JP2643598B2 - Ｈｔｌｖ‐▲ｉ▼抗体に対する免疫反応性を有する合成ペプチド組成物 - Google Patents
Ｈｔｌｖ‐▲ｉ▼抗体に対する免疫反応性を有する合成ペプチド組成物Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
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Description
【発明の詳細な説明】 序論 ヒトＴ細胞白血病ウイルスサブグループＩ（HTLV−Ｉ
と命名されている）はある種の成人リンパ様悪性疾患、
特に成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫（ATL）の病原として
関与しているレトロウイルスである（１−３）。HTLV−
Ｉ蛋白と反応する抗体はATL患者の血清中に見いだされ
た。これらのHTLV−Ｉ抗体はこのウイルスのgagコア抗
原とエンベロープ蛋白の両方を認識する（４、５）ｏヒ
トＴ細胞白血病ウイルスIII型（かつてHTLV−IIIとして
知られ、現在はヒト免疫不全ウイルス（HIV）として知
られている）は、後天性免疫不全症候群（AIDS）および
AIDS関連症候群（ARC）の原因であるレトロウイスであ
る。HIV蛋白と反応する抗体はAIDSおよびARC患者の血清
中に見いだされた。これらのHIV抗体はHIVウイルスのga
gコア抗原とエンベロープ蛋白の両方を認識する。米国
では、AIDSがATLよりもかなり多く広まっており、HIVに
対して血清陽性を示すヒトの一部はHTLV−Ｉに対しても
血清陽性である。
と命名されている）はある種の成人リンパ様悪性疾患、
特に成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫（ATL）の病原として
関与しているレトロウイルスである（１−３）。HTLV−
Ｉ蛋白と反応する抗体はATL患者の血清中に見いだされ
た。これらのHTLV−Ｉ抗体はこのウイルスのgagコア抗
原とエンベロープ蛋白の両方を認識する（４、５）ｏヒ
トＴ細胞白血病ウイルスIII型（かつてHTLV−IIIとして
知られ、現在はヒト免疫不全ウイルス（HIV）として知
られている）は、後天性免疫不全症候群（AIDS）および
AIDS関連症候群（ARC）の原因であるレトロウイスであ
る。HIV蛋白と反応する抗体はAIDSおよびARC患者の血清
中に見いだされた。これらのHIV抗体はHIVウイルスのga
gコア抗原とエンベロープ蛋白の両方を認識する。米国
では、AIDSがATLよりもかなり多く広まっており、HIVに
対して血清陽性を示すヒトの一部はHTLV−Ｉに対しても
血清陽性である。
本発明は、合成ペプチド組成物を使用して体液中のHT
LV−Ｉに対する抗体を検出するための非常に感度のよい
方法に関する。本発明はさらに、合成ペプチド組成物を
使用して体液中のHTLV−ＩおよびHIVに対する抗体を同
時に検出するための高感度方法に関する。１つのペプチ
ド組成物は、HTLV−Ｉ蛋白の外側（細胞外）部分（gp46
と呼ばれる）のセグメントに対応するアミノ酸配列を有
するペプチドを含み、さらにHTLV−Ienv蛋白のトランス
メンブラン部分（gp21と呼ばれる）のセグメントに対応
するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。これらの配
列はATL患者の血清中の抗体と高度に免疫反応性である
ことが判明した。また、この種のペプチド組成物は、健
康な哺乳類（ヒトを含む）におけるHTLV−Ｉ感染症に対
して防御を賦与するHTLV−Ｉ抗体の生産を刺激すること
によってATLのためのワクチンの製造に有用である。さ
らに、HTLV−Ｉエンベロープ蛋白の部分に対応するアミ
ノ酸配列をもつペプチドを含むペプチド組成物は、HIV
エンベロープ・コア蛋白の部分に対応するアミノ酸配列
をもつペプチドを含むペプチド組成物と共に使用して、
HTLV−ＩおよびHIVに対する抗体を同時に検出すること
ができる。
LV−Ｉに対する抗体を検出するための非常に感度のよい
方法に関する。本発明はさらに、合成ペプチド組成物を
使用して体液中のHTLV−ＩおよびHIVに対する抗体を同
時に検出するための高感度方法に関する。１つのペプチ
ド組成物は、HTLV−Ｉ蛋白の外側（細胞外）部分（gp46
と呼ばれる）のセグメントに対応するアミノ酸配列を有
するペプチドを含み、さらにHTLV−Ienv蛋白のトランス
メンブラン部分（gp21と呼ばれる）のセグメントに対応
するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。これらの配
列はATL患者の血清中の抗体と高度に免疫反応性である
ことが判明した。また、この種のペプチド組成物は、健
康な哺乳類（ヒトを含む）におけるHTLV−Ｉ感染症に対
して防御を賦与するHTLV−Ｉ抗体の生産を刺激すること
によってATLのためのワクチンの製造に有用である。さ
らに、HTLV−Ｉエンベロープ蛋白の部分に対応するアミ
ノ酸配列をもつペプチドを含むペプチド組成物は、HIV
エンベロープ・コア蛋白の部分に対応するアミノ酸配列
をもつペプチドを含むペプチド組成物と共に使用して、
HTLV−ＩおよびHIVに対する抗体を同時に検出すること
ができる。
より詳細には、本発明は、指定した配列で約34、40、
38、20、24および16個のアミノ酸またはそれらの類縁体
を含む化学合成ペプチド；その混合物、複合体および重
合体より成る群から選ばれるペプチドを含む、HTLV−Ｉ
抗体の検出およびATLの診断に有用なペプチド組成物に
関する。本発明はさらに、指定した配列で約21、19、11
および16個のアミノ酸を含む化学合成ペプチド；その混
合物、複合体および重合体より成る群から選ばれるペプ
チドを含むHIVペプチド組成物と共にHTLV−Ｉペプチド
組成物を使用して、ヒト体液中のHTLV−ＩおよびHIVに
対する抗体を同時に検出することに関する。
38、20、24および16個のアミノ酸またはそれらの類縁体
を含む化学合成ペプチド；その混合物、複合体および重
合体より成る群から選ばれるペプチドを含む、HTLV−Ｉ
抗体の検出およびATLの診断に有用なペプチド組成物に
関する。本発明はさらに、指定した配列で約21、19、11
および16個のアミノ酸を含む化学合成ペプチド；その混
合物、複合体および重合体より成る群から選ばれるペプ
チドを含むHIVペプチド組成物と共にHTLV−Ｉペプチド
組成物を使用して、ヒト体液中のHTLV−ＩおよびHIVに
対する抗体を同時に検出することに関する。
検出方法には酵素免疫吸着アッセイ（ELISA）、ニト
ロセルロースペーパー上でのマルチ−ドット、マルチ−
ラインまたはマルチ−スクエアブロッティング、および
固相抗原としてペプチドを使用する間接赤血球凝集反応
アッセイが含まれる。好適な検出方法はELISAである。
ロセルロースペーパー上でのマルチ−ドット、マルチ−
ラインまたはマルチ−スクエアブロッティング、および
固相抗原としてペプチドを使用する間接赤血球凝集反応
アッセイが含まれる。好適な検出方法はELISAである。
発明の背景 ヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルス（HTLV）は、Ｔ
細胞リンパ腫および皮膚疾患を有する患者から初めて分
離された関連レトロウイルスの１属である。この属の特
定サブグループであるＩ型（HTLV−Ｉとして知られてい
る）は、日本（６−９）、カリブ海諸島（10、11）およ
び米国南西部（12）の地域に発生する成人Ｔ細胞白血病
−リンパ腫（ATL）と呼ばれる疾患と臨床的・疫学的特
徴を共有する悪性疾患の病原体と同定された。
細胞リンパ腫および皮膚疾患を有する患者から初めて分
離された関連レトロウイルスの１属である。この属の特
定サブグループであるＩ型（HTLV−Ｉとして知られてい
る）は、日本（６−９）、カリブ海諸島（10、11）およ
び米国南西部（12）の地域に発生する成人Ｔ細胞白血病
−リンパ腫（ATL）と呼ばれる疾患と臨床的・疫学的特
徴を共有する悪性疾患の病原体と同定された。
現在のところ、HTLV−Ｉの伝播機構は未知であるが、
分子および疫学的分析によりHTLVの水平伝播が明らかに
関係していると分かった（13、14）。ATLを風土病とす
る地域でのHTLV−Ｉ血清陽性は全住民において上昇して
おり、さらに患者の近親者および輸血を受けた者の間で
上昇している（15、16）。
分子および疫学的分析によりHTLVの水平伝播が明らかに
関係していると分かった（13、14）。ATLを風土病とす
る地域でのHTLV−Ｉ血清陽性は全住民において上昇して
おり、さらに患者の近親者および輸血を受けた者の間で
上昇している（15、16）。
このことは、血液サンプルが血液銀行に入る前にそれ
をスクリーニングするために、そしてHTLV−Ｉおよび感
染者に由来する献血を分離して輸血を受けなければなら
ない患者（例えば、血友病者および手術患者）の間にウ
イルスが広がるのを避けるために、安全で、信頼でき
る、感度の高い試験法が早急に必要とされていることを
意味する。
をスクリーニングするために、そしてHTLV−Ｉおよび感
染者に由来する献血を分離して輸血を受けなければなら
ない患者（例えば、血友病者および手術患者）の間にウ
イルスが広がるのを避けるために、安全で、信頼でき
る、感度の高い試験法が早急に必要とされていることを
意味する。
HTLV−Ｉウイルスの完全なヌクレオチド配列は1983年
に報告された（17）。この報告はHTLV−Ｉウイルスの構
造をDNAレベルと推定された蛋白レベルの両方で明らか
にし、HTLV−Ｉウイルスに存在しうる異なるエピトープ
の血清学的研究を可能にした。
に報告された（17）。この報告はHTLV−Ｉウイルスの構
造をDNAレベルと推定された蛋白レベルの両方で明らか
にし、HTLV−Ｉウイルスに存在しうる異なるエピトープ
の血清学的研究を可能にした。
1983年のSeiki et alの報告と同時に、国立がん研究
所のCarl Saxinger博士は、アフリカの人々のHTLV−Ｉ
抗体を検出する酵素イムノアッセイの開発において、単
離したHTLV−Ｉウイルスの固相免疫吸着剤としての使用
を報告した（18）。
所のCarl Saxinger博士は、アフリカの人々のHTLV−Ｉ
抗体を検出する酵素イムノアッセイの開発において、単
離したHTLV−Ｉウイルスの固相免疫吸着剤としての使用
を報告した（18）。
さらに、Samuel et al.（19）は、ATL患者由来の血清
中の抗体の免疫学的に反応するHTLV−Ｉ DNAコード化
糖蛋白を同定するために、E.coli内のクローニング・発
現ベクターが使用されたと報告した。エンベロープ蛋白
をコードするHTLV−Ｉ DNAを切断して断片となし、発
現ベクターに挿入した。この発現ベクターを形質転換に
より、E.coli宿主に導入した。pKS400と呼ばれる１つの
クローンがエンベロープ蛋白産物を生産し、この蛋白は
１群28の血清をスクリーニングするための免疫吸着剤と
して適していることが判明した。細菌が合成したHTLV−
Ｉエンベロープ蛋白配列を認識する抗体は、破壊ヴィリ
オンを抗原として用いたELISAアッセイで調べたときHTL
V抗体を含んでいた、すべての血清中に存在していた（1
8）。
中の抗体の免疫学的に反応するHTLV−Ｉ DNAコード化
糖蛋白を同定するために、E.coli内のクローニング・発
現ベクターが使用されたと報告した。エンベロープ蛋白
をコードするHTLV−Ｉ DNAを切断して断片となし、発
現ベクターに挿入した。この発現ベクターを形質転換に
より、E.coli宿主に導入した。pKS400と呼ばれる１つの
クローンがエンベロープ蛋白産物を生産し、この蛋白は
１群28の血清をスクリーニングするための免疫吸着剤と
して適していることが判明した。細菌が合成したHTLV−
Ｉエンベロープ蛋白配列を認識する抗体は、破壊ヴィリ
オンを抗原として用いたELISAアッセイで調べたときHTL
V抗体を含んでいた、すべての血清中に存在していた（1
8）。
Slamon et al.の出願番号PCT/US85/01803（1986年３
月27日に公開番号WO86/01834として発表された）は、HT
LV−ＩのＸ領域（このウイルスのenvと３′LTRの間にあ
る高度に保存された領域）の発現産物としてHTLV−Ｉの
免疫原部位と関係したポリペプチドを開示した。分子量
37〜40kdのこれらの蛋白はクローン化して、E.coliによ
り融合蛋白として発現させた。得られた産物を精製し、
血清をスクリーニングするための液相免疫沈降試験にお
いて使用した。これらの結果は約77〜87％の正確さを示
した（20）。
月27日に公開番号WO86/01834として発表された）は、HT
LV−ＩのＸ領域（このウイルスのenvと３′LTRの間にあ
る高度に保存された領域）の発現産物としてHTLV−Ｉの
免疫原部位と関係したポリペプチドを開示した。分子量
37〜40kdのこれらの蛋白はクローン化して、E.coliによ
り融合蛋白として発現させた。得られた産物を精製し、
血清をスクリーニングするための液相免疫沈降試験にお
いて使用した。これらの結果は約77〜87％の正確さを示
した（20）。
蛋白の表面にある抗原または免疫原部位をマッピング
するために、あるいは可能なワクチンとして、合成ペプ
チドが次第に使用されるようになった。以前に、本発明
者と共同研究者は、HIV（以前にはHTLV−IIIとよばれ
た）のエンベロープ蛋白上の高度に抗原性のエピトープ
を同定するために、そしてHIV抗体を検出する高感度の
特異的イムノアッセイを開発するために、この手法を用
いた（21）。1988年４月５日付けの米国特許第4735896
号を参照されたい；これらの特許の開示内容は参照によ
りここに引用するものとする（22）。本発明では、HTLV
−Ｉの高度に抗原性のエピトープを選択・同定するため
に、類似の手法が使用される。エピトープ分析のための
エンベロープ蛋白の領域を選択する際に、いくつかの戦
略が用いられた。第一に、HTLV−１とHTLV−２との間で
アミノ酸配列の比較的高い保存を示す領域が検索され
た。第二に、HTLVエンベロープ蛋白のトランスメンブラ
ン部分（第１図参照）、gp21の全領域をカバーする多重
複線状ペプチドが合成され、特性決定された。第三に、
HTLVエンベロープ蛋白の外側部分（第１図参照）、gp46
の全領域をカバーする多重複線状ペプチドが合成され、
特性決定された。以下の配列をもつトランスメンブラン
部分からの３種のペプチド（第２図参照）およびそれら
の混合物は、ATL患者由来の血清と高度に免疫反応性で
あることが分かった： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−NH2 （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−NH2 （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−NH2 （III） また、次の配列をもつ外側部分からの３種のペプチド
およびそれらの混合物も、ATL患者由来の血清と高度に
免疫反応性であることが判明した（第３図参照）： APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−NH2 （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−NH
2 （Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−NH2 （VI） ここで： Ａ＝Ala＝アラニン G＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン I＝Ile＝イソロイシン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 F＝Phe＝フェニルアラニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン S＝Ser＝セリン Ｑ＝Gln＝グルタミン W＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Y＝Tyr＝チロシン Ｌ＝Leu＝ロイシン V＝Val＝バリン Ｋ＝Lys＝リシン C＝Cys＝システイン Ｈ＝His＝ヒスチジン P＝Pro＝プロリン Ｔ＝Thr＝トレオニン 化学合成ペプチドを土台としたHTLV−Ｉ抗体のアッセ
イは、破壊した全ウイルスまたは細菌が生産した免疫吸
着剤を用いるアッセイと比べていくつかの利点を示す。
これらのペプチドは自動固相合成法を使ってグラム量で
簡単に合成することができ、こうして再生産可能な同一
抗原が一貫した収量で得られる。生物学的系からの抗原
の分離はこのような再生産を妨げる。より重要なことと
して、非HTLV−Ｉ感染者に見られる非特異的反応は、ア
ッセイに使用した調製物の異成分によると思われる。こ
れは特に免疫吸着剤として全ウイルスまたはE.coli誘導
組換え産物を用いたアッセイの場合に当てはまる。これ
らの方法では、宿主細胞の内因性細菌蛋白または主要組
織適合抗原がしばしば目的の抗原ウイルスまたは蛋白と
一緒に精製される。これらの汚染抗原に対する抗体は往
々にして正常な人々にも見られるので、一般に行われて
いる抗原分離法では偽陽性結果を排除することができな
い。
するために、あるいは可能なワクチンとして、合成ペプ
チドが次第に使用されるようになった。以前に、本発明
者と共同研究者は、HIV（以前にはHTLV−IIIとよばれ
た）のエンベロープ蛋白上の高度に抗原性のエピトープ
を同定するために、そしてHIV抗体を検出する高感度の
特異的イムノアッセイを開発するために、この手法を用
いた（21）。1988年４月５日付けの米国特許第4735896
号を参照されたい；これらの特許の開示内容は参照によ
りここに引用するものとする（22）。本発明では、HTLV
−Ｉの高度に抗原性のエピトープを選択・同定するため
に、類似の手法が使用される。エピトープ分析のための
エンベロープ蛋白の領域を選択する際に、いくつかの戦
略が用いられた。第一に、HTLV−１とHTLV−２との間で
アミノ酸配列の比較的高い保存を示す領域が検索され
た。第二に、HTLVエンベロープ蛋白のトランスメンブラ
ン部分（第１図参照）、gp21の全領域をカバーする多重
複線状ペプチドが合成され、特性決定された。第三に、
HTLVエンベロープ蛋白の外側部分（第１図参照）、gp46
の全領域をカバーする多重複線状ペプチドが合成され、
特性決定された。以下の配列をもつトランスメンブラン
部分からの３種のペプチド（第２図参照）およびそれら
の混合物は、ATL患者由来の血清と高度に免疫反応性で
あることが分かった： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−NH2 （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−NH2 （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−NH2 （III） また、次の配列をもつ外側部分からの３種のペプチド
およびそれらの混合物も、ATL患者由来の血清と高度に
免疫反応性であることが判明した（第３図参照）： APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−NH2 （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−NH
2 （Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−NH2 （VI） ここで： Ａ＝Ala＝アラニン G＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン I＝Ile＝イソロイシン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 F＝Phe＝フェニルアラニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン S＝Ser＝セリン Ｑ＝Gln＝グルタミン W＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Y＝Tyr＝チロシン Ｌ＝Leu＝ロイシン V＝Val＝バリン Ｋ＝Lys＝リシン C＝Cys＝システイン Ｈ＝His＝ヒスチジン P＝Pro＝プロリン Ｔ＝Thr＝トレオニン 化学合成ペプチドを土台としたHTLV−Ｉ抗体のアッセ
イは、破壊した全ウイルスまたは細菌が生産した免疫吸
着剤を用いるアッセイと比べていくつかの利点を示す。
これらのペプチドは自動固相合成法を使ってグラム量で
簡単に合成することができ、こうして再生産可能な同一
抗原が一貫した収量で得られる。生物学的系からの抗原
の分離はこのような再生産を妨げる。より重要なことと
して、非HTLV−Ｉ感染者に見られる非特異的反応は、ア
ッセイに使用した調製物の異成分によると思われる。こ
れは特に免疫吸着剤として全ウイルスまたはE.coli誘導
組換え産物を用いたアッセイの場合に当てはまる。これ
らの方法では、宿主細胞の内因性細菌蛋白または主要組
織適合抗原がしばしば目的の抗原ウイルスまたは蛋白と
一緒に精製される。これらの汚染抗原に対する抗体は往
々にして正常な人々にも見られるので、一般に行われて
いる抗原分離法では偽陽性結果を排除することができな
い。
従って、本発明のアッセイは、他の方法が直面する偽
陽性反応を明らかに排除すると同時に、実質的に増大し
たシグナル対ノイズ比によって真に陽性の血清に対して
高い感度を示す。この増大したシグナル対ノイズ比は免
疫吸入剤の純度から生じると思われる。
陽性反応を明らかに排除すると同時に、実質的に増大し
たシグナル対ノイズ比によって真に陽性の血清に対して
高い感度を示す。この増大したシグナル対ノイズ比は免
疫吸入剤の純度から生じると思われる。
さらに、今日まで、HTLV−Ｉ感染症に対して防御を賦
与する生ワクチンまたは方法がまったく報告されていな
い。不活化ウイルスの利用は病気にかかる恐れを誘発
し、その許容性および使用を妨げる。
与する生ワクチンまたは方法がまったく報告されていな
い。不活化ウイルスの利用は病気にかかる恐れを誘発
し、その許容性および使用を妨げる。
同様に、哺乳類中のHTLV−Ｉに対するモクローナルお
よびポリクローナル抗体は、その方法において許容でき
ない危険性を提供しつつも、HTLV−Ｉを免疫源として使
用することを包含している。
よびポリクローナル抗体は、その方法において許容でき
ない危険性を提供しつつも、HTLV−Ｉを免疫源として使
用することを包含している。
それ故に、本発明の目的は、テスト試薬としてウイル
スまたはそのリゼイトの使用を必要としない検出・診断
方法を開発することである。
スまたはそのリゼイトの使用を必要としない検出・診断
方法を開発することである。
別の目的は、感度と精度の高いテスト方法を開発する
ことである。
ことである。
さらに他の目的は、たいへん高感度である故に、正確
な結果を得るためにも、きわめて少量のテスト試薬また
は体液しか必要としないテストを開発することである。
な結果を得るためにも、きわめて少量のテスト試薬また
は体液しか必要としないテストを開発することである。
他の目的は、化学的手段によりテスト試薬を製造する
ことである。合成試薬はその後体液中のHTLV−Ｉ抗体の
存在を検出しかつATLを診断するために使用され、これ
によりウイルスまたはそのセグメントにさらされる危険
およびウイルスの不必要な増殖を回避することができ
る。
ことである。合成試薬はその後体液中のHTLV−Ｉ抗体の
存在を検出しかつATLを診断するために使用され、これ
によりウイルスまたはそのセグメントにさらされる危険
およびウイルスの不必要な増殖を回避することができ
る。
他の目的は、健康な哺乳類（ヒトを含む）に注入した
とき、HTLV−Ｉ抗体の生産を刺激してHTLV−Ｉ感染症に
対して防御を賦与するワクチンを開発することである。
とき、HTLV−Ｉ抗体の生産を刺激してHTLV−Ｉ感染症に
対して防御を賦与するワクチンを開発することである。
別の目的は、HTLV−Ｉに対するモノクローナルおよび
ポリクローナル抗体を開発するために、哺乳類に使用す
ることのできる非ウイルス免疫原を提供することであ
る。
ポリクローナル抗体を開発するために、哺乳類に使用す
ることのできる非ウイルス免疫原を提供することであ
る。
他の目的は、HTLV（ＩおよびII）抗体とHIV抗体を同
時に検出するための診断方法を開発することである。
時に検出するための診断方法を開発することである。
文献 1.B.J.Poiesz.,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA.,77:74
15（1980）． 2.B.J.Poiesz.,F.W.Ruscetti,M.,S.Reitz., V.S.Kalyanaraman,R,Gallo,Nature（London）294:268
（1981）． 3.R.C.Gallo et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA.,79:5680
（1982）． 4.M.Essex et al.,Sceiuce.,221:1061（1983）． 5.P.Clapham,K.Napy,R.A.Weiss,Proc.Natl Acad.Sci.8
1:2886（1984）． 6.R.C.Gallo et al.,Cancer Res.,43:3892（1983）． 7.R.C.Gallo,Cancer Surveys,L.M.Franks et al.Eds,
（University Press,Oxford,in press）． 8.W.A.Blattner,K.Tokatsuki,R.C.Gallo.J.Am.Med.Asso
c.,250:1074（1983） 9.K.Tokatsuki,J.Uchiyama,K.Sagawa,J.Yodoi,Topics i
n Hematoloqy,S.Seno,F.Takaku,S.Irino,Eds.（Excerpt
a Madica,Amsterdam,1977）p73. 10.W.A.Blattner et al.,Int.J.Cancer,30:257（198
2）． 11.D.Catovsky et al.,Lancet,1982−I,639（1982）． 12.D.W.Blayney et al.,J.Am.Med.Assoc.,250:1048（19
83）． 13.M.Robert−Guroff.F.W.Ruscetti,L.W.Posner,B.J.Po
iesz,R.C.Gallo,J.Exp.Med.,154:1957（1981）． 14.R.C.Gallo et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA.,79:568
0（1981）． 15.M.Robert−Guroff et al.,J.Exp.Med.,157:248（198
3）． 16.M.Shimoyama et al.,Jpn.J.Clin,Oncol.,12:109（19
82）． 17.M.Seiki,S.Hattori,Y.Hirayama,M.Yoshida Proc.Nat
l Acad.Sci.USA.,80:3618（1983）． 18.Saxinger,C.W.et al.,Science,225:1473（1984）． 19.Samuel,K.F.et al.,Science,Nov.30,1984. 20.Slamon et al.,PCT Patent Publication NO.WO86/01
834. 21.Wang,J.J−G,Steel,S.,Wisniewolski,R.and Wang,C.
Y.Proc.Natl Acad.Sci.USA,83,pp6159−6163（August 1
986）． 22.U.S.Patent No.4,735,896.issued April 5,1988 to
Chang Y.Wang and James G.Wang. 23.Liu,Fu−Tong et al.,Biochemistry，18,pp.690−69
7（1979）． 発明の簡単な説明 本発明によれば、６種のペプチド（それぞれ特定の配
列をもつ）が固相ペプチド合成法により製造される。こ
れらのペプチドは、血清および体液中のHTLV−Ｉ抗体の
高感度・精度検出法に、あるいはATLの診断に、有用で
あることが見いだされた。高い免疫反応性のために、こ
れらのペプチドはBalb/cマウスのような健康な哺乳類に
よるHTLV−Ｉ抗体の生産を刺激するのに有用であること
が判明した。
15（1980）． 2.B.J.Poiesz.,F.W.Ruscetti,M.,S.Reitz., V.S.Kalyanaraman,R,Gallo,Nature（London）294:268
（1981）． 3.R.C.Gallo et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA.,79:5680
（1982）． 4.M.Essex et al.,Sceiuce.,221:1061（1983）． 5.P.Clapham,K.Napy,R.A.Weiss,Proc.Natl Acad.Sci.8
1:2886（1984）． 6.R.C.Gallo et al.,Cancer Res.,43:3892（1983）． 7.R.C.Gallo,Cancer Surveys,L.M.Franks et al.Eds,
（University Press,Oxford,in press）． 8.W.A.Blattner,K.Tokatsuki,R.C.Gallo.J.Am.Med.Asso
c.,250:1074（1983） 9.K.Tokatsuki,J.Uchiyama,K.Sagawa,J.Yodoi,Topics i
n Hematoloqy,S.Seno,F.Takaku,S.Irino,Eds.（Excerpt
a Madica,Amsterdam,1977）p73. 10.W.A.Blattner et al.,Int.J.Cancer,30:257（198
2）． 11.D.Catovsky et al.,Lancet,1982−I,639（1982）． 12.D.W.Blayney et al.,J.Am.Med.Assoc.,250:1048（19
83）． 13.M.Robert−Guroff.F.W.Ruscetti,L.W.Posner,B.J.Po
iesz,R.C.Gallo,J.Exp.Med.,154:1957（1981）． 14.R.C.Gallo et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA.,79:568
0（1981）． 15.M.Robert−Guroff et al.,J.Exp.Med.,157:248（198
3）． 16.M.Shimoyama et al.,Jpn.J.Clin,Oncol.,12:109（19
82）． 17.M.Seiki,S.Hattori,Y.Hirayama,M.Yoshida Proc.Nat
l Acad.Sci.USA.,80:3618（1983）． 18.Saxinger,C.W.et al.,Science,225:1473（1984）． 19.Samuel,K.F.et al.,Science,Nov.30,1984. 20.Slamon et al.,PCT Patent Publication NO.WO86/01
834. 21.Wang,J.J−G,Steel,S.,Wisniewolski,R.and Wang,C.
Y.Proc.Natl Acad.Sci.USA,83,pp6159−6163（August 1
986）． 22.U.S.Patent No.4,735,896.issued April 5,1988 to
Chang Y.Wang and James G.Wang. 23.Liu,Fu−Tong et al.,Biochemistry，18,pp.690−69
7（1979）． 発明の簡単な説明 本発明によれば、６種のペプチド（それぞれ特定の配
列をもつ）が固相ペプチド合成法により製造される。こ
れらのペプチドは、血清および体液中のHTLV−Ｉ抗体の
高感度・精度検出法に、あるいはATLの診断に、有用で
あることが見いだされた。高い免疫反応性のために、こ
れらのペプチドはBalb/cマウスのような健康な哺乳類に
よるHTLV−Ｉ抗体の生産を刺激するのに有用であること
が判明した。
本発明によれば、HTLV−Ｉ抗体の検出およびATLの診
断に有用なペプチド組成物は、次のペプチド： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILWPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）より成る群から
選ばれるペプチド、その混合物、複合体または重合体を
含有する；ただし Ａ＝Ala＝アラニン G＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン I＝Ile＝イソロイシン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 F＝Phe＝フェニルアラニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン S＝Ser＝セリン Ｑ＝Gln＝グルタミン W＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Y＝Tyr＝チロシン Ｌ＝Leu＝ロイシン V＝Val＝バリン Ｋ＝Lys＝リシン C＝Cys＝システイン Ｈ＝His＝ヒスチジン P＝Pro＝プロリン Ｔ＝Thr＝トレオニン 体液中のHTLV−Ｉ抗体を検出しかつATLを診断するた
めの感度・精度の高い方法は、次の段階から成ってい
る： A.次のアミノ酸配列： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILWPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有する群から
選ばれるペプチド、その混合物、複合体または重合体を
含有するペプチド組成物を調製する段階；および B.イムノアッセイ法において抗原として約pH7〜10の緩
衝液中の約0.01μｇ〜約20μg/テストのペプチド組成物
を使用する段階。
断に有用なペプチド組成物は、次のペプチド： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILWPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）より成る群から
選ばれるペプチド、その混合物、複合体または重合体を
含有する；ただし Ａ＝Ala＝アラニン G＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン I＝Ile＝イソロイシン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 F＝Phe＝フェニルアラニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン S＝Ser＝セリン Ｑ＝Gln＝グルタミン W＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Y＝Tyr＝チロシン Ｌ＝Leu＝ロイシン V＝Val＝バリン Ｋ＝Lys＝リシン C＝Cys＝システイン Ｈ＝His＝ヒスチジン P＝Pro＝プロリン Ｔ＝Thr＝トレオニン 体液中のHTLV−Ｉ抗体を検出しかつATLを診断するた
めの感度・精度の高い方法は、次の段階から成ってい
る： A.次のアミノ酸配列： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILWPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有する群から
選ばれるペプチド、その混合物、複合体または重合体を
含有するペプチド組成物を調製する段階；および B.イムノアッセイ法において抗原として約pH7〜10の緩
衝液中の約0.01μｇ〜約20μg/テストのペプチド組成物
を使用する段階。
さらに、本発明によれば、ペプチドそれら自体、また
は蛋白や高分子キャリアーに結合されたペプチド、また
はシステイン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモまた
はヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合された
ペプチド、またはホモまたはヘテロ官能性多価架橋剤の
使用によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリ
ゴマーへ重合されたペプチド、あるいは多価リシン樹脂
上で直接合成されたペプチドを使用して、健康な哺乳類
（ヒトを含む）によるHTLV−Ｉ抗体の生産を刺激するこ
とができる。この方法は、ヒト血清アルブミンのような
キャリアーに結合された、または重合体としての、有効
量のこれら６種のペプチドの混合物を含むペプチド組成
物を、腹腔内または皮下注射により健康な哺乳類の体内
に導入することから成っている。
は蛋白や高分子キャリアーに結合されたペプチド、また
はシステイン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモまた
はヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合された
ペプチド、またはホモまたはヘテロ官能性多価架橋剤の
使用によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリ
ゴマーへ重合されたペプチド、あるいは多価リシン樹脂
上で直接合成されたペプチドを使用して、健康な哺乳類
（ヒトを含む）によるHTLV−Ｉ抗体の生産を刺激するこ
とができる。この方法は、ヒト血清アルブミンのような
キャリアーに結合された、または重合体としての、有効
量のこれら６種のペプチドの混合物を含むペプチド組成
物を、腹腔内または皮下注射により健康な哺乳類の体内
に導入することから成っている。
さらに、本発明によれば、HTLV−Ｉに対する抗体の検
出に有用なペプチド組成物は、HTLV−ＩとHIV−1/2の両
方による感染を同時に検出するために、HIV−１およびH
IV−２に対する抗体の検出に有用なペプチド組成物と共
に使用される。HIV−１およびHIV−２に対する抗体の検
出に有用なペプチド組成物は、特定配列（HIV−２の配
列はペプチドVIIおよびペプチドVIIIの類縁体である）
の以下のアミノ酸またはそれらの類似体の化学合成ペプ
チド： HIV−１ RILAVERYLKDQQLLGIWGCS−Ｘ （VII） ＩWGCSGKLICTTAVPWNAS−Ｘ （VIII） IVRMYSPTSIL−Ｘ （IX） HIV−２ ＤQARLNSWGCAFRQVC （Ｘ） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）、その混合物、
複合体または重合体を含有する；ただし Ａ＝Ala＝アラニン G＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン I＝Ile＝イソロイシン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 F＝Phe＝フェニルアラニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン S＝Ser＝セリン Ｑ＝Gln＝グルタミン W＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Y＝Tyr＝チロシン Ｌ＝Leu＝ロイシン V＝Val＝バリン Ｋ＝Lys＝リシン C＝Cys＝システイン Ｈ＝His＝ヒスチジン P＝Pro＝プロリン Ｔ＝Thr＝トレオニン Ｍ＝Met＝メチオニン 下線を引いたアミノ酸は種々の単離物の間で共有され
る残基を表す。HIV−２のペプチドでは、ヌクレオチド
配列から推定される対応HIV−２エンベロープ蛋白アミ
ノ酸配列において置換が行われた。
出に有用なペプチド組成物は、HTLV−ＩとHIV−1/2の両
方による感染を同時に検出するために、HIV−１およびH
IV−２に対する抗体の検出に有用なペプチド組成物と共
に使用される。HIV−１およびHIV−２に対する抗体の検
出に有用なペプチド組成物は、特定配列（HIV−２の配
列はペプチドVIIおよびペプチドVIIIの類縁体である）
の以下のアミノ酸またはそれらの類似体の化学合成ペプ
チド： HIV−１ RILAVERYLKDQQLLGIWGCS−Ｘ （VII） ＩWGCSGKLICTTAVPWNAS−Ｘ （VIII） IVRMYSPTSIL−Ｘ （IX） HIV−２ ＤQARLNSWGCAFRQVC （Ｘ） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）、その混合物、
複合体または重合体を含有する；ただし Ａ＝Ala＝アラニン G＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン I＝Ile＝イソロイシン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 F＝Phe＝フェニルアラニン Ｎ＝Asn＝アスパラギン S＝Ser＝セリン Ｑ＝Gln＝グルタミン W＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Y＝Tyr＝チロシン Ｌ＝Leu＝ロイシン V＝Val＝バリン Ｋ＝Lys＝リシン C＝Cys＝システイン Ｈ＝His＝ヒスチジン P＝Pro＝プロリン Ｔ＝Thr＝トレオニン Ｍ＝Met＝メチオニン 下線を引いたアミノ酸は種々の単離物の間で共有され
る残基を表す。HIV−２のペプチドでは、ヌクレオチド
配列から推定される対応HIV−２エンベロープ蛋白アミ
ノ酸配列において置換が行われた。
図面の簡単な説明 第１図は、HTLV−１およびHTLV−２エンベロープ蛋白
のアミノ酸配列の比較を示す。
のアミノ酸配列の比較を示す。
第２図は、本明細書中で開示した化学合成ペプチドの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
第３図は、ATL患者由来の血清とここに開示したペプ
チドとの免疫反応性を示すヒストグラムである。
チドとの免疫反応性を示すヒストグラムである。
第４図は、HIV感染患者、ATL患者、および無作為に抽
出した供血者由来の血清とここに開示したペプチドとの
免疫反応性を示すヒストグラムである。
出した供血者由来の血清とここに開示したペプチドとの
免疫反応性を示すヒストグラムである。
第５図は、ここに開示した７種の化学合成ペプチドの
混合物を使用する酵素イムノアッセイによるHTLV−Ｉお
よびHIV（１および２）に対する抗体の同時検出を示す
ヒストグラムである。
混合物を使用する酵素イムノアッセイによるHTLV−Ｉお
よびHIV（１および２）に対する抗体の同時検出を示す
ヒストグラムである。
発明の詳細な説明 本発明によれば、体液中のHTLV−Ｉ抗体の検出、ATL
の診断、およびHTLV−Ｉに対する抗体の生産を刺激する
ことによる健康な哺乳類のワクチン接種のために、哺乳
類中のHTLV−Ｉに対するモノクローナルおよびポリグロ
ーナル抗体の双方の開発のために６種のペプチドが化学
的に合成される。これらのペプチドは次の配列を有す
る： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）。
の診断、およびHTLV−Ｉに対する抗体の生産を刺激する
ことによる健康な哺乳類のワクチン接種のために、哺乳
類中のHTLV−Ｉに対するモノクローナルおよびポリグロ
ーナル抗体の双方の開発のために６種のペプチドが化学
的に合成される。これらのペプチドは次の配列を有す
る： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）。
また、これらのペプチドは複合体であってもよく、す
なわち、それらはウシ血清アルブミン（BSA）またはヒ
ト血清アルブミン（HSA）のようなキャリアー蛋白に結
合させることができる。さらに、これらのペプチドは重
合体であってもよく、すなわち、それらは分枝オクタマ
ーリシン樹脂のような高分子樹脂上で合成することがで
きる。
なわち、それらはウシ血清アルブミン（BSA）またはヒ
ト血清アルブミン（HSA）のようなキャリアー蛋白に結
合させることができる。さらに、これらのペプチドは重
合体であってもよく、すなわち、それらは分枝オクタマ
ーリシン樹脂のような高分子樹脂上で合成することがで
きる。
さらに、異なる単離物間の株による変異に適応させる
ために、保存的置換についての調節および非保存的置換
を伴うもの間の選択が上記の特定配列において行われ
る。
ために、保存的置換についての調節および非保存的置換
を伴うもの間の選択が上記の特定配列において行われ
る。
体液中のHTLV−Ｉに対する抗体の検出およびATLの診
断のためのテスト試薬として有用なポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、gp21と呼ばれるHTLV−Ｉウイルスのアミノ
酸配列の部分セグメント、およびgp46と呼ばれるHTLV−
Ｉウイルスのアミノ酸配列の部分セグメント（両方とも
HTLV−Ｉウイルスのエンベロープ蛋白を規定するgp61の
一部である）に対応するように選ばれる。
断のためのテスト試薬として有用なポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、gp21と呼ばれるHTLV−Ｉウイルスのアミノ
酸配列の部分セグメント、およびgp46と呼ばれるHTLV−
Ｉウイルスのアミノ酸配列の部分セグメント（両方とも
HTLV−Ｉウイルスのエンベロープ蛋白を規定するgp61の
一部である）に対応するように選ばれる。
抗体HTLV−Ｉを検出するための固相免疫吸着剤として
有用なペプチドは、側鎖保護ｔ−Boc−アミノ酸を用い
る“古典的”なMerrifield固相ペプチド合成法により、
以下のアミノ酸配列に一致するように合成した： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）。
有用なペプチドは、側鎖保護ｔ−Boc−アミノ酸を用い
る“古典的”なMerrifield固相ペプチド合成法により、
以下のアミノ酸配列に一致するように合成した： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （Ｉ） QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ （II） NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ （III） APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ （IV） SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ（Ｖ） CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ （VI） （ここでＸは−OHまたは−NH2である）。
樹脂上での目的の保護ペプチドの合成が完了した後、
ペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸で処理して、樹脂か
らのペプチドを切断するためにペプチドと樹脂との間の
ベンジルエステル結合を切断する。ベンジル誘導保護基
で合成の間中保護されるアミノ酸の官能基も同時にペプ
チドから切断される。その後、遊離ペプチドは高性能液
体クロマトグラフィー（HPLC）で精製して、アミノ酸分
析により生化学的に特性決定される。
ペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸で処理して、樹脂か
らのペプチドを切断するためにペプチドと樹脂との間の
ベンジルエステル結合を切断する。ベンジル誘導保護基
で合成の間中保護されるアミノ酸の官能基も同時にペプ
チドから切断される。その後、遊離ペプチドは高性能液
体クロマトグラフィー（HPLC）で精製して、アミノ酸分
析により生化学的に特性決定される。
同様に、Ｃ−末端にアミド基を有するこれらペプチド
の合成は、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用
して以下の方法により達成できる； Ｃ−末端残基の４−メチルビンズヒドリルアミン樹脂
へのカップリング 上記方法により合成されたペプチドはHTLV−Ｉに対す
る抗体と高度に反応性であり、HTLV−Ｉ抗体を検出する
ための高感度の特異的免疫吸着剤として使用することが
できる。
の合成は、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用
して以下の方法により達成できる； Ｃ−末端残基の４−メチルビンズヒドリルアミン樹脂
へのカップリング 上記方法により合成されたペプチドはHTLV−Ｉに対す
る抗体と高度に反応性であり、HTLV−Ｉ抗体を検出する
ための高感度の特異的免疫吸着剤として使用することが
できる。
表Ｉおよび表IIは、ELISA法（ウェルプレートは1:1:1
（I:II:III）の重量比のペプチドおよび不活性化HTLV−
Ｉで被覆する）を使ってATL患者由来の血清から得られ
たデータを示す。表IIIでは３種のペプチド混合物（1:
1:1）および不活性化HTLV−Ｉと同様に、ウェルプレー
トを３種のペプチド各々でそれぞれ被覆したELISA法に
よりATL患者由来の血清から得られたデータを比較す
る。表IVは、ウェルプレートを重量比1:0.25:1:1（II:I
V:V:VI）のペプチドII、IV、ＶおよびVIの混合物で被覆
したELISA法を使って、ATL患者由来の血清から得られた
データを示す。表Ｖは、赤血球（RBC）をペプチドVI−B
SA複合体で被覆した凝集法を利用して、ATL患者由来の
血清から得られたデータを示す。
（I:II:III）の重量比のペプチドおよび不活性化HTLV−
Ｉで被覆する）を使ってATL患者由来の血清から得られ
たデータを示す。表IIIでは３種のペプチド混合物（1:
1:1）および不活性化HTLV−Ｉと同様に、ウェルプレー
トを３種のペプチド各々でそれぞれ被覆したELISA法に
よりATL患者由来の血清から得られたデータを比較す
る。表IVは、ウェルプレートを重量比1:0.25:1:1（II:I
V:V:VI）のペプチドII、IV、ＶおよびVIの混合物で被覆
したELISA法を使って、ATL患者由来の血清から得られた
データを示す。表Ｖは、赤血球（RBC）をペプチドVI−B
SA複合体で被覆した凝集法を利用して、ATL患者由来の
血清から得られたデータを示す。
HTLV−Ｉ抗体との免疫反応における本発明ペプチド組
成物の高感度および特異性に基づいて、これらのペプチ
ド組成物はATL感染症のためのワクチンとして、あるい
は哺乳類（ヒトを含む）にHTLV−Ｉに対するモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体を発生させるための免疫
原として有用であると考えられる。また、ペプチド組成
物は、蛋白に結合されたまたは高分子キャリアー樹脂
（例．オクタマーリシン樹脂）上で合成されたもの、ま
たはシステイン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモま
たはヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合され
たもの、あるいはホモまたはヘテロ官能性多価架橋剤の
使用によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリ
ゴマーへ重合されたものも、HTLV−Ｉ抗体の生産を刺激
しかつ健康な哺乳類にHTLV−Ｉ感染症に対する防御を賦
与するために、正常個体に導入することができる。本発
明のペプチド組成物はウイルスから生化学的に誘導され
るものではないので、予防接種を受けようとする正常個
体がこの病気にさらされる危険はない。
成物の高感度および特異性に基づいて、これらのペプチ
ド組成物はATL感染症のためのワクチンとして、あるい
は哺乳類（ヒトを含む）にHTLV−Ｉに対するモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体を発生させるための免疫
原として有用であると考えられる。また、ペプチド組成
物は、蛋白に結合されたまたは高分子キャリアー樹脂
（例．オクタマーリシン樹脂）上で合成されたもの、ま
たはシステイン酸化誘導ジスルフィド架橋によりホモま
たはヘテロダイマーもしくは高級オリゴマーへ重合され
たもの、あるいはホモまたはヘテロ官能性多価架橋剤の
使用によりホモまたはヘテロダイマーもしくは高級オリ
ゴマーへ重合されたものも、HTLV−Ｉ抗体の生産を刺激
しかつ健康な哺乳類にHTLV−Ｉ感染症に対する防御を賦
与するために、正常個体に導入することができる。本発
明のペプチド組成物はウイルスから生化学的に誘導され
るものではないので、予防接種を受けようとする正常個
体がこの病気にさらされる危険はない。
本発明ペプチドを使用することの利点は数多く存在す
る。
る。
本発明ペプチドは化学的に合成される。このことは、
テスト試薬やワクチンの製造過程でHTLV−Ｉウイルスと
接触しないことを意味する。ワクチン製造中または予防
接種時に、ワクチン製造者や医師はHTLV−Ｉウイルスに
さらされる危険がない。さらに、HTLV−Ｉ抗体を検出す
るテスト（この場合、テスト試薬を血清または体液のサ
ンプルにさらす）の最終段階まで、実験室の研究者がHT
LV−Ｉウイルスにさらされる危険はない。
テスト試薬やワクチンの製造過程でHTLV−Ｉウイルスと
接触しないことを意味する。ワクチン製造中または予防
接種時に、ワクチン製造者や医師はHTLV−Ｉウイルスに
さらされる危険がない。さらに、HTLV−Ｉ抗体を検出す
るテスト（この場合、テスト試薬を血清または体液のサ
ンプルにさらす）の最終段階まで、実験室の研究者がHT
LV−Ｉウイルスにさらされる危険はない。
本発明方法によって回避される別の問題は、HTLV−Ｉ
ウイルスリゼイト調製物と一緒に精製された宿主細胞か
らの抗原物質、あるいは発現されたウイルス断片と一緒
に精製されたE.coli誘導蛋白の存在により生ずる偽陽性
結果の可能性である。正常個体のうちの何人かは、宿主
細胞由来の抗原物質と交差反応するE.coliまたはヒト白
血球抗原（例.HLA）に対する抗体をもっている。これら
の正常個体からの血清サンプルはHTLV−Ｉにさらされな
くてもELISAまたはIRMAテストにおいて陽性の応答を示
すかもしれない。
ウイルスリゼイト調製物と一緒に精製された宿主細胞か
らの抗原物質、あるいは発現されたウイルス断片と一緒
に精製されたE.coli誘導蛋白の存在により生ずる偽陽性
結果の可能性である。正常個体のうちの何人かは、宿主
細胞由来の抗原物質と交差反応するE.coliまたはヒト白
血球抗原（例.HLA）に対する抗体をもっている。これら
の正常個体からの血清サンプルはHTLV−Ｉにさらされな
くてもELISAまたはIRMAテストにおいて陽性の応答を示
すかもしれない。
この型の偽陽性に基づいたHTLV−Ｉに感染しているか
もしれない患者の診断は、その人および彼／彼女の家族
に深刻な不安をもたらす。これらのすべての問題は本発
明によるペプチド組成物をテスト試薬として使用するこ
とにより回避できる。
もしれない患者の診断は、その人および彼／彼女の家族
に深刻な不安をもたらす。これらのすべての問題は本発
明によるペプチド組成物をテスト試薬として使用するこ
とにより回避できる。
さらに、適当なアミノ酸類似体の置換により、上記の
特定アミノ酸配列に基づいた種々のペプチド類縁体が合
成され、これらのペプチドはより低いバックグラウンド
読み取り、あるいはHTLV−Ｉ抗体スクリーニングアッセ
イに有用な固相への良好な吸着能を示す特性をもつこと
が期待される。
特定アミノ酸配列に基づいた種々のペプチド類縁体が合
成され、これらのペプチドはより低いバックグラウンド
読み取り、あるいはHTLV−Ｉ抗体スクリーニングアッセ
イに有用な固相への良好な吸着能を示す特性をもつこと
が期待される。
さらに、本発明のペプチド組成物は合成的に製造され
るので、品質をコントロールすることができ、その結
果、テスト結果の再現性が保証される。また、各テスト
法に必要なペプチドの量はごくわずかであり、しかもペ
プチドの製造経費は比較的少ないので、HTLV−Ｉ抗体に
ついて体液をスクリーニングするコスト、ATL感染症の
診断コスト、およびワクチンの製造コストが比較的低
い。
るので、品質をコントロールすることができ、その結
果、テスト結果の再現性が保証される。また、各テスト
法に必要なペプチドの量はごくわずかであり、しかもペ
プチドの製造経費は比較的少ないので、HTLV−Ｉ抗体に
ついて体液をスクリーニングするコスト、ATL感染症の
診断コスト、およびワクチンの製造コストが比較的低
い。
本発明により製造されたペプチドは、酵素免疫吸着ア
ッセイ（ELISA）、酵素イムノドットアッセイ、凝集ア
ッセイ、ラジオイムノラジオメトリックアッセイ（IRM
A）、または他の公知イムノアッセイにおいてテスト試
薬として用いることにより、HTLV−Ｉ感染を検出しかつ
ATLを診断するために使用される。好適な方法はELISAで
ある。ELISA法は実施例１に、IRMA法は実施例３に、そ
して凝集アッセイは実施例４および５に示してある。
ッセイ（ELISA）、酵素イムノドットアッセイ、凝集ア
ッセイ、ラジオイムノラジオメトリックアッセイ（IRM
A）、または他の公知イムノアッセイにおいてテスト試
薬として用いることにより、HTLV−Ｉ感染を検出しかつ
ATLを診断するために使用される。好適な方法はELISAで
ある。ELISA法は実施例１に、IRMA法は実施例３に、そ
して凝集アッセイは実施例４および５に示してある。
以下の方法において、プレートまたはビーズへのペプ
チドの結合を容易にするために、被覆緩衝液中に0.25重
量％のグルタルアルデヒドが加えられることに注意すべ
きである。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マ
ウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体が第二抗体トレーサ
ーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg
Gの代わりに用いられる。
チドの結合を容易にするために、被覆緩衝液中に0.25重
量％のグルタルアルデヒドが加えられることに注意すべ
きである。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マ
ウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体が第二抗体トレーサ
ーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg
Gの代わりに用いられる。
これらの方法で用いるゼラチンはウシ皮膚ゼラチン、
ブタ皮膚ゼラチン、魚ゼラチンまたは既知の入手可能な
ゼラチン蛋白であり、アルブミン蛋白と置き換えること
ができる。
ブタ皮膚ゼラチン、魚ゼラチンまたは既知の入手可能な
ゼラチン蛋白であり、アルブミン蛋白と置き換えること
ができる。
実施例１ 酵素免疫吸着アッセイによるHTLV−Ｉ抗体の検出 96−ウェルプレートのウェルに、上記のように製造し
た３種のペプチドＩ、II、IIIを1:1:1の重量比で100μ
ｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中の各々1.5μg/ウェルの
ペプチドで４℃にて一晩（または室温で３時間）被覆し
た。ウェルはリン酸緩衝溶液（PBS）で３回洗い、その
後PBS中の３重量％ゼラチン250μｌと37℃で１時間イン
キュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、続い
て0.05容量％Tween20を含むPBSで３回以上洗った。テス
ト血清（患者または正常個体から採取した血液）は20容
量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび0.05容量％
Tween20を含むPBSを用いて1:20および1:200（容量：容
量）の希釈率でそれぞれ希釈した。各ウェルに200μｌ
の希釈血清を加え、37℃で１時間反応させた。その後、
ウェルを0.05容量％Tween20を含むPBSで３回洗い、未結
合抗体を除いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ
抗ヒトIgGを第二抗体トレーサーとして使用して、陽性
ウェルに形成されたHTLV−Ｉ抗体−抗原複合体と結合さ
せた。１容量％正常ヤギ血清および0.05容量％Tween20
を含むPBSで1:3000に希釈した100μｌのペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ヒトIgGを各ウェルに加えて、37℃でさら
に15分間インキュベートした。
た３種のペプチドＩ、II、IIIを1:1:1の重量比で100μ
ｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中の各々1.5μg/ウェルの
ペプチドで４℃にて一晩（または室温で３時間）被覆し
た。ウェルはリン酸緩衝溶液（PBS）で３回洗い、その
後PBS中の３重量％ゼラチン250μｌと37℃で１時間イン
キュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、続い
て0.05容量％Tween20を含むPBSで３回以上洗った。テス
ト血清（患者または正常個体から採取した血液）は20容
量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび0.05容量％
Tween20を含むPBSを用いて1:20および1:200（容量：容
量）の希釈率でそれぞれ希釈した。各ウェルに200μｌ
の希釈血清を加え、37℃で１時間反応させた。その後、
ウェルを0.05容量％Tween20を含むPBSで３回洗い、未結
合抗体を除いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ
抗ヒトIgGを第二抗体トレーサーとして使用して、陽性
ウェルに形成されたHTLV−Ｉ抗体−抗原複合体と結合さ
せた。１容量％正常ヤギ血清および0.05容量％Tween20
を含むPBSで1:3000に希釈した100μｌのペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ヒトIgGを各ウェルに加えて、37℃でさら
に15分間インキュベートした。
ウェルは0.05容量％Tween20含有PBSで５回洗って未結
合抗体を除き、クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.0中に0.0
4重量％オルトフェニレンジアミン（OPD）および0.012
容量％過酸化水素を含む基質混合物100μｌと反応させ
た。この基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキ
シダーゼ標識を検出するために使用された。反応は100
μｌの1.0M H2SO4を加えて停止させ、ELISAリーダーを
使って492nm（すなわちA492）で吸光度を測定した。ア
ッセイは正常個体またはHTLV−Ｉ感染症に無関係の病気
をもつ患者からの血清サンプルの希釈物（1:20）を陰性
対照として用いて２通り行った。A492＝0.12（正常血清
対照の平均A492値の約３倍）の閾値より大きい吸光度読
み取りを陽性として採用した。これらの結果を表１に示
す。
合抗体を除き、クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.0中に0.0
4重量％オルトフェニレンジアミン（OPD）および0.012
容量％過酸化水素を含む基質混合物100μｌと反応させ
た。この基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキ
シダーゼ標識を検出するために使用された。反応は100
μｌの1.0M H2SO4を加えて停止させ、ELISAリーダーを
使って492nm（すなわちA492）で吸光度を測定した。ア
ッセイは正常個体またはHTLV−Ｉ感染症に無関係の病気
をもつ患者からの血清サンプルの希釈物（1:20）を陰性
対照として用いて２通り行った。A492＝0.12（正常血清
対照の平均A492値の約３倍）の閾値より大きい吸光度読
み取りを陽性として採用した。これらの結果を表１に示
す。
＊アッセイは緩衝液で1:20（v/v）に希釈した血清を用
いて行った。閾値は、A492＝0.12として定められ、正常
血清コントロールの平均A492値の約３倍である。
いて行った。閾値は、A492＝0.12として定められ、正常
血清コントロールの平均A492値の約３倍である。
注 ATL患者由来の血清（ロットＩおよびII）は、日本
岡山赤十字社のカンジミヤモト（Ka;ji Miyamoto）の好
意により提供され、AIDS、ARC一次免疫不全、白血球／
エンパ腫の患者の血清は、アービンのカリフォルニア大
学のS.Gupta博士；ニューヨーク大学のD.M.Knowks博士
およびロングアイランドユダヤ人病院のF.D.Siegal博士
の好意により提供された。
岡山赤十字社のカンジミヤモト（Ka;ji Miyamoto）の好
意により提供され、AIDS、ARC一次免疫不全、白血球／
エンパ腫の患者の血清は、アービンのカリフォルニア大
学のS.Gupta博士；ニューヨーク大学のD.M.Knowks博士
およびロングアイランドユダヤ人病院のF.D.Siegal博士
の好意により提供された。
リューマチ関節炎、エリトマトーデスおよびアレルギー
を含む、免疫不全症患者由来の血清は、ニューヨークの
ロックフェラー大学病院のN.Chiorazzi博士の好意によ
り提供された。
を含む、免疫不全症患者由来の血清は、ニューヨークの
ロックフェラー大学病院のN.Chiorazzi博士の好意によ
り提供された。
表１に示す結果は、血清を使用した本発明によるELIS
Aの方法が、きわめて正確で、高度に特異的であること
を示す。しかし、AIDS/ARCまたはHTLV−III（HIV）感染
者の約16.7％がHTLV−Ｉにも感染することがあり、最近
の知見と一致する。この発見は警告しており、HTLV−１
およびHIV（HTLV−III）の二重感染を防止するための、
効果的な測定法が必要とされる。正常個体またはHTLV−
Ｉに感染していないと診断された患者には免疫反応は見
られなかった。
Aの方法が、きわめて正確で、高度に特異的であること
を示す。しかし、AIDS/ARCまたはHTLV−III（HIV）感染
者の約16.7％がHTLV−Ｉにも感染することがあり、最近
の知見と一致する。この発見は警告しており、HTLV−１
およびHIV（HTLV−III）の二重感染を防止するための、
効果的な測定法が必要とされる。正常個体またはHTLV−
Ｉに感染していないと診断された患者には免疫反応は見
られなかった。
血液銀行から、ウイルスに汚染されている血清を排除
するためのスクリーニングテストは、陽性反応と決定す
るための規準は所望により、より厳重にすることができ
る点に留意されたい。
するためのスクリーニングテストは、陽性反応と決定す
るための規準は所望により、より厳重にすることができ
る点に留意されたい。
実施例２ ウェル当り１μｇの不活性化NP40可溶化HTLV−Ｉでウ
ェルプレートを予め被覆すること以外は、実施例１と同
じ血清を使用して実施例１の方法を繰り返した。結果を
表IIに表す。
ェルプレートを予め被覆すること以外は、実施例１と同
じ血清を使用して実施例１の方法を繰り返した。結果を
表IIに表す。
＊閾値は、正常血清対照のA492の最高値として決定され
た。
た。
実施例１で得られた結果と比較して、この方法は正確
さおよび特異性がより低く、ゆえに信頼性が低い。さら
に閾値は、より自由な規準を使用して選択された。
さおよび特異性がより低く、ゆえに信頼性が低い。さら
に閾値は、より自由な規準を使用して選択された。
実施例３ イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）によるHTLV−
Ｉ抗体の検出 96−ウェル軟質ポリ塩化ビニル（PVC）プレートのウ
ェルに、上記のように製造した３種のペプチドの混合物
（1:1:1）を100μｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中1.5μ
g/ウエルで４℃にて一晩（または室温で３時間）被覆す
る。ウェルはリン酸緩衝溶液（PBS）で３回洗い、その
後PBS中の３重量％ゼラチン250μｌと37℃で１時間イン
キュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、続い
て0.05容量％Tween20を含むPBSで３回以上洗浄する。テ
スト血清（ヒト患者または正常個体から採取した血液）
は20容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび0.05
容量％Tween20を含むPBSを用いて1:20および1:200（容
量：容量）の希釈率でそれぞれ希釈する。各ウェルに20
0μｌの希釈血清を加え、37℃で１時間反応させる。そ
の後、ウェルを0.05容量％Tween20含有PBSで３回洗い、
未結合抗体を除去する。Ｉ−125標識アフィニティー精
製ヤギ抗ヒトIgGを第二抗体トレーサーとして使用し
て、陽性ウェルに形成された抗体−抗原複合体と結合さ
せる。１容量％正常ヤギ血清および0.05容量％Tween20
を含むPBS中の50,000〜200,000cpmのＩ−125標識ヤギ抗
ヒトIgG100μｌを各ウェルに加えて、37℃でさらに15分
間インキュベートする。
Ｉ抗体の検出 96−ウェル軟質ポリ塩化ビニル（PVC）プレートのウ
ェルに、上記のように製造した３種のペプチドの混合物
（1:1:1）を100μｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中1.5μ
g/ウエルで４℃にて一晩（または室温で３時間）被覆す
る。ウェルはリン酸緩衝溶液（PBS）で３回洗い、その
後PBS中の３重量％ゼラチン250μｌと37℃で１時間イン
キュベートして、非特異的蛋白結合部位を遮断し、続い
て0.05容量％Tween20を含むPBSで３回以上洗浄する。テ
スト血清（ヒト患者または正常個体から採取した血液）
は20容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよび0.05
容量％Tween20を含むPBSを用いて1:20および1:200（容
量：容量）の希釈率でそれぞれ希釈する。各ウェルに20
0μｌの希釈血清を加え、37℃で１時間反応させる。そ
の後、ウェルを0.05容量％Tween20含有PBSで３回洗い、
未結合抗体を除去する。Ｉ−125標識アフィニティー精
製ヤギ抗ヒトIgGを第二抗体トレーサーとして使用し
て、陽性ウェルに形成された抗体−抗原複合体と結合さ
せる。１容量％正常ヤギ血清および0.05容量％Tween20
を含むPBS中の50,000〜200,000cpmのＩ−125標識ヤギ抗
ヒトIgG100μｌを各ウェルに加えて、37℃でさらに15分
間インキュベートする。
ウェルは0.05容量％Tween20含有PBSで５回洗って未結
合第二抗体を除き、乾かす。ウェルを切り取り、ガンマ
ーシンチレーションカウンターで計数する。アッセイは
1:20希釈物（容量：容量）を用いて２通り実施する。陰
性対照として正常血清サンプルも同時に試験する。正常
血清サンプルの平均読み取り＋4SD（標準偏差）より大
きいcpm読み取りを陽性として採用する。
合第二抗体を除き、乾かす。ウェルを切り取り、ガンマ
ーシンチレーションカウンターで計数する。アッセイは
1:20希釈物（容量：容量）を用いて２通り実施する。陰
性対照として正常血清サンプルも同時に試験する。正常
血清サンプルの平均読み取り＋4SD（標準偏差）より大
きいcpm読み取りを陽性として採用する。
実施例４ 固相免疫吸着剤としてペプチド混合物を被覆したゼラチ
ン粒子、異なる動物種の赤血球、またはラテックスビー
ズを用いる凝集アッセイによるHTLV−Ｉ抗体の検出 1mlの完全洗浄赤血球、ゼラチン粒子、またはポリス
チレンラテックスビーズに５μg/ml〜1mg/mlの範囲の濃
度でペプチド混合物を被覆する。その後、ペプチド混合
物被覆細胞、粒子またはビーズは96−ウェルＵ形マイク
ロプレートのウェル中で段階的希釈血清サンプルとイン
キュベートする。室温で約１時間放置後、ウェルの底ま
たはスライド上の沈降凝集パターンを読み取り、陽性反
応を示す最大希釈率を記録する。
ン粒子、異なる動物種の赤血球、またはラテックスビー
ズを用いる凝集アッセイによるHTLV−Ｉ抗体の検出 1mlの完全洗浄赤血球、ゼラチン粒子、またはポリス
チレンラテックスビーズに５μg/ml〜1mg/mlの範囲の濃
度でペプチド混合物を被覆する。その後、ペプチド混合
物被覆細胞、粒子またはビーズは96−ウェルＵ形マイク
ロプレートのウェル中で段階的希釈血清サンプルとイン
キュベートする。室温で約１時間放置後、ウェルの底ま
たはスライド上の沈降凝集パターンを読み取り、陽性反
応を示す最大希釈率を記録する。
これは血清または体液などのサンプル中のHTLV−Ｉ抗
体の定性・定量分析に多用しうる１段階アッセイであ
る。
体の定性・定量分析に多用しうる１段階アッセイであ
る。
実施例５ 凝集アッセイを用いてHTLV−Ｉ抗体を検出するための
第三のテストキットは、多重96−ウェルＵ−形マイクロ
ウェルプレートおよび（１）ペプチド混合物を被覆した
赤血球、ゼラチン粒子またはラテックスポリスチレンビ
ーズのびん；（２）正常ヒト血清（陰性対照として）；
および（３）NP40処理および熱不活性化ATL陽性血清
（陽性対照として）；を含む凝集アッセイ用の他の補助
物質から成っている。凝集アッセイは実施例４に記載の
方法に従って行われる。
第三のテストキットは、多重96−ウェルＵ−形マイクロ
ウェルプレートおよび（１）ペプチド混合物を被覆した
赤血球、ゼラチン粒子またはラテックスポリスチレンビ
ーズのびん；（２）正常ヒト血清（陰性対照として）；
および（３）NP40処理および熱不活性化ATL陽性血清
（陽性対照として）；を含む凝集アッセイ用の他の補助
物質から成っている。凝集アッセイは実施例４に記載の
方法に従って行われる。
実施例６ HTLV−Ｉ抗体を検出するための診断テストキットを作
製することができる。このテストキットは、使用前に１
ウェル当り100μｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中の1.5μ
ｇの本発明の３種のペプチド混合物（1:1:1）を被覆し
た多重95−ウェルプレートを含む区画容器を含んでい
る。キットはさらに別の密閉容器に収容した酵素検出用
の物質、すなわち１）正常ヒト血清（陰性対照とし
て）;2）NP40処理および熱不活性化ATL陽性血清（陽性
対照として）;3）正常ヤギ血清;4）ペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗ヒトIgG;および５）例えばリン酸クエン酸塩緩
衝液中のオルトフェニレンジアミン（OPD）および過酸
化水素から成る発色指示薬を含んでいる。このアッセイ
は実施例１に記載の方法に従って行われる。
製することができる。このテストキットは、使用前に１
ウェル当り100μｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中の1.5μ
ｇの本発明の３種のペプチド混合物（1:1:1）を被覆し
た多重95−ウェルプレートを含む区画容器を含んでい
る。キットはさらに別の密閉容器に収容した酵素検出用
の物質、すなわち１）正常ヒト血清（陰性対照とし
て）;2）NP40処理および熱不活性化ATL陽性血清（陽性
対照として）;3）正常ヤギ血清;4）ペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗ヒトIgG;および５）例えばリン酸クエン酸塩緩
衝液中のオルトフェニレンジアミン（OPD）および過酸
化水素から成る発色指示薬を含んでいる。このアッセイ
は実施例１に記載の方法に従って行われる。
このテストキットは、本発明ペプチドを前以て被覆し
た96−ウェルプレートの代わりに、固相免疫吸着剤とし
て本発明ペプチドを被覆したポリスチレンビーズ、コン
トロールドポアサイズ（controlled pore size）ガラス
ビーズで満たされた多重ミニカラムまたはニトロセルロ
ースペーパー帯片を使用することができる。
た96−ウェルプレートの代わりに、固相免疫吸着剤とし
て本発明ペプチドを被覆したポリスチレンビーズ、コン
トロールドポアサイズ（controlled pore size）ガラス
ビーズで満たされた多重ミニカラムまたはニトロセルロ
ースペーパー帯片を使用することができる。
実施例７ イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）により抗体
を検出するための第二のテストキットは、100μｌの10m
M NaHCO3緩衝液pH9.5中の本発明ペプチド混合物（1:1:
1）をウェル当り1.5μｇの濃度で被覆した折り曲げられ
る96−ウェルのポリ塩化ビニル（PVC）プレートを含む
区画容器、および１）正常ヒト血清（陰性対照とし
て）;2）NP40処理および熱不活性化ATL陽性血清（陽性
対照として）;3）正常ヤギ血清；および４）Ｉ−125標
識ヤギ抗ヒトIgG;を含むラジオイムノアッセイ用の物質
から成っている。このアッセイは実施例３に記載の方法
に従って行われる。
を検出するための第二のテストキットは、100μｌの10m
M NaHCO3緩衝液pH9.5中の本発明ペプチド混合物（1:1:
1）をウェル当り1.5μｇの濃度で被覆した折り曲げられ
る96−ウェルのポリ塩化ビニル（PVC）プレートを含む
区画容器、および１）正常ヒト血清（陰性対照とし
て）;2）NP40処理および熱不活性化ATL陽性血清（陽性
対照として）;3）正常ヤギ血清；および４）Ｉ−125標
識ヤギ抗ヒトIgG;を含むラジオイムノアッセイ用の物質
から成っている。このアッセイは実施例３に記載の方法
に従って行われる。
このテストキットでは、本発明ペプチドを前以て被覆
した96−ウェルPVCプレートの代わりに、固相免疫吸着
剤として本発明ペプチドを被覆したポリスチレンビーズ
を使用することができる。
した96−ウェルPVCプレートの代わりに、固相免疫吸着
剤として本発明ペプチドを被覆したポリスチレンビーズ
を使用することができる。
実施例８ ATL HTLV−Ｉ抗体の結果を比較するために、実施例
１に従って各々のペプチドおよびそれらの混合物（1:1:
1）、およびCarl Saxinger等による熱不活性化、NP−40
可溶化HTLV−Ｉを使用してひとつの実験を行った。ATL
患者またはHTLV−Ｉ感染者および非感染者由来の血清
は、1:20に希釈された。各々の希釈血清サンプルは、本
発明のペプチドおよびSaxinger等に従って培養されたHT
LV−Ｉに対して二連でテストされた。正常ヒト血清およ
び熱不活性化HTLV−Ｉ血清陽性ATL血清を対照として使
用した。結果を表IIIに示す。
１に従って各々のペプチドおよびそれらの混合物（1:1:
1）、およびCarl Saxinger等による熱不活性化、NP−40
可溶化HTLV−Ｉを使用してひとつの実験を行った。ATL
患者またはHTLV−Ｉ感染者および非感染者由来の血清
は、1:20に希釈された。各々の希釈血清サンプルは、本
発明のペプチドおよびSaxinger等に従って培養されたHT
LV−Ｉに対して二連でテストされた。正常ヒト血清およ
び熱不活性化HTLV−Ｉ血清陽性ATL血清を対照として使
用した。結果を表IIIに示す。
表IIIの結果は、この方法が高感度で高度に特異的で
あることを示している。本発明のペプチド組成物を使用
して、同じ希釈のATL血清サンプルに対して得られたA
492／閾値比は、破壊HTLV−Ｉを使用して同一に希釈し
た同一の血清サンプルに対して得られた比よりもしばし
ば高い。このことは特にペプチド混合物（1:1:1）（重
量比）を免疫吸着体として使用した時に典型的である。
データーはまた、混合物としてのペプチド組成物が高度
に正確であり、偽陰性は得られなかったことを表してい
る。
あることを示している。本発明のペプチド組成物を使用
して、同じ希釈のATL血清サンプルに対して得られたA
492／閾値比は、破壊HTLV−Ｉを使用して同一に希釈し
た同一の血清サンプルに対して得られた比よりもしばし
ば高い。このことは特にペプチド混合物（1:1:1）（重
量比）を免疫吸着体として使用した時に典型的である。
データーはまた、混合物としてのペプチド組成物が高度
に正確であり、偽陰性は得られなかったことを表してい
る。
実施例９ 酵素免疫吸着アッセイによるHTLV−Ｉ抗体の検出 96−ウェルプレートのウェルに、II:IV:V:VI＝1:0.2
5:1:1の重量比の上記のように製造した４種のペプチド
の混合物を100μｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中の3.25
μg/ウェルの混合物で４℃にて一晩（または室温で３時
間もしくは37℃で１時間）被覆した。ウェルはリン酸緩
衝溶液（PBS）で３回洗い、その後PBS中の３重量％ゼラ
チン250μｌと37℃で１時間インキュベートして、非特
異的蛋白結合部位を遮断し、続いて0.05容量％Tween20
を含むPBSで３回以上洗った。テスト血清（ヒト患者ま
たは正常個体から採取した血液）は20容量％正常ヤギ血
清、１重量％ゼラチンおよび0.05容量％Tween20を含むP
BSを用いて1:20および1:200（容量：容量）の希釈率で
それぞれ希釈した。各ウェルに200μｌの希釈血清を加
え、37℃で１時間反応させた。その後、ウェルを0.05容
量％Tween20含有PBSで３回洗い、未結合抗体を除いた。
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGを第二
抗体トレーサーとして使用して、陽性ウェルに形成され
たHTLV−Ｉ抗体−抗原複合体と結合させた。１容量％正
常ヤギ血清および0.05容量％Tween20を含むPBSで1:3000
に希釈した100μｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトI
gGを各ウェルに加えて、37℃でさらに15分間インキュベ
ートした。
5:1:1の重量比の上記のように製造した４種のペプチド
の混合物を100μｌの10mM NaHCO3緩衝液pH9.5中の3.25
μg/ウェルの混合物で４℃にて一晩（または室温で３時
間もしくは37℃で１時間）被覆した。ウェルはリン酸緩
衝溶液（PBS）で３回洗い、その後PBS中の３重量％ゼラ
チン250μｌと37℃で１時間インキュベートして、非特
異的蛋白結合部位を遮断し、続いて0.05容量％Tween20
を含むPBSで３回以上洗った。テスト血清（ヒト患者ま
たは正常個体から採取した血液）は20容量％正常ヤギ血
清、１重量％ゼラチンおよび0.05容量％Tween20を含むP
BSを用いて1:20および1:200（容量：容量）の希釈率で
それぞれ希釈した。各ウェルに200μｌの希釈血清を加
え、37℃で１時間反応させた。その後、ウェルを0.05容
量％Tween20含有PBSで３回洗い、未結合抗体を除いた。
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGを第二
抗体トレーサーとして使用して、陽性ウェルに形成され
たHTLV−Ｉ抗体−抗原複合体と結合させた。１容量％正
常ヤギ血清および0.05容量％Tween20を含むPBSで1:3000
に希釈した100μｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトI
gGを各ウェルに加えて、37℃でさらに15分間インキュベ
ートした。
ウェルは0.05容量％Tween20含有PBSで５回洗って未結
合抗体を除き、クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.0中に0.0
4重量％オルトフェニレンジアミン（OPD）および0.012
容量％過酸化水素を含む基質混合物100μｌと反応させ
た。この基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキ
シダーゼ標識を検出するために使用された。反応は100
μｌの1.0M H2SO4を加えて停止させ、ELISAリーダーを
使って492nmの吸光度（すなわちA492）を測定した。ア
ッセイは正常個体またはHTLV−Ｉ感染症に無関係の病気
をもつ患者からの血清サンプルの希釈物（1:20）を陰性
対照として用いて２通り行った。A492＝0.17〔正常対照
のA492＋0.1（反応性対照のA492値）〕の閾値より大き
い吸光度読み取りを陽性として採用した。これらの結果
を表IVおよび第４図に示す。
合抗体を除き、クエン酸ナトリウム緩衝液pH5.0中に0.0
4重量％オルトフェニレンジアミン（OPD）および0.012
容量％過酸化水素を含む基質混合物100μｌと反応させ
た。この基質混合物は着色生成物を形成させてペルオキ
シダーゼ標識を検出するために使用された。反応は100
μｌの1.0M H2SO4を加えて停止させ、ELISAリーダーを
使って492nmの吸光度（すなわちA492）を測定した。ア
ッセイは正常個体またはHTLV−Ｉ感染症に無関係の病気
をもつ患者からの血清サンプルの希釈物（1:20）を陰性
対照として用いて２通り行った。A492＝0.17〔正常対照
のA492＋0.1（反応性対照のA492値）〕の閾値より大き
い吸光度読み取りを陽性として採用した。これらの結果
を表IVおよび第４図に示す。
＊アッセイは緩衝液で1:20（v/v）に希釈した血清を用
いて行った。
いて行った。
注:ATL患者由来の血清は親切にも日本赤十字社から提供
され、AIDS、ARC、一次免疫不全症、白血病／リンパ腫
の患者からの血清はアービンのカリフォルニア大学のS.
Gupta博士、コロンビア大学のD.M.Knowles博士、および
ロングアイランドユダヤ人病院のF.D.Siegal博士により
親切にも提供された。
され、AIDS、ARC、一次免疫不全症、白血病／リンパ腫
の患者からの血清はアービンのカリフォルニア大学のS.
Gupta博士、コロンビア大学のD.M.Knowles博士、および
ロングアイランドユダヤ人病院のF.D.Siegal博士により
親切にも提供された。
表IVの結果は、血清サンプルを用いた本発明によるEL
ISAテスト法が非常に正確で、高度に特異的であること
を示している。しかしAIDS/ARCまたはHTLV−III（HIV）
感染者の約16.7％がHTLV−Ｉにも感染していることがわ
かり、これは最近の知見と一致する。この発見は警告し
ており、HTLV−ＩおよびHIV（HTLV−III）の二重感染を
防止するための効果的な測定法が必要とされる。
ISAテスト法が非常に正確で、高度に特異的であること
を示している。しかしAIDS/ARCまたはHTLV−III（HIV）
感染者の約16.7％がHTLV−Ｉにも感染していることがわ
かり、これは最近の知見と一致する。この発見は警告し
ており、HTLV−ＩおよびHIV（HTLV−III）の二重感染を
防止するための効果的な測定法が必要とされる。
血液銀行からウイルスに汚染された血液を除くスクリ
ーニングテストにおいて、所望により、陽性反応を規定
する規準をより厳重にすることができる点に留意された
い。
ーニングテストにおいて、所望により、陽性反応を規定
する規準をより厳重にすることができる点に留意された
い。
実施例10 凝集アッセイによるHTLV−Ｉ抗体の検出 Merrifield固相法により合成された本発明のHTLV−Ｉ
ペプチドは、本質的にFu−Tong Liu et al,Biochemistr
y18:690−697（1979）に記載されるように、ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（MBS）で誘導体化したウシ血清アルブミン（BSA）に
結合させた。0.013mlのMBS溶液（ジメチルホルムアミド
中0.025mg/ml）を室温で0.32mlのBSA溶液（0.01Mリン酸
緩衝液pH7.0中100mg/ml）に加えた。〔BSA溶液に加える
MBSの量は、研究する特定の複合体について決定されたB
SA対MBSの最適モル比により変化しうる。〕この混合物
は室温で１時間攪拌し、その後遠心して沈澱アルブミン
を除いた。次に、澄明混合物をセファデックスＧ−25の
ゲル濾過にかけ、280nmでのそれらの吸光度により検出
した蛋白含有画分をプールし、必要になるまで−70℃で
凍結保存した。
ペプチドは、本質的にFu−Tong Liu et al,Biochemistr
y18:690−697（1979）に記載されるように、ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（MBS）で誘導体化したウシ血清アルブミン（BSA）に
結合させた。0.013mlのMBS溶液（ジメチルホルムアミド
中0.025mg/ml）を室温で0.32mlのBSA溶液（0.01Mリン酸
緩衝液pH7.0中100mg/ml）に加えた。〔BSA溶液に加える
MBSの量は、研究する特定の複合体について決定されたB
SA対MBSの最適モル比により変化しうる。〕この混合物
は室温で１時間攪拌し、その後遠心して沈澱アルブミン
を除いた。次に、澄明混合物をセファデックスＧ−25の
ゲル濾過にかけ、280nmでのそれらの吸光度により検出
した蛋白含有画分をプールし、必要になるまで−70℃で
凍結保存した。
ペプチドはH2O中に10mg/mlで溶解した。予め定められ
た量の各ペプチド溶液は予め活性化されたBSA−MBS溶液
に滴下し、室温で３時間攪拌した。最終ペプチド−BSA
複合体はゲル濾過または十分な透析により遊離ペプチド
から分離した。ペプチド対BSAの比は慣用方法に従ってS
DS−PAGEにり決定した。
た量の各ペプチド溶液は予め活性化されたBSA−MBS溶液
に滴下し、室温で３時間攪拌した。最終ペプチド−BSA
複合体はゲル濾過または十分な透析により遊離ペプチド
から分離した。ペプチド対BSAの比は慣用方法に従ってS
DS−PAGEにり決定した。
一例として、ペプチドVI−BSA複合体はその後二重ア
ルデヒド固定化ヒトＯ赤血球にpH4.0で吸着させた。次
に、ペプチド−複合体被覆赤血球はNaBH4で処理して非
特異的蛋白結合を妨げた。その後、ペプチド−複合体被
覆赤血球をPBSで洗い、５％正常ヒト血清−PBS溶液とイ
ンキュベートした。これらの処理細胞はその後血清およ
び血漿サンプル中のHTLV−Ｉ抗体を検出するための凝集
アッセイにおいて使用した。
ルデヒド固定化ヒトＯ赤血球にpH4.0で吸着させた。次
に、ペプチド−複合体被覆赤血球はNaBH4で処理して非
特異的蛋白結合を妨げた。その後、ペプチド−複合体被
覆赤血球をPBSで洗い、５％正常ヒト血清−PBS溶液とイ
ンキュベートした。これらの処理細胞はその後血清およ
び血漿サンプル中のHTLV−Ｉ抗体を検出するための凝集
アッセイにおいて使用した。
成人Ｔ細胞白血病患者由来の全部で100の血清は、
（１）固相としてHTLV−Ｉウイルスリゼイトを用いる酵
素イムノアッセイ（EIA）〔DuPont社のHTLV−Ｉ ELIS
A〕；（２）ウェスターンブロット（WB）分析；（３）
固相としてペプチドVI−BSA複合体を用いる上記のHTLV
−Ｉ凝集アッセイによりHTLV−Ｉ抗体について試験し
た。これらの結果を表Ｖに示す。
（１）固相としてHTLV−Ｉウイルスリゼイトを用いる酵
素イムノアッセイ（EIA）〔DuPont社のHTLV−Ｉ ELIS
A〕；（２）ウェスターンブロット（WB）分析；（３）
固相としてペプチドVI−BSA複合体を用いる上記のHTLV
−Ｉ凝集アッセイによりHTLV−Ｉ抗体について試験し
た。これらの結果を表Ｖに示す。
＊HTLV−Ｉ凝集アッセイで陰性の結果が出た２つのサン
プルは、HTLV−Ｉのp19コア蛋白に対する抗体のみをも
つことが判明した。
プルは、HTLV−Ｉのp19コア蛋白に対する抗体のみをも
つことが判明した。
実施例11 ７種の化学合成ペプチドの混合物を用いる酵素イムノア
ッセイによるHTLV−Ｉ抗体とHIV（１および２）抗体の
同時検出 実施例１の方法に従って、本発明の７種の化学合成ペ
プチドを含む溶液を使用して、96ウェルプレートのウェ
ルに被覆した。３種のペプチドはHTLV−Ｉペプチド属
〔II、IVおよびVI〕から;3種はHIV−１ペプチド属〔VI
I、VIIIおよびIX〕から；そして１種はHIV−２ペプチド
属〔Ｘ〕からそれぞれ誘導された。ペプチドII:IV:VI:V
II:VIII:IX:Xは合計濃度21.2μg/mlにおいて2:0.2:2:1
0:1:1:5の比で存在していた。HIV−１陽性ドナー（155
サンプル）;HIV−２陽性ドナー（10サンプル）；ウェス
ターンブロットでHTLV−Ｉ陽性ドナー（92サンプル）；
ウェスターンブロットでHTLV−Ｉ陰性ドナー（４サンプ
ル）；自己免疫病患者（AI、36サンプル）；および無作
為に抽出した供血者（RBD、474サンプル）；からの全部
で771のサンプルがそれらのレトロウイスル免疫反応性
についてペプチド被覆プレート上で試験された。
ッセイによるHTLV−Ｉ抗体とHIV（１および２）抗体の
同時検出 実施例１の方法に従って、本発明の７種の化学合成ペ
プチドを含む溶液を使用して、96ウェルプレートのウェ
ルに被覆した。３種のペプチドはHTLV−Ｉペプチド属
〔II、IVおよびVI〕から;3種はHIV−１ペプチド属〔VI
I、VIIIおよびIX〕から；そして１種はHIV−２ペプチド
属〔Ｘ〕からそれぞれ誘導された。ペプチドII:IV:VI:V
II:VIII:IX:Xは合計濃度21.2μg/mlにおいて2:0.2:2:1
0:1:1:5の比で存在していた。HIV−１陽性ドナー（155
サンプル）;HIV−２陽性ドナー（10サンプル）；ウェス
ターンブロットでHTLV−Ｉ陽性ドナー（92サンプル）；
ウェスターンブロットでHTLV−Ｉ陰性ドナー（４サンプ
ル）；自己免疫病患者（AI、36サンプル）；および無作
為に抽出した供血者（RBD、474サンプル）；からの全部
で771のサンプルがそれらのレトロウイスル免疫反応性
についてペプチド被覆プレート上で試験された。
これらのサンプルに関する合成ペプチドに基づいたレ
トロウイルスコンボEIA（HTLV−ＩおよびHIV−1/2）の
性能は第５図に示してある。明らかに、これらの結果は
HTLV−ＩペプチドとHIVペプチドとの併用がレトロウイ
ルス感染症の検出に有用であることを示している。
トロウイルスコンボEIA（HTLV−ＩおよびHIV−1/2）の
性能は第５図に示してある。明らかに、これらの結果は
HTLV−ＩペプチドとHIVペプチドとの併用がレトロウイ
ルス感染症の検出に有用であることを示している。
上記の実施例は本発明を例示するものであって、その
範囲を制限するものではないことを理解すべきである。
範囲を制限するものではないことを理解すべきである。
Claims (25)
- 【請求項１】次の配列： APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ IV SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ Ｖ CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ VI （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドIV、ＶおよびVIよりなる群から選ばれるペプチド；ま
たは上記ペプチドの混合物、複合体もしくは重合体を含
むことを特徴とする、HTLV−Ｉ抗体に対して特異的免疫
反応性を有するペプチド組成物。 - 【請求項２】ペプチドIV、ＶおよびVIと、以下の配列： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ Ｉ QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ II NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ III を有するペプチドＩ、IIおよびIIIの混合物とを含み、
I:II:III:IV:V:VI比が、0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01
〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇであ
る、請求項１記載のペプチド組成物。 - 【請求項３】ペプチドIV、ＶおよびVIの比が、0.01〜20
μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇであるペプチドIV、Ｖお
よびVIの混合物を含む、請求項１記載のペプチド組成
物。 - 【請求項４】ペプチドII、IV、ＶおよびVIの比が、１μ
g:0.25μg:1μg:1μｇであるペプチドII、IV、Ｖおよび
VIの混合物を含む、請求項１記載のペプチド組成物。 - 【請求項５】ペプチドIIおよびIVの比が、0.01〜20μg:
0.01〜20μｇであるペプチドIIおよびIVの混合物を含
む、請求項１記載のペプチド組成物。 - 【請求項６】HTLV−Ｉ抗体を検出するためのイムノアッ
セイ法であって、以下の工程： （ａ）抗原として、次の配列： APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ IV SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ Ｖ CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ VI （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドIV、ＶおよびVIよりなる群から選ばれるペプチド；ま
たは上記ペプチドの混合物、複合体もしくは重合体を含
む、HTLV−Ｉ抗体に対して特異的免疫反応性を有するペ
プチド組成物の有効量を用いて、固体支持体を被覆する
工程、 （ｂ）テスト血清中のHTLV−Ｉ抗体とペプチド組成物と
のペプチド−抗体複合体が形成されるように、緩衝液で
希釈したテスト血清を加える工程、 （ｃ）上記混合物をインキュベートする工程、および （ｄ）上記ペプチド−抗体複合体の存在を検出する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項７】ペプチドIV、ＶおよびVIと、以下の配列： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ Ｉ QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ II NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ III を有するペプチドＩ、IIおよびIIIの混合物を含み、I:I
I:III:IV:V:VI比が、0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜2
0μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇであるペ
プチド組成物で固体支持体を被覆する、請求項６記載の
イムノアッセイ法。 - 【請求項８】ペプチドIV、ＶおよびVIの比が、0.01〜20
μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇであるペプチドIV、Ｖお
よびVIの混合物で固体支持体を被覆する、請求項６記載
のイムノアッセイ法。 - 【請求項９】ペプチドII、IV、ＶおよびVIの比が、１μ
g:0.25μg:1μg:1μｇであるペプチドII、IV、Ｖおよび
VIの混合物で固体支持体を被覆する、請求項６記載のイ
ムノアッセイ法。 - 【請求項１０】ペプチドIIおよびIVの比が、0.01〜20μ
g:0.01〜20μｇであるペプチドIIおよびIVの混合物で固
体支持体を被覆する、請求項６記載のイムノアッセイ
法。 - 【請求項１１】工程（ｄ）が、酵素で標識された既知の
第二抗体およびこの酵素と反応して着色生成物を形成す
る基質を導入することを含む、請求項６〜10のいずれか
１項記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１２】工程（ｄ）が、放射性元素で標識された
既知の第二抗体を導入することを含む、請求項６〜10の
いずれか１項記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１３】ペプチド−抗体複合体が、凝集パターン
として検出可能である、請求項６〜10のいずれか１項記
載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１４】固体支持体が、マルチ−ドット、マルチ
−ラインまたはマルチ−スクエア配列にペプチド組成物
で被覆された帯片である、請求項６〜10のいずれか１項
記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１５】以下のものを含む、HTLV−Ｉ抗体を検出
するためのテストキット： （ａ）固体支持体、 （ｂ）固体支持体に被覆された、請求項１記載のペプチ
ド組成物を含む免疫吸着剤、 （ｃ）陰性対照としての正常血清のサンプル、 （ｄ）陽性対照としてのHTLV−Ｉ抗体を含む血清のサン
プル、 および （ｅ）血清サンプルを希釈するための緩衝剤。 - 【請求項１６】以下のものを含む、HTLV−Ｉ抗体を検出
するためのテストキット： （ａ）固体支持体、 （ｂ）固体支持体に被覆された、請求項２記載のペプチ
ド組成物を含む免疫吸着剤、 （ｃ）陰性対照としての正常血清のサンプル、 （ｄ）陽性対照としてのHTLV−Ｉ抗体を含む血清のサン
プル、 および （ｅ）血清サンプルを希釈するための緩衝剤。 - 【請求項１７】次の配列： APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLTLVQLTLQS−Ｘ IV SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ Ｖ CFDPQIQAIVSSPCXNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ VI （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドIV、ＶおよびVIよりなる群から選ばれる少なくとも１
つのペプチド；または上記ペプチドの混合物、複合体も
しくは重合体、および 次の配列： RILAVERYLKDQQLLGIWGCS−Ｘ VII IWGCSGELICTTAVPWNAS−Ｘ VIII IVRMYSPTSIL−Ｘ IX DQARLNSWGCAFRQVC−Ｘ Ｘ （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドVII、VIII、IXおよびＸよりなる群から選ばれる少な
くとも１つのペプチド；または上記ペプチドの混合物、
複合体もしくは重合体 を含むことを特徴とする、HTLV−Ｉ抗体およびHIV抗体
に対して特異的免疫反応性を有するペプチド組成物。 - 【請求項１８】次の配列： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ Ｉ QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ II NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ III （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドＩ、IIおよびIIIよりなる群から選ばれる少なくとも
１つのペプチド；または上記ペプチドの混合物、複合体
もしくは重合体を、さらに含む、請求項17記載のペプチ
ド組成物。 - 【請求項１９】ペプチドＩ、II、III、IV、Ｖ、VI、VI
I、VIII、IXおよびＸの混合物を含み、ペプチドI:II:II
I:IV:V:VI:VII:VIII:IX:X比が、0.01〜20μg:0.01〜20
μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μ
g:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇ
である、請求項18記載のペプチド組成物。 - 【請求項２０】ペプチドII、IV、VI、VII、VIII、IXお
よびＸの混合物を含み、ペプチドII:IV:VI:VII:VIII:I
X:X比が、0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01
〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇであ
る、請求項18記載のペプチド組成物。 - 【請求項２１】ペプチドII、IV、VI、VII、VIII、IXお
よびＸの混合物を含み、ペプチドII:IV:VI:VII:VIII:I
X:X比が、２μg:0.2μg:2μg:10μg:1μg:1μg:1.5μｇ
である、請求項18記載のペプチド組成物。 - 【請求項２２】HTLV−Ｉ抗体およびHIV抗体を同時に検
出するためのイムノアッセイ法であって、以下の工程： （ａ）抗原として、次の配列： APPLLPHSNLDHILEPSIPWKSKILTLVQLTLQS−Ｘ IV SSTPLLYPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQAICSSPCH−Ｘ Ｖ CFDPQIQAIVSSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA−Ｘ VI （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドIV、ＶおよびVIよりなる群から選ばれる少なくとも１
つのペプチド；または上記ペプチドの混合物、複合体も
しくは重合体、および 次の配列： RILAVERYLAnQQLLGIWGCS−Ｘ VII IWGCSGKLICTTAVPWNAS−Ｘ VIII IVRMYSPTSIL−Ｘ IX DQARLNSWGCAFRQVC−Ｘ Ｘ （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドVII、VIII、IXおよびＸよりなる群から選ばれる少な
くとも１つのペプチド；または上記ペプチドの混合物、
複合体もしくは重合体 を含むことを特徴とする、HTLV−Ｉ抗体およびHIV抗体
に対して特異的免疫反応性を有するペプチド組成物の有
効量を用いて、固体支持体を被覆する工程、 （ｂ）テスト血清中のHTLV−Ｉ抗体およびHIV抗体とペ
プチド組成物とのペプチド−抗体複合体が形成されるよ
うに、緩衝液で希釈したテスト血清を加える工程、 （ｃ）上記混合物をインキュベートする工程、および （ｄ）上記ペプチド−抗体複合体の存在を検出する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２３】次の配列： GLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ Ｉ QNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQC−Ｘ II NRRGLDLLFWEQGGLC−Ｘ III （ここでＸは−OHまたは−NH2である）を有するペプチ
ドＩ、IIおよびIIIよりなる群から選ばれる少なくとも
１つのペプチド；または上記ペプチドの混合物、複合体
もしくは重合体を、さらに含むペプチド組成物で固体支
持体を被覆する、請求項22記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項２４】ペプチドII、IV、VI、VII、VIII、IXお
よびＸの比が、0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:
0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μg:0.01〜20μｇで
あるペプチドII、IV、VI、VII、VIII、IXおよびＸの混
合物で固体支持体を被覆する、請求項23記載のイムノア
ッセイ法。 - 【請求項２５】ペプチドII、IV、VI、VII、VIII、IXお
よびＸの比が、２μg:0.2μg:2μg:10μg:1μg:1μg:1.
5μｇであるペプチドII、IV、VI、VII、VIII、IXおよび
Ｘの混合物で固体支持体を被覆する、請求項23記載のイ
ムノアッセイ法。
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