を妨げた。その後、ペプチド−複合体被覆赤血球をＰＢＳで洗い、５％正常ヒト血清−ＰＢＳ溶液とインキュベートした。これらの処理細胞はその後血清および血漿サンプル中のＨＴＬＶ抗体を検出するための凝集アッセイにおいて使用した。

成人Ｔ細胞白血病患者由来の全部で１００の血清は、（１）固相としてＨＴＬＶ −１ウイルスリゼイトを用いる酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）　　［ＤｕＰｏｎｔ社のＨＴＬＶ−Ｉ　ＥＬＩＳＡＩ　　；　（２）ウェスターンプロット（ＷＢ）分析：　（３）固相としてペプチド■−ＢＳＡ複合体を用いる上記のＨＴＬＶ凝集アッセイによりＨＴＬＶ抗体について試験した。これらの結果を表■に示す。

異旦　　　恐慢　　　　影１　　　　　旦工Ｖη１１シ弓１−＋　　　　　　　　７７　　　　　　　　＋　　　　　　　　　７７陽性十未確定　　　　　２　　　　　　　＋　　　　　　　　　２陰性本−２１２１陰性ネＨＴＬＶ凝集アツセイで陰性の結果が出た２つのサンプルは、ＨＴＬＶのｐ１９コア蛋白に対する抗体のみをもつことが判明した。

実施例１の方法に従って、本発明の７種の化学合成ペプチドを含む溶液を使用して、９６ウエルプレートのウェルに被覆した。３種のペプチドはＨＴＬＶ−Ｉペプチド属［１、ＩＴおよび■］から８３種はＨＴＶ−１ペプチド属［ＸＩ［Ｉ、ＸＩＶおよびＸＶｌから；そして１種はＨＩＶ−２ペプチド属［ＸＶｌ［］からそれぞれ誘導された。ペプチドｕ：ｙ：ｖｒ：ｘｍ：ｘｙ：ｘｖ：ｘｖｒは合計濃度２１　、２ｔＬｇ／ｍ　＋において２：０．２：２：１０：１：］：５の比で存在していた。ＨＩ　Ｖ−１陽性ドナー（１５５サンプル）；ＨＩＶ−２陽性ドナー（１０サンプル）：ウエスターンプロットでＨＴＬＶ陽性ドナー（９２サンプル）；ウェスターンプロットでＨＴＬＶ陰性ドナー（４サンプル）：自己免疫病患者ＣＡＩ、３６サンプル）−および無作為に抽出した供血者（ＲＢＤ、４７４サンプル）；からの全部で７７１のサンプルがそれらのレトロウィルス免疫反応性についてベグチド被覆プレート上で試験された。

図に示しである。明らかに、これらの結果はＨＴＬＶペプチドとＨＩＶペプチドとの併用がレトロウィルス感染症の検出に有用であることを示している。

実施例５イムノラジオメトリ・ンクアンセイ（ＩＲＭＡ）によるＨＴＬＶ抗体の検出９６−ウェル軟質ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）グレートのウェルに、上記のように製造した３種のペプチドの混合物（Ｉ：１：］）を１００μ＋のｌＯｍＭＮａＨｃｏ、緩衝液ｐＨ９，５中１．５μｇ／ウェルで４°Ｃにて一晩（または室温で３時間）被覆する。ウェルはリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で３回洗い、その後ＰＢＳ中の３重量％ゼラチン２５０μｌと３７℃で１時間インキュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、統いて０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで３回以上洗浄する。

テスト血清（ヒト患者または正常個体から採取した血液）は２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０を含むＰＢＳを用いて１：２０および１：２００（容量：容量）の希釈率でそれぞれ希釈する。

各ウェルに２００μＩの希釈血清を加え、３７°Ｃで１時間反応させる。その後、ウェルを０．０５容量％Ｔｔｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで３回洗い、未結合抗体を除去する。ｌ−１２５標識アフイニテイ一精製ヤギ抗ヒトＩｇ’Ｇを第二抗体トレーサーとして使用して、陽性ウェルに形成された抗体−抗原複合体と結合させるａ１１容量正常ヤギ血清および０．０５容量％Ｔｗｅｅｎ　２’０を含むＰＢＳ中の５０．０００−２００．ＯＯＯｃｐｍのｌ−１２５標識ヤギ抗ヒト１ｇＧ　１００μｍを各ウェルに加えて、３７℃でさらに１時間インキュベートする。

ウェルは０．０５容量％Ｔｖｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで５回洗って未結合第二抗体を除き、乾かす。ウェルを切り取り、ガンマ−シンチレーションカウンターで計数する。アッセイはｌ：２０希釈物（容量：容量）を用いて２通り実施する。

陰性対照として正常血清サンプルも同時に試験する。正常血清サンプルの平均読み取り＋４３Ｄ（標準偏差）より大きいｃｐｍ読み取りを陽性として採用する。

実施例６固相免疫吸着剤としてペプチド混合物を被覆したゼラチン粒子、異なる動物種の赤血球、またはラテックスビーズを用いる凝集アッセイによるＨＴＬＶ抗体の検出１ｍｌの完全洗浄赤血球、ゼラチン粒子、またはポリスチレンラテックスビーズに５μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でペプチド混合物を被覆する。その後、ペプチド混合物被覆細胞、粒子またはビーズは９６−ウェルＵ形マイクロプレートのウェル中もしくはスライド上で段階的希釈血清サンプルとインキュベートする。室温で約１時間放置後、ウェルの底またはスライド上の沈降凝集パターンを読み取り、陽性反応を示す最大希釈率を記録する。

これは血清または体液などのサンプル中のＨＴＬＶ抗体の定性・定量分析に利用しうる１段階アンセイである。

実施例７凝集アッセイを用いてＨＴＬＶ抗体を検出するための第三のテストキットは、多重マイクロウェルプレートを含む区画容器、および（１）ペプチド混合物を被覆した赤血球、ゼラチン粒子またはラテックスポリスチレンビーズのびん；（２）正常ヒト血Ｗ！（陰性対照として）；　　（３）ＮＰ４０処理および熱不活性化ＨＴＬＶ−１陽性血清（陽性対照として）−および（４）サンプル希釈剤；を含む凝集アッセイ用の他の補助物質から成っている。凝集アッセイは実施例３に記載の方法に従って行われる。

実施例８ＨＴＬＶ抗体を検出するための診断テストキットを作製することができる。このテストキットは、使用前に１００μｍのｌＯｍＭＮａＨＣＯ，緩衝液ｐＨ９，５中の本発明ペプチドまたはペプチド混合物を被覆した多重９６−ウェルプレートを含む区画容器を含んでいる。キットはさらに別の密閉容器に収容した酵素検出用の物質、すなわちｌ）正常ヒト血清（陰性対照として）；２）ＮＰ４０九理および熱不活性化ＨＴＬ、Ｖ−Ｉ陽性血清（陽性対照として）；３）サンプル希釈剤；４）ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ；および５）例えばリン酸クエン酸塩緩衝液中のオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）　お、Ｊ：び過酸化水素から成る発色指示薬を含んでいる。このアッセイは実施例１に記載の方法ｌコ従って行われる。

このテストキットでは、本発明ペプチドまたはペプチド混合物を前以て被覆した９６−ウェルプレートの代わりに、固相免疫吸着剤として本発明ペプチドを被覆したポリスチレンビーズ、コンドロールドポアサイズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐａｒｅ　５ｉｚｅ）ガラスピーズ、またはニトロセルロースベーパー帯片を使用することがイムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）により抗体を検出するための第二のテストキットは、１００μｍのｌＯｍＭＮａＨＣＯ，緩衝液ｐＨ９−５中の本発明ペプチドまたはペプチド混合物を被覆した多重９６−ウェル軟質ポリ塩化ビニル（ＰｖＣ）プレートを含む区画容器、およびｌ）正常ヒト血清（陰性対照として）；２）ＮＰ４０処理および熱不活性化ＨＴＬ、Ｖ−■陽性血清（陽性対照として）；３）サンプル希釈剤−および４）Ｉ−１２５標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ；を含むラジオイムノアッセイ用の物質から成っている。このアッセイは実施例５に記載の方法に従って行われる。

このテストキットでは、本発明ペプチドを前以て被覆した９６−ウェルＰＶＣプレートの代わりに、固相免疫吸着剤として本発明ペプチドを被覆したポリスチレンビーズを使用すること合成ペプチドを用いる酵素イムノアッセイによるＨＴＬＶ−Ｔ抗体（ＨＴＬＶ−１抗体ではない）の特異的検出ＨＴＬＶ−Ｉに対応する配列：ＡＰＰＬＬＰ）ＩＳＮＩ、ＤＨＩＩ、ＥＰＳＩＰＷＫＳＫＩ、ＬＴＬＶＱＬＴＬＱＳを有する５μｇ／ｍｌの本発明合成ＨＴＬＶ−Ｉペプチド■を含む溶液を、実施例１に従って９６−ウェルグレートのウェルに被覆した。ＨＴＬＶリゼイトに基づいたテストで反復反応性を示すことが知られた個体または供血者からの全部で１２０のサンプルが、それらの免疫反応性についてペプチド被覆プレートで試験された。１２０のサンプルのうち、７３はＨＴＬＶ−■またはＨＴＬＶ−Ｉ［特異的ＤＮＡグローブを用いるポリメラーゼチェイン反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　：　Ｐ　ＣＲ）によっても試験された。

これらのうち、４３はＰＣＲでＨＴＬＶ−■について陽性であり、そして３０はＰＣＲでＨＴＬＶ−ＩＩについて陽性であった。ウェスターンプロット（ＷＢ）やラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）のような補足的テストも１２０全部のサンプルについて寅施した。利用できるＰＣＲ結果をもたないサンプルの場合は、ＷＢおよびＲＩＰＡ結果を潜在的ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−ＩＩ陽性とみなした。従って、１２０のサンプルは次のカテゴリーから成っていた：すなわち、ＰＣＲでＨＴＬＶ−１陽性（４３サンプル）；ウェスターンプロント・およびＲＴＰＡで潜在的ＨＴＬＶ−Ｉ陽性（１２サンプル）、ＰＣＲでＨＴＬＶ−ＩＩ陽性（３０サンプル）；ウェスターンプロットおよびＲＩＰＡで潜在的ＨＴＬＶ −ＩＦ陽性（２６サンプル）；およびウイルスリゼイトＥＬ　Ｉ　ＳＡでＨＴＬＶに対して反復反応性であるが、ウェスターンプロットおよびＲＴＰＡで陰性（ＲＲ（ＷＢ　ＮＥＧ）、Ｑサンプル）７この合成ペプチドに基づいたＥＩＡの性能（ＨＴＬＶ−７ｍ異性）は表■に示しである。表■の結果は、この方法がＨＴＬＶ−１に対して高感受性で特異的であり、ＨＴＬＶ−Ｉ感染とＨＴＬＶ−ｎ感染を区別するために使用できることを示している。一方、全ウイルスリゼイトＥＩＡは、１２０全部のサンプルに対して陽性の結果を与えるので、２つのウィルス感染症を識別できない。

麦旦ペプチド■に　るテスト１皇（括弧内のアッセイにより確認）　　　ａｔｔｏ、り捜１致　　Ｊ１翻（１、ＨＴＬＶ−１（ＰＣＲ）　　　　　　　　　　４１／４３　　　　　　９５．３２、　ＨＴＬＶ−１（ＷＢ／ＲＩ　ＰＡ）　　　　　　１２／１２　　　　　１００３、ＨＴＬＶ−Ｉ［（ＰＣＲ）　　　　　　　　　　　４／３０　　　　　　１３．３４　、　ＨＴＬＶ−ＩＩ　（ＷＢ／ＲＩ　ＰＡ）　　　　　　　ｌ／２６　　　　　　３．８５、ＲＲ（ＷＢ　ＮＥＧ）　　　　　　　　　　　　０／９　　　　　　　０ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉｔ陽性であることがＰＣＲ，ＲＩＰＡまたはＷＢにより確認された個体および供血者からの血清は、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、から、および米国赤十字社（ＡＲＣ）のＣｈａｎｇ　Ｆａｎｇ博士より親切にも提供された。

医＊＠３−１合成ペプチドを用いる酵素イムノアッセイによるＴ（Ｔ１．Ｖ−Ｔｒ抗体（ＨＴＬＶｉ抗体ではない）の特異的検出第２図のＨＴＬＶ−Ｉ［に対応する配列、すなわち５ＰＰＬＶＨＤＳＤＬＥ）ＩＶＬＴＰＳＴＳＷＴＴＫＩＬＫＦＩＱＬＴＬＱＳ　。

のアミノ酸配列を有する、ＨＴＬＶ−Ｉ［ペプチドＸと呼ばれる。

本発明のＨＴＬＶ−１ペプチド■の合成ペプチド額絵体を含む溶液は、実施例１の方法に従って５ｕｇ／ｍｌの海産でｑ６ウエルプレートのウェルを被覆するために使用した、零施例１０と同じ１２０のサンプルが試験された。

この合成ペプチドに基づいたＥＩＡの性能（ＨＴＬＶ−＃特異性）は表■に示しである。表■の結果は、この方法がＨＴＬＶ−■に対して高感受性で特異的であり、ＨＴ　Ｔ、　Ｖ　−Ｉｒ　Ｍ休とＨＴＬＶ−Ｉ抗体を区別するために使用できることを示１．でいる。一方、全ウイルスリゼイトＥＩＡは、１２０全部のサンプルに対して陽性の結果を与えるので、２つのウィルス感染症を識別できない。

計ペプチドＸによるースト患者（括弧内のアッセイにより確認）　　　陽性数／試験数　　　陽性％１、　ＨＴＬＶ−ＩＩ　（ＰＣＲ）　　　　　　　　　　２８／３０　　　　　　９３．３２、　ＨＴＬＶ−ＩＩ　（ＷＢ／ＲＩ　ＰＡ）　　　　　　２４／２６　　　　　　９２．３３、ＨＴＬＶ−１（ＰＣＲ）　　　　　　　　　　　０／４３　　　　　　０４　、　ＨＴＬＶ−１（ＷＢ／ＲＩ　ＰＡ）　　　　　　　Ｏ／１２　　　　　　０ｓ、ＲＲ（ＷＢ　ＮＥＧ）　　　　　　　　　　　　０／９　　　　　　　０上記の実施例は本発明を例示するものであって、その範囲を制限するものではないことを理解すべきである。

＾４９２ｎｍ＾４９２ｎｍ＾４９２ｎｍ１．事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９０１００２６０平成２年特許願第５０３８２３号２、発明の名称ＨＴＬＶ−Ｉ抗体に対する免疫反応性を有する合成ペプチド組成物３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住所名　称　　ユナイテッド・バイオメディカル・インコーホレーテッド４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補１Ｆ命令の日付　　平成　３年　６月　４日　（発送日）（尚、（２）の書面の発明の名称の以外の内容には変更なし）国際調査邦牛

Claims

【特許請求の範囲】１．次の配列：【配列があります】（ＩＶ）【配列があります】（Ｖ）【配列があります】（ＶＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）より成る群から選ばれるペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；または上記ペプチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合体から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ −ＩＩ抗体に対して特異的免疫反応性を有するペプチド組成物。２．ペプチドＩＶ、ＶおよびＶＩの混合物から成る、請求項１記載のペプチド組成物。３．次のアミノ酸配列：【配列があります】（ＩＩ）を有するペプチドＩＩまたはその類縁体をさらに含む、請求項２記載のペプチド組成物。４．次のアミノ酸配列： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｘ）【配列があります】（ＸＩ）【配列があります】（ＸＩＩ）を有するペプチドＩＶ、ＶおよびＶＩの類縁体を含む、請求項１記載のペプチド組成物。５．ペプチドＩＶ、ＶおよびＶＩと、次の配列【配列があります】（Ｉ）【配列があります】（ＩＩ）【配列があります】（ＩＩＩ）を有するペプチドＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、またはその類縁体、との混合物から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体に対して特異的免疫反応性を有するペプチド組成物。６．（Ａ）固体支持体に、次のアミノ酸配列：【配列があります】（ＩＶ）【配列があります】（Ｖ）【配列があります】（ＶＩ）【配列があります】（Ｘ）【配列があります】（ＸＩ）【配列があります】（ＸＩＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）より成る群から選ばれるペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；またはそのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合体を含む有効量のペプチド組成物を抗原として被覆し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加え（その場合、テスト検体中のＨＴＬＶ −Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体がペプチド組成物とペプチド−抗体複合体を形成する）；（Ｃ）この混合物をインキュベートし；そして（Ｄ）ペプチド −抗体複合体の存在を検出する；ことから成るＨＴＬＶ−Ｉ抗体を検出してＡＴＬ疾患を診断するためのイムノアッセイ法。７．固体支持体は有効量のペプチドＩＶ、ＶおよびＶＩの混合物で被覆される、請求項６記載のイムノアッセイ法。８．固体支持体は有効量のペプチドＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩの混合物で被覆される、ただしペプチドＩＩまたけその類縁体はアミノ酸配列：【配列があります】（ＩＩ）を有する、請求項６記載のイムノアッセイ法。９．段階Ｄは酵素で標識した既知の第二抗体およびこの酵素と反応して着色生成物を形成する基質を導入することを含む、請求項６記載のイムノアッセイ法。１０．各テストにおいて、ペプチド組成物は有効量のＩＩ：ＩＶ：Ｖ：ＶＩの混合物である、請求項９記載の方法。１１．段階Ｄは酵素で標識した既知の第二抗体およびこの酵素と反応して着色生成物を形成する基質を導入することを含む、請求項８記載のイムノアッセイ法。１２．段階Ｄは放射性元素で標識した既知の第二抗体を導入することを含む、請求項６記載のイムノアッセイ法。１３．ペプチドー抗体複合体は凝集パターンとして検出可能である、請求項６記載のイムノアッセイ法。１４．ペプチドー抗体複合体は凝集パターンとして検出可能である、請求項８記載のイムノアッセイ法。１５．固体支持体はマルチドット、マルチーライン、またはマルチースクエア配列にペプチド組成物で被覆された帯片である、請求項６記載のイムノアッセイ法。１６．固体支持体はマルチドット、マルチーライン、またはマルチースクエア配列にペプチド組成物で被覆された帯片である、請求項８記載のイムノアッセイ法。１７．（ａ）固体支持体；（ｂ）固体支持体に被覆された、請求項１記載のペプチド組成物から成る免疫吸着剤；（ｃ）陰性対照としての正常血清のサンプル；（ｄ）陽性対照としてのＨＴＬＶ −Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を含む血清のサンプル；および（ｅ）血清サンプルを希釈するための緩衝剤；から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を検出してＡＴＬ、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ感染症を診断するためのテストキット。１８．（ａ）固体支持体；（ｂ）固体支持体に被覆された、請求項４記載のペプチド組成物から成る免疫吸着剤；（ｃ）陰性対照としての正常血清のサンプル；（ｄ）陽性対照としてのＨＴＬＶ −Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を含む血清のサンプル；および（ｅ）血清サンプルを希釈するための緩衝剤；から成る、ＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を検出してＡＴＬ、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ感染症を診断するためのテストキット。１９．次の配列：【配列があります】（ＩＶ）【配列があります】（Ｖ）【配列があります】（ＶＩ）【配列があります】（Ｘ）【配列があります】（ＸＩ）【配列があります】（ＸＩＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）より成る群から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；または上記ペプチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合体；および次の配列：【配列があります】【配列があります】（ＸＩＩＩ）【配列があります】（ＸＩＶ）【配列があります】（ＸＶ）【配列があります】（ＸＶＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）より成る群から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体（ＨＩＶ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；または上記ペプチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合体；から成る、ＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩおよびＨＩＶの抗体に対して特異的免疫反応性を有するペプチド組成物。２０．ペプチドＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶおよびＸＶＩの混合物から成る、請求項１９記載のペプチド組成物。２１．ペプチドＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶおよびＸＶＩの混合物とペプチドＩＩから成る、請求項１９記載のペプチド組成物。２２．ＩＩ：ＩＶ：ＶＩ：ＸＩＩＩ：ＸＩＶ：ＸＶ：ＸＶＩは２：０２：２：１０：１：１．５の重量比である、請求項２１記載のペプチド組成物。２３．（Ａ）固体支持体に、次のアミノ酸配列：【配列があります】（ＩＶ）【配列があります】（Ｖ）【配列があります】（ＶＩ）【配列があります】（Ｘ）【配列があります】（ＸＩ）【配列があります】（ＸＩＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）より成る群から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；またはそのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合体；および次のアミノ酸配列：【配列があります】（ＸＩＩＩ）【配列があります】（ＸＩＶ）【配列があります】（ＸＶ）【配列があります】（ＸＶＩ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）より成る群から選ばれる少なくとも１種のペプチド、その類縁体（ＨＩＶ抗体に対する免疫反応性が実質的に保持されるという条件で、アミノ酸が付加または欠失されるか、あるいは配列中のアミノ酸が置換される）；または上記ペプチドのセグメント、混合物、複合体、もしくは重合体；を含む有効量のペプチド組成物を抗原として被覆し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加える（その場合、テスト検体中のＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩおよびＨＩＶ抗体がペプチド組成物とペプチド−抗体複合体を形成する）；ことから成るＨＴＬＶ−Ｉおよび／またはＨＴＬＶ−ＩＩおよびＨＩＶの抗体を同時に検出するためのイムノアッセイ法。２４．固体支持体はペプチドＩＶまたはＸ、ＶＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶおよびＸＶＩの混合物とペプチドＩＩで被覆される、請求項２３記載のイムノアッセイ法。２５．ＩＩ：ＩＶ／Ｘ：ＶＩ：ＸＩＩＩ：ＸＩＶ：ＸＶ：ＸＶＩは２：０２：２：１０：１：１．５の重量比である、請求項２４記載のイムノアッセイ法。２６．（Ａ）固体支持体に、次のアミノ酸配列：【配列があります】（ＩＶ）（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である）を有する有効量のペプチド組成物またはその類縁体を被覆し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加え（その場合、テスト検体中のＨＴＬＶ−Ｉ抗体がペプチド組成物とペプチド−抗体複合体を形成する）；（Ｃ）この混合物をインキュベートし；そして（Ｄ）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する；ことによって体液中のＨＴＬＶ−Ｉ抗体の存在とＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の存在を識別するためのイムノアッセイ法。２７．有効量は約０．０１〜２０μｇである、請求項２６記載のイムノアッセイ法。２８．次のアミノ酸配列：【配列があります】（Ｘ）を有する、体液中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を検出してＨＴＬＶ−ＩＩ感染症を診断するためのペプチド組成物。２９，（Ａ）固体支持体に、有効量の請求項２８記載のアミノ酸配列を有するペプチド組成物を後覆し；（Ｂ）緩衝液で希釈したテスト検体を加え（その場合、テスト検体中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体がペプチド組成物とペプチド−抗体複合体を形成する）；（Ｃ）この混合物をインキュベートし；そして（Ｄ）ペプチド−抗体複合体の存在を検出する；ことによって体液中のＨＴＬＶ−ＩＩ抗体の存在とＨＴＬＶ−Ｉ抗体の存在を識別するためのイムノアッセイ法。３０．有効量は約０．０１〜２０μｇである、請求項２９記載のイムノアッセイ法。