KR930008448B1 - T-4수용체에 대한 결합을 억제하며, 면역원으로서 작용하는 소형 펩티드 - Google Patents

T-4수용체에 대한 결합을 억제하며, 면역원으로서 작용하는 소형 펩티드

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
T-4수용체에 대한 결합을 억제하며, 면역원으로서 작용하는 소형 펩티드
[도면의 간단한 설명]
제 1a 도는125I-gp120의 뇌막 및 T세포에 대한 교차 결합을 나타내는 것으로, (a)는125I-gp120 단독, (b)는 원숭이, (c)는 쥐, (d)는 사람의 뇌 및 (e)는 인체 T세포이다.
제 1b 도는125I-표지된 원숭이 뇌막의 면역 석출을 나타내는 것으로, (f)는 1차 항체를 첨가하지 않은 대조군의 경우, (g)는 OKT 4Mab를 첨가한 경우, 및 (h)는 OKT8 Mab를 첨가한 경우이다.
제 1c 도는125I-표지된 인체 T세포의 면역 석출을 나타내는 것으로, (i)는 1차 항체를 첨가하지 않을 대조군의 경우, (j)는 OKT4 Mab를 첨가한 경우, 및 (k)는 OKT8 Mab를 첨가한 경우이다.
제 2a 도는 쥐의 신선한 해마 막에 특이적으로 결합한125-gp120의 치환을 나타낸다. 각 측정은 3개조로 수행하고, 하나의 실험이 3회 반복되어 유사한 결과를 가짐을 나타내었다. OKT4 및 4A 10μg/ml로 치환될 수 있는 특이적 결합은 전체 결합의 27 내지 85%의 범위에 있고, 이것은 나타낸 실험에서 2,201±74cpm이었다.
제 2b 도는 비루스 감염이 펩티드 T와 그의 합성 동족체에 의해 차단되는 것을 나타낸다. 각 측정은 2개조로 수행하였다. 결과는 하나의 실험이 3회 반복되어 유사한 결과를 가짐을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 간단한 설명]
본 발명은 세포 표면 상의 수용체 부위를 차단하여 HTLV-Ⅲ/LAV [이하 HIV(사람 면역 결핍 비루스)로 명명함]가 인체 세포에 결합하는 것을 억제함으로써 인체 T세포의 비루스 감염을 예방하는 합성적으로 제조한 소형 펩티드 서열에 관한 것이다. 이들 펩티드는 감염을 예방하면서, 또한 HIV비루스의 인벨로프(envelope) 단백질에 대한 항체 생성을 유도한다. 그러므로, 이들 펩티드는 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 진전을 예방하는 백신(vaccine)으로서의 용도를 가질 수도 있다. 펩티드에 대한 모노클로날 항체들은 또한 HIV비루스를 동정하는 진단 시약으로서 사용할 수도 있다. 그러므로, 펩티드와 펩티드에 대한 항체는 HIV 보균자 또는 AIDS 환자의 동정을 위한 시험키트 제조에 사용한다.
[발명의 배경]
AIDS(HIV) 비루스의 완전한 뉴클레오티드 서열은 수 명의 연구자들에 의해 보고되어 왔다.[리 래트너(Lee Ratner) 등, Nature 제313호, 제277페이지, 1985년 1월, 무에싱(Muesing) 등, Nature 제313호, 제450페이지, 1985년 2월 및 와인-헵슨(Wain-Habson) 등, Cell 제40호, 제9-17페이지, 1985년 1월 참조]. 인벨로프 유전자는 특히 항원성 및 감염성과 관련되어 있다. 그러나, 인벨로프 부분은 또한 고도로 분기된 부위를 갖는 것으로 공지되어 있다. HIV 비루스 인벨로프 당단백질은 사람, 쥐 및 원숭이의 뇌막 및 면역계의 세포에 공유적으로 부착되는 것으로 나타났다.
비루스가 세포막 수용체 상의 고도로 특이적인 부위에 부착되어 세포 및 조직 친화성을 발휘할 수 있다는 사실은 연구자들로 하여금 세포막의 비루스 수용체 부위에서 결합하여 이들 세포에 특정 비루스가 결합하는 것을 예방하는 약제를 탐구하도록 고무시켰다. 특이적 수용체 개재 우두(vaccinia) 비루스 감염이 합성 펩티드에 의해 차단된다는 증거는 이전에 증명되었다 [엡스타인(Epstein) 등, Nature, 제318호, 제663-667페이지 참조].
HIV 비루스는 T임파구 및 대식구(大食球)를 포함하여, HIV에 감염되기 쉬운 여러 가지 세포 상에 존재하는, CD4 또는 T4부위로 알려진 표면 분자에 결합하는 것으로 나타났다[샤(Shaw) 등, Science 제226호, 제1165-1171페이지, HTLV-Ⅲ의 친화성의 검토 참조].
면역 결핍증으로부터 발생하는 증상 이외에, AIDS환자는 신경 정신적 결함을 나타낸다. 중추 신경계 및 면역계는 신경 펩티드 개재 세포간 전달의 수용체로 작용하는 다수의 특이적 세포 표면 인식분자를 공유한다. 신경 펩티드 및 그의 수용체들은 충분한 진화적 안정성을 나타내며, 단세포 생물 및 고등 동물에서 크게 변하지 않은 형태로 잘 보존되고 있다. 또한, 중추 신경계 및 면역계에는 HIV인벨로프 당단백질(gp120)이 결합하는 수용체로서 작용하는 공통적인 CD4(T4) 세포 표면 인식 분자가 있다. 고도로 보존된 동일한 신경 펩티드 정보 물질이 HIV의 것과 현저히 유사한 수용체를 통하여 면역 및 뇌 기능을 통합하므로, 본 발명자들은 HIV 당단백질 gp120과, 이전에 엡스타인 바르-비루스(Epstein Barr-Virus)의 인벨로프 부위로부터 동정된 짧은 펩티드 사이의 매우 유사한 아미노산 서열이 비루스 수용체 결합에 필수적인 코어 펩티드를 나타낼 수 있음을 가정하였다. 본 발명자들은 이와 같은 펩티드는 수용체 세포와 결합하여 HIV gp 120의 결합을 차단시킴으로써 세포의 HIV감염을 예방하는데 유용하고, 수용체 부위에 결합하는 이들은 펩티드는 펩티드 서열에 대한 항체의 생성을 일으키며, 이들 펩티드는 AIDS예방용 면역 기초를 제공하는데 사용될 수 있음을 가정하였다.
[목 적]
본 발명의 목적은 뇌막 및 면역계 세포의 수용체 부위에 HIV(AIDS비루스)가 결합하는 것을 방지함으로써 AIDS증상을 경감시키는 작용을 하는 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 HIV(AIDS비루스)에 노출될 수 있는 사람을 AIDS의 발명으로부터 보호하기 위한 항체를 유도하는데 사용되는 백신으로서의 용도를 갖는 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 HIV 또는 HIV인벨로프 단백질에 대한 항체의 존재를 동정하는 진단 수단을 제공하는 것이다.
[발명의 상세한 설명]
HIV 인벨로프 당단백질(gp 120)중의 옥타펩티드는 컴퓨터-지원 분석으로 동정되었다. 트레오닌의 함량이 높기 때문에 "펩티드 T"라고 불리우는 이 펩티드는 gp120이 뇌막에 결합하는 것을 억제하는 것으로 나타났다. 이 펩티드는 서열 Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr를 갖는다. 후기의 분석은 유사한 결합 특성을 갖는 관련된 펜타팹티드의 부류에 관하여 기재하였다.
본 발명의 제 1 측면에 따라, 하기 일반식(Ⅰ)
Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb(Ⅰ)
(식 중, Ra는 아미노 말단 잔기 Ala- 또는 D-Ala이고, Rb는 카르복시 말단 잔기 -Thr 또는 -Thr 아미드임)의 펩티드 또는 그의 아미노 말단 및 카르복시 말단중 하나 또는 모두에서 추가로 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체 또는 하기 일반식(Ⅱ)
R1-R2-R3-R4-R5(Ⅱ)
(식 중, R1은 아미노 말단 잔기 Thr-, Ser-, Asn-, Glu-, Arg-, Ile- 또는 Leu이고, R2는 Thr-, Ser- 또는 Asp이고, R3는 Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys 또는 Trp이고, R4는 Tyr이며, R5는 바람직하기로는 카르복시 말단 잔기 -Thr, -Arg 또는 -Gly임)의 펩티드 또는 아미노 말단 잔기로서 대응하는 D-아미노산 및 (또는) 카르복시 말단 잔기로서 대응하는 아미드 유도체 및 (또는) 아미노말단 및 카르복시 말단중의 하나 또는 모두에서 추가로 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체가 제공된다. R5에 바람직한 아미노산이 제시되어 있지만, 이 위치에서 아미노산을 광범위하게 변화시킬 수 있다. 실제로, R5가 없이 카르복시 말단 아미노산으로서 R4(티로신)로 펩티드를 종결시킬 수 있다. 이와 같은 펩티드들은 본 발명에서 지적하는 군의 결합 특성을 보유한다. 세린과 트레오닌은 본 발명에서 지적하는 생물학적 특성의 목적을 위해 상호 교체할 수 있다. 본 발명에 의한 유효 화합물은 생리학적으로 허용되는 펩티드의 염으로 존재할 수 있다.
이 부류의 펩티드들은 T4비루스 수용체에 결합한다는 것을 발견하였다.
대부분의 바람직한 펩티드 및 상기 펩티드 T로는 상기 식(Ⅰ)의 옥타펩티드인
D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr 및 D-Ala-Ser-Thr- Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-아미드, 및 상기 식(Ⅱ)의 펜타펩티드인 Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr, Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr, Thr-Thr-Asn- Tyr-Thr, 및 아미노 말단 잔기로서 D-Thr 및 (또는) 카르복시 말단에서 아미드 유도체를 갖는 이들의 동족체가 있다.
본 발명의 화합물은 혈액 뇌 관문을 통한 분자의 통과를 증진시키기 위해 공지된 방법으로 유익하게 변형시킬 수 있다. 아세틸화는 펩티드의 결합 활성을 증진시키는 데 특히 유용한 것으로 증명되었다. 말단 아미노 부위 및 카르복시 부위들은 변형에 특히 바람직한 부위들이다.
이 펩티드들은 또한 안정성과 경구 이용성을 개선하기 위해 구속 형태로 변형시킬 수도 있다.
이하에서 다음과 같은 약자를 사용한다.
Figure kpo00001
달리 기재하지 않는 한, 아미노산은 물론 천연 형태의 L-입체 이성질체이다.
12종의 펜타팹티드에 대한 아미노산 서열의 비료를 표 1에 나타내었다. 역사적으로 본 발명자들은 최초의 컴퓨터 조사에 의해 펩티드 T(ARV 단리물 중에 함유됨)가 관련 부분임이 밝혀졌으나, 추가의 비루스 서열이 이용가능해짐에 따라 관련있는 생물학적으로 유효한 서열은 명목상으로 펩티드 T[4-8], 또는 서열 TTNYT로 이루어진 보다 짧은 펜타펩티드일 수 있음이 명백해졌다. 단리물중에서 본 발명자들은 이러한 더 짧은 부위에서만 발견되는 실질적인 상동성을 비교하였다(표1). 변경의 대부분은 2종류의 밀접하게 관련된 아미노산인 세린(S)과 트레오닌(T)의 상호 전환이다. 펩티드 T중의 7위치에 있는 티로신은 이들 구조 모두의 불변의 특징으로서 이것이 생물학적 활성에 필수적임을 나타낸다.
5위치에서의 치환은 T,G,R 또는 S를 포함한다. 4 위치 및 6위치는 S,T 및 N으로 우선 제한되고 (하나의 예외를 가짐) 모든 아미노산은 밀접하게 유사한 입체 특성을 갖는 비하전 극성 기를 함유한다. 5개의 여러가지 AIDS 비루스 단리물(9,10)중의 일반적인 서열 일치의 평가는 펩티드 T서열 주위 및 이것을 포함하는 부위가 고도의 가변 영역임을 나타낸다. 이와 같은 가변성은 이 위치(locus)에서 정의될 수 있는 기(들)의 강력한 선택적 변화를 통한 특수화를 나타낼 수 있다. 아편제 펩티드들과 같이, 이들 펩티드 T동족체들은 메티오닌(met) 및 로이신(leu) 엔케팔린(enkephalin)을 암시하는, 복수 형태로 존재하는 것으로 보인다. 이들 여러가지 AIDS 비루스 단리물 중에 나타난 이들 펜타펩티드 서열은 생물학적으로 활성이며, 이전에 주로 T헬퍼 세포의 표면 "마커(marker)"로서 공지된 CD4 수용체의 아고니스트로서 상호작용할 수 있다.
[표 1] 다수의 AIDS비루스 단리물 중의 ENV서열 비교
Figure kpo00002
1에서 숫자는 ARV env 서열(9)내의 아미노산의 상대적 위치를 의미함.
7개의 아미노산을 갖는 펩티드 CYS-THR-THR-ASN-TYR-THR-CYS로 또한 활성이 있다. 시스테인을 코어에 첨가하는 것은 활성에 역효과를 미치지 않는다.
이 펩티드들은 발명자와 제조업자 간의 비밀 계약 하에 페닌슐라 레버러터리스(Peninsula Laboratories)에 의해 주문 합성되었다. 고상 펩티드 합성의 메리필드(Merrifield)법을 사용하였다(미합중국 특허 제3,531,258호 참조). 합성된 펩티드들이 특히 적합하다. 펩티드 T 및 그의 일부분인 펜타펩티드는 비루스로부터 단리시킬 수 있지만, 메리필드의 방법에 따라 제조한 펩티드들은 비루스 및 세포 파편이 없다. 그러므로, 합성 펩티드를 사용하는 경우, 오염 물질에 대한 부반응은 일어나지 않는다.
본 발명에 의한 펩티드들은 통상적인 합성법에 의해 제조할 수 있다. 고상법 및 액상법 모두를 사용할 수 있다.
본 발명자들은 메리필드의 고상법이 특히 편리한 것임을 발견하였다. 이 방법에서, 펩티드는 사슬의 카르복시 말단을 불용성 지지체에 공유 결합시켜 두고 단계적 방법으로 합성된다. 중간체 합성 단계도중, 펩티드는 여전히 고상이므로 편리하게 조작할 수 있다. 고체 지지체는 클로로메틸화 스티렌-디비닐벤젠 공중합체이다.
카르복시 말단 아미노산의 N-보호 형태, 예를 들면 t-부톡시카르보닐 보호(Boc-) 아미노산은 클로로메틸화 스티렌 디비닐 벤젠 공중합체 수지의 클로로메틸 잔기와 반응하여 수지의 보호된 아미노 아실 유도체를 제조하며, 여기에서 아미노산은 수지와 커플링하여 벤질 에스테르를 형성한다. 이것을 탈보호시키고, 다음에 필요한 보호 형태의 아미노산과 반응시켜서 수지에 부착된 보호 디펩티드를 제조한다. 아미노산은 일반적으로, 예를 들면 카르보디아미드 또는 활성 에스테르를 사용하여 활성화된 형태로 사용한다. 수지상에서 목적하는 펩티드가 제조될 때까지 이 순서를 반복하고 펩티드 사슬은, 아미노 말단에서 필요한 N-보호 아미노산과 축합시킴으로써 1회에 한 잔기씩을 성장시킨다. 이어서, 펩티드-수지를 무수 불화수소산으로 처리하여, 제조된 펩티드가 수지에 결합하고 있는 에스테르 결합을 절단하여 목적하는 펩티드를 얻는다. 통상적인 방법을 사용하여, 합성 과정중에 보호되었던 아미노산의 측쇄 관능기들을 동시에 제거할 수도 있다. 펩티드의 카르복시 말단 상에서 아미드 기를 갖는 펩티드의 합성은 4-메틸벤즈히드릴아민수지를 사용하여, 통상적인 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에 의한 화합물은 세포의 수용체 부위를 효과적으로 차단하여, 원숭이, 쥐 및 사람의 뇌막 및 면역계의 세포에서 HIV(AIDS 비루스)에 의한 세포 감염을 예방하는 것으로 밝혀졌다.
그러므로, 본 발명의 한 측면으로서, 본 발명자들은 인체 의학 또는 수의학에서 사용하기에 적합한 본 발명의 화합물 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형체로 이루어지는 제약 조성물을 제공한다. 이와 같은 조성물은 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하여 통상적인 방법으로 사용하도록 제공될 수 있다. 필요하다면, 조성물은 임의로 1종류 이상의 다른 치료제, 예를 들면 다른 항 비루스제를 추가로 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 펩티드들은 경구, 구강, 비경구, 국소 또는 직장내 투여용으로 제제할 수 있다.
특히, 본 발명에 의한 펩티드들은 주사 또는 주입용으로 제형화시킬 수 있으며, 보존제를 첨가시켜서 단위 투여 형태의 앰플제 또는 다중 투여 용기제로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 부형제 중에서 현탁액제, 용액제 또는 에멀젼제와 같은 형태를 이룰 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및 (또는) 분산제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용전에 적합한 부형제, 예를 들면 발열 물질(pyrogen)이 없는 멸균수(水)를 사용하여 조제할 수 있는 분말 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 제약 조성물은 항균제 또는 보존제와 같은 다른 활성 성분을 함유할 수도 있다.
조성물은 활성 물질을 0.001-99% 함유할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명에 의한 펩티드를 제약상 허용되는 부형제 또는 담체와 혼합하는 것으로 이루어진 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
주사 또는 주입에 의한 투여에 있어서, 체중이 약 70kg인 성인의 치료를 위해 사용하는 1일 용량은, 예를 들면 투여 방식 및 환자의 상태에 따라, 0.2mg 내지 10mg, 바람직하게는 0.5 내지 5mg이며, 1 내지 4회 용량으로 투여할 수 있다.
친화 상수는 모르핀의 친화 상수와 유사한 것으로 가정되었다. 이 친화성을 근거로 하여, 일일 투여 용량으로 0.33-0.0003mg/kg이 제시되었다. 이 복용량은 유효한 것으로 입증되었다. 혈중 농도로 10-6내지 10-11몰 혈중 농도가 제시된다. 원숭이에 있어서, 일일 용량 3mg/kg을 투여하면 150×10-9M의 혈청 농도가 되었다. 이 농도는 10-8M의 농도를 얻기 위해 필요한 농도보다 15배 이상 높은 것이다. 영장류는 일반적으로 인체에 사용되는 투여량의 10배를 필요로 한다.
본 발명의 또다른 측면은 AIDS비루스 감염으로부터 보호하기 위한 본 발명의 펩티드를 함유하는 백신제제에 관한 것이다. 백신은 적합한 부형제, 예를 들면 멸균수, 염수 또는 완충 염수중에서 인체 혈청 알부민과 같은 단백질에 임의로 결합시킨, 면역 유효량의 펩티드, 예를 들면 체중 1kg당 1㎍ 내지 20mg을 함유할 것이다. 수산화 알루미늄 겔과 같은 보조제를 사용할 수 있다. 투여는, 예를 들면 근육내, 복강내, 피하, 또는 정맥내 주사로 가능하다. 투여는 1회 또는, 예를 들면 1-4주 간격으로 여러번 시행할 수 있다.
항원성을 증진시키기 위해 게(crab)로부터 얻은 항원 서열 및 다른 무척추 동물의 단백질도 본 발명의 펩티드에 첨가시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 AIDS비루스 검출용 시험 키트 및 항원 공급원으로서 본 발명의 펩티드를 함유하는 AIDS비루스에 대한 항체, 또는 본 발명의 펩티드에 의해 유도된 모노클로날 항체에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명에 의한 펩티드를 시험 키트에 효소-결합 면역 흡수 분석(ELISA) 또는 효소 면역 반점 분석에서 시험시약으로서 사용하여 AIDS감염을 검출하고, AIDS 및 AIDS 발병전 상태를 진단할 수 있다. 이와 같은 시험 키트는 항원성 펩티드 또는 모노클로날 항체가 미리 흡수되거나 또는 공유 결합되어 있는 불용성 다공성 표면 또는 고상 지지체[이와 같은 표면 또는 지지체는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 또는 웰(well) 형태가 바람직함], 시험 혈청, 표면 또는 지지체에 흡수된 항원 또는 항체에 특이적으로 결합하여 포화시키는 이종 항혈청, 여러가지 희석제와 완충액, 특이적으로 결합된 항체 검출용 표지화 결합제 및 효소기질, 조인자(cofactor) 및 색소원(chromogen)과 같은 기타 발색 시약을 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 펩티드는 통상적인 기술을 사용하여 AIDS비루스의 인벨로프 서열중 관련된 부분에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 유도하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있으며, 이와 같은 모노클로날 항체는 본 발명의 추가의 특성을 형성한다.
[실험 방법 및 데이터]
gp120의 방사선 표지화, 뇌막의 제조, gp120의 수용체에 대한 결합 및 교차 결합 T4항원의 면역 석출.
HIV의 HTLV-Ⅲb를 H9 세포에서 증식시키고, gp120을 면역친화성 크로마토그래피 및 예비 NaDodSO4/PAGE에 의해 단리시켰다. 정제시킨 gp120을 클로라민-T 방법에 의해125I로 표지시켰다.
신선한 인체, 원숭이 및 쥐의 해마(hippocampus)를 빙냉시킨 50mM Hepes(pH7.4) 100부피 중에서 신속하게 균질화시켰다[폴리트론(Ploytron), 브린크만 인스트루먼츠(Brinkmann Instruments) 제품]. 원심분리(15,000×g)시켜서 모은 막을 최초 부피의 완충액 중에서 세척하여, 즉시 사용하거나 또는 -70℃에서 저장하였다. 사용 전에, 뇌막 및 고도로 정제시킨 T세포[참조 16, 래리 왈(Larry Wahl)의 증전본]를 인산염-완충 식염수(PBS)중에서 15-30분 동안 예비 배양시켰다. 뇌(단백질 약 100㎍) 20㎎(최초의 습윤 중량)에서 얻은 막을 0.1% 소혈청 알부민과 펩티다제 억제제 박시트라신(0.005%), 아프로티닌(0.005%), 로이펩틴(0.001%) 및 키모스타틴(0.001%)을 함유하는 50mM Hepes 200리터(최종 부피)중에서, 37℃로 1시간 동안125I-gp120 28,000cpm과 함께 배양시켰다. 배양물을 신속하게 진공여과시키고, 계측하여 수용체 결합 물질을 측정하였다.
[면역 설출]
가용화시킨 0.5% Triton X-100/PBS, 락토퍼옥시다제/글루코오스 옥시다제/ I-요오드화 뇌막 또는 완전한 T 세포를 매 반응 당 10㎍으로 지시된 mAb와 함께 배양(4℃에서 철야)시켜서 면역 석출물을 제조하였다. 고상 면역 흡수제[임뮤노비드(immunobeads), 바이오-래드(Bio-Rad)제품]를 사용하여 이들이 NaDodSO4/PAGE에 의해 분리되기 전에 면역 복합체를 석출시켰다. 대조 배양물은 원래의 mAb 또는 서브클래스 대조 mAb(OKT8)을 함유하지 않았다.
[화학적 신경 해부학 및 컴퓨터 지원 농도 측정법]
인체, 원숭이 및 쥐의 신선한 동결된 뇌의 크리오스태트(Cryostat) 정단 25㎛ 절편을 해동시키고, 젤라틴 피복 슬라이드 상에서 건조시키고, 수용체를 다음에 설명한 바와 같이 가시화하였다(18). 조직 절편을 T4,T4A,T8 및 T11에 대한 항체(10㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 RPMI 배지 중에서 0℃로 철야 인큐베니션시키고 난 후, 이들의 항원과 교차 결합시키고,125I-gp120으로 표지시키기 위해 슬라이드에 고정시킨 조직 절편을 표지되지 않은 gp120 1μM 또는 mAb OKT4A[오르토 다이아그노스틱스(Ortho Diagnostics)] 10㎍/ml의 존재 또는 부재 하에 5ml 슬라이드 캐리어에서 인큐베이션시켰다.
[T임파구 서브세트(subset) 분리]
T세포의 세브세트는 퍼콜(Percoll) 밀도 정제된 말초 혈액 T세포를 특이적인 모노클로날 항체(T4 또는 T8) 10㎍/ml로 처리하여 얻었다. 이어서, 처리한 세포를 염소 [F(ab')2] 항마우스 면역 글로블린[세로 랩(Sero Lab) 제품, 매사추세츠주, 이스트배리소재]을 도포한 플라스틱제 페트리 디쉬(petri dish) 상에서 4℃로 30분 동안 분산시켰다(21). 이어서, 부착되지 않은 세포를 제거하고, 세척한 후 유동 혈구 계산법(flow cytometry)에 의해 반응성을 분석하였다. 분리시킨 T4 및 T8세포 개체수의 5% 미만이 기타 T세포 서브세트로 오염되었다. 이어서, 세포를 식물성 혈구 응집소(1㎍/ml)와 함께 72시간 동안 배양하고, 하기와 같이 HIV에 노출시켰다. 감염된 세포의 세포 특성을 측정하여 표현형으로 특상화시켰다.
[비루스 감염]
감염에 사용된 HTLV-Ⅲ 비루스는 AIDS 환자에게서 갓 채취한 시료로부터 이루어진 인터루킨 2(IL-2) 의존성 배양 T 세포주로부터 단리하여 감염 허용성 IL-2-비의존성 세포주인 Hut 78에 감염시켰다.
[실시예 1]
인체 T세포의 것과 식별할 수 없는 다람쥐 원숭이, 쥐 또는 인체 뇌막으로부터 얻은 막에125I-gp120을 특이적으로 결합시켜서 약 170Kd의 방사선 표지화 교차 결합 생성물을 얻었다.( 제 1a 도 참조). 이 결과는 gp120이 대략 60Kd 단백질과 결합할 수 있으며, 미반응125I-gp120은 막이 조재하지 않은 대조물(a레인)에 인접해서 전개됨을 나타낸다.
방사선 요오드화 인체 뇌막을 OKT4와 OKT8(㎍/ml)를 사용하여 면역 석출시킨 것(제 1b 도 참조)은 뇌막이 인체 T임파구 상에서 동정된 것과 식별할 수 없는, 약 60Kd의 T4항원을 함유함을 나타내고 (제 1c 도 참조), 이와 대조적으로, OKT8은 뇌막에 없는 (제 1b 도 참조) T임파구 (제 1c 도 참조) 중에서 저 분자량(약 30Kd) 단백질을 면역석출시키며, 이것은 뇌의 T4가 고유의 임파구에서 유도되지 않음을 나타낸다. 이와 유사한 결과를 원숭이 및 쥐(나타내지 않음)의 해마막을 사용하여 관찰하였다. 이들 결과는 T4항원이 비루스 수용체로서 작용하며, 면역 및 중추 신경계에 의해 공유되는 고도로 보존된 60Kd분자임을 나타낸다.
엡스타인-바르 및 HTLV-Ⅲ/LAV가 거의 동일한 옥타펩티드 서열을 공유한다는 사실을 "T펩티드"의 합성과 연구를 고무시켰다. 제 2 도를 갓 준비된 쥐의 뇌막에 결합하는125I-gp120의 고친화성(0.1nM 범위) 및 포화도를 나타낸다(제 2a 도 참조). 특이성(제 2b 도)은 OKT3가 아닌 OKT4 및 OKT4A(0.1㎍/ml)를 사용하는 차단에 의해 증명되었다. 펩티드 T 및 그의 합성 동족체 중의 2가지 (무관한 옥타펩티드 물질P[1-8]는 아님)는125I-gp120결합을 0.1nM 범위에서 뚜렷하게 억제시켰다(제 2c 참조). 8위치에서 D-트레오닌-아미드의 치환은 수용체 결합 활성이 100배 이상 손실되는 결과를 가져왔다. 일반적으로 [L-Ala] 대신에 [D-Ala]로 치환시키면 펩티드 T보다 일관성있게 더 강력하고, 펩티드제에 대하여 보다 내성이 있는 동족체를 얻으며, C말단 트레오닌의 아미드화의 결과도 일관성있게 다소 강력한 효능을 갖게하였다.(제 3 도 참조).
합성 펩티드를 인체 T세포의 비루스 감염 차단능에 대해 시험했을 때, 실험자는 결합 측정 결과에 무지하였다. 결합 측정시에 10-7에서 유효한 3개의 펩티드들은 역전사 효소 활성의 검출수준을 거의 9배 감소시킬 수 있었다. 활성이 약한 결합 치환제 [D-Thre]-펩티드 T는 유사하게 비루스 감염의 차단을 크게 감소시키는 것으로 나타났으며, 뚜렷한 억제를 이루기 위해 100배 더 높은 농도를 필요로 하였다. 따라서, 4개 펩티드의 효능을 등급 순서 (D-[Ala]1-펩티드 T-아미드〉D-[Ala]1, -펩티드 T〉펩티드 T〉D-[Thre]8펩티드 T-아미드) 뿐만 아니라, 수용체 결합 및 비루스 감염을 억제함에 있어서 이들의 절대 농도는 밀접하게 관련되어 있다(제 3 도 참조).
[실시예 2]
인체 T세포 T4항원과 동일하지는 않으나 유사한, 대략 60Kd의 단백질은 사람의 뇌로부터 제조한 막 상에 명백하게 보전된 분자형태로 존재하였으며, 또한 방사선 표지화 HIV외막 당단백질(125I-gp120)은 크기 및 면역 석출 특성이 T4항원과 식별할 수 없는 3종류의 포유류 뇌에 존재하는 분자에 공유적으로 교차 결합시킬 수 있다. 뇌 박편 상의 항체 결합 수용체 가시화 방법을 사용하여, 피질성 신경망 상에서 가장 조밀하고, 3종류의 포유류 뇌 모두에서 유사하게 조직화된, 뇌 T4의 신경 해부학적 분포 패턴이 제공되었다. 또한, 방사선 표지화 HIV비루스 외막 당단백질은 인접한 뇌 절편상에서 동일한 패턴으로 결합되어, 다시 한번 더 T4가 HIV수용체였음을 암시하였다.
[실시예 3]
화학적 신경 해부학 및 컴퓨터 지원 농도 측정법
사람, 원숭이 및 쥐의 동결된 신선한 뇌의 크리오스태트(Cryostat) 절단 2미크론 절편을 해동시키고, 겔피복 슬라이드 상에서 건조시키고, 수용체를 문헌[헤르켄함(Herkenham) 및 퍼트(Pert), J.Neurosci. 제 2 호, 제 1129-1149페이지(1982년)]에 기재한 바와 같이 가시화하였다. T4,T4A,T8 및 T11에 대한 항체(10㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 RPMI내에서 0℃ 철야인큐베이션시키고 난 후, 이들의 항원에 교차 결합시키고,125I-염소 항 마우스 항체로 가시화하였다. 항원/수용체를125I-gp120으로 표시시키기 위해 슬라이드에 고정시킨 조직 절편을 표지되지 않은 gp120(10-6M) 또는 Mab OKT4A(10㎍/ml)(오르토 다이아그노스틱스)의 존재 또는 부재하에 5ml 슬라이드 캐리어에서 막에 대해 상기한 바와 같이 수행하였다.
정량적 색상에 대한 자동 방사선 사진 필름 불투명도의 컴퓨터 자동 변형을 수행하였다. 원숭이 뇌 절편을 사용하여 방사능이 표준 공지 증분을 동시 노출시켜서 logO.D 대 cpm의 선형도 (4=〉.99)를 얻었는데 여기에서는 방사능의 상대 농도를 상당히 외삽시킬 수 있다. 티오닌을 갖는 뇌 절편의 세포 염색을 통상적인 방법과 염색 조직 위에 있는 수용체의 가시화에 의해 수행하였다.
[실시예 4]
실험을 수행하여 다람쥐 원숭이 뇌의 문(吻)에서 꼬리 계열 또는 치관측 절편 상으로 T4항원의 불포를 측정하였다. 이들 실험은 세포 구조학적으로 중요한 뇌간(腦幹) 영역(예, 흑질(黑質))에 결합하는 T4모노클로날 항체의 검출 농도가 있으나, 피질이 풍부한 현저한 패턴은 신경축의 모든 농도에서 명백함을 나타내었다. OKT4와 동일한 아강으로부터의 T임파구에 대한 모노클로날 항체인 OKT8은 현저한 패턴을 나타내지 않는다. 일반적으로, 뇌 피질 내의 보다 많은 표재층들은 가장 조밀한 T4항원 농도를 함유하며, 편도 위에 있는 전면 및 주변 가장자리의 피질은 심층 전체에 걸쳐서 특히 수용체가 풍부하다. 해마 형성체는 원숭이, 쥐 및 사람의 뇌에서 가장 조밀한 수용체 농도를 갖는다. 사진 유제 중에 담근 다람쥐 원숭이 절편의 암시야 현미경법은 가장 조밀한 수용체 표지화 밴드가 치상회(dentate gyrus) 및 적절한 해마(극수소의 뉴런을 함유함)의 분자층 내에 위치함을 나타내었다. 따라서, 수용체는 신경망(수상돌기 및 축색의 뉴런 연장부)에 적절히 분포된 것으로 보이거나 또는 염색되지 않은 대신경교세포의 특이적인 부분 집합에 극소화될 수 있다.
화학적 신경 해부학의 특이성의 증거 및 T4와 비루스 외막 인식분자가 식별될 수 없음을 나타내는 결과들이 측정되었다. OKT4 또는125I-gp120을 가시화에 사용했든지 또는 사용하지 않았든지 간에 쥐 뇌의 과상 절편은 매우 유사한 피질/해마가 풍부한 패턴의 수용체 분포를 나타내었다. 또한, 이 패턴은 배양이 미표지화 gp120(1μM), OKT4A(10㎍/ml) 또는 OKT4A(10㎍/ml)의 존재 하에 일어나는 경우에 명백하지 않았다. OKT8 및 OKT11을 포함하여 기타 인체 T세포 표면 항원에 대한 다른 종류의 마우스 Mab는 제 2 차 항체만을 갖는 재생검출 가능한 항원/수용체가 없기 때문에125I-염소 항 바우스 IgG 제 2 차 항체로 가시화한 경우에 쥐의 뇌 상에서 검출 가능한 패턴을 얻지 못하였다.

Claims (17)

  1. 하기 식(Ⅰ)의 펩티드 또는 아미노 말단 및 카르복시말단 중의 어느 하나 또는 모두에 부가의 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 하기 식(Ⅱ)의 펩티드 또는 아미노 말단 잔기로서 대응하는 D-아미노산을 갖거나 또는 카르복시 말단 잔기에 대응하는 아미드 유도체를 갖거나 또는 아미노 말단 및 카르복시 말단중의 어느 하나 또는 모두에 부가로 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염.
    Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb(Ⅰ)
    R1-R2-R3-R4-R5(Ⅱ)
    상기 식들에서, Ra는 아미노 말단 잔기 Ala- 또는 D-Ala이고, Rb는 카르복시 말단 잔기 -Thr 또는 -Thr 아미드이고, R1은 아미노 말단 잔기 Thr-, Ser-, Asn-, Leu, Ile-, Arg- 또는 Glu-이고, R2는 Thr, Ser 또는 Asp이고, R3는 Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys 또는 Trp이고, R4는 Tyr이며, R5는 카르복시 말단 아미노기이다.
  2. 하기 식(Ⅰ)의 펩티드 또는 아미노 말단 및 카르복시말단 중의 어느 하나 또는 모두에 부가의 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 하기 식(Ⅱ)의 펩티드 또는 아미노 말단 잔기로서 대응하는 D-아미노산을 갖거나 또는 카르복시 말단 잔기에 대응하는 아미드 유도체를 갖거나 또는 아미노 말단 및 카르복시 말단중의 어느 하나 또는 모두에 부가로 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염.
    Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb(Ⅰ)
    R1-R2-R3-R4-R5(Ⅱ)
    상기 식들에서, Ra는 아미노 말단 잔기 Ala- 또는 D-Ala이고, Rb는 카르복시 말단 잔기 -Thr 또는 -Thr 아미드이고, R1은 아미노 말단 잔기 Thr-, Ser-, 또는 Asn-이고, R2는 Thr, Ser 또는 Asp이고, R3는 Thr, Ser, Asn, 또는 Arg이고, R4는 Tyr이며, R5는 카르복시 말단 잔기 -Thr, -Arg 또는 -Gly이다.
  3. 하기 식(Ⅰ)의 펩티드 또는 아미노 말단 및 카르복시말단 중의 어느 하나 또는 모두에 부가의 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 하기 식(Ⅱ)의 펩티드 또는 그의 유도체.
    Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb(Ⅰ)
    R1-R2-R3-R4(Ⅱ)
    상기 식들에서, Ra는 아미노 말단 잔기 Ala- 또는 D-Ala이고, Rb는 카르복시 말단 잔기 -Thr 또는 -Thr 아미드이고, R1은 아미노 말단 잔기 Thr-, Ser-, Asn-, Glu-, Arg-, Ile- 또는 Leu-이고, R2는 Thr, Ser 또는 Asp이고, R3는 Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys 또는 Trp이고, R4는 카르복시 말단 -Tyr이다.
  4. 제 1 항에 있어서, 하기 식의 펩티드.
    X-R1-R2-R3-R4-R5-X
    상기 식에서, X는 시스테인이다.
  5. ala-ser-thr-thr-thr-asn-tyr-thr, thr-thr-asn-tyr-thr, ser-ser-thr-tyr-arg, asn-thr-ser-tyr-thr, thr-thr-ser-tyr-thr, ser-ser-thr-tyr-arg, asn-thr-ser-tyr-gly, ser-thr-asn-tyr-arg, ser-ser-thr-tyr-arg, ser-ser-arg-tyr-arg, ser-ser-thr-tyr-arg, thr-thr-ser-tyr-ser 및 cys-thr-thr-asn-tyr-thr-cys중에서 선택된 펩티드.
  6. 제약 담체 중에 유효 성분으로서 제 1 항의 펩티드를 1개 이상 함유하는, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  7. 제약 담체 중에 유효 성분으로서 제 2 항의 펩티드를 1개 이상 함유하는, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  8. 제약 담체 중에 유효 성분으로서 제 3 항의 펩티드를 1개 이상 함유하는, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  9. 제약 담체 중에 유효 성분으로서 제 4 항의 펩티드를 1개 이상 함유하는, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  10. 제약 담체 중에 유효 성분으로서 제 5 항의 펩티드를 1개 이상 함유하는, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  11. 단백질에 결합된 제 1 항의 펩티드로 이루어진, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 단백질이 인체 혈청 알부민인 조성물.
  13. 다공성 표면 또는 고상 기질에 결합된 제 1 항의 항원 펩티드를 함유하는, T4수용체에 결합하는 항원에 대한 검출용 시험 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 항원 펩티드가 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰(well)에 결합되는 키트.
  15. 유효 성분으로서 제 1 항의 펩티드를 2개 이상 함유하는, 세포에 대한 비루스의 결합을 방지하기 위한 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서 일반식(Ⅱ)중의 R5가 카르복시 말단 아미노기인 펩티드, 또는 아미노 말단 잔기로서 대응하는 D-아미노산을 가지며 카르복시 말단 잔기에서 대응하는 아미드 유도체를 가지며, 아미노 말단 및 카르복시 말단 중의 어느 하나 또는 모두에 부가로 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염.
  17. 제 2 항에 있어서 일반식(Ⅱ)중의 R5가 카르복시 말단 잔기 -Thr, -Arg 또는 -Gly인 펩티드, 또는 아미노 말단 잔기로서 대응하는 D-아미노산을 가지고, 카르복시 말단 잔기에서 대응하는 아미드 유도체를 가지며, 아미노 말단 및 카르복시 말단 중의 어느 하나 또는 모두에 부가로 Cys-잔기를 갖는 그의 유도체, 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염.
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