PT84992B - Processo para a preparacao de peptideos pequenos que inibem a ligacaoa receptores t-4 e que actuam como imunogenios - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PEPTIDEOS PEQUENOS QUE INIBEM A LIGAÇÃO A RECEPTORES T-4 E QUE ACTUAM COMO IMUNOGÊNIOS”
onde R representa um residuo amino-terminal Ala- ou D-Ala e R^ representa um residuo carboxi-terminal -Tre ou -Tre-ami. da ou um seu derivado com um residuo Cis- adicional em um ou em ambos os terminais amino e carboxi, ou de peptideos com a fórmula (II):1 2 3 4 5
R -RZ-RJ-R -R onde R·*· é um residuo Tre-, Ser-, Asn-, Leu-, Ile-, Arg- ou Glu- amino-terminal,
R e Tre, Ser ou Asp *
R é Tre, Ser, Asn, Arg, Gin, Lis ou Trp
R^ é Tir e R^ é um grupo amino carboxi-terminal ou um seu derivado com um D-amino ácido correspondente como residuo amino-terminal, e/ou um derivado amida correspondente no residuo car boxi-terminal e/ou adicionamente um residuo Cis- em um ou em ambos terminais amino e carboxi, ou um seu sal fisiológicamente aceitável.
Estes peptideos que se ligam a receptores T4 sao úteis para evitar as infecçoes virais por virus que se ligam aos receptores T4. Pensa-se que estes peptideos actuam como agentes bloqueadores competitivos.
processo de preparaçao consiste, essencialmente, em se proceder a condensações sucessivas de amino ácidos, enquanto a extremidade carboxi da cadeia é covalentemente ligada a um suporte insolúvel, por exemplo,
copolímero clorometilado de estireno-divinilbenzeno, permanecendo o peptídeo na fase sólida para permitir uma melhor manipulaçao.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DO INVENTO
Este invento relaciona-se com sequências peptídicas curtas que inibem a ligaçao de HTLV-III/LAV (aqui a seguir referido como HIV) às células humanas bloqueando os locais receptores na superfície da célula, e evitando desse modo a infecçao virai das células T hu. manas. Os peptídeos, ao mesmo tempo que evitam a infecçao, também induzem a produção de anticorpos contra a proteína do invólucro do virus HIV. Por esse motivo, estes peptídeos também sao utilizados como vacinas para evitar o desenvolvi, mento do Sindroma de Imuno Deficiência Adquirida (SIDA). Os anticorpos monoclonais em relaçao aos peptídeos também podem ser usados como agentes diagnósticos para identificar o vírus HIV. Assim, os peptídeos e os anticorpos em relaçao aos peptidos podem ser utilizados para preparar equipamentos (Kits) de ensaio para a identificação dos portadores de HIV ou de pessoas atingidas por SIDA.
FUNDAMENTOS DO INVENTO
A sequência completa de nucleotídeos do virus da SIDA (HIV) foi referida por vários investi, gadores. (Ver Lee Ratner et al., Nature 313, p. 277, January 1985; Muesing et al., Nature 313, p. 450, February 1985; e Wain-Habson et al.,Cell 40, pp. 9 - 17. January 1985), 0 gene invólucro foi associado particularmente com a antigenji cidade e com a infecciosidade. Contudo, sabe-se que a porção invólucro possui regiões que sao altamente divergentes. A glicoproteina do invólucro do virus HIV revelou a afixaçao covalente às membranas do cérebro de seres humanos, ratos, e macacos e a células do sistema imunitário.
A compreensão de que os virus podem exercer tropismo celular e dos tecidos por ligaçao a locais altamente específicos nos receptores da membrana celular encorajou os investigadores a procurarem agentes que se ligassem aos locais receptores de virus nas membranas celulares evitando desse modo a ligaçao de um virus específico em relação a essas células. Foi préviamente realizada uma demons traçao do bloqueio da infecciosidade por virus vaccinia mediados por receptores específicos por meio de peptidos sintéticos (Epstein et al., Nature 318; 663-667).
Verificou-se que o virus HIV se li. ga a uma molécula da superfície conhecida como a região CD4 ou T4, a qual está presente em várias células susceptíveis à infecçao por HIV, incluindo os linfocitos T e os macrófagos. (Ver Shaw et al., Science 226, pp. 1165-1171 para uma discussão sobre o tropismo de HTLV-III).
Para além dos sintomas resultantes da imuno deficiência, os doentes com SIDA apresentam afecçoes neuropsicológicas. 0 sistema nervoso e central e o sistema imunitário partilham um grande número de moléculas de recoii hecimento específicas da superfície da célula, servindo como receptores para a comunicação intercelular mediana pelos neuropeptídeos. Os neuropeptídeos e os seus receptores apr£ sentam uma profunda estabilidade evolutiva, que é altamente conservada numa forma muito inalterada tanto em organismos unicelulares como em animais superiores. Alem disso, o sistema nervoso central e o sistema imunitário apresentam moljé cuias de reconhecimento à superfície das células DC4 (T4) que servem como receptores para a ligaçao da glicoproteina do invólucro do HIV (gp 120). Visto que as mesmas substân6
cias de informação, neuropeptídeos altamente conservados in. tegram a função imunitária e cerebral através de receptores notávelmente semelhantes aos do HIV, consideramos como postulado que uma sequência de amino ácidos muito semelhante entre a glicoproteina do gp 120 do HIV e um peptideo curto préviamente identificado num outro contexto a partir da região invólucro do virus Epstein Barr pode indicar o peptido central essencial para a ligaçao com o receptor virai. Foi postulado que esse peptido possa ser util para evitar a infecçao de células com HIV por ligaçao com células receptoras e bloqueando a ligaçao de gp 120 de HIV, que a ligaçao desses peptídeos aos locais receptores possa dar lugar a produção de anticorpos dirigidos contra a sequência peptidX ca, e que esses peptídeos possam ser usados para proporcionar bases imunológicas para a prevenção da SIDA.
OBJECTIVOS
Foi objectivo do presente invento proporcionar peptídeos que pudessem actuar para alívio dos sintomas de SIDA evitando a ligaçao do HIV (virus da SIDA) aos locais receptores das células das membranas cerebrais e do sistema imunitário.
Foi também objectivo do presente invento proporcionar peptídeos para utilização como vacinas a serem usadas pára dar origem a anticorpos que protejam contra o desenvolvimento de SIDA em pessoas que possam vir a estar expostas ao HIV (virus da SIDA).
Foi outro objectivo do presente iii
vento proporcionar meios diagnósticos para identificar a presença de anticorpos em relaçao ao HIV ou à proteina do invólucro do HIV.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Foi identificado um octapeptídeo na glicoproteina do invólucro do HIV (gp 120) por meio de análise assistida por computador. Este peptido, chamado peptido T devido ao conteúdo elevado de treonina, revelou inibir a ligaçao de gp 120 às membranas do cerebro. 0 peptji do tem a sequencia Ala-Ser-Tre-Tre-Tre-Asn-Tir-Tre. Uma aná lise posterior indicou uma classe de pentapeptídeos afins possuindo propriedades de ligaçao semelhantes.
De acordo com um primeiro aspecto do presente invento proporciona-se um peptídeo com a fórmula (I):Ra-Ser-Tre-Tre-Tre-Asn-Tir-R^ (I) onde R representa um residuo amino-terminal Ala- ou D-Ala e R^ representa um resíduo carboxi-terminal -Tre ou -Tre amida ou um seu derivado com um residuo Cis- adicional em um ou em ambos os terminais amino e o carbóxi, ou um peptídeo com a fórmula (II):r1-r2-r3-r4-r5 (II)
onde β! é um resíduo amino-terminal Tre-, Ser-, Asn-, Glu-, Arg-, Ile- ou Leu-, .
R e Tre, Ser ou Asp,
R^ é Tre, Ser, Asn, Arg, Gin, Lis ou Tre
R4 é Tir e R e de preferência um residuo carboxi-terminal -Tre, -Arg ou -Gli ou um seu derivado com um D-amino ácido corr esponden. te como resíduo amino-terminal, e/ou um derivado amida correspondente no resíduo carboxi-terminal e/ou adicionalmente um resíduo Cis- em um ou em ambos os terminais amino e carboxi. Embora tenham sido indicados ao amino ácido preferidos em R^ sabe-se que o amino ácido nesta posição pode variar amplamente. Com efeito, é possivel terminar o peptideo com R (Tirosina) como o amino acido carboxi-terminal em que está ausente. Esses peptídeos retêm as propriedades de ligaçao do grupo aqui indicado. A serina e a treonina parecem poder ser trocadas entre si tendo como finalidade proprie^ dades biológicas aqui indicadas. Os compostos activos do in. vento podem existir como sais fisiológicamente aceitáveis de peptidos.
Verificou-se que esta classe de pej) tídeos se liga aos receptores virais T4. Os peptídeos mais preferidos, assim como o peptideo T atrás referido, sao os octapeptídeos que se seguem com a fórmula (I):D-Ala-Ser-Tre-Tre-Tre-Asn-Tir-Tre e D-Ala-Ser-Tre-Tre-Tre-Asn-Tir-Tre-amida e os pentapeptídeos que se seguem com a fórmula (II):Tre-Asp-Asn-Tir-Tre
Tre-Tre-Ser-Tir-Tre
Tre-Tre-Asn-Tir-Tre e os seus análogos com D-Tre como o residuo terminal amino e/ou um derivado amida no terminal carboxi.
Os compostos do invento podem ser modificados benéficamente por métodos conhecidos para facilitar a passagem de moléculas através da barreira sangue-cjé rebro. A acetilaçao provou ser especialmente útil para aumentar a actividade de ligaçao do peptideo. Os locais dos amino e carboxi terminais sao locais particularmente preferidos para modificação.
Os peptídeos deste podem também ser modificados numa conformação constrangida para proporcionar uma estabilidade melhorada e possibilidade de utilização oral.
Sao aqui usadas a seguir as abre viaturas seguintes:10
| Amino Ácido Três Letras Codigo de | Codigo de Uma Letra | |
| arginina | arg | R |
| asparagina | asn | N |
| acido aspartico | asp | D |
| cisteina | cis | C |
| glicina | gli | G |
| serina | ser | S |
| treonina | tre | T |
| tirosina | tir | Y |
Excepto se for indicado diferentemente os amino ácidos sao, evidentemente, apresentados sob a forma de L-estereoisomeros.
Ê apresentada no Quadro 1 uma compa raçao das sequências de amino ácidos de 12 pentapeptidos. Embora historicamente a nossa pesquisa inicial por computador tenha revelado que o peptido T (contido no isolado de ARV) era uma metade relevante, à medida que as sequências virais adicionais se tornaram disponíveis, tornou-se claro que a sequência bioactiva, relevante, podia ser um pentape_2 tídeo mais curto compreendendo, nominalmente, peptido T/ 4-87, ou a sequência TTNYT. Nos isolados que comparámos (Quadro 1) foram distinguidas homologias substanciais apenas nesta região, mais curta. A maior parte das alterações sao as inter-conversoes da serina (S) e treonina (T), dois amino ácidos infimamente relacionados. A tirosina da posição 7 do peptídeo T constitui uma caracteristica invariante de tg das estas construções indicando que pode ser obrigatório pa_ ra que haja bioactividade. As substituições que ocorrem na posição 5 incluem T, G, R ou S. As posiçoes 4 e 6 foram prjl
meiro restringidas (com uma excepçao) a S, T e N, todos os amino ácidos contendo grupos polares, sem carga com proprie. dades estéricas muito semelhantes. Uma avaliaçao da concordância da sequência geral entre 5 vários isolados de vírus da SIDA (9,10) revela que a região à volta e incluindo a se quência do peptídeo T constitui uma área muito variável. E_s sa variabilidade pode indicar especialização através de uma forte diversificação selectiva da(s) funçao(oes) que podem ser definidas neste local. Tal como os peptídeos opiáceos, estes análogos peptido T parecem existir sob múltiplas formas, que fazem lembrar a met e leu encefalina. Estas sequên cias de pentapeptídeos nestes vários isolados de vírus da SIDA sao biologicamente activas e capazes de interactuarem como gonistas do receptor CD4-préviamente conhecido amplamen. te como um marcador1' da superfície das células auxiliares T.
Quadro 1. Comparaçao da Sequência ENV de Múltiplos Isolados de Vírus da SIDA
| Isolado | Sequência | Referência |
| peptido T | ASTTTNYT | Pert, C.B. et al. PNAS (em impressão) |
| ^1^(195-199) | TTNYT | Willey, R.L. et al. |
| LAV | TTSYT | PNAS 83: 5038, 1986 |
| Z3 | SSTYR | |
| NY5 | NTSYT | |
| BIO(HTLV-III) | TTSYT | Starcich, B.R. et al. |
| WMJ-1 | SSTYR | Cell 45:637, 1986 |
Continuação :-
| HAT-3 | NTSYG | |
| Isolados sequênciais | STNYR | |
| WMJ-1 | SSTYR | Hahn, B.L. et al. |
| WMJ-2 | SSRYR | Science 232: 1548, |
| WMJ-3 | SSTYR | 1986 |
| TTSYS |
Os números referem-se a posiçoes relativas dos amino ácidos na sequência env ARV (9).
peptídeo com sete amino ácidos CIS-TRE-TRE-ASN-TIR-TRE-CIS é também activo. A adiçao de cis teinas a um núcleo nao afecta prejudicialmente a actividade.
Os peptídeos eram habitualmente sintetizados pelos laboratórios Península ao abrigo de um acordo confidencial entre os inventores e o produtor. Foi usado o método de Merrifield de síntese peptidica de fase so lida. (Ver Patente dos E.U.A. No. 3.531.258 que é aqui incor. porada como referência). Os peptídeos sintetizados sao especialmente preferidos. Enquanto que o peptido T e o pentapeptídeo que é uma sua porção podem ser isolados a partir do vírus, os peptídeos preparados de acordo com Merrifield estão isentos de restos de vírus e de células. Assim, nao ocorrem reacçoes inconvenientes em relaçao aos contaminantes quando sao usados peptídeos sintetizados.
Os peptídeos do invento podem ser produzidos por métodos convencionais de sintese peptidica.
Podem ser usados os métodos tanto de fase sólida como de fase liquida. Verificamos ser particularmente conveniente o método de fase sólida de Merrifield. Neste processo o peptídeo é sintetizado por passos enquanto que a extremidade carboxi da cadeia é ligada covalentemente ao suporte insolúvel. Durante os passos sintéticos intermediários o peptido permanece na fase sólida podendo assim ser manipulado conveniente, mente. 0 suporte sólido é um copolímero estireno-divinilbenzeno clorometilado.
Uma forma protegida em N do amino ácido carboxi-terminal, por exemplo um amino ácido protegido em t-butoxicarbonilo (Boc-), é feito reagir com o resíduo clorometilo da resina de copolímero de estireno divinilbenzj; no clorometilada para produzir um derivado amino protegido-acilo da resina, em que o amino ácido é ligado à resina sob a forma de um éster benzílico. Este é desprotegido e feito reagir com uma forma protegida do amino ácido requerido a seguir produzindo desse modo um dipeptídeo ligado à resina. 0 amino ácido será geralmente usado sob uma forma activada, por exemplo por utilização de uma carbodiimida ou de um éster activo. Esta sequência é repetida e a cadeia peptídica desenvolve um resíduo em certa altura por condensação na extremidade amino com os amino ácidos protegidos em N requeridos até o peptídeo requerido ter sido unido a superfície da resina. A resina-peptídeo é então tratada com ácido fluorídrico anidro para fazer a clivagem do éster ligando o peptídeo unido à resina, a fim de libertar o peptídeo requerido. Grupos funcionais da cadeia lateral de amino ácidos que devem ser bloqueados durante o processo sintético, usando métodos convencionais, podem também ser simultaneamente removi, dos. A sintese de um peptídeo com um grupo amida no seu terminal carboxi pode ser realizada de um modo convencional, usando uma resina 4-metilbenzidrilamina.
Verificou-se que os compostos do invento bloqueiam com eficácia os locais receptores das celu.
las com HIV (vírus da SIDA) nas membranas do cérebro e nas células do sistema imunitário dos macacos, ratos e seres humanos .
Assim, num aspecto do invento propor, cionamos uma composição farmacêuticamente compreendendo um composto peptídico do invento em associaçao com um veículo ou excipiente farmacêuticamente aceitavel, adaptado para utilização em medicina humana ou veterinária. Essas composiçoes podem ser apresentadas para utilização de um modo convencional em mistura com um ou mais veículos ou excipientes fisiológicamente aceitáveis. As composiçoes podem conter ain. da facultativamente um ou mais agentes terapêuticos que podem ser, se desejado, agentes antivirais diferentes.
Assim, os peptídeos de acordo com o invento podem ser formulados para administraçao oral, bucal, parentérica, tópica ou retal.
Em particular, os peptidos de acordo com o invento podem ser formulados para injecçao ou para infusão e podem ser apresentados sob uma forma de dose unitária em ampolas ou em recipientes multidose com a adiçao de um preservativo. As composiçoes podem apresentar-se sob a forma de suspensões, soluçoes, ou emulsões em veículos oleosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilizaçao e/ou de dispersão. Alter. nativamente o ingrediente activo pode apresentar-se sob a forma de um pó para constituição com um veículo apropriado, por exemplo água sem agentes pirogénicos, estéril, antes da utilização.
As composiçoes farmacêuticas de acordo com o invento podem também conter outros ingredientes activos tais como agentes anti-microbianos, ou preservativos.
As composiçoes podem conter entre 0,001-99% do material activo. 0 invento proporciona ainda um processo para preparar uma composição farmacêutica que compreende levar um peptido do invento a associar-se com um excipiente ou veículo farmacêuticamente aceitavel.
Para administraçao por injecção ou infusão, a dosagem diária utilizada para tratamento de um ser humano adulto com aproximadamente 70 Kg de peso corporal variará entre 0,2 mg e 10 mg, de preferência 0,5 a 5 mg, que pode ser administrada em 1 a 4 doses, por exemplo, depen. dendo da via de administraçao e da situaçao clinica do doente .
Foi postulado que as constantes de afinidade sao semelhantes às da morfina. Tendo como base esta afinidade, foi sugerida uma dosagem de, 33-, 0003 mg/Kg por dia. Esta dosagem provou ser eficaz. Ê sugerida uma concentraçao sanguínea molar de 10 a 10 . Nos macacos mg/Kg por dia realizam uma concentração no soro de 150 x
-9 x 10 M. Esta concentração e 15 vezes mais elevada do que a — —8 necessária para se conseguir uma concentração de 10 M. Os primatas requerem geralmente uma dose 10 vezes superior à dq se usada nos seres humanos.
Um outro aspecto deste invento relaciona-se com as preparações de vacinas contendo um peptídeo de acordo com o invento, para proporcionar protecção contra a infecçao pelo vírus da SIDA. A vacina devera conter uma quantidade imunogénicamente eficaz de peptido, por exem pio 1 jig a 20 mg/Kg do hospedeiro, conjugado f acultativameii te com uma proteina tal como a albumina do soro humano, num veículo apropriado, por exemplo água estéril, solução salina ou solução salina tamponada. Podem ser utilizados adjuvantes, tal como gel de hidróxido de alumínio. A administrei çao pode ser feita por injecção, por exemplo intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutâneamente ou intravenosa, mente. A administração pode efectuar-se de uma só vez ou v£ rias vezes, por exemplo com 1-4 semanas de intervalo.
Sequências antigénicas do carangue; jo assim como proteinas de outros invertebrados podem também ser adicionadas aos peptídeos do invento para promover a antigenicidade.
Ainda outro aspecto deste invento relaciona-se com Kits de ensaio para a detecçao do virus da SIDA e de anticorpos em relaçao aos vírus da SIDA contendo um peptideo de acordo com o invento como originador do antji génio, ou um anticorpo monoclonal produzido por um peptido de acordo com o invento. Por exemplo pode ser usado um peptjj deos de acordo com o invento num estojo de ensaio para detectar a infecçao pela SIDA e para diagnosticar situações de SIDA e de pré-SIDA usando esse peptido como o reagente do ensaio num ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou um ensaio imunodo enzimático. Esses Kits de ensaio podem incluir uma superfície porosa insolúvel ou um substrato sól_i do nos quais o peptideo antigénico ou o anticorpo monoclonal foram pre-absorvidos ou ligados covalentemente, apresen_ tando-se essa superfície ou esse substrato de preferência sob a forma de placas ou recipientes para microtitulaçao; soros para ensaio; heteroantissoros que se ligam específicamente a e saturam o antigénio ou anticorpo absorvido na superfície ou suporte; vários diluentes e tampões; conjugados marcados para a detecçao de anticorpos ligados especificamente e outros reagentes que geram sinais tais como substratos enzimáticos, cofactores e cromogegénios.
peptideo de acordo com o invento pode ser usado como um imunogénio para produzir anticorpos monoclonais que se ligam especificamente à porção relevante da sequência de invólucro do vírus da SIDA, usan do técnicas convencionais; esses anticorpos monoclonais constituem um outro aspecto do invento.
MÉTODOS E DADOS EXPERIMENTAIS
Radiomarcaçao de gp 120, Preparaçao de membranas de Cerebro, Ligaçao e Ligaçao Cruzada de gp 120 ao receptor, e imunoprecipitaçao de Antigénio T4. 0 isolado HTLV-IIIb de HIV foi propagado em células H9, e o gp 120 foi isolado por cromatografia de imunoafinidade e NaDodSO,/PAGE
125 - 4 preparativo. 0 gp 120 foi marcado com I pelo método da cloramina-T.
Hipocampos frescos de ser humano, macaco e ratazana foram homogenizados rapidamente (Polytron, Brinkmann Instruments) em 100 vol de Heps 50mM arrefecido pelo gelo (pH 7,4). As membranas recolhidas por centrifugação (15.000 x g) foram lavadas no volume tampao original e foram usadas frescas ou armazenadas a -70°C. Antes da utilização, as membranas cerebrais e células T altamente purificadas (ref. 16; dádiva de Larry Wahl) foram pré-incubadas dii rante 15-30 minutos em solução salina tamponada com fosfato
(PBS). As membranas derivadas de 2 mg (peso húmido inicial) de cérebro (Q? 100 jug de proteina) foram incubadas com 28.000 cpm de ^^p_gp],20 durante 1 hora a 37°C em 200 jul (volume final) de Hepes 50 mM contendo 0,1% de albumina de soro bovino e os inibidores da peptidase bacitracina (0,005%), aprotinina (0,005%), leupeptina (0,001%), e quimostatina (0,001%). As incubações foram filtradas sob vácuo rapidamen. te e contadas para determinar o material ligado ao receptor.
Imunoprecipitação . Os imunoprecipi_ tados foram preparados por incubaçao (durante a noite a 4°C) de 0,5% de triton Χ-100/PBS-solubilizada, lactoperoxidase/ „ 125 /glucose oxidase/membranas de cerebro iodinadas- I ou células T intactas com mAbs indicados a 10 ug por reacçao. Foi usado um imunoabsorvente de fase-solida (imunopérolas, bio-Rad) para precipitar complexos imunes antes da sua trans formaçao por NaDodSO^/PAGE. As incubações de controlo nao continham qualquer mAb primário ou uma subclasse de mAb de controlo (0KT8).
Neuroanatomia Química e Densitometria Assistida por Computador. Secções de 25-jum, cortadas com criostato, de cerebros recentemente congelados de seres humanos, macacos e ratazanas foram montadas por descongelação e secas para darem origem a lâminas revestidas por gelatina, e foram visualizados receptores tal como foi descrito (18). As incubações, com ou sem anticorpos (10 yug/ml) contra T4, T4A, T8, e Til, foram conduzidas (realizadas) durante a noite a 0°C em meio RPMI, com ligaçao cruzada com os seus antigenios, e visualizadas com anticorpo antiratinho
125 de cabra marcado com I. As incubações de secções de tecido montadas em lâminas para marcar o receptor-antigénio
9 ζ com JI-gpl20 foram realizadas em veículos de lâminas de ml com (1 jum) ou sem gpl2O nao marcado ou mAb 0KT4A (10 ^ig/ml) (ortho Diagnostics).
Separaçao de Subséries de Linfócitos-T. Foram obtidas subséries de células T por tratamento de células T do sangue periférico purificado por densidade, de Percoll, com anticorpos monoclonais específicos (T4 ou T8) a 10 jug/ml. As células tratadas foram então extraidas por evaporaçao (21) numa placa de Petri plástica que foi revestida com imunoglóbulina anti-ratinho / Fíab’^/ de cabra (Sero Lab, Eastbury, MA) durante 30 minutos a 4°C. As células nao aderentes foram então removidas, lavadas, e analisadas quanto à sua reactividade por meio de citometria de corrente (fluxo). As populações separadas de células T4 e T8 têm < 5% de contaminaçao por outras subséries de células T. As células foram então submetidas a cultura com fitohemaglutinjl na (1 yig/ml) durante 72 horas e expostas a HIV tal como é descrito a seguir. As células infectadas foram caracterizadas fenotipícamente quando foram realizados ensaios de cit£ toxicidade.
Infecçao por Virus. 0 vírus HTLV-III usado para a infecçao foi isolado a partir de linha de células T de cultura dependentes de uma interleucin 2 (IL-2) estabelecida a partir de material recente de doente com SIDA e feito passar para HuT 78, uma linha celular IL-2-independente permissiva.
DESCRIÇÃO DOS GRÁFICOS
A Figura IA indica uma ligaçao
125 cruzada de I-gpl2O a membranas do cerebro e células T
5 ** (a) I-gpl20 apenas; (b) macaco; (c) rato; (d) cerebro humano; e (e) células T humanas.
As figuras 1B e 1C indicam a imuno. precipitação de membranas de cérebro de macaco e de células 125
T humanas marcadas com I, respectivamente; (f,i) nenhum controlo de anticorpo primário; (g,J) OKT4 Mab; (h,K) 0KT8 Mab.
A Figura 2A indica um deslocamento 125 da ligaçao especifica de I-gpl2O a membranas frescas do hipocampo de rato. Cada determinação foi realizada em triplicado; sao indicados os resultados de uma experiência, que foi realizada três vezes com resultados semelhantes. A ligaçao específica deslocável por 10 yug/ml de 0KT4 e 4A variou entre 27 e 85% da ligaçao total, que foi de 2,201 + 74 cpm na experiência indicada.
A Figura 2B indica que a infectividade virai é bloqueada pelo peptídeo T e pelos seus análogos sintéticos. Cada determinação foi realizada em duplicado. Os resultados representam uma única experiência que foi repetida três vezes com resultados semelhantes.
EXEMPLO I
Ê obtido um único produto de liga.
çao cruzada radiomarcado de cerca de 180 Kd apos ligaçao específica de I-gpl20 a membranas do cérebro de macaco, ou de rato ou de homem que sao indistinguíveis do das células T humanas (Fig. IA). Este resultado indica que gpl20 pode ser ligado a uma proteina de aproximadamente 60 Kd;
125
I-gpl20 desloca-se adjacente ao controlo sem membrana (faixa a).
A imunoprecipitaçao das membranas de cérebro humano radioiodinado com 0KT4 e 0KT8 (10 yug/ml) (Fig. 1B) indica que as membranas do cérebro contêm um antigénio T4 de cerca de 60 Kd, indistinguível do identificado nos linfocidos T humanos (Fig. 1C); por contraste, 0KT8 imunoprecipita uma proteina de baixo peso molecular (cerca de 30 Kd) a partir dos linfocitos T (Fig. 1C) que está ausente nas membranas cerebrais (Fig. 1B) indicando que T4 ce rebral nao deriva de linfocitos residentes. Sao observados resultados semelhantes com membranas do hipocampo do macaco e rato (nao indicado). Estes resultados indicam que o anti. génio T4 serve como receptor virai e que e uma molécula 60 Kd altamente conservada partilhada pelos sistemas imuni. tário e nervoso central.
A compreensão de que o Epstein-Barr e o HILV-III partilham uma sequência octapeptídeo quase idêntica provocou a síntese e o estudo do peptídeo T. A Figura 2 demonstra a elevada afinidade (variaçao 0,1 nM) e 125 saturabilidade (Fig. 2A) de I-gpl20 ligando-se a membranas de cérebro de ratazana recentemente preparadas. A especificidade (Fig. 2B) é demonstrada por bloqueamento com 0KT4 e OKT4A, mas nao com 0KT3 (0,1 ^ig/ml). 0 peptídeo T e dois dos seus análogos sintéticos (mas nao a irrelevante subjs tância octapeptídeo P/“l-87 ) inibiram significativamente a _ 1 9 S ligaçao de I-gpl20 na ordem de 0,1 nM (Fig. 2C). A substi.
tuiçao de uma D-treonina-amida na posição 8 resultou numa perda de actividade de ligaçao ao receptor de pelo menos 100 vezes. A substituição clássica de / L-Ala7 por / D-Ala7 resulta num análogo consistentemente mais potente, presumí^velmente mais resistente à peptidase do que o peptídeo T; a amidaçao da treonina C também produz consistentemente uma potência um tanto maior (Figura 3).
Quando os peptidos sintéticos foram ensaiados quanto à sua capacidade para bloquear a infeq çao virai das células T humanas, os experimentadores eram cegos em relaçao aos resultados dos ensaios de ligaçao. A 10 7 M os três peptídeos activos no ensaio de ligaçao sao capazes de reduzir níveis detectáveis de actividade da transcriptase reversa em quase 9 vezes. 0 / D-Tre7-peptídeo. -deslocador da actividade menos activo revelou de um modo se melhante um bloqueio grandemente reduzido da infecçao virai, requerendo concentrações 100 vezes mais elevadas para conseguir uma inibição significativa. Assim, estão infimamente correlacionados nao apenas o escalonamento das potências de quatro peptídeos (D-/ Ala7|-peptídeo T-amida 7D-/ Ala7|-peptídeo T>peptídeo T > D-/ Tre7g-peptídeo T-amida), mas também as suas concentrações absolutas para inibirem a ligaçao ao receptor e a infecçao pelo vírus (Figura 3).
EXEMPLO 2
Uma proteína de aproximadamente 60-Kd, que é semelhante se nao idêntica ao antigénio T4 da c£ lula humana, estava presente na forma molecular aparentemen. te conservada nas membranas preparadas a partir do cerebro , 125 humano; alem disso, a glicoproteina ( I-gpl20) do involucro de HIV radiomarcada pode ser submetida covalentemente a ligaçao cruzada com uma molécula presente nos cerebro dos mamíferos cujos tamanhos e propriedades de imunoprecipitaçao nao se podiam distinguir do antigénio T4. Usando um método para visualizar os receptores ligados ao anticorpo nos cortes de cérebro, foi apresentado o padrao de distribuição neuroanatómica de T4 do cérebro, que é o mais denso no neurc) pil cortical e analogamente organizado em cada um dos três cérebros de mamíferos. Também a glicoproteina do invólucro do vírus HIV ligada num padrao idêntico sobre os cortes de cérebro adjacentes, sugerem de novo que T4 foi o receptor do HIV.
EXEMPLO 3
Neuroanatomia Química, Densitometria Assistida por Computador. Cortes de 25 microns cortados por criostato de cérebro congelado recentemente de ser humano, macaco e rato foram montados por descongelamento e secos em lâminas revestidas por gel sendo os receptores visualizados tal como foi descrito por Herkenham and Pert, J. Neurosci., 2: 1129-1149 (1982). As incubações, com ou sem anticorpos (10 ug/ml) contra T4, T4A, T8 e Til, foram realizadas durante a noite a 0°C em RPMI, submetidas a ligaçao cruzada com os seus antigénios e visualizadas com anticorpo 125 anti-ratinho de cabra- I. As incubações das secções de tecido montadas em lâminas a fim de marcar o antigénio/receptor com I-gpl20 foram realizadas em veiculos lâminas de 5 ml com (10_^M) ou sem gpl20 ou Mab OKT4A (10 yig/ml) nao marcados (Ortho Diagnostics) tal como foi atras descrito para as membranas.
Foi realizada a transformaçao assistida por computador da opacidade da película autoradiográfica em imagens quantitativas de cor. A co-exposiçao de padrões de incrementos conhecidos da radioactividade com os cortes de cérebro de macaco gerou um traçado linear (4 => ,99) de log 0. D. versus cpm a partir do que se pode extrapolar significativamente a concentração relativa de ra dioactividade. A coloraçao celular das secções de cérebro com tionina foi realizada por métodos clássicos e visualizei çao de receptores sobrejacentes ao tecido corado.
EXEMPLO 4
Foram realizadas experiências para determinar a distribuição do antigénio T4 numa série frontal a caudal ou secções em coroa de cérebro de saguim. Estas experiências revelam que existem niveis detectáveis de anticorpo monoclonal T4 ligando-se a áreas citiarquiteto. nicamente significativas do tronco cerebral (por exemplo a substância nigra), mas o padrao surpreendente do enriquecimento cortical é aparente em qualquer nível do neuroeixo. 0KT8, um anticorpo monoclonal dirigido ao linfócito T da mesma subclasse que 0KT4, nao apresenta qualquer padrao observável. Geralmente, as camadas mais superficiais no interior do córtex cerebral contém as concentrações mais densas de antigénio T4; o córtex frontal e perilimbico sobreja. centes à amigdala sao particularmente ricos em receptores em todas as camadas profundas. A formaçao hipocampo possui a concentração de receptores mais densa nos cérebros de macaco, rato e homem. A microscopia de campo escuro de secções de saguim mergulhadas em emulsão fotográfica revelou que a faixa mais densa marcaçao de receptores se localiza no inte25
rior das camadas moleculares das circunvoluções cerebrais dentadas e do próprio hipocampo (que contem muito poucos neuroneos). Assim, parece que os receptores sao correctamente distribuídos sobre o neuropil (as extensões neuronais de dentricos e axónios) ou podem estar localizados numa subsérie especifica de células astrogliais nao coradas. As secções em coroa (transversais) de cerebro de rato revelaram um padrao rico muito semelhante no cortex/hipo125 campo de distribuição de receptores em que 0KT4 ou I-gpl2O foi usado para visualizaçao. Além disso, este padrao nao se tornou aparente quando a incubaçao ocorreu na presen. ça de gpl2O nao marcado (1 , 0KT4 (10 jug/ml) ou 0KT4 (10 'Pg/ml). Outros Mabs de ratinho dirigidos contra outros antigénios superficiais da célula T humana incluindo 0KT8 e 0KT11 nao revelaram um padrao detectável no cerebro do rato quando visualisados por anticorpo secundário IgG anti125
-ratinho de cabra- I tal como nao houve antigenio/recejj tor detectável, reprodutível com apenas anticorpo secundário.
Claims (26)
- REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a preparaçao de um peptideo com a fórmula:Ra-Ser-Tre-Tre-Asn-Tir-R^ (I) onde R representa um residuo amino-terminal Ala- ou D-Ala e R^1 representa um residuo carboxi-terminal -Tre ou -Tre-amida ou um seu derivado com um residuo Cis- adicional em um ou em ambos os terminais amino ou carbóxi, ou um peptideo com a fórmula (II):R1-R2-R3-R4-R5 (II)1 , onde R e um residuo amino-terminal Tre-, Ser-, Asn-, Leu-, Ile-, Arg- ou Glu2 ,R e Tre, Ser ou Asp3 ,R e Tre, Ser, Asn, Arg, Gin, Lis ou Trp é Tir5 , e R e um grupo amino carboxi-terminal ou um seu derivado com um D-amino ácido correspondente, como residuo amino-terminal, e/ou um derivado amida correspondente no residuo carboxi-terminal e/ou adicionalmente um residuo-Cis num ou em ambos os terminais amino e carbóxi, ou um seu sal fisi£ lógicamente aceitável, caracterizado por se proceder a uma síntese por condensação de amino ácidos em vários passos, enquanto a extremidade carboxi da cadeia é covalentemente ligada a um suporte insolúvel, por exemplo, copolímero clor£ metilado de estireno-divinilbenzeno, e por, durante os passos intermédios de síntese, o peptideo permanecer, de prefe rência, na fase sólida, de modo a poder ser convenientemente manipulado.
- 2-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um peptideo com a fórmula:Ra-Ser-Tre-Tre-Tre-Asn-Tir-R^ (i) onde R representa um residuo amino-terminal Ala- ou D-Ala e R^ representa um residuo carboxi-terminal -Tre ou -Treamida ou um seu derivado com um residuo Cis-terminal num ou ambos os terminais amino e carboxi, ou um peptideo com a fo£ mula (II) : r1_r2_r3_r4_r5 (II) em que R representa um residuo amino-terminal Ala- ou D-Ala e Ru representa um residuo carboxi-terminal -Tre ou -Tre-amida ou um seu derivado com um residuo Cis- adicional em um ou em ambos os terminais amino e carboxi, ou um peptideo com a fórmula (II):12 3 4 5Ri-Rz-RJ-R -IT (II) em que Rb é um resíduo amino-terminal Tre-, Ser- ou AsnR é-Tre, Ser ou Asp
- 3 ,R e Tre, Ser, Asn ou Arg é Tir e R^ é um resíduo carboxi-termínal -Tre, -Arg ou -Gli ou um seu derivado com um D-amino ácido correspondente, como resíduo amino-terminal e/ou um derivado amida correspondente no residuo carboxi-terminal e/ou adicionalmente um residuo Cis- em um ou em ambos os terminais amino e carboxi, ou um seu sal fisiológicamente aceitáveis.3-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se preparar um peptideo com a fórmula (I):-Ra-Ser-Tre-Tre-Tre-Asn-Tir-Rb (I) aonde R representa um residuo amino-terminal Ala- ou D-Ala e Rb representa um residuo carboxi-terminal -Tre ou -Tre amida ou um seu derivado com um residuo Cis-adicional em um ou em ambos os terminais amino e carboxi, ou um peptideo com a fórmula (II):29 r1_r2_r3_r4 (ui) onde r! é um residuo amino-terminal Tre-, Ser-, Asn-, Glu-, Arg-, Ile-, ou Leu-,R é Tre, Ser ou Asp,3 ,R e Tre, Ser, Asn, Arg, Gin, Lis ou Trp,R e um residuo carboxi-terminal -Tir ou um seu derivado.
- 4-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um peptideo com a fórmula:1 2 3 4 5X-R -R -R -R -R -X em que X é cisteina.
- 5ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um peptideo escolhido entre ala-ser-tre-tre-tre-asn-tir-tre, tre-tre-asn-tir-tre, ser-ser-tre-tir-arg, asn-tre-ser-tir-tre, tre-tre-ser-tir-tre, ser-ser-tre-tir-arg, asn-tre-ser-tir-gli, ser-tre-asn-tir-arg, ser-ser-tre-tir-arg, ser-ser-ar^ -tir-arg, ser-ser-tre-tir-arg, tre-tre-ser-tir-ser, e cis-tre-tre-asn-tir-tre-cis.
- 6-. - Processo para a preparaçao de uma composição de matéria caracterizado por se incluir na referida composição, como ingrediente activo, pelo menos um peptideo obtido de acordo com a reivindicação 1, jun tamente com um veiculo farmacêutico.
- 7a. - Processo para a preparaçao de composição de matéria caracterizado por se incluir na r£ ferida composição, como ingrediente activo, pelo menos um peptideo obtido de acordo com a reivindicação 2 juntamente com um veiculo farmacêutico.
- 8a. - Processo para a preparaçao de uma composição de matéria caracterizado por se incluir na referida composição, como ingrediente activo, pelo menos um peptideo obtido de acordo com a reivindicação 3 juntameii te com um veiculo farmacêutico.
- 9a. - Processo para a preparaçao de uma composição de matéria caracterizado por se incluir na referida composição, como ingrediente activo pelo menos um peptideo obtido de acordo com a reivindicação 4 juntamente com um veiculo farmacêutico.
- 10a. - Processo para a preparaçao de uma composição de matéria caracterizado por se incluir na referida composição, como ingrediente activo, pelo menos um peptideo obtido de acordo com a reivindicação 5 juntamente com um veiculo farmacêutico.
- 11a. - Método para evitar a ligaçao de antigénio a células de mamíferos caracterizado por se administrar uma quantidade bloqueadora do receptor T4, eficaz de uma composição preparada de acordo com a reivindicação 6, sendo a gama de dosagem de 0,33 a 0,0003 mg de ingrediente activo, por kg de peso corporal, por dia.
- 12a. - Método de acordo com a rejí vindicaçao 11, caracterizado por o antigénio ser um virus.
- 13a. - Método de acordo com a rejí vindicaçao 12, caracterizado por o virus ser o agente causa dor da SIDA.
- 14a. - Método para evitar a ligaçao de virus a células de mamíferos caracterizado por se administrar uma quantidade bloqueadora do receptor T4, efji caz de uma composição preparada de acordo com a reivindicação 7, sendo a gama de dosagem de 0,33 a 0,0003 mg do ingrediente activo, por kg de peso corporal, por dia.
- 15a. - Método para evitar a ligji ção de virus a células de mamíferos caracterizado por se administrar uma quantidade bloqueadora do receptor T4 eficaz de uma composição preparada de acordo com a reivindicação 8, sendo a gama de dosagem de 0,33 a 0,0003 mg de ingrediente activo, por kg de peso corporal por dia.
- 16a. - Método para evitar a liga. çao de virus a células de mamíferos caracterizado por se administrar uma quantidade bloqueadora do receptor T4, eficaz, de uma composição preparada de acordo com a reivindicação 9, sendo a gama de dosagem de 0,33 a 0,0003 mg, de ingrediente activo, por kg de peso corporal, por dia.
- 17a. - Método para evitar a ligaçao do virus a células de mamíferos caracterizado por se administrar uma quantidade bloqueadora do receptor T4, eficaz de uma composição preparada de acordo com a reivindicação 10, sendo a gama de dosagem de 0,33 a 0,0003 mg de ingrje diente activo, por kg de peso corporal, por dia.
- 18a. - Processo para a preparaçao de uma composição de matéria caracterizado por se incluir na referida composição um peptideo obtido de acordo com a reivindicação 1 conjugado com uma proteína.
- 19a. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a proteina ser albumina do soro humano.
- 20a. - Método para evitar a SIDA, caracterizado por se administrar uma quantidade imunogénica, eficaz, de uma composição obtida de acordo com a reivindicação 6, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 1 pg a 20 mg, por kg de peso corporal, por dia.
- 21a. - Método para evitar a SIDA caracterizado por se administrar uma quantidade imunogénica eficaz de uma composição obtida de acordo com a reivindicação 18, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 1 pg a 20 mg, por kg de peso corporal, por dia.
- 22-, - Equipamento (Kit) de teste para detectar anticorpos em relaçao ao antigénio que se liga ao receptor T4 caracterizado por ser composto por um peptideo antigénico obtido de acordo com a reivindicação 1 liga, do a uma superfície porosa ou a um subtracto solido.
- 23a. - Kit de acordo com a reivijn dicaçao 22, caracterizado por o peptideo antigénico ser ligado a cavidades de uma placa de microtitulaçao.
- 24a. - Processo para a preparaçao de uma composição de matéria caracterizado por se incluir na referida composição, como ingrediente activo pelo menos dois ou mais peptídeos obtidos de acordo com a reivindicação 1, juntamente com um veiculo farmacêutico.
- 25ã. - Método para evitar doenças provocadas por virus que se ligam ao receptor T4 caracterizado por se administrar uma quantidade imunogénicamente efi. caz de uma composição obtida de acordo com a reivindicação 6, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 1 |ig a 20 mg por kg de peso corporal por dia.
- 26a. - Método para evitar doenças provocadas por virus que se ligam a receptores T4 caracterizado por administrar uma quantidade imunogénicamente efi34 caz de uma composição obtida de acordo com a reivindicação24 em séries de 2-4 doses administradas com um intervalo de1 a 4 semanas.
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