DE69015708T2 - Künstliche peptid-zusammensetzungen mit immunoreaktiven antikörpern von htlv-1. - Google Patents
Künstliche peptid-zusammensetzungen mit immunoreaktiven antikörpern von htlv-1.Info
- Publication number
- DE69015708T2 DE69015708T2 DE69015708T DE69015708T DE69015708T2 DE 69015708 T2 DE69015708 T2 DE 69015708T2 DE 69015708 T DE69015708 T DE 69015708T DE 69015708 T DE69015708 T DE 69015708T DE 69015708 T2 DE69015708 T2 DE 69015708T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- htlv
- peptide
- peptides
- mixture
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 166
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 146
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 102
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 7
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 claims description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 11
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 38
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 24
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 abstract description 17
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 abstract description 16
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 abstract description 6
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 abstract description 5
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 abstract description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 abstract description 3
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 abstract 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 43
- 206010001413 Adult T-cell lymphoma/leukaemia Diseases 0.000 description 42
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 26
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 17
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 16
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 15
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 15
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 15
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 13
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 13
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 13
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 11
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 9
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 6
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010016275 Fear Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108700010909 HTLV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- -1 pH 9.5 Substances 0.000 description 1
- 238000012017 passive hemagglutination assay Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- MSTPNDZQVGSTET-UHFFFAOYSA-M sodium;2-anilino-6-sulfanylidene-1h-1,3,5-triazine-4-thiolate Chemical compound [Na+].N1C(=S)N=C([S-])N=C1NC1=CC=CC=C1 MSTPNDZQVGSTET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
- C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
- Der menschliche T-Zell-Leukämie-Virus Untergruppe I (jetzt bezeichnet als HLTV-1) ist ein ursächlich an gewisse adulte lymphoide Malignitäten, insbesondere adultem T-Zell-Leukämie- Lymphoma (ATL) (1-3) gebundener Retrovirus. Antikörper, die mit HTLV-1-Proteinen reagieren, sind in Seren von ATL-Patienten gefunden worden. Diese HTLV-1-Antikörper erkennen sowohl die Gag-Kern-Antigene und die Hüllproteine des HTLV-1-Virus (4,5). Menschlicher T-Zell lymphotroper Virustyp III (früher als HTLV-III bekannt, jetzt als menschlicher Immunschwächevirus oder HIV bezeichnet) ist ein ursächlich an erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) und den AIDS verwandten Komplex (ARC) gebundener Retrovirus. Antikörper, die mit HIV-Proteinen reagieren, sind in den Seren von ATDS- und ARC-Patienten gefunden worden. Diese HIV-Antikörper erkennen wowohl die Gag- Kern-Antigene und Hüllproteine des HIV-Virus. In den Vereinigten Staaten ist die AIDS-Erkrankung deutlich vorherrschender als ATL, wobei einige für HIV-Serum positive Individuen auch für HTLV-1-Serum positiv sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft hochsensitive Verfahren zur Antikörperbestimmung gegen HTLV-1 in Körperflüssigkeiten unter Verwendung synthetischer Peptidzusaminensetzungen. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein hochsensitives Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 und HIV in Körperflüssigkeiten durch die Verwendung synthetischer Peptidzusammensetzungen. Eine Peptidzusammensetzung enthält Peptide mit zu Segmenten des externen (extrazellulären) Bereiches des HTLV-1-Hüllproteins entsprechenden Aminosäuresequenzen, als gp 46 bezeichnet, und kann darüber hinaus mit zu Segmenten des Transmembranbereichs des HTLV-1- Hüllproteins, als gp 21 bezeichnet, entsprechende Aminosäuresequenzen aufweisen. Von diesen Sequenzen wurde gefunden, daß sie eine hohe Immunoreaktivität gegenüber Antikörpern in Seren von Patienten mit ATL haben. Solche Peptidzusammensetzungen sind auch nützlich für die Herstellung eines Vakzins gegen ATL durch Stimulation der Antikörperproduktion gegen HTLV-1, welches Schutz gegen HTLV-1-Infektion in gesunden Säugetieren, einschließlich den Menschen, bereitstellt. Darüber hinaus kann eine mit zu Bereichen der HTLV-1-Hüllproteine entsprechenden Aminosäuresequenz enthaltende Peptidzusammensetzung in Verbindung mit einer Peptidzusaminensetzung verwendet werden, die Peptide mit Aminosäuresequenzen enthält, die Bereichen des HIV-Hüll- und Kernproteins zur simultanen Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1- und HIV entspricht.
- Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Peptidzusammensetzungen, die für die Bestimmung von HTLV-1-Antikörpern und der Diagnose von ATL nützlich sind, die Peptide enthalten, die aus etwa 34, 40, 38, 20, 24 und 16 Aminosäuren enthaltenden synthetischen Peptiden oder ihren Analogons in einer vorher beschriebenen Sequenz, deren Analogons, Segmente, Mischungen, Konjugate und Polymere ausgewählt sind. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer HTLV-1-Peptidzusammensetzung in Verbindung mit einer HIV-Peptidzusammensetzung, die aus chemisch synthetisierten Peptiden, die aus etwa 21, 19, 11 und 16 Aminosäuresequenzen enthaltenden Peptiden ausgewählt ist, deren Analogons, Segmente, Mischungen, Konjugate und Polymere, zur gleichzeitigen Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 und HIV in menschlichen Körperflüssigkeiten.
- Die Bestimmungsverfahren beinhalten ein enzymgebundenes Immunoadsorbenz-Assay (ELISA), Multi-Dot-, Multi-Line- oder Multi- Square-Blotten auf Nitrocellulosepapier und einen passiven Hemagglutinations-Assay unter Verwendung der Peptide als Festphasenantigene. Die bevorzugte Bestimmungsmethode ist ELISA.
- Die menschlichen T-Zell-Leukämie-Lymphoma-Viren (HTLV) sind eine Familie verwandter Retroviren, die ursprünglich aus Patienten mit T-Zell-Lymphoma und Hauterscheinungen isoliert worden sind. Eine besondere Untergruppe der Familie, Typ I, jetzt als HTLV-1 bekannt, ist ursächlich mit Malignitäten ver bunden, die klinische und epidemiologische Merkmale mit der als adulter T-Zell-Leukämie-Lymphoma (ATL) bezeichneter Krankheit teilen, die in gewissen Bereichen Japans (6-9), dem Karibischen Becken (10,11) und den südwestlichen Vereinigten Staaten (12) auftreten.
- Obwohl der Mechanismus der Übertragung von HTLV-1 augenblicklich unbekannt ist, wird horizontale Transmission des HTLV klar durch molekulare und epidemiologische Analysen impliziert (13,14). HTLV-1-Serumpositivität in endemischen Bereichen für ATL ist überall in den allgemeinen Populationen erhöht und darüber hinaus unter nahen Familienmitgliedern von Patienten und in Empfängern von Bluttransfusionen (15,16).
- Das bedeutet, daß eine dringende Notwendigkeit für einen sicheren, wiederholbaren und sensitiven Test besteht, um jede Blutprobe vor ihrer Einbringung in Blutbanken zu überprüfen und die von HTLV-1 infizierten Individuen erhaltenen Blutspenden zu isolieren, um die unabsichtliche Verbreitung des Virus bei Patienten, die Bluttransfusionen erhalten müssen, zum Beispiel hämophilen und chirurgischen Patienten, zu vermeiden.
- Die vollständige Nukleotidsequenz des HTLV-1-Virus ist seit 1983 (17) bekannt. Diese Veröffentlichung klärte die Struktur des HTLV-1-Virus sowohl von der DNA-Ebene und der vorhergesagten Proteinebene auf und erlaubte weitere serologische Untersuchungen verschiedener Epitope, die auf dem HTLV-1-Virus vorliegen können.
- Zur selben Zeit veröffentliche Dr. Carl Saxinger am National Cancer Institute die Verwendung des isolierten HTLV-1-Virus als ein Festphasenimmunoadsorbenz für die Entwicklung eines Enzymimmuno-Assays zur Bestimmung von HTLV-1-Antikörpern in der afrikanischen Bevölkerung (18).
- Weiter wird durch Samuel et al. (19) berichtet, daß ein kombiniertes Klonier- und Expressionssystem in E. coli verwendet worden ist, um HTLV-1-kodierte Glykoproteine zu identifizieren, die immunologisch mit Antikörpern in Seren von ATL-Patienten reagieren. Die das Hüllprotein kodierende HTLV- 1-DNA wurde in Fragmente gespalten und in einen Expressionsvektor eingebracht. Die Expressionsvektoren wurden in E. coli durch Transformation eingeführt. Ein als pKS400 bezeichneter Klon erzeugte ein Hüllproteinprodukt, das als geeignet zur Verwendung als ein Immunoadsorbenz gefunden wurde, um eine Gruppe von 28 kodierten Seren zu überprüfen. Antikörper, die die bakteriell synthetisierten HTLV-1-Hüllproteinsequenzen erkannten, wurden in allen Seren gefunden, von denen gezeigt worden war, daß sie Antikörper gegen HTLV-1 durch einen ELISA- Assay mit zerstörten Virions des Antigens (18) aufweisen.
- Slamon et al. beschreiben in WO-A-86/01834 mit immunogenen Bereichen des HTLV-1- assoziierte Polypeptide als Expressionsprodukte der X-Region des HTLV-1, eine hochkonservierte zwischen env und dem 3' LTR des Virus angeordneten konservierten Bereichs. Die Proteine mit einem Molekulargewicht zwischen 37 kd und 40 kd wurden kloniert und als Fusionsproteine in E. coli exprimiert. Die erhaltenen Produkte wurden gereinigt und in Flüssigphasenimmunopräzipitationstests verwendet, um Seren zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten eine Genauigkeit von etwa 77 bis 87% (20).
- Synthetische Peptide sind zunehmend verwendet worden, um Antigen- oder Immunogen-Bereiche auf den Proteinoberflächen und als mögliche Vakzine festzustellen. Die genannten Erfinder und ein Kollege haben auf den Hüllproteinen von HTLV-III spezische Immunoassays für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-III (jetzt als HIV bezeichnet) entwickelt (21). Vgl. auch US-A- 4,735,896, deren Inhalt unter Bezugnahme hiermit eingearbeitet wird (22). Ein vergleichbarer Versuch wird in der vorliegenden Erfindung angewendet, um hochantigene Epitope in HTLV-1 auszuwählen und zu identifizieren. In ausgewählten Bereichen des Hüllproteins für die Epitopanalyse werden verschiedene Strategien angewendet. Zuerst werden Bereiche gesucht, die eine relativ hochkonservierte Aminosäuresequenz zwischen HTLV-1 und HTLV-2 zeigen. Anschließend werden vielfach überlappende lineare Peptide, die die gesamten Bereiche von gp 21, dem Transmembranbereich des HTLV-1-Hüllproteins (vgl. Figur 1) überlappen, synthetisiert und charakterisiert. Anschließend werden vielfach überlappende lineare Peptide synthetisiert und charakterisiert, die den Gesamtbereich des gp 46, des externen Bereiches des HTLV-1-Hüllproteins (vgl. Figur 1), bedecken. Drei Peptide aus dem Transmembranbereich mit den nachfolgenden Sequenzen (vgl. Figur 2) und eine Mischung davon wurden als hochimmunoreaktiv mit Seren von Patienten mit ATL gefunden:
- und drei Peptide von dem externen Bereich mit den nachfolgenden Sequenzen und eine Mischung davon wurden als hochimmunoreaktiv mit Seren von Patienten mit ATL (Figur 3) gefunden:
- in denen
- A = Ala = Alanin G = Gly = Glycin
- R = Arg = Arginin I = Ile = Isoleucin
- D = Asp = Asparaginsäure F = Phe= Phenylalanin
- N = Asn = Asparagin S = Ser = Serin
- Q = Gln = Glutamin W = Trp = Tryptophan
- E = Glu = Glutaminsäure Y = Tyr = Tyrosin
- L = Leu = Leucin V = Val = Valin
- K = Lys = Lysin C = Cys = Cystein
- H = His = Histidin P = Pro = Prolin
- T = Thr = Threonin
- Assays für Antikörper gegen HTLV-1 basierend auf chemisch synthetisierten Peptiden zeigen einige Vorteile gegenüber Assays unter Verwendung voll zerstörter Viren oder bakteriell erzeugter Immunoadsorbenzien. Die Peptide können leicht in Gramm- Mengen unter Verwendung automatischer Festphasenverfahren synthetisiert werden, wobei ein reproduzierbares Antigen von hoher Integrität mit gleichbleibenden Ausbeuten bereitgestellt wird. Die Isolierung der Antigene aus biologischen Systemen schließt eine solche Reproduzierbarkeit aus. Wichtiger ist, daß nicht spezifische Reaktivitäten in nicht-HTLV-1-infizierten Individuen wahrscheinlich auf der Heterogenität der für den Assay verwendeten Präparationen beruhen. Dies ist insbesondere wahr für Assays unter Verwendung entweder des gesamten Virus oder von Escherichia coli sich ableitenden rekombinanten Erzeugnissen als Tmmunoadsorbenzien. In diesen Verfahren werden die Haupthistokompatibilitätsantigene oder endogenen bakteriellen Proteine der Wirtszellen häufig mit dem gewünschten Antigenvirus oder Protein mitgereinigt. Da Antikörper gegen diese kontaminierten Antigene häufig in normalen Individuen gefunden werden, können falsch-positive Ergebnisse durch Verwendung einiger Antigenisolationsverfahren nicht eliminiert werden.
- Der Assay gemäß vorliegender Erfindung schließt daher klar die mit den anderen Verfahren verbundenen falsch-positiven Reaktionen aus und zeigt gleichzeitig eine hohe Sensitivität gegenüber echt-positiven Seren durch das im wesentliche erhöhte signal-to-noise-Verhältnis. Dieses erhöhte signal-to- noise-Verhältnis beruht sehr wahrscheinlich auf der Reinheit des Immunoadsorbenz.
- Darüber hinaus ist bis heute kein lebensfähiges Vakzin oder ein Verfahren zur Bereitstellung eines Schutzes gegen HTLV-1 berichtet worden. Die Verwendung des desaktivierten Virus erzeugt Ängste, sich die Krankheit zuzuziehen, wodurch seine Annehmbarkeit und Verwendung verhindert wird.
- Ähnlich erfordert die Entwicklung monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen HTLV-1 in Säugetieren die Verwendung von HTLV-1 als Immunogen, wobei unannehmbare Risiken in dem Verfahren vorliegen.
- Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Bestimmungs- oder Diagnostikverfahren zu entwickeln, das nicht die Verwendung des Virus oder dessen Lysats als Testreagenz erfordert.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Testverfahren zu entwickeln, das hochsensitiv und genau ist.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Test zu entwickeln, der hochsensitiv ist, so daß sehr wenig Testreagenz oder Körperflüssigkeit nötig ist, um ein genaues Ergebnis zu erhalten.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Testreagenz mittels chemischer Verfahren zu erzeugen. Das synthetische Reagenz kann dann zur Bestimmung der Gegenwart von Antikörpern gegen HTLV-1 in Körperflüssigkeiten und zur Diagnose von ATL verwendet werden, wodurch die Gefahr der Aussetzung des Virus oder dessen Segmenten und der unnötigen Proliferation des Virus verhindert wird.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Vakzin zu entwickeln, das, wenn es in ein gesundes Säugetier, einschließlich des Menschen, eingebracht wird, die Antikörperproduktion gegen HTLV-1 stimulieren wird, wodurch ein Schutz gegen eine HTLV-1-Infektion bereitgestellt wird.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein nicht-virales Immunogen bereitzustellen, welches in Säugetieren zur Entwicklung monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen HTLV-1 verwendet werden kann.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein diagnostisches Verfahren für die gleichzeitige Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 und Antikörpern gegen HIV zu entwickeln.
- 1. B.J. Poiesz., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7415 (1980)
- 2. B.J. Poiesz., F.W. Ruscetti, M., S. Reitz., V.S. Kalyanaraman, R. Gallo, Nature (London) 294:268 (1981)
- 3. R.C. Gallo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5680 (1982)
- 4. M. Essex et al., Science, 221:1061 (1983)
- 5. P. Clapham, K. Napy, R.A. Weiss, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:2886 (1984)
- 6. R.C. Gallo et al., Cancer Res., 43:3892 (1983)
- 7. R.C. Gallo, Cancer Surveys, L.M. Franks et al. Eds., (University Press, Oxford, in press)
- 8. W.A. Blattner, K. Tokatsuki, R.C. Gallo., J. Am. Med. Assoc., 250:1074 (1983)
- 9. K. Takatsuki, J. Uchiyama, K. Sagawa, J. Yodoi, Topics in Hematology, S. Seno, F. Takaku, S. Irino, Eds. (Excerpta Medica, Amsterdam, 1977) Seite 73
- 10. W.A. Blattner et al., Int. J. Cancer, 30:257 (1982)
- 11. D. Catovsky et al., Lancet, 1982-1, 639 (1982)
- 12. D.W. Blayney et al., J. Am. Med. Assoc., 250:1048 (1983)
- 13. M. Robert-Guroff, F.W. Ruscetti, L.W. Posner, B.J. Poiesz, R.C. Gallo, J. Exp. Med., 154:1957 (1981)
- 14. R.C. Gallo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5680 (1981)
- 15. M. Robert-Guroff et al., J. Exp. Med., 157:248 (1983)
- 16. M. Shimoyama et al., Jpn. J. Clin. Oncol., 12:109 (1982)
- 17. M. Seiki, S. Hattori, Y. Hirayama, M. Yoshida, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3618 (1983)
- 18. Saxinger, C.W. et al., Science, 225:1473 (1984)
- 19. Samuel, K.P. et al., Science, Nov. 30, 1984
- 20. Slamon et al., PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO86/01834
- 21. Wang, J.J-G, Steel, S., Wisniewolski, R. und Wang, C.Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, Seiten 6159-6163 (August 1986)
- 22. US-A-4,735,896, erteilt am 5. April 1988 an Chang Y. Wang und James G. Wang
- 23. Liu, Fu-Tong et al., Biochemistry, 18, Seiten 690-697 (1979)
- Gemäß der Erfindung sind sechs Peptide, die in einer spezifischen Sequenz angeordnet sind, durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt worden. Von diesen Peptiden wurde gefunden, daß sie in einem hochsensitiven und genauen Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 in Seren und Körperflüssigkeiten und zur Diagnose von ATL nützlich sind. Von diesen Peptiden wurde ebenfalls gefunden, daß sie in der stimulierenden Produktion von Antikörpern gegen HTLV-1 in gesunden Säugetieren wie Balb/c-Mäusen nützlich sind.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 und zur Diagnose von ATL nützliche Pepidzusammensetzung ein aus
- ausgewähltes Peptid, in dem Z -OH oder -NH&sub2; sind, deren Analogons, Segmente, Mischungen, Konjugaten und Polymeren, in denen
- A = Ala = Alanin G = Gly = Glycin
- R = Arg = Arginin I = Ile = Isoleucin
- D = Asp = Asparaginsäure F = Phe= Phenylalanin
- N = Asn = Asparagin S = Ser = Serin
- Q = Gln = Glutamin W = Trp = Tryptophan
- E = Glu = Glutaminsäure Y = Tyr = Tyrosin
- L = Leu = Leucin V = Val = Valin
- K = Lys = Lysin C = Cys = Cystein
- H = His = Histidin P = Pro = Prolin
- T = Thr = Threonin
- sind.
- Das hochsensitive und genaue Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 in Körperflüssigkeiten und zur Diagnose von ATL umfaßt die folgenden Schritte:
- A. Herstellen einer Peptidzusammensetzung, die ein aus der Gruppe mit den folgenden Aininosäuresequenzen ausgewähltes Peptid enthält:
- in denen Z -OH oder -NH&sub2; ist, deren Analogons, Segmenten, Mischungen, Konjugaten und Polymeren; und
- B. Verwendung von etwa 0,01 ug bis etwa 20 ug pro Test in einem Puffer bei einem pH von etwa 7 bis 10, der Peptidzusammensetzung als Antigen in einem Immunoassayverfahren.
- Darüber hinaus können gemäß vorliegender Erfindung die Peptide selbst oder wenn sie an einen Protein- oder einen Polymerträger oder wenn sie zu Homo- oder Heterodimeren oder höheren Oligomeren durch Cysteinoxidation, die eine Disulfidquervernetzung induziert, polymerisiert werden oder wenn sie zu Homo- oder Heterodimeren oder höheren Oligomeren durch Verwendung von homo- oder heterofunktionellen multivalenten Quervernetzungsmitteln polymerisiert werden, oder wenn sie direkt an ein polyvalentes Lysinharz synthetisiert sind, um die Produktion von Antikörpern gegen HTLV-1 in gesunden Säugetieren, einschließlich des Menschen, zu stimulieren. Das Verfahren umfaßt die Einbringung einer wirksamen Menge der Peptidzusammensetzung einschließlich einer Mischung der an einen Träger wie Humanserumalbumin konjugierten Mischung dieser sechs Peptide oder als Polymer in den Körper eines gesunden Säugetiers durch intraperitoneale oder subkutane Injektion.
- Darüber hinaus kann gemäß vorliegender Erfindung eine für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 nützliche Peptidzusammensetzung in Verbindung mit für die Bestimmung von Antikörpern gegen HIV-1 und HIV-2 nützlichen Peptidzusammensetzungen zur gleichzeitigen Bestimmung von Infektionen durch sowohl HTLV-1 als auch HIV-1 und HIV-2 verwendet werden. Für die Bestimmung von Antikörpern gegen HIV-1 und HIV-2 nützliche Peptidzusammensetzungen umfassen chemisch synthetisierte Peptide der nachfolgenden Aminosäuren oder deren Analogons in den vorherbeschriebenen Sequenzen, worin die Sequenz für HIV-2 ein Analogon des Peptids VII und Peptids VIII ist:
- worin Z -OH oder -NH&sub2; ist, und deren Analogons, Segmente, Mischungen und Po,lymere beinhaltet, in denen
- A = Ala = Alanin G = Gly = Glycin
- R = Arg = Arginin I = Ile = Isoleucin
- D = Asp = Asparaginsäure F = Phe= Phenylalanin
- N = Asn = Asparagin S = Ser = Serin
- Q = Gln = Glutamin W = Trp = Tryptophan
- E = Glu = Glutaminsäure Y = Tyr = Tyrosin
- L = Leu = Leucin V = Val = Valin
- K = Lys = Lysin C = Cys = Cystein
- H = His = Histidin P = Pro = Prolin
- T = Thr = Threonin M = Met = Methionin
- sind.
- Die unterstrichenen Aminosäuren zeigen diejenigen Reste, die verschiedenen Isolaten gleich sind. Für HIV-2-Peptid X wurden Substitutionen in der Hüllproteinaminosäuresequenz durchgeführt, die aus der Nukleotidsequenz vorhergesagt wurden.
- Figur 1 zeigt und vergleicht die Aminosäuresequenzen der HTLV-1- und HTLV-2-Hüllproteine.
- Figur 2 zeigt die Aminosäuresequenzen der gemäß vorliegender Erfindung chemisch synthetisierten Peptide.
- Figur 3 ist ein Histogramm, das die gemäß vorliegender Erfindung beschriebenen Immunoreaktivitäten mit Seren von ATL-Patienten zeigt.
- Figur 4 ist ein Histogramm, das die Immunoreaktivitäten der gemäß vorliegender Erfindung beschriebenen Peptide mit Seren von Patienten mit HIV-Infektion, Patienten mit ATL und zufälligen Blutspendern zeigt.
- Figur 5 ist ein Histogramm, das die gleichzeitige Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 und HIV (1 und 2) durch einen Enzymimmunoassay unter Verwendung einer Mischung aus sieben chemisch snythethisierten Peptiden gemäß vorliegender Erfindung zeigt.
- Gemäß vorliegender Erfindung sind sechs Peptide zur Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 in Körperflüssigkeiten und zur Diagnose von ATL, für die Vakzinierung von gesunden Säugetieren durch Stimulation der Antikörperproduktion gegen HTLV-1 in gesunden Säugetieren und zur Entwicklung von sowohl monoklonalen und polyklonalen Antikörpern gegen HTLV-1 in Säugetieren chemisch synthetisiert worden. Diese sechs Peptide sind in der folgenden Sequenz angeordnet:
- in denen Z -OH oder -NH&sub2; ist.
- Diese Peptide können Analogons oder Segmente, d.h. längere oder kürzere Peptidketten mit mehreren Aminosäuren an den endständigen Aminosäuren, zum Beispiel -Gly-, -Gln-, -Asn- und -Cys- der vorstehenden Sequenz, oder durch von jedem endständigen terminalen Ende entfernte Aminosäuren enthalten. Diese Peptide können auch Konjugate enthalten, d.h. sie können an Trägerproteine wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Humanserumalbumin (HSA) gekoppelt sein. Darüber hinaus können diese Peptide Polymere enthalten, d.h. sie können an einem Polymerharz synthetisiert sein, zum Beispiel als verzweigtes octameres Lysinharz. Es wird angenommen, daß solange die durch die dominanten Antikörper gegen HTLV-1 erkennbaren Peptidimmunoreaktivitäten beibehalten werden, die Analogons der synthetischen Peptide auch Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen von genannten Aminosäuren der vorstehenden Sequenz umfassen können.
- Zusätzlich können zur Akkomodation strain-to-strain-Variationen unter verschiedenen Isolaten, Berichtigungen für konservative Substitutionen und Selektion unter den Alternativen, an denen nicht-konservative substitutionen beteiligt sind, in den vorher beschriebenen Sequenzen durchgeführt werden.
- Die Aminosäuresequenzen der als Testreagenzien für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 in Körperflüssigkeiten und zur Diagnose von ATL nützlichen Polypeptide werden ausgewählt, um einem Teilsegment der als gp 21 bezeichneten Aminosäuresequenz des HTLV-1-Virus und einem als gp 46 bezeichneten Teilsegment der Aminosäuresequenz des HTLV-1-Virus zu entsprechen, wobei beide Teile von gp 61 sind, welches das Hüllprotein des HTLV-1-Virus definiert.
- Die als Festphasenimmunoadsorbenzien für die Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 nützlichen Peptide werden nach dem klassischen Merrifield-Verfahren der Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von t-BOC-Aminosäuren synthetisiert, um den folgenden Aminosäuren zu entsprechen:
- in denen Z -OH oder -NH&sub2; ist.
- Analogons dieser sechs Peptide können durch Variieren der Aminosäuresequenzen entweder durch Hinzufügen, Abziehen, Substitution oder Deletion der gewünschten t-BOC-Aminosäure(n) hergestellt werden.
- Nachfolgend an die Komplettierung der Anordnung der gewünschten blockierten Peptide an dem Harz wird das Peptidharz mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure behandelt, um die Benzylesterbindung des Peptids an dem Harz zu spalten, wobei das Peptid freigesetzt wird. Funktionelle Gruppen der Aminosäuren, die während der Synthese durch Benzyl sich herleitende Blokkiergruppen blockiert sind, werden gleichzeitig von dem Peptid gespalten. Das freie Peptid wird dann analysiert und durch High Performance Liquid Chromatography (HPLC) gereinigt und biochemisch durch Aminosäureaanalyse charakterisiert.
- Auf gleiche Weise kann die Synthese dieser Peptide, die eine Amidgruppe an ihrem C-terminalen Ende aufweisen, durch Verwendung von 4-Methylbenzhydrylaminharz gemäß dem nachfolgenden Schema erreicht werden: Kopplung des C-terminalen Restes an den 4-Methylbenzylhydrilaminrest 4-Methylbenzylhydrilamin-Harz Diisopropylcarbodiimid
- Die gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren synthetisierten Peptide sind hochreaktiv mit Antikörpern gegen HTLV-1 und können als hochsensitives und spezifisches Immunoadsorbenz zur Bestimmung der Antikörper gegen HTLV-1 verwendet werden.
- Die Tabellen I und II zeigen die mit Seren von ATL-Patienten unter Verwendung eines ELISA-Verfahrens erhaltenen Daten, in denen die Platten mit einer Mischung der Peptide in einem Gewichtsverhältnis von 1:1:1 (I:II:III) und inaktiviertem HTLV-1 beschichtet sind. Tabelle III vergleicht die mit Seren von ATL-Patienten unter Verwendung eines ELISA-Verfahrens erhaltenen Daten, in denen die Mikrotiterplatten jeweils mit jedem der drei Peptide sowie einer Mischung (1:1:1) davon und zerstörtem HTLV-1 beschichtet sind. Tabelle IV zeigt die mit Seren von ATL-Patienten unter Verwendung eines ELISA-Verfahrens erhaltenen Daten, in denen die Mikrotiterplatten mit einer Mischung der Peptide II, IV, V und VI in einem Gewichtsverhältnis von 1:0,25:1:1 (II:IV:V:VI) beschichtet sind. Tabelle V zeigt die mit Seren von ATL-Patienten erhaltenen Daten unter Verwendung eines Agglutinationsverfahrens, in dem die roten Blutkörperchen (RBC) mit einem Peptid VI-BSA-Konjugat beschichtet sind.
- Basierend auf dem hohen Sensitivitäts- und Spezifitätsgrad der Peptidzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung in der Immunoreaktion von Antikörpern gegen HTLV-1 wird angenommen, daß die Peptidzusammensetzung auch als ein Vakzin gegen ATL und als ein Immunogen zur Entwicklung von sowohl monoklonalen und polyklonalen Antikörpern gegen HTLV-1 in Säugetieren einschließlich des Menschen nützlich sein können. Die Peptidzusammensetzungen können, wenn sie an ein Protein gekoppelt sind oder an ein Polymerharz (z.B. einem octameren Lysinharz) synthetisiert sind oder wenn sie zu Homo- oder Heterodimeren oder höheren Oligomeren durch Cysteinoxidation, die Disulfidquervernetzung induziert, polymerisiert sind, oder wenn sie zu Homo- oder Heterodimeren oder höheren Oligomeren unter Verwendung von homo- oder heterofunktionellen multivalenten Quervernetzungsmitteln polymerisiert sind, in normale Personen eingebracht werden, um die Produktion von Antikörpern gegen HTLV-1 zu stimulieren und einen Schutz gegen eine Infektion durch HTLV-1 in gesunden Säugetieren bereitzustellen. Da die Peptidzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung sich biochemisch nicht vom Virus ableitet, besteht keine Gefahr der Aussetzung der normalen Personen, die gegen diese Krankheit vakziniert werden sollen.
- Die Vorteile der Verwendung der Peptide gemäß vorliegender Erfindung sind zahlreich.
- Die Peptide werden chemisch synthetisiert. Dies bedeutet, daß es keine Beteiligung des HTLV-1-Virus zu keinem Zeitpunkt während des Verfahrens der Herstellung des Testreagenz oder des Vakzins gibt. Während der Herstellung des Vakzins oder des Vakzinierungsverfahrens riskieren die Hersteller oder Personen in den Gesundheitsberufen eine Aussetzung gegenüber dem HTLV- 1-Virus. In gleicher Weise besteht kein Risiko der Aussetzung gegenüber HTLV-1 in der Verwendung dieser Peptide oder der Entwicklung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen HTLV-1 in Säugetieren. Darüber hinaus besteht bis zur Endstufe des Tests zur Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1, in der das Testreagenz den Proben der Seren oder Körperflüssigkeit ausgesetzt ist, kein Risiko der Aussetzung des Laborpersonals gegenüber dem HTLV-1-Virus.
- Ein weiteres Problem, welches durch das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung vermieden wird, ist die Möglichkeit der durch die Gegenwart von antigenem Material aus den Wirtszellen verursachter falsch-positiver Ergebnisse verursachte Co- Reinigung mit der HTLV-1-viralen Präparation oder der sich von E. coli herleitenden mit den exprimierten viralen Fragmenten co-gereinigten Proteine. Einige normale Individuen haben Antikörper gegen E. coli oder menschliche LeukozytenAntigene, zum Beispiel HLA, welche mit den antigenen Materialien der Wirtszellen kreuzreagieren. Serumproben von diesen normalen Individuen können, obwohl sie nicht HTLV-1 ausgesetzt gewesen sind, eine positive Antwort im ELISA- oder IRMA-Test zeigen.
- Eine Diagnose, daß eine Person mit HTLV-1 aufgrund dieser Art von falsch-positiver Reaktion infiziert sein kann, bringt dieser Person und ihrer oder seiner Familie schwere Sorge. Alle diese Probleme können durch die Verwendung der Peptidzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung als die Testreagenzien vermieden werden.
- Darüber hinaus wird mit geeigneten Aminosäureanalogsubstitutionen erwartet, daß verschiedene auf der vorstehenden Aminosäuresequenz basierende Peptidanalogons mit Eigenschaften synthetisiert werden können, die eine geringere Hintergrundauslesung oder bessere Adsorptionskapazität gegenüber Festphasen, die nützlich für HTLV-1-Antikörperscreeningassays sind, zeigen.
- Darüber hinaus kann wegen der synthetisch hergestellten Peptidzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung die Qualität kontrolliert werden und als Ergebnis davon die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse sichergestellt werden. Da überdies sehr geringe Mengen der Peptide für jedes Testverfahren benötigt werden und da die Kosten der Herstellung der Peptide relativ niedrig sind, sind auch die Kosten der Überprüfung der Körperflüssigkeiten auf Antikörper gegen HTLV-1 und zur Diagnose von ATL und die Herstellung eines Vakzins relativ niedrig.
- Die gemäß vorliegender Erfindung hergestellten Peptide können zur Bestimmung der HTLV-1-Infektion und zur Diagnose von ATL unter Verwendung derselben als Testreagenz in einem enzymgebundenen Immunoadsorbenz-Assay (ELISA), einem Enzymimmunodot-Assay, einem Hemagglutinations-Assay, einem radioimmunoradiometrischen Assay (IRMA) oder anderen im Stand der Technik bekannten Immunoassays verwendet werden. Das bevorzugte Verfahren ist ELISA. Die ELISA-Technik ist in Beispiel 1, die IRMA-Technik in Beispiel 3 und der Hemagglutinations-Assay in den Beispielen 4 und 5 gezeigt.
- Es ist festzustellen, daß in den nachfolgenden Verfahren 0,25 Gew.-% Glutaraldehyd dem Beschichtungspuffer zugesetzt werden, um eine bessere Peptidbindung auf den Platten oder Beads zu ermöglichen. Darüber hinaus kann ein mit Merrettichperoxidase konkugierter monoklonaler Maus-Anti-Human-IgG-Antikörper anstelle von mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti- Human-IgG als zweitem Antikörper verwendet werden.
- Die in diesen Verfahren verwendete Gelatine beinhaltet Kalbshautgelatine, Schweinehautgelatine, Fischgelatine oder alle bekannten erhältlichen Gelatineproteine oder kann durch Albuminproteine ersetzt werden.
- Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher erläutert.
- Die Löcher einer 96-Lochplatte werden bei 4ºC über Nacht (oder 3 Stunden bei Raumtemperatur) mit einer Mischung der wie vorstehend beschrieben hergestellten drei Peptide in einem Gewichtsverhältnis von I:II:III = 1:1:1 mit 1,5 ug pro Loch der Mischung in 100 ul 10mM NaHCO&sub3;-Puffer, pH 9,5, beschichtet. Die Löcher werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und anschließend mit 250 ul 3 Gew.-% Gelatine in PBS bei 37ºC während 1 Stunde inkubiert, um nicht-spezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren, gefolgt von drei weiteren Waschungen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS. Die Testseren (Blut von einem menschlichen Patienten oder einem normalen Individuum) werden mit 20 Vol.-% normalem Ziegenserum, 1 Gew.-% Gelatine und 0,05 Vol.-% Tween 20 in Verdünnungen von 1:20 und 1:200 (V/V) enthaltendem PBS verdünnt. 200 ul der verdünnten Seren werden in jedes Loch eingebracht und während 1 Stunde bei 37ºC reagieren gelassen. Die Löcher werden anschließend dreimal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti- Human-IgG wird als zweiter Antikörper verwendet, um mit dem in positiven Löchern gebildeten HTLV-1-Antkörper-Antigen-Komplex zu binden. 100 ul mit Peroxidase markiertem Ziegen-Anti-Human- IgG in einer Verdünnung von 1:3000 in 1 Vol.-% normalem Ziegenserum, 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS werden jedem Loch zugesetzt und bei 37ºC während weiteren 15 Minuten inkubiert.
- Die Löcher werden fünfmal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen und mit 100 41 der 0,05 Gew.-% Orthophenylendiamin (OPD) und 0,012 Vol.-% Wasserstoffperoxid in Natriumcitratpuffer, pH 5,0, enthaltenden Substratmischung umgesetzt. Die Substratmischung wurde verwendet, um den Peroxidasemarker durch Bildung eines gefärbten Produktes zu bestimmen. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 100 ul 1,0 M H&sub2;SO&sub4; beendet und die Absorbtion unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes bei 492 nm (i.e. A&sub4;&sub9;&sub2;) bestimmt. Die Assays wurden zweifach mit einer Verdünnung (1:20) von Serumproben normaler Individuen oder von Patienten mit zu HTLV-1-Infektionen nicht verwandten Erkrankungen als Negativkontrolle durchgeführt. Absorptionen von mehr als dem Grenzwert von A&sub4;&sub9;&sub2; = 0,12 (etwa 3x dem Durchschnitts-A&sub4;&sub9;&sub2;-Wert der Normalserumkontrolle) wurden als positiv angesehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Tabelle I Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 durch ELISA* unter Verwendung einer Mischung von drei Peptiden als Festphasenimmunoadsorbenz Personenkreis Anzahl positiv/Anzahl getestet* Prozent positiv Patienten mit ATL Patienten mit AIDS/ARC oder bekannter Infektion mit HTLV-III Patienten mit Autoimmunkrankheiten Normale Individuen
- * Der Assay wurde unter Verwendung von Seren bei einer Verdünnung von 1:20 (V/V) mit Puffer durchgeführt. Der Grenzwert wurde als A&sub4;&sub9;&sub2; = 0,12 definiert, etwa des Dreifachen (3x) des durchschnittlichen A&sub4;&sub9;&sub2;-Wertes der Normalserumkontrolle.
- Bemerkung: Seren von Patienten mit ATL (Gruppe I und II) wurden dankenswerterweise von Dr. Kanji Miyamoto des Japanischen Okayama Roten Kreuzes bereitgestellt, Seren von Patienten mit AIDS, ARC-Primärimmunodefekt, Leukämie/Lymphoma wurden durch Dr. S. Gupta von der University of California in Irvine, Dr. D.M. Knowles von der New York University und Dr. F.D. Siegal vom Long Island Jewish Hospital bereitgestellt. Die Seren von Patienten mit Autoimmunerkrankungen einschließlich rheumatischer Arthritis, systemischem Lupus erythematosus und Allergien wurden durch Dr. N. Chiorazzi vom Rockefeller University Hospital, New York, bereitgestellt.
- Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, daß das ELISA-Testverfahren gemäß vorliegender Erfindung mit Serumproben sehr genau und hochspezifisch ist. Obwohl etwa 16,7% der AIDS/ARC oder HTLV-III (HIV) infizierten Personen mit HTLV-1 infiziert waren, ist dies in Übereinstimmung mit den kürzlichen Befunden. Diese Befunde sind alarmierend und es wird nach wirksamen Maßnahmen zur Verhinderung der Doppelinfektion durch HTLV-1 und HIV (HTLV-III) gerufen. Keine Immunoreaktivität wurde bei den normalen Personen oder Patienten gefunden, die als nicht mit HTLV-1 infiziert angesehen werden.
- Es ist festzustellen, daß in Screening-Verfahren zum Ausschluß viruskontaminierten Bluts aus Blutbanken die Kriterien zur Def inierung positiver Reaktionen erheblich strenger sein sollten, wenn gewünscht.
- Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde unter Verwendung der gleichen Serenproben wie in Beispiel 1 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Lochplatten mit 1 ug pro Loch hitzeinaktiviertem NP40 löslichem HTLV-1 vorbeschichtet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 durch ELISA unter Verwendung von hitzeinaktiviertem NP40 löslichem HTLV-1 als Festphasenimmunoadsorbenz Personenkreis Anzahl positiv/Anzahl getestet* Prozent positiv Patienten mit ATL Patienten mit AIDS/ARC oder bekannter Infektion mit HTLV-III Patienten mit Autoimmunkrankheiten Normale Individuen * Der Grenzwert ist als der höchste A&sub4;&sub9;&sub2; der normalen Serumkontrolle definiert.
- Im Vergleich mit den Ergebnissen gemäß Beispiel 1 ist dieses Verfahren weniger genau und spezifisch und daher weniger zuverlässig. Darüber hinaus ist der Grenzwert unter Verwendung eines liberaleren Kriteriums ausgewählt.
- Die Löcher von flexiblen 96-Loch-Polyvinylchlorid-(PVC)-Platten werden bei 4ºC über Nacht (oder 3 Stunden bei Raumtemperatur) mit einer Mischung (1:1:1) der wie vorstehend beschrieben hergestellten drei Peptide mit 1,5 ug pro Loch in 100 ul 10mM NaHCO&sub3;-Puffer, pH 9,5, beschichtet. Die Löcher werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und anschließend mit 250 ul 3 Gew.-%-iger Gelatine in PBS bei 37ºC während 1 Stunde inkubiert, um nicht-spezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren, gefolgt durch dreimaliges Waschen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 haltigem PBS. Die Testseren (Blut von menschlichen Patienten oder normalen Individuen) werden mit 20 Vol.-% normalem Ziegenserum, 1 Gew.-% Gelatine und 0,05 Vol.-% Tween 20 haltigem PBS in Verdünnungen von jeweils 1:20 und 1:200 (V/V) verdünnt. 200 ul der verdünnten Seren werden jedem Loch hinzugesetzt und während 1 Stunde bei 37ºC reagieren gelassen. Die Löcher werden anschließend dreimal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. I-125 markiertes affinitätsgereinigtes Ziegen-Anti-Human-IgG wird als zweiter Antikörper verwendet, der mit dem in den positiven Löchern gebildeten Antikörper-Antigen-Komplex bindet. 100 ul I-125 markiertes Ziegen-Anti-Human-IgG von 50.000 bis 200.000 cpm in 1 Vol.-% normalem Ziegenserum, 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS wird jedem Loch hinzugefügt und bei 37ºC während einer weiteren Stunde inkubiert.
- Die Löcher werden fünfmal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um ungebundenen zweiten Antikörper zu entfernen, und getrocket. Die Löcher werden ausgeschnitten und in einem gamma-Szintillations-Counter gemessen. Die Assays werden in zweifacher Ausfertigung in einer 1:20-Verdünnung (V/V) durchgeführt. Normalserumproben als Negativkontrolle werden gleichzeitig getestet. Cpm-Auslesungen von mehr als der durchschnittlichen Auslesung der Normalserumproben + 4SD (Standardabweichung) werden als positiv angesehen.
- 1 ml ausgiebig gewaschene Erythrozyten, Gelatineteilchen oder Polystyrollatexbeads werden mit der Peptidmischung in Konzentrationen im Bereich von 5 ug/ml bis 1 mg/ml beschichtet. Die mit der Peptidmischung beschichteten Zellen, Teilchen oder Beads werden anschließend mit in Reihe verdünnten Serumproben in den Löchern einer 96-Loch U-förmigen Mikrotiterplatte inkubiert. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur während etwa 1 Stunde werden die Agglutinationsmuster auf dem Grund ausgelesen und die größte Verdünnung, die eine positive Reaktion zeigt, aufgezeichnet.
- Dies stellt einen Einstufen-Assay dar, welcher sowohl für qualitative und quantitative Analysen für die Gegenwart von Antikörpern gegen HTLV-1 in Proben einschließlich Seren oder Bioflüssigkeiten verwendet werden kann.
- Ein dritter Testkit zur Bestimmung von HTLV-1-Antikörper unter Verwendung des Hemagglutinations-Assays enthält einen abgeteilten Behälter, der eine Vielzahl 96-Loch haltiger U-förmiger Mikrotiterplatten und Materialien enthält, oder einen Hemagglutinations-Assay einschließlich (1) eines Behälters mit einer Peptidmischung beschichteter Erythrozyten, Gelatineteilchen oder Latexpolystyrolbeads, (2) normalem menschlichem Serum (als Negativkontrolle) und (3) hitzeinaktiviertem NP40 löslichem serumpositivem ATL-Serum (als Positivkontrolle). Das Verfahren gemäß Beispiel 4 wird durchgeführt.
- Ein diagnostischer Testkit für die HTLV-1-Antikörper-Bestimmung wird hergestellt. Der Testkit umfaßt einen abgeteilten Behälter, der eine Vielzahl 96-löchriger Platten enthält, die mit 1,5 ug pro Loch der Peptidmischung (1:1:1) gemäß vorliegender Erfindung in 100 ul 10mM NaHCO&sub3;-Puffer, pH 9,5, vor Verwendung beschichtet sind. Der Kit enthält darüber hinaus Materialien für die Enzymbestimmung in getrennten versiegelten Behältern, die aus 1) normalem Humanserum (als Negativkontrolle), 2) hitzeinaktiviertem NP40 löslichem HTLV-1 serumpositivem ATL-Serum (als Positivkontrolle), 3) normalem Ziegenserum, 4) mit Peroxidase markiertem Ziegen-Anti-Human-IgG und 5) einem aus Orthophenylendiamin (OPD) und Wasserstoffperoxid in Phosphatcitratpuffer bestehenden Farbwechselindikator bestehen. Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wird wiederholt.
- In diesem Testkit können die mit dem Peptid gemäß vorliegender Erfindung vorbeschichteten 96 Lochplatten durch Polystyrolbeads, durch eine Vielzahl von mit Glasbeads mit kontrollierter Porengröße gefüllten Mini-Säulen oder mit den Peptiden gemäß vorliegender Erfindung vorbeschichteten Nitrocellulosepapierstreifen zur Verwendung als das Festphasenimmunoadsorbenz ersetzt werden.
- Ein zweiter Testkit zur Bestimmung von Antikörpern unter Verwendung des immunoradiometrischen Assays (IRMA) umfaßt ein abgetrenntes Behältnis, das eine Vielzahl von 96-löchrigen flexiblen Polyvinylchlorid-(PVC)-Platten, die mit der Peptidmischung (1:1:1) gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Konzentration von 1,5 ug pro Loch der Peptidmischung in 100 ul 10mM NaHCO&sub3;-Puffer, pH 9,5, vorbeschichtet sind und Materialien für den Radioimmunassay einschließlich: 1) normalem Humanserum (als Negativkontrolle), 2) hitzeinaktiviertem NP40 löslichem serumpositivem ATL-Serum (als Positivkontrolle), 3) normalem Ziegenserum und 4) I-125 markiertem Ziegen-Anti- Human-IgG enthält. Das Verfahren gemäß Beispiel 3 wird wiederholt.
- In diesem Testkit können die mit den Peptiden gemäß vorliegender Erfindung beschichteten 96-Loch PVC-Platten durch mit dem Peptid gemäß vorliegender Erfindung vorbeschichteten Polystyrolbeads zur Verwendung als Festphasenimmunoadsorbenz ersetzt werden.
- Ein Experiment wird durchgeführt, um ATL HTLV-1 Antikörper- Ergebnisse unter Verwendung individueller Peptide und einer Mischung (1:1:1) davon in dem Verfahren gemäß Beispiel 1 und hitzeinaktiviertem NP40 löslichem HTLV-1 gemäß Saxinger et al. zu vergleichen. Die Seren von ATL-Patienten oder von HTLV-1- infizierten asymptomatischen Individuen wurden 1:20 verdünnt. Doppelproben einer jeden verdünnten Serumprobe wurden gegen die Peptide gemäß vorliegender Erfindung und kultiviertem HTLV-1 gemäß Saxinger et al. getestet. Normales Humanserum und hitzeinaktiviertes HTLV-1 serumpositives ATL-Serum wurden als Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Vergleich des A&sub4;&sub9;&sub2;-Grenzwertverhältnisses für 102 HTLV-1 positive Seren unter Verwendung der Peptide I, II, III, deren Mischungen und zerstörtem HTLV-1 als Festphasenimmunoadsorbenz Gruppe Nr. Probe Nr. zerstörtes HTLV-1 Peptid Gruppe Nr. Probe Nr. zerstörtes HTLV-1 Peptid Gruppe Nr. Probe Nr. zerstörtes HTLV-1 Peptid Gruppe Nr. Probe Nr. zerstörtes HTLV-1 Peptid
- Die Ergebnisse in Tabelle III zeigen, daß das Verfahren hochsensitiv und spezifisch ist. Das Verhältnis der erzielten A492-Grenzwerte unter Verwendung der Peptidzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung gegen ATL-Serumproben bei der gleichen Verdünnung ist oft sehr viel höher als das unter Verwendung des inaktivierten HTLV-1 gegen identische Serumproben bei identischen Verdünnungen erzielte. Das ist insbesondere zutreffend, wenn eine Mischung (1:1:1) von Gewichtsteilen der Peptide als das Immunoadsorbenz verwendet wurde. Die Daten zeigen auch, daß die Peptidzusammensetzung in Form einer Mischung sehr genau ist und keine falsch-negativen Ergebnisse erhalten wurden.
- Die Löcher einer 96-Lochplatte werden bei 4ºC über Nacht (oder während 3 Stunden bei Raumteperatur oder während 1 Stunde bei 37ºC) mit einer Mischung aus vier Peptiden wie vorher beschrieben in einem Gewichtsverhältnis von II:IV:V:VI = 1:0,25:1:1 mit 3,25 ug pro Loch der Mischung in 100 ul 10mM NaHCO&sub3;-Puffer, pH 9,5, beschichtet. Die Löcher werden dreimal mit phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS) gewaschen und anschließend mit 250 ul 3 Gew.-% Gelatine in PBS bei 37ºC während 1 Stunde inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren, gefolgt von drei weiteren Waschungen mit 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS. Die Testseren (Blut von menschlichen Patienten oder Normalindividuen) werden mit 20 Vol.-% normalem Ziegenserum, 1 Gew.-% Gelatine und 0,05 Vol.-% Tween 20 enthaltendem PBS in Verdünnungen von jeweils 1:20 und 1:200 (V/V) verdünnt. 200 ul der verdünnten Seren werden zu jedem Loch gegeben und während 1 Stunde bei 37ºC reagieren gelassen. Die Löcher werden anschließend dreimal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Mit Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Human-IgG wird als zweiter Antikörper verwendet, um mit dem in den positiven Löchern gebildeten HTLV-1-Antikörper-Antigen-Komplex zu binden. 100 ul Peroxidase markiertes Ziegen-Anti-Human-IgG in einer Verdünnung von 1:3000 in 1 Vol.-% normalem Ziegenserum, 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS werden jedem Loch zugesetzt und bei 37ºC während weiteren 15 Minuten inkubiert.
- Die Löcher werden fünfmal mit 0,05 Vol.-% Tween 20 in PBS gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen, und mit 100 ul der 0,04 Gew.-% Orthophenylendiamin (OPD) und 0,012 Vol.-% Wasserstoffperoxid in Natriumcitratpuffer, pH 5,0, haltiger Substratmischung reagieren gelassen. Diese Substratmischung wird verwendet, um die Peroxidasemarkierung durch Bildung eines gefärbten Produktes zu bestimmen. Die Umsetzungen wurden durch Zugabe von 100 ul 1,0M H&sub2;SO&sub4; beendet und die Absorption unter Verwendung eines ELISA-Auslesers bei 492 nm (i.e. A&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen. Die Assays wurden zweifach mit einer Verdünnung (1:20) der Serumproben von normalen Individuen oder von Patienten mit zu HTLV-1-1nfektion nicht verwandten Erkrankungen als Negativkontrollen durchgeführt. Absorptionsauslesungen von mehr als dem Grenzwert von A&sub4;&sub9;&sub2; = 0,17 [A&sub4;&sub9;&sub2;-Wert für Normalkontrolle + 0,1 (A&sub4;&sub9;&sub2;-Wert für eine reaktive Kontrolle)] wurden als positiv angesehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV und Figur 4 gezeigt. Tabelle IV Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV-1 durch ELISA unter Verwendung einer Mischung von vier Peptiden als Festphasenimmunoadsorbenz Personenkreis Anzahl positiv/Anzahl getestet* Prozent positiv Patienten (Gruppe 5) mit ATL (HTLV-1 Western Blot Positiv) Patienten (Gruppe 5) mit ATL (HTLV-1 Western Blot Negativ) Patienten mit AIDS/ARC oder bekannt als infiziert mit HIV Normale Individuen * Assay wurde unter Verwendung von Sera bei 1:20 (V/V) Verdünnung mit Puffer durchgeführt.
- Anmerkung: Seren von Patienten mit ATL wurden freundlicherweise durch das Japanische Rote Kreuz, Seren von Patienten mit AIDS, ARC Primär-Immunschwäche, Leukämie/Lymphomas durch Dr. S. Gupta von der University of California in Irvine, Dr. D.M. Knowles von der New York University und Dr. F.D. Siegal vom Long Island Jewish Hospital zur Verfügung gestellt.
- Die Ergebnisse der Tabelle IV zeigen, daß das ELISA-Testverfahren gemäß vorliegender Erfindung mit Serumproben sehr genau und hochspezifisch ist. obwohl etwa 16,7% der mit AIDS/ARC oder HTLV-III (HIV) infizierten Individuen als mit HTLV-1 infiziert gefunden werden, liegt dies in Übereinstimmung mit kürzlichen Ergebnissen. Diese Ergebnisse sind alarmierend und wirksame Messungen sind notwendig, um eine Doppelinfektion durch HTLV-1 und HIV zu verhindern. Keine Immunoreaktivität wurde in Seren von Normalpersonen gefunden.
- Es ist festzustellen, daß in den Prüftests zum Ausschluß von viruskontaminiertem Blut aus Blutbanken die Kriterien zur Definierung von Positivreaktionen erheblich strenger gemacht werden können, falls gewünscht.
- Die gemäß vorliegender Erfindung beanspruchten HTLV-1-Peptide, die gemäß dem Merrifield-Festphasenverfahren synthetisiert wurden, werden mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert, welches mit M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), wie es im wesentlichen durch Fu-Tong Liu et al. in Biochemistry 18:690-697 (1979) beschrieben worden ist, derivatisiert. Zu 0,32 ml einer BSA-Lösung (100 mg/ml in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0) bei Raumtemperatur werden 0,013 ml einer MBS-Lösung (0,025 mg/ml in Dimethylformamid) gegeben. [Die Menge an der BSA-Lösung zugesetzten MBS kann gemäß dem optimalen Molverhältnis von BSA zu MBS, bestimmt für ein spezifisches überprüftes Konjugat, variiert werden.] Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt, nach der sie zentrifugiert wurde, um jegliches präzipitiertes Albumin zu entfernen. Die geklärte Mischung wurde anschließend einer Gelfiltration auf Sephadex G-25 unterworfen und die proteinhaltigen bei einer Absorption bei 280 nm bestimmten Fraktionen gepoolt und bei -70ºC tiefgefroren bis zu ihrer Verwendung gelagert.
- Die Peptide wurden in H&sub2;O in 10 mg/ml gelöst. Eine vorherbestimmte Menge einer jeden Peptidlösung wurde tropfenweise zu der vorher aktivierten BSA-MBS-Lösung gegeben und bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt. Die endgültigen Peptid- BSA-Konjugate wurden von anderen freien Peptiden mittels Gelfiltration oder extensiver Dialyse abgetrennt. Das Verhältnis von Peptid zu BSA wurde durch SDS-PAGE gemäß herkömmlichen Verfahren bestimmt.
- In einem Beispiel wurde anschließend konjugiertes Peptid VI- BSA an Doppelaldehyd fixierten menschlichen Blutgruppe O Erythrozyten bei pH 4,0 adsorbiert. Die peptidkonjugatbeschichteten Erythrozyten wurden anschließend mit NaBH&sub4; behandelt, um unspezifische Proteinbindung zu verhindern. Die peptidkonjugatbeschichteten Erythrozyten wurden anschließend mit PBS gewaschen und mit 5% normaler menschlicher Serum-PBS- Lösung inkubiert. Die so behandelten Zellen wurden anschließend in einem Agglutinationstest zur Bestimmung von HTLV-1-Antikörpern in sowohl Serum- und Plasma-Proben verwendet.
- Insgesamt 100 Seren von Patienten mit adulter T-Zell-Leukämie wurden auf Antikörper gegen HTLV-1 durch (1) einem Enzymimmuno-Assay (EIA) unter Verwendung HTLV-1-viralem Lysat als Festphase [Dupont's HTLV-1 ELISA], (2) der Western-Blot(WB)- Analyse, (3) dem vorstehend beschriebenen HTLV-1-Agglutinations-Assay unter Verwendung des Peptid VI-BSA-Konjugats als Festphase getestet.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Tabelle V Anzahl der untersuchten ATL-Proben Ergebnisse HTLV-1-Agglutinations-Assay unbest. positiv + negativ *
- * Die zwei Proben, die mit dem HTLV-1-Agglutinations-Assay als negativ getestet wurden, enthielten nur das p19-Kernprotein von HTLV-1.
- Eine sieben der chemisch synthetisierten Peptide gemäß vorliegender Erfindung enthaltende Lösung wurde verwendet, um die Löcher einer 96-Lochplatte gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 zu beschichten. Drei der Peptide waren aus der HTLV-1-Peptidfamilie [II, IV und VI], drei aus der HIV-1-Peptidfamilie [VII, VIII und IX] und eines aus der HIV-2-Peptidfamilie [X] hergeleitet. Die Peptide II:IV:VI:VII:VIII:IX:X lagen in einem Verhältnis von 2:0,2:2:10:1:1:5 in einer Gesamtkonzentration von 21,2 ug/ml vor. Insgesamt 771 Proben von als HIV-1- positiven (155 Proben), HIV-2-positiven (10 Proben), HTLV-1- positiven durch Western Blot (92 Proben), HTLV-1-negativen durch Western Blot (4 Proben), Patienten mit Autoimmunerkrankungen (AI, 36 Proben) bekannten Spendern und von zufälligen Blutspendern (RBD, 474 Proben) wurden auf den peptidbeschichteten Platten hinsichtlich ihrer entsprechenden retroviralen Immunoreaktivitäten bestimmt.
- Das Ergebnis dieses synthetischen Peptids basierend Retroviralcombo EIA (HTLV-1 und HIV-1 und 2) mit diesen Proben ist in Figur 5 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen klar die Nützlichkeit dieser HTLV-1-Peptide in Verbindung mit den HIV-Peptiden zur Bestimmung retroviraler Infektionen.
Claims (21)
1. Peptidzusammensetzung mit spezifischer Immunoreaktivität
für Antikörper gegen HTLV-1,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie ein aus
ausgewähltes Peptid enthält, in dem Z -OH oder NH&sub2;, Analogons
davon, in denen Aminosäuren in der Sequenz hinzugefügt,
entfernt oder substituiert werden können, solange die
Immunoreaktivität des Peptids für Antikörper gegen HTLV-1 im
wesentlichen beibehalten wird, und deren Mischungen, Konjugate
und Polymere.
2. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Mischung aus den Peptiden I, II, II, IV, V und VI
enthält, in der I:II:III:IV:V:VI in einem Verhältnis von 0,01-
20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug
ist.
3. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Mischung aus den Peptiden IV, V und VI enthält, in
der IV:V:VI in einem Verhältnis von 0,01-20 mg:0,01-20
ug:0,01-20 ug ist.
4. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Mischung aus den Peptiden II, IV, V und VI enthält,
in der II:IV:V:VI in einem Verhältnis von 1 ug:0,25 ug:1 ug:
1 ug ist.
5. Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen
HTLV-1 und zur Diagnose von ATL-Bedingungen,
gekennzeichnet durch
A. Beschichten eines festen Trägers mit einer wirksamen Menge
einer Peptidzusammensetzung enthaltend ein aus
ausgewähltes Peptid, in dem Z -OH oder NH&sub2; ist, deren
Analogons, in denen Aminosäuren der Sequenz hinzugefügt, entfernt
oder substituiert werden können, solange die Immunoreaktivität
des Peptids für Antikörper gegen HTLV-1 im wesentlichen
beibehalten wird, und deren Segmenten, Mischungen, Konjugaten und
Polymeren als Antigen;
B. Hinzufügen eines mit einem Puffer verdünnten Testserums,
in dem die Antikörper gegen HTLV-1 in dem Testserum einen
Peptid-Antikörper-Komplex mit der Peptidzusammensetzung
bilden,
C. Inkubieren der Mischung und
D. Bestimmen des Vorliegens des Peptid-Antikörper-Komplexes.
6. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger mit einer Mischung aus den Peptiden IV, V und
VI beschichtet ist, in der IV:V:VI in einem Verhältnis von
0,01-20 ug:0,01-20 mg:0,01-20 ug ist.
7. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger mit einer Mischung aus den Peptiden II, IV, V
und VI beschichtet ist, in der II:IV:V:VI in einem Verhältnis
von 1 ug:0,25 ug:1 ug:1 ug ist.
8. Immunoassay-Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt D das Einführen eines zweiten mit einem Enzym
markierten bekannten Antikörpers und eines Substrates umfaßt,
welches mit dem Enzym unter Bildung eines gefärbten Produktes
reagiert.
9. Immunoassay-Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Schritt D das Einführen eines zweiten mit einem
radioaktiven Element markierten bekannten Antikörpers umfaßt.
10. Immunoassay-Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Peptid-Antikörper-Komplex als ein Agglutinationsmuster
bestimmbar ist.
11. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger ein mit der Peptidzusammensetzung
beschichteter Streifen in einem Multidot-, Multi-Line- oder Multi-
Square-Array ist.
12. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger ein mit der Peptidzusammensetzung
beschichteter Streifen in einem Multidot-, Multi-Line- oder Multi-
Square-Array ist.
13. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger ein mit der Peptidzusammensetzung
beschichteter Streifen in einem Multidot-, Multi-Line- oder Multi-
Square-Array ist.
14. Test-Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen HTLV und zur
Diagnose von ATL,
dadurch gekennzeichnet, daß es
a. einen festen Träger,
b. ein eine Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1
enthaltendes Immunoadsorbens, das auf den festen Träger
aufgebracht ist,
c. eine Probe eines Normalserums als Negativkontrolle,
d. eine Probe eines Antikörpers gegen HTLV als
Positivkontrolle enthaltenden Serums und
e. einen Puffer zum Verdünnen der Serumproben
aufweist.
15. Peptidzusammensetzung mit spezifischer Immunoreaktivität
für Antikörper gegen HTLV-1 und HIV,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie zumindest eines aus
ausgewählten Peptids, in dem Z -OH oder NH&sub2; ist, deren
Analogons, in denen Aminosäuren in der Sequenz hinzugefügt,
entfernt oder substituiert werden können, solange die
Immunoreaktivität gegen sich von HTLV-1 herleitenden Antikörpern im
wesentlichen beibehalten wird, und deren Mischungen,
Konjugaten und Polymeren, und zumindest eines aus
ausgewählten Peptids enthält, in dem Z -OH oder NH&sub2; ist, deren
Analogons, in denen Aminosäuren in der Sequenz hinzugefügt,
entfernt oder substituiert werden können, solange die
Immunoreaktivität für Antikörper gegen HIV im wesentlichen
beibehalten wird, deren Mischungen, Konjugaten und Polymeren.
16. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Mischung von Peptiden I, II, III, IV, V, VI, VII,
VIII, IX und X enthält, in der I:II:III:IV:V:VI:VII:VIII:IX:X
in einem Verhältnis von 0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-
20ug:0,01-20ug:0,01-20ug:0,01-20ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-
20 ug enthalten ist.
17. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Mischung von Peptiden II, IV, VI, VII, VIII, IX und X
enthält, in der II:IV:VI:VII:VIII:IX:X in einem Verhältnis von
0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20
ug:0,01-20 ug enthalten ist.
18. Peptidzusammensetzung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß
sie eine Mischung von Peptiden II, IV, VI, VII, VIII, IX und X
enthält, in der II:IV:VI:VII:VIII:IX:X in einem Verhältnis von
2 ug:0,2 ug:2 ug:10
ug:1 ug:1 ug:1,5 ug enthalten ist.
19. Immunoassay-Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von
Antikörpern gegen HTLV-1 und HIV,
gekennzeichnet durch:
A. Beschichten eines festen Trägers mit einer wirksamen Menge
einer Peptidzusammensetzung, enthaltend zumindest ein aus
ausgewähltes Peptid, in dem Z -OH oder NH&sub2; ist, deren
Analogons, in denen die Aminosäuren in der Sequenz hinzugefügt,
entfernt oder substituiert werden können, solange die
Immunoreaktivität für Antikörper gegen HTLV-1 im wesentlichen
beibehalten wird, deren Mischungen, Konjugate und Polymeren als
Antigen; und zumindest ein aus
ausgewähltes Peptid, in dem Z -OH oder NH&sub2; ist, deren
Analogons, in denen die Aminosäuren in der Sequenz hinzugefügt,
entfernt oder substituiert werden können, solange die
Immunoreaktivität für Antikörper gegen HIV im wesentlichen
beibehalten wird, deren Mischungen, Konjugate und Polymere als
Antigen,
B. Hinzufügen eines mit einem Puffer verdünnten Testserums,
in dem die Antikörper gegen HTLV-1 und HIV im Testserum einen
Peptid-Antikörper-Komplex mit der Zusammensetzung bilden,
C. Inkubieren der Mischung und
D. Bestimmen des Vorliegens des Peptid-Antikörper-Komplexes.
20. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger mit einer Mischung der Peptide II, IV, VI,
VII, VIII, IX und X beschichtet ist, in denen II:IV:VI:VII:
VIII:IX:X in einem Verhältnis von 0,01-20 ug:0,01-20ug:0,01-20
ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug:0,01-20 ug enthalten ist.
21. Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß
der feste Träger mit einer Mischung der Peptide II, IV, VI,
VII, VIII, IX und X beschichtet ist, in denen II:IV:VI:VII:
VIII:IX:X in einem Verhältnis von 2ug:0,2 ug:2 ug:10 ug:1 ug:1
g:1,5 ug enthalten ist.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29763589A | 1989-01-13 | 1989-01-13 | |
| PCT/US1990/000260 WO1990008162A1 (en) | 1989-01-13 | 1990-01-16 | Synthetic peptide compositions with immunoreactivities to antibodies to htlv-1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69015708D1 DE69015708D1 (de) | 1995-02-16 |
| DE69015708T2 true DE69015708T2 (de) | 1995-06-08 |
Family
ID=23147129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69015708T Expired - Fee Related DE69015708T2 (de) | 1989-01-13 | 1990-01-16 | Künstliche peptid-zusammensetzungen mit immunoreaktiven antikörpern von htlv-1. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0404935B1 (de) |
| JP (1) | JP2643598B2 (de) |
| AT (1) | ATE116660T1 (de) |
| CA (1) | CA2025019C (de) |
| DE (1) | DE69015708T2 (de) |
| WO (1) | WO1990008162A1 (de) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5614366A (en) * | 1986-12-31 | 1997-03-25 | Genelabs Technologies, Inc. | HTLV-I peptide antigens and kit |
| FI910245A (fi) * | 1990-01-24 | 1991-07-25 | United Biomedical Inc | Syntetiska peptidkompositioner med immunoreaktivitet mot htlv-antikroppar. |
| NZ238855A (en) * | 1990-07-18 | 1994-03-25 | Iaf Biochem Int | Peptides, mixtures thereof and compositions useful for detecting htlv-i and htlv-ii infections |
| US5378805A (en) * | 1990-08-29 | 1995-01-03 | United States Of America | Immunoreactive HTLV-I/II ENV and POL peptides |
| WO1992004046A1 (en) * | 1990-08-29 | 1992-03-19 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Novel peptide antigens and immunoassays, test kits and vaccines using the same |
| US5773211A (en) * | 1991-07-10 | 1998-06-30 | Abbott Laboratories | Differentiation of HTLV-I and HTLV-II using synthetic peptides |
| NZ243636A (en) * | 1991-07-29 | 1993-06-25 | Iaf Biochem Int | Immunoassay and kit for simultaneously detecting antibodies to hiv-1, hiv-2, htlv-1 and htlv-11 |
| JP3506252B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2004-03-15 | ジェネラブス・テクノロジーズ・インコーポレイテッド | Ｈｔｌｖ−ｉ／ｈｔｌｖ−ｉｉの分析及び方法 |
| EP0736179A1 (de) * | 1993-12-20 | 1996-10-09 | Abbott Laboratories | Differenzierung von htlv-i und htlv-ii unter verwendung synthetischer peptide |
| TWI225070B (en) * | 1999-12-01 | 2004-12-11 | Food Industry Res & Dev Inst | Novel peptides used as angiotensin converting enzyme inhibitor and preparation process thereof |
| CA2579676A1 (en) | 2004-09-08 | 2007-02-15 | Hana Golding | Compositions and methods for the detection of hiv-1/hiv-2 infection |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5063150A (en) * | 1984-09-19 | 1991-11-05 | The Regents Of The University Of California | Retroviral polypeptides associated with human cellular transformation |
| US4833071A (en) * | 1987-01-09 | 1989-05-23 | United Biomedical, Inc. | Peptide composition as anitgen for detection of antibodies to HTLV-I, as a vaccine for ATL and methods therefor |
| WO1989006543A1 (en) * | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genelabs Incorporated | Htlv-i peptide antigen and assay |
| EP0345792A3 (de) * | 1988-06-10 | 1991-05-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | HTLV-1/HIV-1-Fusionsproteine |
-
1990
- 1990-01-16 DE DE69015708T patent/DE69015708T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-16 JP JP2503823A patent/JP2643598B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-16 AT AT90903508T patent/ATE116660T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-16 EP EP90903508A patent/EP0404935B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-16 CA CA002336943A patent/CA2025019C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-16 WO PCT/US1990/000260 patent/WO1990008162A1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2025019A1 (en) | 1990-07-14 |
| JP2643598B2 (ja) | 1997-08-20 |
| EP0404935A1 (de) | 1991-01-02 |
| EP0404935A4 (en) | 1991-03-13 |
| WO1990008162A1 (en) | 1990-07-26 |
| JPH03504165A (ja) | 1991-09-12 |
| DE69015708D1 (de) | 1995-02-16 |
| ATE116660T1 (de) | 1995-01-15 |
| CA2025019C (en) | 2002-06-18 |
| EP0404935B1 (de) | 1995-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3750812T2 (de) | Peptidzusammensetzung und Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-III. | |
| DE3689097T2 (de) | Synthetisches Peptid und Verfahren für dessen Benutzung zum Nachweis von Antikörpern zu HTLV-III, Diagnose von AIDS und PRE-AIDS-Bedingungen und als Impfstoffe. | |
| DE3650175T2 (de) | Synthetische antigene zum nachweis von aids. | |
| DE3750339T2 (de) | HTLV-III umhüllende Peptiden. | |
| DE3750088T2 (de) | Synthetische Polypeptide und Antikörper bezogen auf Vorzeitig-Diffus-Antigene vom Epstein-Barr-Virus. | |
| DE3788397T3 (de) | Synthetische htlv-iii-peptid-zusammensetzungen und ihre verwendung. | |
| Koprowski et al. | Multiple sclerosis and human T-cell lymphotropic retroviruses | |
| US4833071A (en) | Peptide composition as anitgen for detection of antibodies to HTLV-I, as a vaccine for ATL and methods therefor | |
| DE68916421T2 (de) | Synthetische peptidantigene zum nachweis von htlv-1-infektionen. | |
| DE3588248T2 (de) | LAV-Antigene und -Peptide | |
| DE68928130T2 (de) | Synthetische vom HIV-GP120-env-Protein abgeleitete Peptide und ihre Anwendung | |
| DE3752170T2 (de) | Synthetisches Antigen zum Nachweis von mit AIDS in Zusammenhang stehenden Krankheiten | |
| Chang et al. | Detection of antibodies to human T-cell lymphotropic virus-III (HTLV-III) with an immunoassay employing a recombinant Escherichia coli-derived viral antigenic peptide | |
| DE69223250T3 (de) | Detektion des immunschwäche-virus aus felis | |
| DE69015708T2 (de) | Künstliche peptid-zusammensetzungen mit immunoreaktiven antikörpern von htlv-1. | |
| DE69129207T2 (de) | Peptide, von Virus-HIV-Hüllen-Glycoproteinen abstammend, deren Verwendung zum Nachweis einer Infektion dieser Viren und für die Impfung gegen AIDS | |
| DE3789633T2 (de) | HTLV-III(LAV)Decke-Peptide. | |
| DE3854550T2 (de) | HIV-Peptide und Methoden für den Nachweis von HIV. | |
| EP0439077B1 (de) | Immunaktive Peptidzusammensetzung gegen HTLV-Antikörper | |
| DE69207200T2 (de) | IMMUNTEST ZUM GLEICHZEITIGEN NACHWEIS VON HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II ANTIKÖRPERN | |
| US5476765A (en) | Synthetic peptide compositions with immunoreactivities to antibodies to HTLV and as vaccines | |
| DE3886032T2 (de) | Hiv-1-verwandte polypeptide, diagnosesysteme und testverfahren. | |
| US5681696A (en) | Synthetic peptide compositions with immunoreactivities to antibodies to HTLV | |
| Palker et al. | Purification of envelope glycoproteins of human T cell lymphotropic virus type I (HTLV-I) by affinity chromatography | |
| KR930008448B1 (ko) | T-4수용체에 대한 결합을 억제하며, 면역원으로서 작용하는 소형 펩티드 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |