FI99115C - T-4 reseptoreihin sitoutuvaa antigeeniä kohtaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa reagoivia peptidejä ja niiden diagnostinen käyttö - Google Patents

Description

99115 T-4 reseptoreihin sitoutuvaa antigeeniä kohtaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa reagoivia peptidejä ja niiden diagnostinen käyttö 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta FI 885630.

Keksinnön lyhyt kuvaus Tämä keksintö liittyy synteettisesti tuotettuihin lyhyisiin peptidijaksoihin, jotka aiheuttavat HTLV-III/ 10 LAV:n eli HIV-viruksen vaippaproteiiniin kohdistuvien vasta-aineiden tuotannon. Tästä johtuen näitä peptideitä ja niitä vastaan valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voitaisiin käyttää diagnostisina aineina HIV-viruksen tunnistamiseksi. Tämän vuoksi peptideillä ja peptidejä vas-15 taan suunnatuilla vasta-aineilla voisi olla käyttöä valmistettaessa koepakkauksia HIV-viruksen kantajien tai AIDS:a potevien henkilöiden tunnistamiseksi.

Keksinnön tausta

Useat tutkijat ovat raportoineet AIDS (HIV) -viruk-20 sen täydellisen nukleiinihappojärjestyksen. (Katso Lee Ratner ja muut, Nature 313, s. 277, tammikuu 1985; Muesing ja muut, Nature 313, s. 450, helmikuu 1985; ja Wain-Habson . ja muut Cell 40, sivut 9-17, tammikuu 1985.) Vaippageeniä on erityisesti liitetty antigeeni syy teen ja tartuntaky-25 kyyn. Vaipan alueen tiedetään myös sisältävän alueita, • · • * jotka ovat hyvin vaihtelevia. HIV-viruksen vaipan glyko- :*.* proteiinin on osoitettu liittyvän kovalenttisella sidok- sella ihmisen, rotan ja apinan aivojen kalvoihin ja immuu- • · » : nijärjestelmän soluihin.

30 Sen ymmärtäminen, että virukset voivat osoittaa va- likoivuutta soluja ja kudoksia kohtaan kiinnittymällä so-lukalvon pinnan reseptorien erittäin spesifisiin alueisiin, on rohkaissut tutkijoita etsimään aineita, jotka • · : voisivat sitoutua solukalvojen virusreseptorikohtiin ja • .· 35 näin ehkäistä tietyn viruksen sitoutuminen näihin solui- | · 2 99115 hin. Aikaisemmin on osoitettu (Epstein ja muut Nature 318, sivut 663-667), että vaccinia-viruksen erityisten reseptorien välittämä tartuntakyky voidaan osoittaa tulevan tehottomaksi synteettisten peptidien avulla.

5 HIV-viruksen on osoitettu sitoutuvan pintamolekyy- liin, joka tunnetaan CD4- tai T4-alueena, mikä esiintyy monissa eri HIV-tartunnalle alttiissa soluissa, mukaanlukien T-lymfosyytit ja makrofagit. (Katso Shaw et ai. [Science 226, sivut 1165-1171], missä on tarkasteltu HTLV-10 III:n valikoivuutta).

Immunopuutoksesta aiheutuvien oireiden lisäksi AIDS-potilaat osoittavat hermopsykologisia vaurioita. Keskushermostolla ja immuunijärjestelmällä on suuri määrä yhteisiä spesifisiä solupinnan tunnistusmolekyylejä, jotka 15 toimivat hermopeptidien välittämän solujen välisen yhteydenpidon reseptoreina. Hermopeptidit ja niiden reseptorit ovat osoittautuneet huomattavan pysyviksi kehityksen kuluessa ja ovat säilyneet lähes muuttumattomassa muodossa yksisoluisissa eliöissä sekä korkeammissa eläimissä. Li-20 säksi keskushermostossa ja immuunijärjestelmässä havaitaan yhteiset DC4 (T4) solupinnan tunnistusmolekyylit, jotka toimivat HIV:n vaipan glykoproteiinin (gp 120) reseptoreina. Koska samat suuressa määrin säilyneet hermopeptideistä ; · · koostuvat tietoa kuljettavat aineet yhdistävät immuuni- ja ·.* * 25 aivotoiminnan reseptoreilla, jotka ovat huomattavassa mää- • · • ’ * rin samankaltaisia HIV:n reseptoreiden kanssa, on väitet- • · : \· ty, että se hyvin samanlainen aminohappojärjestys, joka •t* HIV:n glykoproteiini 120:11a on erään lyhyen peptidin • · · · ·*·*; kanssa, joka tunnistettiin aiemmin muussa yhteydessä Ep- 30 stein-Barr -viruksen vaippa-alueelta, saattaa merkitä sel- ;·. laisen ydinpeptidin olemassaoloa, joka on oleellinen vi- • · · * rusreseptoriin sitoutumiselle. Esitettiin, että tällaiset reseptorikohtiin sitoutuvat peptidit aiheuttaisivat pepti-dijaksoja kohtaan suunnattujen vasta-aineiden tuotannon, :.,/35 ja että näitä peptidejä voitaisiin käyttää tarjoamaan immunologinen perusta AIDS:n diagnosoimiseksi.

3 99115

Tarkoitus Tämän keksinnön kohde oli saada diagnostisia keinoja HIV:a tai HIV:n vaippaproteiinia kohtaan kehittyneiden vasta-aineiden toteamiseksi.

5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Tunnistettiin oktapeptidi HIV:n vaipan glykopro-teiinissa (gp 120) tietokoneavusteista analyysia käyttäen. Tämän peptidin, joka nimettiin "peptidi T":ksi korkean treoniinisisältönsä perusteella, on osoitettu estävän gp 10 120:n sitoutumisen aivon kalvoihin. Peptidin aminohappo- järjestys on Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr. Myöhempi analyysi paljasti samantyyppisiä pentapeptidejä, joilla on samanlaiset sitoutumisominaisuudet.

Tämän keksinnön mukaiselle peptidille on tunnus-15 omaista, että sillä on kaava I: X-Ra-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb-X (I) jossa kaavassa 20 Ra on aminopään pääteryhmä Ala- tai D-Ala-,

Rb on karboksipään pääteryhmä -Thr tai -Thr-amidi, ja . . X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, tai sillä on kaava II: * 25 • · :* X-R1-R2-R3-R4-R5-X (II) • « • * * • · • · *·’ jossa kaavassa

• · · · «J

R1 on aminopään pääteryhmä Thr-, Ser-, Asn-, Leu-, 30 Ile-, Arg- tai Glu-, _ R2 on Thr, Ser tai Asp, R3 on Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys tai Trp, R4 on Tyr, ja : R5 on karboksipään pääteaminohapporyhmä, vastaava 35 D-aminohappo, vastaava amidi johdannainen tai R5 puuttuu, ja . 99115 4 X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, edellyttäen kuitenkin ettei peptidi ole Ser-Thr-Asn-Tyr-Thr, tai niiden fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja.

5 R5 on mieluimmin karboksipään pääteryhmä -Thr, Arg tai Gly tai näiden johdannainen. Peptidi, joka päättyy R4:ään (tyrosiiniin) säilyttää tässä käsitellyn ryhmän si-toutumisominaisuudet. Tämän keksinnön aktiiviset yhdisteet voivat esiintyä peptidien fysiologisesti hyväksyttävinä 10 suoloina.

Tämän ryhmän peptidien on havaittu sitoutuvan T4-virusreseptoreihin.

Kaikkein ensisijaisimmat peptidit, sekä ylläkuvattu peptidi T, ovat seuraavanlaisia kaavan (I) mukaisia okta-15 peptidejä: D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr j a D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-amidi ja seuraavanlaisia kaavan (II) mukaisia pentapeptidejä: Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr 20 Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr

Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr ja niiden analogeja, joilla aminopään pääteryhmänä on D-Thr ja/tai karboksipään pääteryhmänä amidijohdannainen.

Tässä esitettyjä peptidejä voi myös modifioida ava- • · * *.· 25 ruusrakenteeltaan rajoitetuiksi pysyvyyden parantamiseksi.

• · '· ' Jäljempänä käytetään seuraavia lyhenteitä: • · · : .* Aminohappo Kolmikirjaiminen Yksikirjaiminen ··· koodi koodi • · · · ^____________ • · · • · ·

*·* 30 arginiini arg R

asparagiini asn N

• ·

i ’*· asparagiinihappo asp D

kysteiini cys C

: glysiini gly G

« · *

35 seriini ser S

treoniini thr T

·...· tyrosiini tyr Y

5 99115

Ellei muuten ole osoitettu, ovat aminohapot tietenkin luonnollisissa L-stereoisomeerisissa muodoissa.

Kahdentoista pentapeptidin aminohappojärjestysten vertailu on esitetty taulukossa 1. Vaikka historiallisesti 5 aluksi suorittamamme tietokonehaku paljasti peptidi T:n (ARV-eristyksen sisältämä peptidi) olevan asianomainen jakso, uusien virusperäisten aminohappojaksojen tultua saataville kävi selväksi, että asianomainen bioaktiivinen jakso voisi olla lyhempi pentapeptidi, joka nimellisesti 10 koostuu peptidistä T (4-8), tai jakso TTNYT. Vertaamissamme eristyksissä (taulukko 1) huomattavaa homologiaa havaittiin vain tällä lyhyemmällä alueella. Suurin osa muutoksista on seriinin (S) ja treoniinin (T), kahden toisiaan läheisesti muistuttavan aminohapon, vaihtuminen kes-15 kenään. Peptidi T:n asemassa 7 oleva tyrosiini on kaikkien näiden muotojen muuttumattomana säilyvä piirre, mikä viittaa siihen, että se voi olla bioaktiivisuudelle välttämätön. Asemassa 5 esiintyvät korvaustapahtumat käsittävät T:n, G:n, R:n ja S:n. Asemat 4 ja 6 rajattiin ensin käsit-20 tämään (yhtä poikkeusta lukuunottamatta) S:n, T:n ja N:n, jotka kaikki ovat aminohappoja, joilla on varauksettomat polaariset, avaruusrakenteeltaan läheisesti samanlaiset . . ryhmät. Viiden eri AIDS-virus eristysvalmisteen kesken M,' suoritettu jaksojen yhtäläisen yhdenmukaisuuden määrittä- 25 minen paljastaa, että alue, joka sijaitsee peptidi T-jak-: ' son vieressä ja johon tämä itse kuuluu, on hyvin muuntele- i .* vaa. Tällainen muuntelevuus voi viitata alakantojen kehit- tymiseen sellaisen voimakkaan toiminnan (toimintojen) mo-

«M

ί nimuotoisuuden lisääntymisen välityksellä, joka on alttii- 30 na valintatapahtumille, ja joka sijoittuu tälle alueelle.

·*·.. Opiaattipeptidien tavoin nämä peptidi T:n analogit näyt- tävät esiintyvän monissa muodoissa, muistuttaen met- ja leu-enkefaliineja. Nämä pentapeptidijaksot, jotka esiin-· tyvät näissä useissa eri AIDS-viruseristysvalmisteissa, 35 ovat biologisesti aktiivisia ja kykenevät vuorovaikutuk- 6 99115 seen CD4 reseptorin - aiemmin laajemmalti tunnettu T-aut-tajasolujen pinta"markkeeri" ominaisuudestaan - vastavaikuttajana.

Taulukko 1. ENV-jakson vertailu useista AIDS viruseristys-5 valmisteista

Eristysvalmiste Jakso Viite peptidi T ASTTTNYT Pert, C.B., ja muut PNAS (painossa) 10 XARV (195-199) TTNYT Willey, R.L. ja muut LAV TTSYT PNAS 83, s.5083, 1986

Z3 SSTYR

NY5 NTSYT

15 B10(HTLV-III) TTSYT Starcich, B.R., ja muut WMJ-1 SSTYR Cell, 45, s. 637, 1986

HAT-3 NTSYG

Peräkkäiset eris-tysvalmisteet STNYR

20 WMJ-1 SSTYR Hahn, B.L. ja muut WMJ-2 SSRYR Science 232 s. 1548, WMJ-3 SSTYR 1986

: TTSYS

·/· '· 25 1 Numerot viittaavat aminohappojen suhteellisiin paikkoihin :** . ARV env -jaksossa (9).

Seitsemästä aminohaposta koostunut peptidi CYS-THR- • · .:. THR-ASN-TYR-THR-CYS on myös aktiivinen. Kysteiinien lisäys ···· ydin jaksoon ei merkittävästi heikennä aktiivisuutta. Pep- • · · 30 tidit syntetoitiin Peninsula Laboratories -yhtiön toimit- .. tamana palveluna keksinnön tekijöiden ja valmistajan väli- • · * sen luottamuksellisuussopimuksen alaisuudessa. Käytettiin

Merrifieldin kiinteän faasin peptidisynteesiä. (Katso US-patentti nro 35311258, mikä liitetään tähän hakemukseen 35 viittaamalla.) Syntetoidut peptidit ovat ensisijaisessa 7 99115 asemassa. Vaikkakin peptidi T ja tähän osana kuuluva pen-tapeptidi voitaisiin eristää viruksesta, Merrifieldin mukaan syntetoidut peptidit eivät sisällä jäämiä soluista tai viruksista. Tämän johdosta kontaminaatioita kohtaan 5 syntyneitä reaktioita ei tapahdu, kun käytetään syntetoi-tuja peptidejä.

Tämän keksinnön peptidejä voidaan tuottaa tavanomaisilla peptidisynteesimenetelmillä. Sekä kiinteän että nestemäisen faasin menetelmiä voidaan käyttää. Olemme ha-10 vainneet Merrifieldin kiinteän faasin olevan erityisen käyttökelpoinen. Tässä menetelmässä peptidi syntetoidaan vaiheittain ketjun karboksipään ollessa kovalenttisesti liitetty liukenemattomaan kantajaan. Synteesin välivaiheiden aikana peptidi pysyy kiinteässä faasissa ja on siten 15 helposti käsiteltävissä. Kiinteä kantajafaasi on klorome-tyloitu styreeni-divinyylibentseeni -kopolymeeri.

Karboksipään pääteaminohapon N-suojatun muodon, esim. t-butoksikarbonyyli (Boc-) -suojatun aminohapon, annetaan reagoida klorometyloidun styreeni-divinyylibentsee-20 ni-kopolymeerihartsin klorometyyliryhmän kanssa, jolloin syntyy hartsin suojattu aminoasyylijohdannainen, missä aminohappo on liittynyt hartsiin bentsyyliesterinä. Tämän . . suojaus poistetaan ja sen annetaan reagoida seuraavan ami- nohapon suojatun muodon kanssa, mistä syntyy hartsiin lii- • · * *·/ ’ 25 ttynyt suojattu dipeptidi. Aminohappoa käytetään tavaili- • · ' ’ sesti aktivoidussa muodossaan, esim. käyttämällä karbodi- • · : *.· imidiä tai aktiivista esteriä. Nämä vaiheet toistetaan ja peptidiketju kasvaa ryhmä kerrallaan kondensoitumalla amici : nopäästään haluttujen N-suojattujen aminohappojen kanssa 30 kunnes haluttu peptidi on koottu kantajaan. Peptidihartsi käsitellään sitten vedettömällä fluorivetyhapolla, mikä katkaisee koottua peptidiä kantajaan yhdistävän esterisi-doksen halutun peptidin vapauttamiseksi. Samalla voidaan ··'· · tavanomaisin menetelmin vapauttaa aminohappojen sivuketju- :· 35 jen funktionaaliset ryhmät, jotka on täytynyt suojata syn- • 8 99115 teesivaiheiden ajaksi. Amidiryhmän karboksi-päässään sisältävän peptidin synteesi voidaan suorittaa tavanomaisesti 4-metyylibentshydrylamiinihartsia käyttäen.

Vielä yksi tämän keksinnön kohde liittyy AIDS-vi-5 rusten havaitsemiseksi käytettäviin koepakkauksiin, joiden antigeenilähde sisältää tämän keksinnön mukaisen peptidin. Keksinnön mukaiselle koepakkaukselle sellaista antigeeniä kohtaan suunnattujen vasta-aineiden määrittämiseksi, joka sitoutuu T4 reseptoriin, on tunnusomaista, että se sisäl-10 tää huokoiseen pintaan tai kiinteälle alustalle sidotun keksinnön mukaisen peptidin. Esimerkiksi tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan käyttää koepakkaukessa havaitsemaan AIDS-infektio ja AIDS ja esi-AIDS -tilojen diagnoosiin käyttämällä sitä testireagenssina entsyymiin kytke-15 tyssä immunosorbenttimääritystestissä (ELISA) tai entsyymi -immunotäplämääritystestissä. Tällaiset koepakkaukset voivat sisältää liukenemattoman huokoisen pinnan tai kiinteän alustan, johon antigeeninen peptidi on etukäteen adsorboitu tai liitetty kovalenttisesti, tällaisen pinnan 20 tai alustan ensisijaisesti mikrotiitterilevyn tai kuoppien muodossa; testiseerumit; toisperäiset antiseerumit, jotka sitoutuvat spesifisesti pintaan tai kantajaan adsorboituun • ·, antigeeniin tai vasta-aineeseen ja kyllästävät tämän; I 1 useita eri laimentimia ja puskuriliuoksia; leimattuja kon- • · · *t1 25 jugaatteja spesifisesti liittyneiden vasta-aineiden ha- • · : 1 vaitsemiseksi ja muita signaalia aiheuttavia reagensseja, • · · : kuten entsyymin substraatteja, kofaktoreita ja kromogeene- jä.

• · · Y : Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen kek- 30 sinnön mukaisen peptidin käyttö diagnostisessa menetelmäs-·1·.. sä ihmisen immuunikatovirus (HIV)-infektion havaitsemisek- si kehonesteestä tai kudoksesta, joka menetelmä on käyttökelpoinen hankitun immuunikato-oireryhmän (AIDS) tai sen :·· : esiasteen diagnosoimiseen, jolloin • · i u ' t 1 9 99115 a) näyte saatetaan reagoimaan mainitun antigeenisen peptidin kanssa, b) muodostetaan antigeeni-vasta-ainekompleksi, ja c) havaitaan muodostunut antigeeni-vasta-ainekom- 5 pieksi.

Tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan myös käyttää tavanomaisiin menetelmin immunogeeninä aiheuttamaan sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottoa, jotka spesifisesti sitoutuvat asianmukaisiin alueisiin 10 AIDS-viruksen vaipan jaksossa.

Kokeelliset menetelmät ja koetulokset

Gp 120:n leimaus radioaktiivisella merkkiaineella, kalvojen valmistus aivoista, gp 120:n sitoutuminen ja ris-tiinsitominen reseptoriin, ja T4-antigeenin immunosaostus 15 HIV:n HTLV-IIIb kantaa lisättiin H9 soluissa ja gp 120 eristettiin immuuniaffiniteettikromatografiaa ja pre-paratiivista NaDodS04/PAGE:a käyttämällä. Puhdistettu gp 120 leimattiin 125I:lla kloramiini-T -menetelmällä.

Tuoreet ihmisen, apinan ja rotan pikkuaivot homoge-20 noitiin nopeasti (Polytron, Brinkmann Instruments) 100 tilavuudessa jääkylmää Hepes (pH 7,4)-puskuria. Sentrifugoi-malla (15000 x g) kerätyt kalvot pestiin alkuperäisen pus-. kuriliuoksen tilavuudessa ja käytettiin tuoreeltaan tai V..‘ varastoitiin -70 °C:ssa. Aivojen kalvot ja pitkälle puhdis- « · · 1 • · 25 tetut T-solut (viite 16; lahjoitus Larry Wahl'ilta) esi- • · • ’ inkuboitiin ennen käyttöä 15-30 min fosfaatilla puskuroi- • · · ϊ ·* dussa suolaliuoksessa (PBS). 20 mg:n erä (märkäpaino alus- sa) aivoista peräisin olevia kalvoja (noin 100 pg proteiini : nia) inkuboitiin 28000 cpm:n erän kanssa 125I-gp 120:a 1 30 tunnin ajan 37 °C:ssa 200 pl:ssa (lopullinen tilavuus) 50 ·*·.. mM Hepes-puskuriliuosta, joka sisälsi 0,1 % naudan seeru- min albumiinia ja peptidaasi-inhibiittoreita basitrasiini (0,005 %), aprotiniini (0,005 %), leupeptiini (0,001 %) ja : kymostatiini (0,001 %). Inkubointiseokset suodatettiin no- 35 peasti tyhjiön avulla ja radioaktiivisuus laskettiin re- septoriin kiinnittyneen materiaalin määrän määrittämisek si.

10 99115

Immuuni saostus

Immuunisaostumat valmistettiin inkuboimalla (yön 5 yli 4 °C:ssa) 0,5 % Triton-X-100/PBS -liuoksella liukoiseksi tehtyjä, laktoperoksidaasi/glukoosioksidaasi/125I jodat-tuja aivojen kalvoja tai ehjiä T-soluja ilmoitettujen mo-noklonaalisten vasta-aineiden kanssa, joita käytettiin 10 pg reaktiota kohti. Kiinteän faasin immunoadsorbenttia 10 (Immunobeads, Bio-Rad) käytettiin immuunikompleksien saos- tamiseen ennen niiden erottelua NaDodS04/PAGE:11a. Verrokki -inkuboinnit eivät sisältäneet primäärisiä monoklonaali-sia vasta-aineita tai sisälsivät alaryhmän verrokkina olevan monoklonaalisen vasta-aineen (0KT8).

15 Kemiallinen hermoanatomia ja tietokoneavusteinen tiheysmittaus 25 pm kryostaattileikkeet tuoreena pakastetuista ihmisen, apinan ja rotan aivoista kiinnitettiin sulattamalla ja kuivattiin gelatiinilla päällystetyille objekti-20 laseille, ja reseptorit saatettiin havaittaviksi viitteessä (18) kuvatulla tavalla. Inkuboinnit ilman T4, T4A, T8 ja Tll vastaan suunnattuja vasta-aineita (10 pg/ml) tai . . näiden kanssa suoritettiin yön yli 0 °C:ssa RPMI-liuokses- sa, sidottiin ristiin antigeeneihinsä ja saatettiin ha- • 1 1 **’ ' 25 väittäviksi 125I:lla leimatulla vuohen hiirtä vastaan suun- * · • · : 1 natulla vasta-aineella. Objektilasille kiinnitettyjen ku- : 1.1 dosleikkeiden inkuboinnit antigeenireseptorin leimaamisek- si 125I-gp 120:11a suoritettiin 5 ml:n objektilasisäiliöissä : leimaamattoman gp 120: n kanssa (1 pM) tai ilman tätä tai 30 0KT4A monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (10 pg/ml) (Ort-ho Diagnostics) tai ilman tätä.

T-lymfosyyttien alaryhmien erottaminen • T-solujen alaryhmät saatiin käsittelemällä Percoll- ·'<: · tiheysgradientissa puhdistettuja ääreisverenkierron T-so- 35 luja spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla (T4 tai 1 « • »

I · I

• « 11 99115 T8), joiden pitoisuus oli 10 pg/ml. Käsiteltyjä soluja seisotettiin 30 min 4 °C:ssa muovisella petrimaljalla, jonka pintaan oli kiinnitetty vuohen [F(ab')2] hiirtä vastaan kohdistettua immunoglobuliinia (Sero Lab, Eastbury, MA).

5 Tämän jälkeen poistettiin vapaaksi jääneet solut, ja ne pestiin ja niiden reaktiivisuus tutkittiin virtaussytomet-rilla. Erotetuissa T4 ja T8 solupopulaatioissa on muita T-solujen alaryhmiä < 5 % kontaminaatiotasolla. Solut viljeltiin sitten fytohemagglutiniinin (1 pg/ml) läsnäollessa 10 ja altistettiin HIV:lle kuten jäljempänä kuvataan. HIV:tä sitoutuneiden solujen ilmiasun luonne selvitettiin, kun solujen toksisuusmääritykset tehtiin.

Virussitoutuminen

Sitoutumiseen käytetty HTLV-virus eristettiin in-15 terleukiinia 2 (IL-2)-vaativasta viljellystä T-solulinjas-ta, joka oli eristetty tuoreesta AIDS-potilaan materiaalista ja siirrostettu HuT 78:aan, permissiiviseen solulin-jaan, joka on riippumaton IL-2:sta.

Piirrosten kuvaus 20 Kuva IA osoittaa 125I-gp 120: n ristiinsitoutumisen aivon kalvoihin ja T-soluihin. (a) yksinomaan 125I-gp 120; (b) apina; (c) rotta; (d) ihmisen aivot; ja (e) ihmisen . . T-solut.

* ·

Kuvat IB ja 1C osoittavat 125I-leimattujen apinan < < · '·* ' 25 aivojen kalvojen ja vastaavasti ihmisen T-solujen immuuni- » « ! * saostuksen; (f,i) verrokki ilman primääristä vasta-ainet- : ta; (g,j) monoklonaalinen vasta-aine OKT4; (h,k) 0KT8 mo- % noklonaalinen vasta-aine.

Kuvassa 2A nähdään tuoreisiin rotan pikkuaivojen 30 kalvoihin kohdistuneen spesifisen 125I-gp 120:n sitoutumisen syrjäytyminen. Kukin määritys tehtiin kolmesti; tulokset f yhdestä kolme kertaa samanlaiset tulokset antaneesta kokeesta on esitetty. Sellaisen spesifisen sitoutumisen as- : te, joka oli syrjäytettävissä 10 pg/ml 0KT4:a ja 4A:a, 35 vaihteli 27 ja 85 % välillä kokonaissitoutumisesta, joka esitetyssä kokeessa oli 2201 ± 74 cpm.

. «

I I I

Ψ · 12 99115

Kuva 2B osoittaa, että peptidi T ja sen synteettiset analogit tekevät viruksen sitoutumisen tehottomaksi. Kukin määritys tehtiin kahdella rinnakkaiskokeella. Tulokset edustavat yhtä koetta, joka toistettiin kolmasti sa-5 manlaisin tuloksin.

Esimerkki 1 125I-gp 120: n sitoutuessa spesifisesti pääkalloapi-nan, rotan tai ihmisen aivojen kalvoihin saadaan yksi ra-dioaktiivisesti leimautunut, noin 180 Kd:n ristiinsitoutu-10 mistuote, jota ei voida erottaa vastaavasta ihmisen T-so-luihin sitoutuneesta tuotteesta (kuva IA). Tämä tulos osoittaa, että gp 120 voidaan kytkeä noin 60 Kd:n proteiiniin; reagoimaton 125I-gp 120 kulkeutuu ilman kalvoja ajetun verrokin vieressä (kanava a).

15 Radioaktiivisella jodilla leimattujen ihmisen aivo jen kalvojen immuunisaostus 0KT4:lla ja OKT8:lla (10 pg/ ml)(kuva IB) osoittaa, että aivojen kalvot sisältävät T4-antigeenin, joka on kooltaan noin 60 Kd, eikä sitä voi erottaa ihmisen T-lymfosyyteistä tunnistetusta vastaavasta 20 antigeenistä (kuva 1C); tätä vastoin OKT8:lla suoritetussa immunosaostuksessa saostuu T-lymfosyyteistä (kuva 1C) pienen (noin 30 Kd) molekyylipainon omaava proteiini, jota ei esiinny aivojen kalvoissa (kuva IB), mikä viittaa siihen, että aivojen T4 ei ole peräisin näihin paikallistuvista V 25 lymfosyyteistä. Samanlaisia tuloksia (tuloksia ei esitet-• · • ’ · ty) on saatu apinan ja rotan pikkuaivojen kalvoja käyttä- « · 2 *,· mällä. Nämä tulokset osoittavat, että T4-antigeeni toimii ;:· virusreseptorina ja se on hyvin säilynyt 60 Kd:n molekyy- li, joka on yhteinen immuunijärjestelmälle ja keskusher- t 30 mostolle.

Sen seikan toteaminen, että Epstein-Barr ja HTLV- f «· III/LAV omaavat lähes identtiset oktapeptidijaksot, johti "peptidi T"n synteesiin ja tutkimiseen. Kuva 2 osoittaa, ; että 125I-gp 120: n sitoutuminen vastavalmistettuihin rotan I · ' 'f 35 aivojen kalvoihin tapahtuu suurella affiniteetilla (0,1 » t * Λ * * » - · * · 13 99115 nM:n alue) ja että tämä on kyllästyvää. Spesifisyyden (kuva 2B) osoittaa estyminen 0KT4:lla ja 0KT4A:lla, mutta ei 0KT3:lla (0,1 pg/ml). Peptidi T ja kaksi sen synteettistä analogia estivät merkittävästi 125I-gp 120:n sitoutu-5 misen 0,1 nM:n alueella (kuva 2C) (mutta tähän yhteyteen kuulumaton oktapeptidi aine P (1-8) ei tätä tehnyt). Asemaan 8 tehty D-threoniiniamidikorvaus aiheutti ainakin 100-kertaisen reseptoriin kohdistuvan sitoutumisaktiivi-suuden katoamisen. Klassinen (L-ala):n korvaus (D-ala):lla 10 johti pysyvästi vaikutuskykyisempään, nähtävästi enemmän peptidaasia kohtaan resistenttiin analogiin kuin peptidi T; C-pään päätetreoniini tuottaa pysyvästi jonkinverran lisääntyneen vaikutuskyvyn (kuva 3).

Kun testattiin synteettisten peptidien kykyä eh-15 käistä reseptoriin sitoutumista ihmisen T-soluissa, kokeiden suorittajat eivät tienneet sitoutumiskokeiden tuloksia. Tasolla 10'7 kolme sitoutumismäärityksessä aktiivista peptidiä vähentävät havaittavaa käänteistranskriptaasita-soa lähes 9-kertaisesti. Vähemmän aktiivinen sitoutumisen 20 syrjäyttäjä (D-thre)-peptidi T osoittautui niinikään sitoutumisen estoltaan suuresti heikentyneeksi, ja merkittävän eston aikaansaamiseksi sitä tarvittiin 100 kertaa suu-; rempi pitoisuus. Näin ollen ei ainoastaan neljän peptidin luokkien välinen järjestys ((D-( Ala ^-peptidi T-amidi > (D- » · ♦ 25 (Ala ^-peptidi T > peptidi T > (D-(Thr )8-peptidi T-amidi), • · *. . vaan myös näiden reseptoriin sitoutumisen esto korreloi • · · 14 99115 suuksiensa puolesta ei voida erottaa T4-antigeenista. Käyttämällä menetelmää, jolla aivojen leikkeistä havaitaan vasta-ainetta sitoneet reseptorit, esitettiin aivojen T4:n hermoanatornisen jakautuman muodostama hahmo, joka on ti-5 hein kuorikerroksen hermosyiden pääteverkossa ja joka on järjestynyt analogisesti kaikilla kolmella nisäkkäällä.

Myös radioaktiivisesti leimattu HIV-viruksen vaipan glyko-proteiinin sitoutuminen tuotti vastaavanlaisen hahmon peräkkäisissä leikkeissä, mikä viittaa siihen, että T4 oli 10 HlV-reseptori.

Esimerkki 3

Kemiallinen hermoanatomia, tietokoneavusteinen ti-heysmittaus

Tuoreena jäädytettyjen ihmisen, apinan ja rotan 15 aivojen 25 mikronin kryostaattileikkeet kiinnitettiin sulattamalla ja kuivattiin geelipäällysteisille objektila-seille ja reseptorit saatettiin havaittaviksi julkaisussa Herkenham ja Pert, J. Neurosci., 2, sivut 1129-1149 (1982) kuvatulla tavalla. Inkuboinnit T4:a, T4A:a, T8:a ja 20 Tll:a kohtaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa (10 pg/ ml) ja ilman näitä suoritettiin yön yli 0 °C:ssa RPMIrssa, ristiinsidottiin antigeeneihinsa ja saatettiin havaitta- • viksi 125I-vuohen hiirtä vastaan suunnatulla vasta-aineella. 125I-gp 120:11a tapahtuvaa antigeenin/reseptorin leimaamista « · · 25 varten suoritetut objektilasille kiinnitettyjen kudosleik- • · ·. . keiden inkuboinnit suoritettiin 5 ml:n objektilasisäi- • · « ; ·* liöissä käyttäen (10‘6 leimaamatonta gp 120: a tai 0KT4A (10 • · · pg/ml) monoklonaalista vasta-ainetta tai jättäen nämä • · · · pois, kuten yllä on kuvattu kalvojen käytön yhteydessä.

30 Suoritettiin tietokoneavusteinen autoradiografia- filmin muunnos kvantitatiivisiksi värikuviksi. Apinan aivojen leikkeiden kanssa rinnan suoritettu valotus tunnetun radioaktiivisuuslisäyksen sisältäviä standardeja käyttämällä antoi tulokseksi lineaarisen kuvaajan (4 => 0,99) 35 log 0D:n ja cpm:n suhteen, josta radioaktiivisuuden suh- 15 99115 teellinen pitoisuus voidaan mielekkäästi ekstrapoloida. Aivoleikkeiden solujen värjäys tioniinilla suoritettiin klassisilla menetelmillä ja reseptorit saatettiin havaittaviksi värjätyssä kudoksessa.

5 Esimerkki 4

On suoritettu kokeita T4-antigeenin jakautuman määrittämiseksi pääkalloapinan aivojen etuosasta takaosaan ulottuvassa sarjassa tai pitkin vaakatasoa tehdyissä leikkeissä. Nämä kokeet osoittavat, että T4 monoklonaalisen 10 vasta-aineen sitoutumista aivorungon (esim. substantia nigraan) soluarkkitehtuuriin nähden mielekkäille alueille tapahtuu havaittavan suurissa määrissä, mutta silmiinpistävä kuorikerrokseen rikastuva esiintymishahmo näkyy her-mostoakselin jokaisella tasolla. 0KT8, T-lymfosyyttiä koh-15 taan suunnattu monoklonaalinen vasta-aine samasta alaryhmästä kuin 0KT4, ei muodosta minkäänlaista tunnistettavaa hahmoa. Aivojen kuorikerroksen kaikkein ylimmät pintakerrokset sisältävät yleensä T4-antigeenin tiheimmän pitoisuuden; isojen aivojen kuorikerroksen otsalohko ja limbis-20 tä järjestelmää ympäröivä kuorikerroksen osa mantelitumak-keen yläpuolella sisältävät erityisen paljon reseptoreita, jotka paikallistuvat kaikkialle sisäisiin kerroksiin. Re-. _._ septorien tihein pitoisuus kohdistuu aivotursoalueelle apinan, rotan ja ihmisen aivoissa. Filminkehitysliuokseen ,·. 25 kastettujen pääkalloapinan leikkeiden pimeäkenttämikrosko- • · :t ‘ pointi paljasti, että reseptorien tiheimmän leimautumisen • · · ' ·* vyöhyke sijaitsee hammaspoimun molekulaarisessa kerrokses- sa ja itse aivotursossa (joka sisältää hyvin vähän neuro- • I » · neja). Reseptorit siis näyttävät sijoittuvan juuri sopi- 30 vasti kattamaan hermosyiden pääteverkkoaluetta (hermopäät-teiden ja viejähaarakkeiden hermojatkoksia) tai sijoittu-vat johonkin erityiseen värjäytymättömään tähtitukikudok-sen solujen alaryhmään.

On tehty määrityksiä, joista ilmenee näyttöä kerni -35 allisen hermoanatomian spesifisyydelle ja joista saadut 16 99115 tulokset osoittavat, että T4 ja viruksen vaipan proteiinin tunnistava molekyyli eivät poikkea toisistaan. Rotan aivojen vaakatason suuntaisissa leikkeissä paljastui hahmoltaan hyvin samanlainen isojen aivojen kuorikerrokseen/ai-5 votursoon keskittyvä reseptorijakautuma riippumatta siitä, käytettiinkö havaittavaksi saattamiseen 0KT4 tai 125I-gp 120. Lisäksi tällaista hahmoa ei havaittu, kun inkubointi tapahtui leimaamattoman gp 120:n (1 μΜ), 0KT4A:n (10 pg/ ml) tai 0KT4:n (10 pg/ml) läsnäollessa. Mitään tunnistet-10 tavaa hahmoa ei saatu rotan aivoista muilla toisia ihmisen T-solujen antigeenejä kohtaan suunnatuilla hiiren monoklo-naalisilla vasta-aineilla, 0KT8 ja 0KT11 mukaanlukien, kun havaittavaksi saattaminen suoritettiin 125I-vuohen anti-hiiri IgG sekundaarisella vasta-aineella, samoin kuin pelkkää 15 sekundaarista vasta-ainetta käyttämällä ei löytynyt toistettavasta havaittavaa antigeeniä/reseptoria.

m m • · • · • · • · · • · • · • · · »mmm mmm m · · • · · m m m m m m mm m

Claims (10)

17 99115

1. Peptidi, tunnettu siitä, että sillä on kaava I: 5 X-R*-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb-X (I) jossa kaavassa Ra on aminopään pääteryhmä Ala- tai D-Ala-,

10 Rb on karboksipään pääteryhmä -Thr tai -Thr-amidi, ja X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, tai peptidillä on kaava II:

15 X-R1-R2-R3-R4-R5-X (II) jossa kaavassa R1 on aminopään pääteryhmä Thr-, Ser-, Asn-, Leu-, Ile-, Arg- tai Glu-,

20 R2 on Thr, Ser tai Asp, R3 on Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys tai Trp, R4 on Tyr, ja R5 on karboksipään pääteaminohapporyhmä, vastaava D-aminohappo, vastaava amidijohdannainen tai R5 puuttuu, ja 25 X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, • · ’ edellyttäen kuitenkin ettei peptidi ole Ser-Thr- : Asn-Tyr-Thr, .... tai niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat. v

: 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, t u n - 30. e t t u siitä, että se on kaavan II mukainen peptidi, *.'· jossa • * · « R1 on Thr-, Ser- tai Asn-, R3 on Thr, Ser, Asn tai Arg, ja R5 on -Thr, -Arg tai -Gly. 18 99115

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siltä, että se on kaavan II mukainen peptidi, josta R5 puuttuu.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, t u n -5 n e t t u siitä, että se on Cys-R1-R2-R3-R4-R5-Cys.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että se on Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr, Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr,

10 Ser-Ser-Thr-Tyr-Arg, Asn-Thr-Ser-Tyr-Thr, Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr Asn-Thr-Ser-Tyr-Gly, Ser-Thr-Asn-Tyr-Arg,

15 Ser-Ser-Arg-Tyr-Arg, Thr-Thr-Ser-Tyr-Ser, tai Cys-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Cys.

6. Koepakkaus sellaista antigeeniä kohtaan suunnattujen vasta-aineiden määrittämiseksi, joka sitoutuu T4 20 reseptoriin, tunnettu siitä, että se sisältää huokoiseen pintaan tai kiinteälle alustalle sidotun patenttivaatimuksen 1 mukaisen peptidin.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koepakkaus, tunnettu siitä, että antigeeninen peptidi on si- 25 dottu mikrotiitterilevyn seiniin.

• · • 8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen pepti- • · « ·1 ·' din käyttö diagnostisessa menetelmässä ihmisen immuuni- katovirus (HIV)-infektion havaitsemiseksi kehonesteestä # f V · tai kudoksesta, joka menetelmä on käyttökelpoinen hankitun 30 immuunikato-oireyhtymän (AIDS) tai sen esiasteen diagno- ·1·.. soimiseen, jolloin a) näyte saatetaan reagoimaan mainitun antigeenisen peptidin kanssa, b) muodostetaan antigeeni-vasta-ainekompleksi, ja 35 c) havaitaan muodostunut antigeeni-vasta-ainekomp- leksi. II • I 19 99115

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että peptidiä käytetään diagnostisessa menetelmässä, jossa antigeeni-vasta-ainekompleksi määritetään immunomääritysmenetelmällä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että peptidiä käytetään diagnostisessa menetelmässä, jossa antigeeni-vasta-ainekompleksi määritetään radioimmunomääritysmenetelmällä, entsyymisidotulla immunomääritysmenetelmällä tai immunotäplämääritysmenetel-10 mällä. • · • · • · « » • · · « · • · t « · « « • · « « I 1 · Φ ♦ ' • · 1 I I · • · • · · * 20 99115