FI94352C - Menetelmä peptidien valmistamiseksi, jotka estävät sitoutumista T-4-reseptoreihin ja toimivat immunogeeneinä - Google Patents

Description

94352

Menetelmä peptidien valmistamiseksi, jotka estävät sitoutumista T-4-reseptoreihin ja toimivat immunogeeneinä

Keksinnön lyhyt kuvaus 5 Tämä keksintö liittyy synteettisesti tuotettuihin lyhyisiin peptidijaksoihin, jotka estävät HTLV-III/LAV:n (mitä seuraavassa kutsutaan HIV:ksi) sitoutumista ihmisen soluihin tekemällä toimintakyvyttömäksi solun pinnan re-septorikohtia ja siten ehkäisten viruksen tartuntakyvyn 10 ihmisen T-soluja kohtaan. Samalla kun nämä peptidit ehkäisevät tartuntakykyä, ne myös aiheuttavat HIV-viruksen vaippaproteiiniin kohdistuvien vasta-aineiden tuotannon. Tästä johtuen näillä peptideillä on käyttöä rokotteina estämään hankitun immuunikato-oireyhtymän (AIDS) kehitty-15 mistä.

Keksinnön tausta

Useat tutkijat ovat raportoineet AIDS (HIV)-viruksen täydellisen nukleiinihappojärjestyksen. (Katso Lee Ratner ja muut, Nature 313 s. 277, tammikuu 1985; Muesing 20 ja muut, Nature 313, s. 450, helmikuu 1985; ja Wain-Habson ja muut Cell 40, sivut 9-17, tammikuu 1985. ) Vaippagee-niä on erityisesti yhdistetty antigeenisyyteen ja tartu-tuntakykyyn. Vaipan alueen tiedetään myös sisältävän alueita, jotka ovat hyvin vaihtelevia. HIV-viruksen vaipan 25 glykoproteiinin on osoitettu liittyvän kovalenttisella si doksella ihmisen, rotan ja apinan aivojen kalvoihin ja immuunijärjestelmän soluihin.

Sen ymmärtäminen, että virukset voivat osoittaa valikoivuutta soluja ja kudoksia kohtaan kiinnittymällä so-30 lukalvon pinnan reseptorien erittäin spesifisiin aluei siin, on rohkaissut tutkijoita etsimään aineita, jotka * voisivat sitoutua solukalvojen virusreseptorikohtiin ja näin ehkäistä tietyn viruksen sitoutuminen näihin soluihin. Aikaisemmin on osoitettu (Epstein ja muut Nature 318, 35 sivut 663 - 667), että vaccinia-viruksen erityisten resep- 2 ο λ τ ς ο s ^ O L· torien välittämä tartuntakyky voidaan osoittaa tulevan tehottomaksi synteettisten peptidien avulla.

HIV-viruksen on osoitettu sitoutuvan pintamolekyy-liin, joka tunnetaan CD4- tai T4-alueena, mikä esiintyy 5 monissa eri HIV-tartunnalle alttiissa soluissa, mukaanlukien T-lymfosyytit ja makrofagit. (Katso Shaw ja muut [Science 226, sivut 1165 - 1171], missä on tarkasteltu HTLV-III:n valikoivuutta).

Immunopuutoksesta aiheutuvien oireiden lisäksi 10 AIDS-potilaat osoittavat hermopsykologisia vaurioita. Keskushermostolla ja immuunijärjestelmällä on suuri määrä yhteisiä spesifisiä solupinnan tunnistusmolekyylejä, jotka toimivat hermopeptidien välittämän solujen välisen yhteydenpidon reseptoreina. Hermopeptidit ja niiden reseptorit 15 ovat osoittautuneet huomattavan pysyviksi kehityksen kuluessa ja ovat säilyneet lähes muuttumattomassa muodossa yksisoluisissa eliöissä sekä korkeammissa eläimissä. Lisäksi keskushermostossa ja immuunijärjestelmässä havaitaan yhteiset DC4 (T4) solupinnan tunnistusmolekyylit, jotka 20 toimivat HIV:n vaipan glykoproteiinin (gp 120) reseptoreina. Koska samat suuressa määrin säilyneet hermopeptideistä koostuvat tietoa kuljettavat aineet yhdistävät immuuni- ja aivotoiminnan reseptoreilla, jotka ovat huomattavassa määrin samankaltaisia HIV:n reseptoreiden kanssa, on väitet-25 ty, että se hyvin samanlainen aminohappojärjestys, joka HIV:n glykoproteiini 120:11a on erään lyhyen peptidin kanssa, joka tunnistettiin aiemmin muussa yhteydessä Epstein-Barr -viruksen vaippa-alueelta, saattaa merkitä sellaisen ydinpeptidin olemassaoloa, joka on oleellinen virusresep-30 toriin sitoutumiselle. Esitettiin väittämät, että tällaista peptidiä voitaisiin hyödyntää estämään HIV:a tartutta-’ masta soluja siten, että peptidi liittyy reseptorisoluihin ja on esteenä HIV gp 120 liittymiselle, että tällaiset reseptorikohtiin sitoutuvat peptidit aiheuttaisivat pepti-35 dijaksoja kohtaan suunnattujen vasta-aineiden tuotannon, 94552 3 ja että näitä peptidejä voitaisiin käyttää tarjoamaan immunologinen perusta AIDS:n torjumiseksi.

Tarkoitus Tämän keksinnön kohteena oli valmistaa peptidejä, 5 jotka voisivat parantaa AIDS:n estämällä HIV:n (AIDS viruksen) sitoutumisen reseptorikohtiin aivojen kalvoihin ja immuunijärjestelmän soluihin.

Tämän keksinnön kohteena oli myös valmistaa peptidejä käytettäväksi rokotteina sellaisten vasta-aineiden 10 synnyttämiseksi, jotka suojaisivat HIV:lie (AIDS-viruksel-le) mahdollisesti altistuvia henkilöitä AIDS:n kehittymistä vastaan.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Tunnistettiin oktapeptidi HIV:n vaipan glykoprote-15 Unissa (gp 120) tietokoneavusteista analyysia käyttäen. Tämän peptidin, joka nimettiin "peptidi T":ksi korkean treoniinisisältönsä perusteella, on osoitettu estävän gp 120:n sitoutumisen aivon kalvoihin. Peptidin aminohappo-järjestys on Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr. Myöhempi 20 analyysi paljasti samantyyppisiä pentapeptidejä, joilla on samanlaiset sitoutumisominaisuudet.

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava I: 25 X-R*-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb-X (I) jossa kaavassa

Ra on aminopään pääteryhmä Ala- tai D-Ala-,

Rb on karboksipään pääteryhmä -Thr tai -Thr-amidi, 30 ja X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, * tai peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava II: X-R1-R2-R3-R4-R5-X (II) 35 jossa kaavassa

O A KO

✓ Lt o D L

4 R1 on aminopään pääteryhmä Thr-, Ser-, Asn-,

Leu-, Ile-, Arg- tai Glu-, R2 on Thr, Ser tai Asp, R3 on Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys tai Trp, 5 R4 on Tyr, ja R5 on karboksipään pääteaminohapporyhmä, vastaava D-aminohappo, vastaava amidijohdannainen tai R5 puuttuu, ja X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, edellyttäen kuitenkin, ettei peptidi ole Ser-Thr-10 Asn-Tyr-Thr, tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi .

R5 on mieluimmin karboksipään pääteryhmä -Thr, Arg tai Gly tai näiden johdannainen. Peptidi, joka päättyy 15 R4:ään (tyrosiiniin), säilyttää tässä käsitellyn ryhmän si- toutumisominaisuudet. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut aktiiviset yhdisteet voivat esiintyä peptidien fysiologisesti hyväksyttävinä suoloina.

Tämän ryhmän peptidien on havaittu sitoutuvan T4-20 virusreseptoreihin.

Kaikkein ensisijaisimmat peptidit, sekä ylläkuvattu peptidi T, ovat seuraavanlaisia kaavan (I) mukaisia okta-peptidejä: D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr j a 25 D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-amidi ja seuraavanlaisia kaavan (II) mukaisia pentapeptidejä: Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr 30 ja niiden analogeja, joilla aminopään pääteryhmänä on D-Thr ja/tai karboksipään pääteryhmänä amidijohdannainen.

* Esitettyjä yhdisteitä voi olla edullista muunnella menetelmillä, joiden tiedetään edistävän molekyylien pääsyä aivoveriesteen läpi. Asetylointi on osoittautunut eri-35 tyisen käyttökelpoiseksi peptidien sitoutumisaktiivisuuden li 94552 5 parantajaksi. Amino- ja karboksipäiden kohdat ovat ensisijaisia modifiointikohtia. Tämän keksinnön peptidejä voi myös modifioida avaruusrakenteeltaan rajoitetuiksi pysyvyyden parantamiseksi ja suun kautta tapahtuvan annostelun 5 edistämiseksi.

Jäljempänä käytetään seuraavia lyhenteitä:

Aminohappo Kolmikirjaiminen Yksikirjaiminen _ koodi_ koodi_

10 arginiini arg R

asparagiini asn N

asparagiinihappo asp D

kysteiini cys C

glysiini gly G

15 seriini ser S

treoniini thr T

tyrosiini tyr Y

Ellei muuten ole osoitettu, ovat aminohapot tietenkin 20 luonnollisissa L-stereoisomeerisissa muodoissa.

Kahdentoista pentapeptidin aminohappojärjestysten vertailu on esitetty taulukossa 1. Vaikka historiallisesti aluksi suorittamamme tietokonehaku paljasti peptidi T:n (ARV-eristyksen sisältämä peptidi) olevan asianomainen 25 jakso, uusien virusperäisten amihohappojaksojen tultua saataville kävi selväksi, että asianomainen bioaktiivinen jakso voisi olla lyhempi pentapeptidi, joka nimellisesti koostuu peptidistä T (4-8), tai jakso TTNYT. Vertaamissamme eristyksissä (taulukko 1) huomattavaa homologiaa ha-30 valttiin vain tällä lyhyemmällä alueella. Suurin osa muutoksista on seriinin (S) ja treoniinin (T), kahden toisiaan läheisesti muistuttavan aminohapon, vaihtuminen kes-* kenään. Peptidi T:n asemassa 7 oleva tyrosiini on kaikkien näiden muotojen muuttumattomana säilyvä piirre, mikä viit-35 taa siihen, että se voi olla bioaktiivisuudelle välttämätön. Asemassa 5 esiintyvät korvaustapahtumat käsittävät • 6 94352 T:n, G:n, R:n ja S:n. Asemat 4 ja 6 rajattiin ensin käsittämään (yhtä poikkeusta lukuunottamatta) S:n, T:n ja N:n, jotka kaikki ovat aminohappoja, joilla on varauksettomat polaariset, avaruusrakenteeltaan läheisesti samanlaiset 5 ryhmät. Viiden eri AIDS-virus eristysvalmisteen kesken suoritettu jaksojen yhtäläisen yhdenmukaisuuden määrittäminen paljastaa, että alue, joka sijaitsee peptidi T-jakson vieressä ja johon tämä itse kuuluu, on hyvin muuntele-vaa. Tällainen muuntelevuus voi viitata alakantojen kehit-10 tymiseen sellaisen voimakkaan toiminnan (toimintojen) monimuotoisuuden lisääntymisen välityksellä, joka on alttiina valintatapahtumille, ja joka sijoittuu tälle alueelle. Opiaattipeptidien tavoin nämä peptidi T:n analogit näyttävät esiintyvän monissa muodoissa, muistuttaen met- ja 15 leu-enkefaliineja. Nämä pentapeptidijaksot, jotka esiintyvät näissä useissa eri AIDS-viruseristysvalmisteissa, ovat biologisesti aktiivisia ja kykenevät vuorovaikutukseen CD4 reseptorin - aiemmin laajemmalti tunnettu T-aut-tajasolujen pinta"markkeeri" ominaisuudestaan - vastavai-20 kuttajana.

O Λ l L 0 7

Taulukko 1.

ENV-jakson vertailu useista AIDS viruseristysval-misteista 5

Eristysvalmiste Jakso Viite peptidi T ASTTTNYT Pert, C.B., ja muut PNAS (painossa) 10 1ARV (195-199) TTNYT Willey, R.L. ja muut LAV TTSYT PNAS 83, s.5083, 1986

Z3 SSTYR

NY5 NTSYT

15 B10(HTLV-III) TTSYT Starcich, B.R., ja muut WMJ-1 SSTYR Cell, 45, s. 637, 1986

HAT-3 NTSYG

Peräkkäiset eris-tysvalmisteet STNYR

20 WMJ-1 SSTYR Hahn, B.L. ja muut WMJ-2 SSRYR Science 232 s. 1548, WMJ-3 SSTYR 1986

TTSYS

25 1 Numerot viittaavat aminohappojen suhteellisiin paikkoi hin ARV env -jaksossa (9).

Seitsemästä aminohaposta koostunut peptidi CYS-THR-THR-ASN-TYR-THR-CYS on myös aktiivinen. Kysteiinien lisäys ydinjaksoon ei merkittävästi heikennä aktiivisuutta. Pep-30 tidit syntetoitiin Peninsula Laboratories -yhtiön toimittamana palveluna keksinnön tekijöiden ja valmistajan väli-* sen luottamuksenisuussopimuksen alaisuudessa. Käytettiin

Merrifieldin kiinteän faasin peptidisynteesiä. (Katso US-patentti n:o 35311258, mikä liitetään tähän hakemukseen 35 viittaamalla.) Syntetoidut peptidit ovat ensisijaisessa 8 O A ZlZ O S Lt ^ U L· asemassa. Vaikkakin peptidi T ja tähän osana kuuluva pen-tapeptidi voitaisiin eristää viruksesta, Merrifieldin mukaan syntetoidut peptidit eivät sisällä jäämiä soluista tai viruksista. Tämän johdosta kontaminaatioita kohtaan 5 syntyneitä reaktioita ei tapahdu, kun käytetään syntetoi-tuja peptidejä.

Tässä esitettyjä peptidejä voidaan tuottaa tavanomaisilla peptidisynteesimenetelmillä. Sekä kiinteän että nestemäisen faasin menetelmiä voidaan käyttää. On havait-10 tu Merrifieldin kiinteän faasin olevan erityisen käyttökelpoinen. Tässä menetelmässä peptidi syntetoidaan vaiheittain ketjun karboksipään ollessa kovalenttisesti liitetty liukenemattomaan kantajaan. Synteesin välivaiheiden aikana peptidi pysyy kiinteässä faasissa ja on siten hel-15 posti käsiteltävissä. Kiinteä kantajafaasi on kloromety-loitu styreeni-divinyylibentseeni-kopolymeeri. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Karboksipään pääteaminohapon N-suojatun muodon, 20 esim. t-butoksikarbonyyli (Boc-) -suojatun aminohapon, annetaan reagoida klorometyloidun styreeni-divinyylibent-seeni-kopolymeerihartsin klorometyyliryhmän kanssa, jolloin syntyy hartsin suojattu aminoasyylijohdannainen, missä aminohappo on liittynyt hartsiin bentsyyliesterinä. Tä-25 män suojaus poistetaan ja sen annetaan reagoida seuraavan aminohapon suojatun muodon kanssa, mistä syntyy hartsiin liittynyt suojattu dipeptidi. Aminohappoa käytetään tavallisesti aktivoidussa muodossaan, esim. käyttämällä karbo-di-imidiä tai aktiivista esteriä. Nämä vaiheet toistetaan 30 ja peptidiketju kasvaa ryhmä kerrallaan kondensoitumalla aminopäästään haluttujen N-suojattujen aminohappojen kans-! sa kunnes haluttu peptidi on koottu kantajaan. Peptidi- hartsi käsitellään sitten vedettömällä fluorivetyhapolla, mikä katkaisee koottua peptidiä kantajaan yhdistävän este-35 risidoksen halutun peptidin vapauttamiseksi. Samalla voi- 9 94552 9 daan tavanomaisin menetelmin vapauttaa aminohappojen sivu-ketjujen funktionaaliset ryhmät, jotka on täytynyt suojata synteesivaiheiden ajaksi. Amidiryhmän karboksi-päässään sisältävän peptidin synteesi voidaan suorittaa tavanomai-5 sesti 4-metyylibentshydrylamiinihartsia käyttäen.

Valmistettavien yhdisteiden havaittiin tekevän solujen reseptorikohtia toimintakyvyttömiksi ja ehkäisevän HIV-viruksen tartuntakykyä soluja kohtaan apinan, rotan ja ihmisen aivojen kalvoissa ja immuunijärjestelmän soluissa.

10 On kehitetty farmaseuttinen valmiste, joka koostuu keksinnön peptidiyhdisteestä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai täyteaineen kanssa, joka soveltuu ihmis- tai eläinlääketieteelliseen käyttöön. Tällaiset valmisteet voidaan asettaa käytettäväksi tavanomaisesti 15 sekoitettuna yhteen tai useampaan fysiologisesti hyväksyt tävään kantajaan tai täyteaineeseen. Valmisteet voivat vaihtoehtoisesti sisältää lisäksi yhtä tai useampaa muuta terapeuttista ainetta, joka voi haluttaessa olla muu viruksia kohtaan vaikuttava aine.

20 Keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit voidaan siten muokata käyttökokoonpanonsa puolesta suun kautta, suuontelon kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti, paikallisesti tai peräsuolen kautta tapahtuvaa annostelua varten.

. 25 Farmaseuttiset aineet voivat myös sisältää muita aktiivisia ainesosia, kuten antimikrobiaalisia aineita tai säilöntäaineita.

Valmisteet voivat sisältää 0,001 - 99 % aktiivista ainesta.

30 Ruiskuttamalla tai infuusion kautta tapahtuvaa annostelua varten aikuisen, ruumiinpainoltaan noin 70-ki-* loisen ihmisen päivittäisannos vaihtelee noin 0,2 - 10 mg:aan, mieluummin 0,5-5 mg:aan, joka voidaan antaa esimerkiksi yhdestä neljään annoksena riippuen annostustiestä 35 ja potilaan kunnosta.

10 94352

Esitettiin väittämä, että affiniteettivakiot ovat samanlaisia kuin morfiineilla. Tämän affiniteetin perusteella ehdotettiin päiväannokseksi 0,33 - 0,0003 mg/kg. Tämä on osoittautunut tehokkaaksi. Veressä saavutettavaksi 5 pitoisuudeksi ehdotetaan 10'6 - 10'11 molaarista veressä olevaa pitoisuutta. Apinoilla 3 mg/kg päivässä saavutetaan seerumissa olevaksi pitoisuudeksi 150 x 10'9 M. Tämä pitoisuus on 15 kertaa suurempi kuin mikä on tarpeen 10‘8 M pitoisuuden saavuttamiseksi. Kädellisillä tarvitaan yleensä 10 ihmisillä käytettyä annosta 10 kertaa suurempi annos.

Esitettiin edelleen rokotevalmiste, joka sisältää tämän keksinnön mukaisesti valmistetun peptidin AIDS-vi-rusinfektiota kohtaan saatavan suojan aikaansaamiseen. Rokote tulee sisältämään immunogeenisesti tehokkaan määrän 15 peptidiä, esim. 1 μg - 20 mg/kg saajan painoa, liitettynä vaihtoehtoisesti valkuaisaineeseen, kuten ihmisen seerumin albumiiniin sopivassa kantaja-aineessa, esim. steriilissä vedessä, saliinissa tai puskuroidussa saliinissa. Voidaan käyttää tehosteaineita kuten alumiinihydroksidigeeliä. 20 Annosteluna voi olla ruiskeen anto, esim. lihakseen, vatsaonteloon, ihon alle tai suoneen. Annostelu voi tapahtua kerran tai useita kertoja, esim. 1-4 viikon välein.

Peptidiin voidaan myös lisätä antigeenisyyden edistämiseksi ravusta peräisin olevia antigeenisiä jaksoja, 25 tai muiden selkärangattomien valkuaisaineita.

Kokeelliset menetelmät 1a koetulokset Gp 120:n leimaus radioaktiivisella merkkiaineella, kalvojen valmistus aivoista, gp 120:n sitoutuminen ja ristiinsitominen reseptoriin, ja T4-antigeenin 30 immunosaostus HIV:n HTLV-IIIb kantaa lisättiin H9 soluissa ja gp • 120 eristettiin immuuniaffiniteettikromatografiaa ja pre- paratiivista NaDodS04/PAGE:a käyttämällä. Puhdistettu gp 120 leimattiin 125I:lla kloramiini-T-menetelmällä.

94552 11

Tuoreet ihmisen, apinan ja rotan pikkuaivot homogenoitiin nopeasti (Polytron, Brinkmann Instruments) 100 tilavuudessa jääkylmää Hepes (pH 7,4)-puskuria. Sentrifugoi-malla (15 000 x g) kerätyt kalvot pestiin alkuperäisen 5 puskuriliuoksen tilavuudessa ja käytettiin tuoreeltaan tai varastoitiin -70 °C:ssa. Aivojen kalvot ja pitkälle puhdistetut T-solut (viite 16; lahjoitus Larry Wahl'ilta) esi-inkuboitiin ennen käyttöä 15 - 30 min fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). 20 mg:n erä (märkäpaino 10 alussa) aivoista peräisin olevia kalvoja (noin 100 pg proteiinia) inkuboitiin 28000 cpm:n erän kanssa 125I-gp 120:a 1 tunnin ajan 37 °C:ssa 200 pl:ssa (lopullinen tilavuus) 50 mM Hepes -puskuriliuosta, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia ja peptidaasi-inhibiittoreita basitrasii-15 ni (0,005 %), aprotiniini (0,005 %), leupeptiini (0,001 %) ja kymostatiini (0,001 %). Inkubointiseokset suodatettiin nopeasti tyhjiön avulla ja radioaktiivisuus laskettiin reseptoriin kiinnittyneen materiaalin määrän määrittämiseksi .

20 Immuunisaostus

Immuunisaostumat valmistettiin inkuboimalla (yön yli 4 °C:ssa) 0,5 % Triton-X-100/PBS -liuoksella liukoiseksi tehtyjä, laktoperoksidaasi/glukoosioksidaasi/125I jodat-tuja aivojen kalvoja tai ehjiä T-soluja ilmoitettujen mo-. . 25 noklonaalisten vasta-aineiden kanssa, joita käytettiin 10 pg reaktiota kohti. Kiinteän faasin immunoadsorbenttia (Immunobeads, Bio-Rad) käytettiin immuuni-kompleksien saostamiseen ennen niiden erottelua NaDodS04/PAGE: 11a. Verrokki-inkuboinnit eivät sisältäneet primäärisiä monoklo-30 naalisia vasta-aineita tai sisälsivät alaryhmän verrokkina olevan monoklonaalisen vasta-aineen (0KT8).

«

Kemiallinen hermoanatomia ja tietokoneavusteinen tiheysmittaus 25 pm kryostaattileikkeet tuoreena pakastetuista 35 ihmisen, apinan ja rotan aivoista kiinnitettiin sulatta- 9 4 · b 12 s maila ja kuivattiin gelatiinilla päällystetyille objekti-laseille, ja reseptorit saatettiin havaittaviksi viitteessä (18) kuvatulla tavalla. Inkuboinnit ilman T4, T4A, T8 ja Tll vastaan suunnattuja vasta-aineita (10 pg/ml) tai 5 näiden kanssa suoritettiin yön yli 0 °C:ssa RPMI-liuokses-sa, sidottiin ristiin antigeeneihinsä ja saatettiin havaittaviksi 125I:lla leimatulla vuohen hiirtä vastaan suunnatulla vasta-aineella. Objektilasille kiinnitettyjen ku-dosleikkeiden inkuboinnit antigeenireseptorin leimaamisek-10 si 125I-gp 120:11a suoritettiin 5 ml:n objektilasisäiliöis-sä leimaamattoman gp 120:n kanssa (1 μΜ) tai ilman tätä tai 0KT4A monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (10 pg/ml) (Ortho Diagnostics) tai ilman tätä.

T-lvmfosvvttien alaryhmien erottaminen 15 T-solujen alaryhmät saatiin käsittelemällä Percoll- tiheysgradientissa puhdistettuja ääreisverenkierron T-so-luja spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla (T4 tai T8), joiden pitoisuus oli 10 pg/ml. Käsiteltyjä soluja seisotettiin 30 min 4 °C:ssa muovisella petrimaljalla, jon-20 ka pintaan oli kiinnitetty vuohen [F(ab')2] hiirtä vastaan kohdistettua immunoglobuliinia (Sero Lab, Eastbury, MA). Tämän jälkeen poistettiin vapaaksi jääneet solut, ja ne pestiin ja niiden reaktiivisuus tutkittiin virtaussytomet-rilla. Erotetuissa T4 ja T8 solupopulaatioissa on muita 25 T-solujen alaryhmiä < 5 % kontaminaatiotasolla. Solut vil-jeltiin sitten fytohemagglutiniinin (1 pg/ml) läsnäollessa ja altistettiin HIV:lie kuten jäljempänä kuvataan. Tartunnan saaneiden solujen ilmiasun luonne selvitettiin, kun solujen toksisuusmääritykset tehtiin.

30 Virustartunta

Tartuntaan käytetty HTLV-virus eristettiin inter-leukiinia 2 (IL-2) vaativasta viljellystä T-solulinjasta, joka oli eristetty tuoreesta AIDS-potilaan materiaalista ja siirrostettu HuT 78:aan, permissiiviseen solulinjaan, 35 joka on riippumaton IL-2:sta.

• 13 g a * ςο s Lr yj D £.

Piirrosten kuvaus

Kuva IA osoittaa 125I-gp 120: n ristiinsitoutumisen aivon kalvoihin ja T-soluihin. (a) yksinomaan 125I-gp 120; (b) apina; (c) rotta; (d) ihmisen aivot; ja (e) ihmisen 5 T-solut.

Kuvat IB ja 1C osoittavat 125I-leimattujen apinan aivojen kalvojen ja vastaavasti ihmisen T-solujen immuuni-saostuksen; (f,i) verrokki ilman primääristä vasta-ainetta; (g,j) monoklonaalinen vasta-aine OKT4; (h,k) 0KT8 mo-10 noklonaalinen vasta-aine.

Kuvassa 2A nähdään tuoreisiin rotan pikkuaivojen kalvoihin kohdistuneen spesifisen 125I-gp 120:n sitoutumisen syrjäytyminen. Kukin määritys tehtiin kolmesti; tulokset yhdestä kolme kertaa samanlaiset tulokset antaneesta 15 kokeesta on esitetty. Sellaisen spesifisen sitoutumisen aste, joka oli syrjäytettävissä 10 pg/ml 0KT4:a ja 4A:a, vaihteli 27 ja 85 % välillä kokonaissitoutumisesta, joka esitetyssä kokeessa oli 2201 ± 74 cpm.

Kuva 2B osoittaa, että peptidi T ja sen synteetti-20 set analogit tekevät viruksen tartuntakyvyn tehottomaksi.

Kukin määritys tehtiin kahdella rinnakkaiskokeella. Tulokset edustavat yhtä koetta, joka toistettiin kolmasti samanlaisin tuloksin.

Esimerkki 1 25 125I-gp 120:n sitoutuessa spesifisesti pääkalloapa- nan, rotan tai ihmisen aivojen kalvoihin saadaan yksi ra-dioaktiivisesti leimautunut, noin 180 Kd:n ristiinsitoutu-mistuote, jota ei voi erottaa vastaavasta ihmisen T-soluihin sitoutuneesta tuotteesta (kuva IA). Tämä tulos osoit-30 taa, että gp 120 voidaan kytkeä noin 60 Kd:n proteiiniin; reagoimaton 125I-gp 120 kulkeutuu ilman kalvoja ajetun verrokin vieressä (kanava a).

Radioaktiivisella jodilla leimattujen ihmisen aivojen kalvojen immuunisaostus 0KT4:lla ja 0KT8:lla (10 pg/ 35 ml)(kuva IB) osoittaa, että aivojen kalvot sisältävät T4- « 14 94252 antigeenin, joka on kooltaan noin 60 Kd, eikä sitä voi erottaa ihmisen T-lymfosyyteistä tunnistetusta vastaavasta antigeenistä (kuva 1C); tätä vastoin 0KT8:lla suoritetussa immunosaostuksessa saostuu T-lymfosyyteistä (kuva 5 1C) pienen (noin 30 Kd) molekyylipainon omaava proteiini, jota ei esiinny aivojen kalvoissa (kuva IB), mikä viittaa siihen, että aivojen T4 ei ole peräisin näihin paikallistuvista lymfosyyteistä. Samanlaisia tuloksia (tuloksia ei esitetty) on saatu apinan ja rotan pikkuaivojen kalvoja 10 käyttämällä. Nämä tulokset osoittavat, että T4-antigeeni toimii virusreseptorina ja se on hyvin säilynyt 60 Kd:n molekyyli, joka on yhteinen immuunijärjestelmälle ja keskushermostolle .

Sen seikan toteaminen, että Epstein-Barr ja HTLV-15 III/LAV omaavat lähes identtiset oktapeptidijaksot, johti "peptidi T"n synteesiin ja tutkimiseen. Kuva 2 osoittaa, että 125I-gp 120: n sitoutuminen vastavalmistettuihin rotan aivojen kalvoihin tapahtuu suurella affiniteetilla (0,1 nM:n alue) ja että tämä on kyllästyvää. Spesifisyyden 20 (kuva 2B) osoittaa estyminen 0KT4:lla ja 0KT4A:lla, mutta ei 0KT3:lla (0,1 pg/ml). Peptidi T ja kaksi sen synteettistä analogia estivät merkittävästi 125I-gp 120:n sitoutumisen 0,1 nM:n alueella (kuva 2C) (mutta tähän yhteyteen kuulumaton oktapeptidi aine P (1-8) ei tätä tehnyt). Ase-25 maan 8 tehty D-threoniiniamidikorvaus aiheutti ainakin 100-kertaisen reseptoriin kohdistuvan sitoutumisaktiivi-suuden katoamisen. Klassinen (L-ala):n korvaus (D-ala):lla johti pysyvästi vaikutuskykyisempään, nähtävästi enemmän peptidaasia kohtaan resistenttiin analogiin kuin peptidi 30 T; C-pään päätetreoniini tuottaa pysyvästi jonkinverran lisääntyneen vaikutuskyvyn (kuva 3).

·* Kun testattiin synteettisten peptidien kykyä eh käistä virusten tartunta ihmisen T-soluihin, kokeiden suorittajat eivät tienneet sitoutumiskokeiden tuloksia. Ta-35 solia 10"7 kolme sitoutumismäärityksessä aktiivista pep- li 15 94 «'s? / » w tidiä vähentävät havaittavaa käänteistranskriptaasitasoa lähes 9-kertaisesti. Vähemmän aktiivinen sitoutumisen syr-jäyttäjä (D-thre) -peptidi T osoittautui niinikään virustartunnan estoltaan suuresti heikentyneeksi, ja merkittä-5 vän eston aikaansaamiseksi sitä tarvittiin 100 kertaa suurempi pitoisuus. Näin ollen ei ainoastaan neljän peptidin luokkien välinen järjestys ((D-( Ala ^-peptidi T-amidi > (D-(Ala ^-peptidi T > peptidi T > (D-(Thr)8-peptidi T-amidi), vaan myös näiden reseptoriin sitoutumisen ja virus-10 tartunnan esto korreloi läheisesti toisiaan (kuva 3).

Esimerkki 2

Noin 60 Kd:n proteiini, joka on samanlainen ellei identtinen ihmisen T-solujen T4-antigeenin kanssa, esiintyi ilmeisen säilyneessä molekulaarisessa muodossa ihmisen 15 aivoista valmistetuissa kalvoissa; lisäksi radioaktiivi-sesti merkitty HIV:n vaipan glykoproteiini (125I-gp 120) voidaan ristiinsitoa kovalenttisesti kolmen nisäkkään aivojen molekyyliin, jota kokonsa ja immuuni-saostusominai-suuksiensa puolesta ei voida erottaa T4-antigeenista.

20 Käyttämällä menetelmää, jolla aivojen leikkeistä havaitaan vasta-ainetta sitoneet reseptorit, esitettiin aivojen T4:n hermoanatornisen jakautuman muodostama hahmo, joka on tihein kuorikerroksen hermosyiden pääteverkossa ja joka on järjestynyt analogisesti kaikilla kolmella nisäkkäällä. 25 Myös radioaktiivisesti leimattu HIV-viruksen vaipan glyko-proteiinin sitoutuminen tuotti vastaavanlaisen hahmon peräkkäisissä leikkeissä, mikä viittaa siihen, että T4 oli HIV -reseptori.

Esimerkki 3 30 Kemiallinen hermoanatornia, tietokoneavusteinen ti- heysmittaus

Tuoreena jäädytettyjen ihmisen, apinan ja rotan aivojen 25 mikronin kryostaattileikkeet kiinnitettiin sulattamalla ja kuivattiin geelipäällysteisille objektila-35 seille ja reseptorit saatettiin havaittaviksi julkaisussa * 16 9 45b 2

Herkenham ja Pert, J. Neurosci., 2, sivut 1129 - 1149 (1982). Inkuboinnit T4:a, T4A:a, T8:a ja Tiira kohtaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa (10 pg/ml) ja ilman näitä suoritettiin yön yli 0 °C:ssa RPMI:ssa, ristiinsidot-5 tiin antigeeneihinsa ja saatettiin havaittaviksi 125I-vuohen hiirtä vastaan suunnatulla vasta-aineella. 125I-gp 120:11a tapahtuvaa antigeenin/reseptorin leimaamista varten suoritetut objektilasille kiinnitettyjen kudosleikkeiden inkuboinnit suoritettiin 5 ml:n objektilasisäiliöissä käyttäen 10 (10"6 leimaamatonta gp 120:a tai 0KT4A (10 pg/ml) monoklo- naalista vasta-ainetta tai jättäen nämä pois, kuten yllä on kuvattu kalvojen käytön yhteydessä.

Suoritettiin tietokoneavusteinen autoradiografia-filmin muunnos kvantitatiivisiksi värikuviksi. Apinan ai-15 vojen leikkeiden kanssa rinnan suoritettu valotus tunnetun radioaktiivisuuslisäyksen sisältäviä standardeja käyttämällä antoi tulokseksi lineaarisen kuvaajan (4 = > 0,99) log 0D:n ja cpm:n suhteen, josta radioaktiivisuuden suhteellinen pitoisuus voidaan mielekkäästi ekstrapoloida. 20 Aivoleikkeiden solujen värjäys tioniinilla suoritettiin klassisilla menetelmillä ja reseptorit saatettiin havaittaviksi värjätyssä kudoksessa.

Esimerkki 4

On suoritettu kokeita T4-antigeenin jakautuman mää-25 rittämiseksi pääkalloapinan aivojen etuosasta takaosaan ulottuvassa sarjassa tai pitkin vaakatasoa tehdyissä leikkeissä. Nämä kokeet osoittavat, että T4 monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumista aivorungon (esim. substantia nigraan) soluarkkitehtuuriin nähden mielekkäille alueille 30 tapahtuu havaittavan suurissa määrissä, mutta silmiinpistävä kuorikerrokseen rikastuva esiintymishahmo näkyy her-mostoakselin jokaisella tasolla. 0KT8, T-lymfosyyttiä kohtaan suunnattu monoklonaalinen vasta-aine samasta alaryhmästä kuin OKT4, ei muodosta minkäänlaista tunnistettavaa 35 hahmoa. Aivojen kuorikerroksen kaikkein ylimmät pintaker- * 94552 17 rokset sisältävät yleensä T4-antigeenin tiheimmän pitoisuuden; isojen aivojen kuorikerroksen otsalohko ja limbis-tä järjestelmää ympäröivä kuorikerroksen osa mantelitumak-keen yläpuolella sisältävät erityisen paljon reseptoreita, 5 jotka paikallistuvat kaikkialle sisäisiin kerroksiin. Reseptorien tihein pitoisuus kohdistuu aivotursoalueelle apinan, rotan ja ihmisen aivoissa. Filminkehitysliuokseen kastettujen pääkalloapinan leikkeiden pimeäkenttämikrosko-pointi paljasti, että reseptorien tiheimmän leimautumisen 10 vyöhyke sijaitsee hammaspoimun molekulaarisessa kerroksessa ja itse aivotursossa (joka sisältää hyvin vähän neuroneja). Reseptorit siis näyttävät sijoittuvan juuri sopivasti kattamaan hermosyiden pääteverkkoaluetta (hermopäätteiden ja viejähaarakkeiden hermojatkoksia) tai sijoittu-15 vat johonkin erityiseen värjäytymättömään tähtitukikudok-sen solujen alaryhmään.

On tehty määrityksiä, joista ilmenee näyttöä kemiallisen hermoanatomian spesifisyydelle ja joista saadut tulokset osoittavat, että T4 ja viruksen vaipan proteiinin 20 tunnistava molekyyli eivät poikkea toisistaan. Rotan aivojen vaakatason suuntaisissa leikkeissä paljastui hahmoltaan hyvin samanlainen isojen aivojen kuorikerrokseen/ai-votursoon keskittyvä reseptorijakautuma riippumatta siitä, käytettiinkö havaittavaksi saattamiseen 0KT4 tai 125I-gp 25 120. Lisäksi tällaista hahmoa ei havaittu, kun inkubointi ‘ 1 tapahtui leimaamattoman gp 120:n (1 μΜ), 0KT4A:n (10 μg/ ml) tai 0KT4:n (10 pg/ml). Mitään tunnistettavaa hahmoa ei saatu rotan aivoista muilla toisia ihmisen T-solujen antigeenejä kohtaan suunnatuilla hiiren monoklonaalisilla vas-30 ta-aineilla, 0KT8 ja 0KT11 mukaanlukien, kun havaittavaksi saattaminen suoritettiin 125I-vuohen anti-hiiri IgG sekundaarisella vasta-aineella, samoin kuin pelkkää sekundaarista vasta-ainetta käyttämällä ei löytynyt toistettavasti havaittavaa antigeeniä/reseptoria.

35

Claims (11)

18 g ,i x l o y *r o L.

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava I: 5 X-Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb-X (I) jossa kaavassa Ra on aminopään pääteryhmä Ala- tai D-Ala-,

10 Rb on karboksipään pääteryhmä -Thr tai -Thr-amidi, ja X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, tai peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava II:

15 X-R1-R2-R3-R4-R5-X (II) jossa kaavassa R1 on aminopään pääteryhmä Thr-, Ser-, Asn-, Leu-, Ile-, Arg- tai Glu-,

20 R2 on Thr, Ser tai Asp, R3 on Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys tai Trp, R4 on Tyr, ja R5 on karboksipään pääteaminohapporyhmä, vastaava D-aminohappo, vastaava amidijohdannainen tai R5 puuttuu, ja 25 X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, · edellyttäen kuitenkin, ettei peptidi ole Ser-Thr- Asn-Tyr-Thr, tai niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 30 a) karboksipään pääteaminohapon N-suojattu muoto kiinnitetään hartsiin ' b) aminoryhmän suojaryhmä poistetaan c) seuraava aminohappo lisätään suojatussa muodossa ja kytketään edelliseen aminohappoon 35 d) vaiheet b) ja c) toistetaan jokaisen lisättävän aminohapon kohdalla ja 19 94352 e) irrotetaan valmis peptidi hartsista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukainen peptidi, jossa

5 R1 on Thr-, Ser- tai Asn-, R3 on Thr, Ser, Asn tai Arg, ja R5 on -Thr, -Arg tai -Gly.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukai- 10 nen peptidi, josta R5 puuttuu.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan Cys-R1-R2-R3-R4-R5-Cys.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr, Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr, Ser-Ser-Thr-Tyr-Arg, Asn-Thr-Ser-Tyr-Thr,

20 Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly, Ser-Thr-Asn-Tyr-Arg, Ser-Ser-Arg-Tyr-Arg, Thr-Thr-Ser-Tyr-Ser tai 25 Cys-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Cys. • · 94552 20