JP2680011B2

JP2680011B2 - Ｔ−４レセプターへの結合を阻害し免疫原として作用する小ペプチド類

Info

Publication number: JP2680011B2
Application number: JP62503520A
Authority: JP
Inventors: ビーパート，キャンデース; アールラフ，マイクル; エルファーラー，ウィリアム
Original assignee: US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Commerce
Priority date: 1986-06-03
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1997-11-19
Anticipated expiration: 2012-11-19
Also published as: ES2061497T3; NO880479L; CA1341066C; FI94352B; NO176022B; JPH01502659A; PT84992B; DE3787927D1; DK173667B1; HUT48907A; NZ220485A; IL82719A; DE3787927T2; NO880479D0; FI885630A; FI94352C; IE871388L; AU604719B2; IL82719A0; DK53288A

Description

【発明の詳細な説明】発明の簡単な説明本発明は細胞表面上のレセプター部位を阻止して、ヒ
トＴ細胞のウイルス感染症を予防することによりヒト細
胞に結合するHTLV−III/LAV（以下HIVと称する）を阻害
する合成的に製造された短ペプチド配列に関する。これ
らのペプチドは感染症を防止すると共に、又はHIVウイ
ルスのエンベロープタンパク質に対する抗体産生も誘発
する。従って、これらのペプチド類はまた後天性免疫病
症候群（AIDS）の発生を予防するためのワクチンとして
の用途も有する。これらのペプチド類に対するモノクロ
ーナル抗体は、またHIVウイルスを確認するための診断
剤として用いることも可能である。従って、これらのペ
プチド及びこれらのペプチドに対する抗体はHIV保有者
或いはAIDSを患うヒトの確認のための試験キットの製造
における用途も有する。発明の背景 AIDS（HIV）ウイルスの完全なヌクレオチド配列は幾
人かの研究者により報告されている〔リー・ラトナー等
（Lee Ratner,et al.）、Nature313、277頁、1985年１
月；ミュージング等（Muesing,et al.）Nature313、450
頁、1985年２月；及びウェイン−ハブソン（Wain−Habs
on,et al.）、Cell40、９〜17頁、1985年１月参照）。
エンベロープ遺伝子は特に抗原体及び感染性と関連付け
られてきた。しかしながら、エンベロープ部分はまた高
度に拡散性である領域を有することも知られている。HI
Vウイルスエンベロープ糖タンパク質はヒト、ラット、
及びサルの脳膜及び免疫系の細胞に共有的に結合するこ
とが示されてきた。ウイルスが細胞膜レセプター上の高度に特異的部位に
おける付着により細胞及び組織親和性を及ぼすことがあ
るという理解は研究者が細胞膜のウイルスレセプター部
位に結合する試剤を探索してこれらの細胞への特定のウ
イルスの結合を予防することを勇気付けた。合成ペプチ
ド類により阻止される特別のレセプター−媒介ワクチニ
アウイルス感染症は従来示されている〔エプスティン等
（Epstein,et al.）、Nature318、663〜667頁）〕 HIVウイルスはＴリンパ球及びマクロファージを含むH
IV感染にかかりやすい各種細胞上に存在するCD4或いはT
4領域として知られている表面細胞に結合することが示
されている〔HTLV−IIIの親和性（tropism）の議論につ
いてショー等（Shaw et al.）、Science226、1165−117
1頁、参照〕。免疫不全から生ずる徴候に加えて、AIDSを有する患者
は神経心理学的欠陥を示す。中枢神経及び免疫系は多く
の神経タンパク質−媒介細胞間連絡のためのレセプター
として働く多くの特異的細胞表面認識分子を有する。こ
れらの神経タンパク質類及びそれらのレセプターは単細
胞生物並びに高等動物において極めて不変の形態で十分
に保存されている十分な進化的安定性を示す。更に、中
枢神経及び免疫系はHIVエンベロープ糖タンパク質（gp1
20）の結合のためのレセプターとして働く共通のDC4（T
4）細胞表面認識分子を示す。同一の高度に保存された
神経タンパク質情報物質はHIVのそれと顕著に類似した
レセプターを介して免疫及び脳機能を一体化するので、
我々はHIV糖タンパク質gp120と、従来エプスタイン−バ
ーウイルスのエンベロープ領域から別の関連において確
認された短ペプチドの間の極めて類似のアミノ酸配列が
ウイルスレセプター結合に必須の核ペプチドを示すので
はないかと仮定した。その様なペプチドはレセプター細
胞と結合し、HIVgp120の結合を阻止することによりHIV
による細胞の感染を予防するのに有用であり、その様な
レセプター部位に結合するペプチドはそのペプチド配列
に向けられた抗体の産性を生じ、又これらのペプチド類
がAIDSの予防のための免疫学的基礎を与えるのに用いら
れるであろうと仮定された。目的本発明の目的はHIV（AIDSウイルス）の脳膜及び免疫
系の細胞のレセプター部位への結合を予防することによ
りAIDSの徴候を緩和する作用を行うペプチド類を提供す
ることである。本発明の目的又はHIV（AIDSウイルス）に曝されるか
もしれないヒトにおけるAIDSの発生に対して保護する抗
体を生ずるために用いられるワクチン用のペプチド類を
提供することである。更に、本発明の目的はHIV或いはHIVエンベロープタン
パク質に対する抗体の存在を確認する診断手段を提供す
ることである。発明の具体的説明 HIVエンベロープ糖タンパク質（gp120）におけるオク
タペプチドがコンピュータの助けを借りた分析により確
認された。高スレオニン含量により「ペプチドＴ」と称
されるこのペプチドはgp120の脳膜への結合を阻害する
ことが示された。このペプチドはAla−Ser−Thr−Thr−
Thr−Asn−Tyr−Thrの配列を有する。後の分析は同様な
結合特性を有する関連ペンタペプチド類の群を開示し
た。本発明の第一の側面に従えば、下記一般式（Ｉ）で表
わされるペプチド： R^a−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−R^b （Ｉ）（式中、R^aはアミノ末端残基Ala或いはＤ−Alaを表わ
し、及びR^bはカルボキシ末端残基−Thr或いは−Thrアミ
ド或いはそのアミノ及びカルボキシ末端の一方或いは両
方における追加のCys−残基との誘導体を表わす）、或いは下記一般式（II）で表わされるペプチド： R¹−R²−R³−R⁴−R⁵ （II）（式中、R¹はアミノ末端残基Thr−、Ser−、Asn−、Glu
−、Arg、Ile或いはLeu−であり、 R²はThr、Ser或いはAspであり、 R³はThr、Ser、Asn、Arg、Gln、Lys或いはTrpであ
り、 R⁴はTyrであり、及び好ましくはR⁵はカルボキシ末端残基−Thr、Arg或い
は−Gly或いはそのアミノ末端残基としての対応するＤ
−アミノ酸、及び／又はカルボキシ末端残基における対
応するアミド誘導体及び／又は更にアミノ酸カルボキシ
末端の一方或いは両方におけるCys−残基との誘導体で
ある）が提供される。R⁵における好ましいアミノ酸が示
されたが、この位置におけるアミノ酸は広範に変ること
が知られている。事実、R⁵が存在しない場合には、この
ペプチドをカルボキシ末端アミノ酸としてR⁴（チロシ
ン）でこのペプチドの末端を形成することが可能であ
る。その様なペプチド類は茲に教えられる基の結合特性
を保持する。セリン及びスレオニンは茲に教えられる生
物学的性質の目的で交換可能であるように思われる。本
発明の活性化合物はこれらのペプチド類の生理学的に許
容可能な塩として存在してよい。このペプチド類はT4ウイルスレセプターに結合するこ
とが判明した。最も好ましいペプチド類並びに上記ペプチドＴは下記
一般式（Ｉ）のオクタペプチド類：Ｄ−Ala−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr及びＤ−
Ala−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr−アミド、及び下記一般式（II）で表わされるペンタペプチド類： Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr Thr−Thr−Ser−Tyr−Thr Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr、及びアミノ末端残基としてのＤ−Thr及び／又はカルボ
キシ末端におけるアミド誘導体とのそれらの類似体であ
る。本発明の化合物は分子の血液−脳障壁の通過を高める
ことが知られている方法により有益に変成される。この
ペプチドの結合活性を高めるためにアセチル化が特に有
用であることが判明した。末端アミノ及びカルボキシ部
位が特に好ましい変成部位である。このペプチド類は又拘束立方体配座において変成され
て、改良された安定性及び経口利用可能性を与える。以下、次の略号を用いる：アミノ酸三文字記号一文字記号アルギニン arg Ｒアスパラギン asn Ｎアスパラギン酸 asp Ｄシステイン cys Ｃグリシン gly Ｇセリン ser Ｓスレオニン thr Ｔチロシン tyr Ｙ特に断りのない限り、示されるアミノ酸は勿論Ｌ−ス
テレオアイソマーの天然形態にある。 12個のペンタペプチド類のアミノ酸配列の比較を表１
に示す。歴史的には我々の初期のコンピュータ探索はペ
プチドＴ（ARV単離体に含有）が関連部分であることを
示したが、追加のウイルス配列が利用可能となるにつれ
て関連する生活性配列は各自的にペプチドＴ〔４−
８〕、或いは配列TTNYTを含んでなるより短いペンタペ
プチドではないかということが明らかとなった。これら
の単離体において、我々は比較を行い（表１）、実質的
な類似性がこのより短い領域にのみ認められた。変化の
大部分は二つの密接に関連したアミノ酸、セリン（Ｓ）
及びスレオニン（Ｔ）の相互転換である。ペプチドＴの
７位のチロシンはこれらの造成物の不変の特徴であり、
それが生活性を担うものであることを示している。５位
における置換はＴ、Ｇ、Ｒ或いはＳを含む。４及び６位
は先ず、（一つの例外をもって）Ｓ、Ｔ及びＮに制限さ
れ、全てのアミノ酸は極めて類似の立体特性を有する未
荷電極性基を含有する。五つの各種AIDSウイルス単離体
（9,10）の中の一般的配列一致の評価はペプチドＴの周
り及びそれを含む領域は極めて可変性の領域であること
を示す。その様な可変性はこの位置に規定される機能の
強い選択的多様化による分化を示す。麻酔薬（opiate）
ペプチド類と同様に、これらのペプチドＴ類似物はmet
及びleuエンケファリンを想起させる多数形態で存在す
るように思われる。これらの各種AIDSウイルス単離体に
表わされるこれらのペンタペプチド類は生物学的に活性
であり、従来Ｔヘルパー細胞の表面「マーカ」として良
く知られていたCD4レセプターの作用薬として相互作用
することができる。７個のアミノ酸ペプチドCYS−THR−THR−ASN−TYR−T
HR−CYSも又活性である。核へのシステイン類の添加は
活性に悪影響を及ぼさない。これらのペプチド類はPeninsula laboratoriesにより
本発明者等と製造者間の秘密合意の下に注文合成され
た。固相ペプチド合成のMerrifield法が用いられた（本
発明において準用する米国特許第3,531,258号明細書参
照）。これらの合成されたペプチド類は特に好ましい。
ペプチドＴ及びその一部であるペンタペプチドはウイル
スから単離することが可能であったが、Merrifieldに従
って調製されたペプチド類はウイルス及び細胞残片がな
い。従って、合成ペプチド類が用いられる場合には汚染
物質に対する厄介な反応が起こらない。本発明のペプチド類はペプチド合成の常法により製造
される。固相及び液相方法の両方が用いられる。我々は
Merrifieldの固相方法が特に便利であることを見出し
た。この方法において、ペプチドは鎖のカルボキシ末端
が不溶性支持体に共有的に結合されながら段階的に合成
される。中間合成段階に際し、ペプチドは固相に残るの
で、従って操作が便利である。固体支持体はクロロメチ
ル化スチレン−ジビニルベンゼン共重合体である。カルボキシ末端アミノ酸のＮ−保護形態、例えばｔ−
ブトキシカルボニル保護（Boc−）アミノ酸をクロロメ
チル化スチレンジビニルベンゼン共重合体のクロロメチ
ル残基と反応させて、アミノ酸がベンジルエステルの樹
脂に結合した樹脂の保護アミノアシル誘導体を生成す
る。これを脱保護し、次の必要なアミノ酸の保護形態と
反応させて樹脂に結合した保護ジベプチドを生成する。
このアミノ酸は一般的に活性化形態、例えばカルボジイ
ミド或いは活性エステルを使用して用いられる。この配
列を繰返すと必要なペプチドが樹脂上に組立てられるま
でペプチド鎖が必要なＮ−保護アミノ酸とアミノ末端で
縮合することにより一度の一つの残基を成長させる。こ
のペプチド−樹脂を次いで無水フッ化水素酸で処理して
必要なペプチドを放出させるために組立てペプチドを樹
脂に結合するエステルを切断する。合成操作中に、保護
されなければならないアミノ酸の側鎖官能基も又同時に
除去される。そのカルボキシ末端にアミド基を有するペ
プチドの合成は、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂
を用いて、常法により行うことができる。本発明の化合物は、細胞のレセプター部位を有効に阻
止し、及びサル、ラット及びヒト脳膜及び免疫系の細胞
におけるHIV（AIDSウイルス）による細胞感染性を予防
することが判明した。従って、本発明の一側面として、我々は、ヒト或いは
獣医学用に適した薬学的に許容可能な担体或いは賦形剤
と組合わされた本発明のペプチド化合物を含んでなる薬
学的組成物を提供する。その様な組成物は１種以上の生
理学的に許容可能な担体或いは賦形剤と混合して、常法
にて使用するように提供される。これらの組成物は必要
に応じて異なった抗ウイルス剤であってよい１種以上の
その他の治療剤を任意に含んで良い。即ち、本発明のペプチド類は経口、口腔内、非経口、
局所或いは直腸投与用に配合されてよい。特に、本発明によるペプチド類は注射或いは注入用に
配合されてよく、又、防腐剤を添加してアンプル内にお
ける単位投与形態或いは多投与容器内において提供され
てよい。これらの組成物は、油性或いは水性稀釈液内の
懸濁液、溶液或いはエマルジョンなどの形態をとって良
く、又、懸濁、安定化及び／又は分散剤などの配合剤を
含有してよい。或いは又、この活性成分は使用前に適当
な稀釈剤、例えば無菌、発熱物質のない水で戻されるよ
うな粉末形態であってよい。本発明に従う薬学的組成物は又抗微生物剤或いは防腐
剤などのその他の活性成分も含んで良い。これらの組成物は0.001〜99％の活性物質を含有する
ことができる。本発明は更に本発明のペプチドを薬学的に許容可能な
賦形剤或いは担体と合体することを特徴とする薬学的組
成物の製造方法を提供する。注射或いは注入による投与のために、約70kg体重の大
人の治療に用いられる毎日の投与量は、例えば、投与経
路及び患者の状態に応じて、１〜４回の投与で投与され
る。親和定数は、モルヒネのそれらと同様であると仮定さ
れた。この親和性に基づき、毎日、.33−.0003mg/kgの
投与量が示唆された。これは有効であることが判明し
た。10^-6〜10^-11モル血液濃度が示唆される。サルにお
いては、毎日3mg/kgが150×10^-9Mの血清濃度を達成す
る。この濃度は10^-8Mの濃度を達成するのに必要なもの
より15倍大きい。霊長類は通常ヒトに用いられる投与量
の10倍を必要とする。本発明の更にもう一つの側面は、AIDSウイルスによる
感染に対して保護を与えるための、本発明のペプチドを
含有するワクチン調剤に関する。このワクチンは任意に
適当な稀釈液、例えば無菌水、塩水或いは緩衝化塩水中
のヒト血清アルブミンなどのタンパク質に複合化された
有効な免疫原的量、例えば宿主のkg当り１μｇ〜20mgの
ペプチドを含有する。水酸化アルミニウムゲルなどのア
ジュバントが用いられてよい。投与は、例えば筋肉剤、
腹腔内、皮下或いは静脈内などの注射によって行われ
る。投与は、一回或いは、例えば１〜４週間間隔で複数
回行われる。カニからの抗原配列並びにその他の無脊椎動物からの
タンパク質も又、抗原性を促進するために、本発明のペ
プチド類に添加することができる。本発明の更にもう一つの側面は、抗原源としての本発
明のペプチド或いは本発明のペプチドにより顕在化され
たモノクローナル抗体を含有するAIDSウイルス及びAIDS
ウイルスに対する抗体の検出のための試験キットに関す
る。例えば、本発明のペプチドはAIDS感染を検出するた
め、及びそれを酵素結合イムノソーベントアッセイ（EL
ISA）或いは酵素イムノドットアッセイにおいて試験試
薬として用いることにより、AIDS及び前−AIDS状態を診
断するための試験キットに用いられる。その様な試験キ
ットは抗原性ペプチド或いはモノクローナル抗体が予備
吸着或いは共有的に結合された不溶性の多孔性表面或い
は固体基体（その様な表面或いは基体は好ましくはマイ
クロタイタープレート或いはウエルの形態が好まし
い）、試験血清、表面或いは支持体に吸着された抗原或
いは抗体に特異的に結合し飽和するヘテロ抗血清、各種
稀釈液及び緩衝液、特異的に結合した抗体を検出するた
めの標識化複合体（labelled conjugate）及びその他の
酵素基質、コファクター及びクロモゲンなどのシグナル
発生試薬を含むものである。本発明によるペプチドは、通常の技術を用いてAIDSウ
イルスのエンベロープ配列の関連部分に特異的に結合す
るモノクローナル抗体を顕在化する免疫原として用いら
れ、その様なモノクローナル抗体は更に本発明の特徴を
形成するものである。実験方法及びデータ gp120の放射標識化、脳膜の調製、gp120のレセプター
への結合及び架橋及びT4抗原の免疫沈澱。HIVのHTLV−I
II bをH9細胞内で増殖させ、gp120をイムノアフィニテ
ィクロマトグラフィ及び調製NaDodSO₄/PAGEにより単離
した。調製gp120をクロラミン−Ｔ法により¹²⁵Iで標識
化した。新鮮なヒト、サル及びラット海馬を100容の氷冷却50m
M Hepes（pH7.4）中で迅速にホモジナイズした（Polyt
ron,Brinkmann Instruments）。遠心分離（15,000×
ｇ）により集めた膜を元の緩衝液容量中で洗浄し、その
まま用いるか或いは−70℃に貯蔵した。使用前に、脳膜
及び高度に精製したＴ細胞（ref.16;Larry Wahlの贈
物）をリン酸緩衝化塩水（PBS）中において15〜30分間
プレインキュベートした。20mg（初期湿潤重量）の脳
（α100μｇのタンパク質）から得られた膜を28,000cpm
の¹²⁵I−gp120と共に0.1％のウシ血清アルブミン及びペ
プチダーゼ阻害剤バシトラシン（0.005％）アプロチニ
ン（0.005％）、ロイペプチン（0.001％）、及びキモス
タチン（0.001％）を含有する200（最終容量）の50mM
Hepes内で37℃において１時間インキュベートした。
インキュベート物を迅速に真空過し、計数してレセプ
ター−結合物質を求めた。免疫沈澱。免疫沈澱は0.5％ Triton Ｘ−100/PBS可
溶化、ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダー
ゼ/I−ヨード化脳膜或いは完全Ｔ細胞を示されたmAbと
反応当り10μｇでインキュベーション（４℃で一晩）す
ることにより調製した。固相免疫吸着剤（イムノビー
ズ、Bio−Rad）を用いて免疫複合体を沈澱させてからそ
れらをNaDodSO₄/PAGEにより分割した。対照インキュベ
ーションは一次mAb或いはサブクラス対照mAb（OKT8）を
含有していなかった。化学的神経解剖及びコンピュータ補助濃度測定。新鮮
−凍結ヒト、サル及びラット脳のクリオクタット−切断
25μｍ断片をゼラチン被覆スライド上に解凍−搭載し、
乾燥させ、レセプターを説明されているようにして可視
化した。（18）。T4、T4A、T8、及びT11に対する抗体
（10μg/ml）と共に或いは無しに、RPMI培地中でインキ
ュベーションを０℃で一晩行い、それらの抗原に架橋さ
せ、及び¹²⁵I−標識化ヤギ抗−マウス抗体で可視化し
た。抗原−レセプターを¹²⁵I−gp120で標識化するため
のスライド−搭載組織断片のインキュベーションを未標
識化gp120或いはmAb OKT4（10μg/ml）（Ortho Diagno
stics）と共に（１μＭ）或いは無しに5mlスライド担体
中にて行った。Ｔ−リンパ球サブセットの分離。Ｔ細胞のサブセット
をPercoll密度精製末梢血液Ｔ細胞を特定のモノクロー
ナル抗体（T4或いはT8）で10μg/mlにて処理することに
より得た。これらの処理細胞を次いでヤギ〔Ｆ（ab′）
_２〕抗−マウス免疫グロブリン（Sero Lab,Eastbury、
メリーランド州）で被覆されたプラスチックペトリ皿上
で４℃で30分間パン処理した（21）。非付着細胞を次い
で除去し、洗浄し、フローシトメトリー（flow cytomet
ry）により反応性を分析した。分離されたT4及びT8細胞
集団は他のＴ細胞サブセットの＜５％の汚染を有する。
細胞を次いでファイトヘマグルチニン（１μg/ml）共に
72時間培養し、下記の如きHIVに曝露した。細胞毒性ア
ッセイが行われた際に感染細胞を表現型的に特性化し
た。ウイルス感染。感染に用いられたHTLV−IIIウイルス
は新鮮なAIDS患者物質から確立され、許容可能なIL−２
−非依存性細胞系統であるHuT78中に継代したインター
ロイキン２（IL−２）−依存性培養Ｔ−細胞系統から単
離された。図面の簡単な説明第1A図は、¹²⁵I−gp120の脳膜及びＴ細胞への架橋を
示す、（ａ）¹²⁵I−gp120のみ；（ｂ）サル；（ｃ）ラ
ット；（ｄ）ヒトの脳；及び（ｅ）ヒトのＴ細胞。第1B図及び1C図は、それぞれ¹²⁵I−標識化サル脳膜及
びヒトＴ細胞の免疫沈澱を示す；（f,i）一次抗体のな
い対照例；（g,i）OKT4 Mab;（h,k）OKT8 Mab。第2A図は新鮮なラット海馬膜への特異的¹²⁵I−gp120
結合の転位を示す。各測定は三重に行われた。その一つ
の実験の結果が示されている。この実験は３回行なわれ
同様な結果が得られた。10μg/mlのOKT4及び4Aにより転
位可能な特異的結合は示される実験においては2201±74
cpmであった全結合の27〜85％の範囲にあった。第2B図はウイルス感染性がペプチドＴ及びその合成類
似体により阻止されることを示す。各測定は二重に行わ
れた。結果は同様な結果をもって３回繰返された単一の
実験を表わす。例１。約180Kdの単一放射標識化架橋生成物を¹²⁵I
−gp120をヒトＴ細胞のそれとは識別不可能なリスザ
ル、ラット或いはヒト脳膜からの膜に特異的結合をさせ
た後に得た（第1A図）。この結果はgp120は約60Kdのタ
ンパク質にカップリングさせることができ、未反応¹²⁵I
−gp120は膜のない対照例に隣接してある（レーンａ）
ことを示す。放射ヨード標識ヒト脳膜のOKT4及びOKT8（10μg/ml）
による免疫沈澱（第1B図）は脳膜がヒトＴリンパ球上に
確認されるそれと識別不可能な約60KdのT4抗原を含有す
ることを示し（第1C図）、これに対してOKT8は脳膜（第
1B図）中に存在しないＴリンパ球（第1C図）からの低
（約30Kd）分子量タンパク質を免疫沈澱させ、脳T4が存
在リンパ球に由来するものでないことを示している。サ
ル及びラット（示されず）の海馬膜についても同様な結
果が観察される。これらの結果はT4抗原がウイルスレセ
プターとして働き、免疫及び中枢神経系により共有され
る高度に保存された60Kd分子であることを示す。エプスタイン−バー及びHTLV−III/LAVが殆んど同一
のオクタペプチド配列を共有するという認識が「ペプチ
ドＴ」の合成及び研究を引起こした。第２図は新たに調
製したラット脳膜への¹²⁵I−gp120の結合の高い（0.1nM
範囲）親和性及び親和性（第2A図）を示す。特異性（第
2B図）はOKT4及びOKT4Aによる阻止によって示され、OKT
3（0.1μg/ml）では示されない。ペプチドＴ及び二つの
その合成類似体（しかし、無関連なオクタペプチド物質
Ｐ〔１−８〕ではない）は0.1nM範囲において¹²⁵I−gp1
20結合を有意に阻止した（第2C図）。８位におけるＤ−
スレオニン−アミドの置換の結果、少なくとも100倍の
レセプター結合活性の損失を生じた。〔Ｌ−Ala〕の古
典的〔Ｄ−Ala〕置換の結果、ペプチドＴよりも首尾一
貫してより強力なおそらく耐ペプチダーゼ性の類似体が
得られ、Ｃ末端のスレオニンのアミド化も又首尾一貫し
て幾分より大きい強度をもたらす（第３図）。合成ペプチドのヒトＴ細胞ウイルス感染を阻止する能
力を試験した際に、実験者は結合アッセイ結果に対して
盲目にされた。10^-7において結合アッセイにおいて活性
な３個のペプチドが検出可能なレベルの逆転写酵素活性
を殆んど９倍減少させることができる。より活性の低い
結合転位体〔Ｄ−Thre〕−ペプチドＴは同様に極めて減
少したウイルス感染の阻止を示し、有意な阻害を達成す
るためには、100倍より高い濃度を必要とした。この様
に、これらの四つのペプチドの強度のランク順序（Ｄ−
〔Ala〕_１−ペプチドＴ−アミド＞Ｄ−〔Ala〕_１−ペプ
チドＴ＞ペプチドＴ＞Ｄ−〔Thre〕_８−ペプチドＴ−ア
ミド）のみならず、又それらのレセプター結合及びウイ
ルス感染症を阻害する際の絶対的濃度も又密接に関連し
ている（第３図）。例２。ヒト細胞T4抗原に同一でないにせよ同様であ
る約60Kdのタンパク質は、ヒトの脳から調製された膜上
に明らかに保存された分子形態で存在した。更に、放射
標識化HIVエンベロープ糖タンパク質（¹²⁵I−gp120）は
その大きさ及び免疫沈澱の性質がT4抗原とは識別不能で
ある三つの哺乳動物の脳内に存在する分子に共有的に架
橋するとができる。脳スライス上の抗体結合レセプター
を可視化する方法を用いて皮質神経網に亘って最も高密
度であり、全ての三つの哺乳動物脳において同様に組織
されている脳T4の神経解剖分布パターンを提供した。
又、放射標識化HIVウイルスエンベロープ糖タンパク質
は隣接脳断片上に同一パターンで結合され、再びT4がHI
Vレセプターであることを示唆した。例３。化学的神経解剖、コンピュータ−補助密度分
析。新たに凍結したヒト、サル及びラット脳のクリオス
タット−切断25ミクロン断片をゲル被覆スライド上に解
凍搭載し、乾燥させ、及びレセプターをヘルケンハム及
びバート（Harkenham and Pert,J.Neurosci.,2、1129−
1149頁1982年）により説明されているように可視化し
た。T4、T4A、T8及びT11に対する抗体（10μg/ml）を用
いて或いは無しにインキュベーションをRPMI中で０℃で
一晩行い、これらの抗原に架橋させ¹²⁵I−ヤギ抗マウス
抗体で可視化した。抗原／レセプターを¹²⁵I−gp120で
標識化するために、スライド搭載組織断片のインキュベ
ーションを、膜について上記した如く、5mlスライド担
体中で未標識化gp120或いはMab OKT4A（10μg/ml）（O
rtho Diagnostics）を用いて或いは用いずに行った。オートラジオグラフィフィルム不透明度の定量的色画
像へのコンピュータ−補助転換を行った。サルの脳断片
についての標準的公知増加量の放射能の共曝露はそれか
ら相対的放射能濃度を意味深く外挿することのできるlo
g O.D.対cpmの線形プロット（４＝＞.99）を生成した。
チオニンによる脳断片の細胞染色は古典的方法及び染色
組織上に重なるレセプターの可視化により行った。例４。リスザルの脳の吻側乃至尾方系列即ち冠状断
片上のT4抗原の分布を求めるために実験が行われた。こ
れらの実験は脳幹の細胞構築的に意味のある領域（例、
黒質）に結合する検出可能なレベルのT4モノクローナル
抗体があることを示すが、しかし、神経軸のいずれのレ
ベルにおいても皮質富化の顕著なパターンが明らかであ
る。OKT4と同一のサブクラスからのＴリンパ球に向けら
れたモノクローナル抗体であるOKT8は観察可能なパター
ンを示さない。一般的に、脳皮質内部のより外面上の層
は最も高密度のT4抗原濃度を有し、小脳扁頭に重なる前
頭及び周縁皮質は深層の至る所において特にレセプター
に富んでいる。海馬形成はサル、ラット及びヒトの脳に
おいて最も高密度のレセプター濃度を有する。写真エマ
ルジョンに浸漬したリスザル断片の暗視野顕微鏡写真は
最も高密度のレセプター標識化のバンドが歯状回及び海
馬本体の分子層（極めて少ないニューロンを含む）内に
位置していることを示した。この様に、レセプターは神
経網に（樹状突起及び軸索のニューロンの延長）上に正
しく分布されているように思われ、或いは未染色大グリ
ア細胞の特定のサブセットに局在化しているかもしれな
い。化学的神経細胞の特異性及びT4及びウイルスエンベロ
ープ認識分子が識別不能であることを示す結果の証拠が
求められた。ラット脳の冠状断片は視覚化にOKT4或いは
¹²⁵I−gp120のいずれが用いられてもレセプター分布の
極めて類似の皮質／海馬−濃厚パターンを示した。更
に、このパターンはインキュベーションが未標識化gp12
0（１μＭ）、OKT4A（10μg/ml）或いはOKT4（10μg/m
l）の存在下で行われた場合には明らかでなかった。OKT
8及びOKT11を含むその他のヒトＴ細胞表面抗原に対する
その他のマウスMabは二次抗体単独では再現可能な、検
出可能な抗原／レセプターが無かったと正に同様に¹²⁵I
−ヤギ抗マウスIgG二次抗体により視覚化した際にラッ
ト脳上に検出可能なパターンを与えなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 前置審査 (56)参考文献ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ. 211，Ｎｏ．１（1987）ｐ．17〜ｐ．22

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．下記の式（Ｉ）で表されるペプチドまたはその生理
学的に許容可能な塩。 Ra−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Rb （Ｉ）（前記式中、 Raは、AlaまたはＤ−Alaを表し、 Rbは、Thr、Thr−アミドまたはThr−Cysを表す。）２．下記の配列：Ｄ−Ala−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr、またはＤ−Ala−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr−アミドのいずれかである、請求の範囲第１項に記載のペプチ
ド。３．下記の配列を有する、請求の範囲第１項に記載のペ
プチド： Ala−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr。４．下記の式（II）で表されるペプチドまたはその生理
学的に許容可能な塩。 R¹−R²−R³−Tyr−R⁵ （II）（前記式中、 R¹は、Thrを表し、 R²は、ThrまたはAspを表し、 R³は、Thr、Ser、またはAsnを表し、そして R⁵は、Thr、Thr−アミド、またはThr−Cysを表す。）５．下記の配列： Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr、 Thr−Thr−Ser−Tyr−Thr、または Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr のいずれかである、請求の範囲第４項に記載のペプチ
ド。６．下記の配列を有するペプチドまたはその生理学的に
許容可能な塩： Cys−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr−Cys。７．下記の式（Ｉ）で表されるペプチドまたはその生理
学的に許容可能な塩を有効成分として含有してなる、哺
乳動物細胞への抗原に結合を阻止するために用いられる
医薬組成物。 Ra−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Rb （Ｉ）（前記式中、 Raは、AlaまたはＤ−Alaを表し、 Rbは、Thr、Thr−アミドまたはThr−Cysを表す。）８．下記の式（II）で表されるペプチドまたはその生理
学的に許容可能な塩を有効成分として含有してなる、哺
乳動物細胞への抗原の結合を阻止するために用いられる
医薬組成物。 R¹−R²−R³−Tyr−R⁵ （II）（前記式中、 R¹は、Thrを表し、 R²は、ThrまたはAspを表し、 R³は、Thr、Ser、またはAsnを表し、そして R⁵は、Thr、Thr−アミド、またはThr−Cysを表す。）９．下記の配列を有するペプチド： Cys−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr−Cys を有効成分として含有してなる、哺乳動物細胞への抗原
の結合を阻止するために用いられる医薬組成物。１０．抗原がウイルスである、請求の範囲第７項記載の
医薬組成物。１１．抗原がウイルスである、請求の範囲第８項記載の
医薬組成物。１２．抗原がウイルスである、請求の範囲第９項記載の
医薬組成物。１３．ウイルスがAIDSの病原体である、請求の範囲第10
項記載の医薬組成物。１４．ウイルスがAIDSの病原体である、請求の範囲第11
項記載の医薬組成物。１５．ウイルスがAIDSの病原体である、請求の範囲第12
項記載の医薬組成物。１６．多孔性表面または固体基体に結合された、下記の
式（Ｉ）で表されるペプチドまたはその生理学的に許容
可能な塩を含んでなる、T4レセプターに結合する抗原に
対する抗体を検出するための試験キット。 Ra−Ser−Thr−Thr−Thr−Asn−Tyr−Rb （Ｉ）（前記式中、 Raは、AlaまたはＤ−Alaを表し、 Rbは、Thr、Thr−アミドまたはThr−Cysを表す。）１７．多孔性表面または固体基体に結合された、下記の
式（II）で表されるペプチドまたはその生理学的に許容
可能な塩を含んでなる、T4レセプターに結合する抗原に
対する抗体を検出するための試験キット。 R¹−R²−R³−Tyr−R⁵ （II）（前記式中、 R¹は、Thrを表し、 R²は、ThrまたはAspを表し、 R³は、Thr、Ser、またはAsnを表し、そして R⁵は、Thr、Thr−アミド、またはThr−Cysを表す。）１８．多孔性表面または固体基体に結合された、下記の
式で表されるペプチドまたはその生理学的に許容可能な
塩を含んでなる、T4レセプターに結合する抗原に対する
抗体を検出するための試験キット： Cys−Thr−Thr−Asn−Tyr−Thr−Cys。１９．ペプチドがマイクロタイタープレートのウエルに
結合されてなる、請求の範囲第16項に記載のキット。２０．ペプチドがマイクロタイタープレートのウエルに
結合されてなる、請求の範囲第17項に記載のキット。２１．ペプチドがマイクロタイタープレートのウエルに
結合されてなる、請求の範囲第18項に記載のキット。