DE69207200T2

DE69207200T2 - IMMUNTEST ZUM GLEICHZEITIGEN NACHWEIS VON HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II ANTIKÖRPERN

Info

Publication number: DE69207200T2
Application number: DE69207200T
Authority: DE
Inventors: Robert J. Biochem Pharma Inc. Laval Quebec H7T 2L1 Dwyer; Martial Biochem Pharma Inc. Laval Quebec H7T 2L1 2L1 Lacroix; Maan Biochem Pharma Inc. Laval Quebec H7T 2L1 Zrein
Original assignee: Adaltis Inc
Current assignee: Adaltis Inc
Priority date: 1991-07-29
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1996-08-22
Anticipated expiration: 2012-07-25
Also published as: CN1070484A; ATE132268T1; CA2114220A1; DE69207200D1; EG20183A; EP0605433B1; PT100731A; IL102615A; IE922452A1; AU2340992A; ZA925492B; PT100731B; JPH06509868A; ES2085631T3; JP2931100B2; NZ243636A; WO1993003376A1; EP0605433A1; IL102615A0

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Immunoassay-Kits, die verwendbar sind, um in einer biologischen Probe gleichzeitig Antikörper gegen die folgenden Viren nachzuweisen: HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Immunoassay-Kits.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Human-T-Zellen-Leukämie-Virus-Subtyp I (HTLV-I) ist ein Retrovirus, der mit dem Erwachsenen-T-Zellen-Leukämie/Lymphom (adult T-cell leukemia/lymphoma, ATL) nahe verwandt ist (Polesz et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 7415-7419). Er steht auch in Verbindung mit neurologischen Erkrankungen, die als tropische spastische Paraparesie und HTLV-I-assoziierte Myelopathie (HAM) bezeichnet werden (Cessain et al., 1985, Lancet ii, 407-410). Human-T-Zellen-Leukämie-Virus-Subtyp II (HTLV-II) wurde erstemale von einem Patienten mit T-Zellen- Haarzellenleukämie (Kalyanaraman et al., 1982, Science, 218, 571-573) isoliert. Er ist mit einer T-Zellen-Variante der Haarzellenleukämie verwandt.
Erwachsenen-T-Zellen-Leukämie/Lymphom (ATL) tritt hauptsächlich im Südwesten Japans, im Karibischen Becken und in Teilen Mittel- und Südamerikas auf. In diesen Regionen liegt die Serumhäufigkeit bei der allgemeinen Bevölkerung zwischen 5% und 15% und erreicht bei Gruppen mit höherem Alter 30%. In den Vereinigten Staaten liegen HTLV-I/II-Infektionen hauptsächlich bei Benützern intravenöser Drogen vor. In einer jüngeren Studie des Amerikanischen Roten Kreuzes (Williams et al., 1988, Science, 240, 643-646) konnten Antikörper gegen HTLV-I in 10 von 39.898 beliebig ausgewählten Blutspendern in acht U.S.-Städten nachgewiesen werden; dies stellt eine Serumhäufigkeitsrate von 0,025% dar. Eine ähnliche Untersuchung anhand von 3158 Probanden aus Nordägypten führte zur Identifizierung von zwei Trägern (Häufigkeitsrate von 0,06%) (El Parrash et al., 1988, Microbiol. Immunol., 32, 981-984). Bei diesen beiden Untersuchungen wurde zwischen Infektionen mit HTLV-I und HTLV-II nicht deutlich unterschieden.
Man nimmt an, daß auch AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), AIDS related complex (ARC) und pre-AIDS durch einen Retrovirus, insbesondere HIV (Human Immunodeficiency Virus), verursacht werden. Der erste AIDS-related Virus, HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV-1 und ARV bekannt), ist gut charakterisiert werden. Ein weiterer pathogener Retrovirus des Menschen, HIV-2 (früher LAV-2) genannt, wurde nun von westafrikanischen Patienten mit AIDS isoliert. Vgl. beispielsweise WO 87/04459. Es wurde unlängt gezeigt, daß HIV-2 eine Anzahl konservierter Sequenzen mit HIV-1 und den Simian Immunodeficiency Viruses (SIV) gemeinsam hat (Guyader et al., 1987, Nature 326, 662-669).
HTLV-I und HTLV-II unterscheiden sich beide von den AIDS- Viren HIV-1 und HIV-2 in ihrer morphologischen und ihrer genetischen Struktur. Infolgedessen sollten Antikörper gegen HIV- Antigene keine Kreuzreaktion mit HTLV-I- und HTLV-II-Antigenen aufweisen. Serumproben von Patienten mit AIDS zeigten jedoch ein gewisses Ausmaß an Kreuzreaktivität mit HTLV-Antigenen (Essex et al., 1983, Science, 200, 859-862).
Mehrere Beispiele für diagnostische Untersuchungen zum unabhängigen Nachweis von HTLV-Antigenen oder HIV-Antigenen gehören zum Stand der Technik. Beispielsweise betrifft Saxinger et al., 1984, Science, 225, 1473-1476, die Verwendung eines HTLV-I-Antigens als Immunoadsorbens in einem Enzym-Immunoassay (EIA) zum Nachweis von HTLV-I-Antikörpern. Ein weiteres Beispiel ist Gnann et al., 1987, J. Virol., 61, 2639-41, welches Peptidsequenzen betrifft, von welchen es heißt, daß sie zum Nachweis von HIV-1-Antikörpern nützlich sind.
Kürzlich wurden auf diesem Gebiet Versuche unternommen, Diagnose-Sets (bzw. Kits) zu schaffen, die gleichzeitig Antikörper gegen HTLV- und HIV-Antigene nachweisen können. Beispielsweise Anmeldung 136.798 Assay-Kits für den gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I, HTLV-II und HTLV-III (HIV-1). In diesen Kits stammten die HTLV-Antigene von HTLV- Virusteilchen, die aus verschiedenen transformierten Zellinien erhalten wurden. Anderseits betrifft die PCT-Anmeldung WO 90/08162 einen Immunoassay-Kit zum gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-1, HIV-1 und HIV-2 unter Verwendung von Antigenen, die aus dem Hüllenprotein von HTLV-1 und synthetischen HIV-Peptiden stammten.
Keiner dieser oben beschriebenen Tests bietet jedoch ein empfindliches Verfahren für den gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I, HTLV-II, HIV-1 und HIV-2. Tatsächlich stellt keine der oben beschriebenen Assays einen vollständig akzeptablen diagnostischen Test dar, selbst wenn der unabhängige Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II getrennt in Erwägung gezogen wird.
Diese früheren Untersuchungen sind in mehrerer Hinsicht nachteilig. In einigen Fällen werden bei den Tests ganze Viren oder bakteriell erzeugte Immunoadsorbentien verwendet. Der Verwendung dieser Präparate haftet ein Mangel an Spezifität an -- d.h. falsch positiven Ergebnisse --, das das Blut vieler nichtinfizierter Individuen normalerweise Antikörper gegen Verunreinigungen enthält, die üblicherweise in den Präparaten zu finden sind. Fasch positive Ergebnisse treten auch als Ergebnis gemeinsamer Epitope mit Viren, die weder mit HIV noch mit HTLV verwandt sind und die in diesen Präparaten vorhanden sein können, auf. Ein weiteres Problem bei diesen Assays des Standes der Technik ist ihre mangelhafte Empfindlichkeit. Eine mangelhafte Empfindlichkeit macht es möglich, daß verunreinigtes Blut unentdeckt bleibt und dadurch Emfpänger von Blutprodukten möglicherweise infiziert werden und eine fortgesetzte Infektiosität durch nicht diagnostizierte HIV- oder HTLV-Träger möglich ist. Man nimmt an, daß die mangelhalfte Empfindlichkeit in diesen Kombinationsassays des Standes der Technik auf die geringe Oberflächendichte der Epitope auf der Festphase des Assays bei Verwendung von Gesamtvirus- oder bakteriell erzeugten Präparaten zurückzuführen ist. Aus diesen und anderen Gründen besteht noch immer ein großer Bedarf an einem Assay, mittels welchem Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II gleichzeitig nachgewiesen werden. Ein solcher Test würde besser gewährleisten, daß infizierte Blutprodukte nicht in Blutbanken kommen und daß infizierte Personen rasch und frühzeitig eine Behandlung aufsuchen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die erfindungsgemäßen Assay-Kits lösen die oben angeschnittenen Probleme durch die Schaffung eines empfindlichen und spezifischen Mittels und Verfahrens zum gleichzeitig Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II in Proben von Körperflüssigkeiten.
Die Assay-kits dieser Erfindung umfassen auf einem festen Träger aufgetragens Peptide, die zum gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I, HTLV-II, HIV-1 und HIV-2 gegeignet sind.
Die vorliegende Erfindung sieht weiters Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Assay-Kits zum gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I, HTLV-II, HIV-1 und HIV-2 vor.
Die Assay-Kits der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens vier verschiedene HIV- und HTLV-Peptide, zwei für HIV und zwei für HTLV. Mindestens eines der HIV-Peptide kann einen Antikörper gegen HIV-1 erkennen, und mindestens eines der anderen HIV-Peptide kann einen Antikörper gegen HIV-2 erkennen. Auf ähnliche Weise kann mindestens eines der HTLV-Peptide einen Antikörper gegen HTLV-I erkennen und mindestens eines der anderen HTLV-Peptide einen Antikörper gegen HTLV-II erkennen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß, wenn zuerst die HTLV-I und -II-Peptide, und insbesondere wenn ein diese enthaltender Cocktail, auf den festen Träger aufgetragen wird und danach die HIV-Peptide, einzeln oder insbesondere in einem Cocktail, zugegeben werden, die Empfindlichkeit des resultierenden Assays stark verbessert wird. Daher ist auch ein Ziel dieser Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines Assay-Kits zum gleichzeitigen Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II, wobei die HTLV-I- und - II Peptide, vorzugsweise in Form eines Cocktails, zuerst auf den Träger aufgetragen und danach die HIV-1- und HIV-2-Peptide, wiederum vorzugsweise als Cocktail, dem Träger zugefügt werden.
Die Kits dieser Erfindung können zum Screenen einer großen Vielfalt biologischer Proben und Flüssigkeiten verwendet werden. Diese umfassen Blut, Plasam, Serum, Speichel, Harn, Tränen, Milch oder Zerebrospinalflüssigkeit.
Die HIV-1-Peptide, welche in den Kits und Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, sind aus der Gruppe der Peptide der Formal a-X-b ausgewählt, worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus.
und deren Analoga;
a ein Amino-Terminus, ein bis acht Aminosäuren, jedoch vorzugsweise ein bis fünf Aminosäuren und insbesondere ein bis drei Aminosäuren, oder ein Substituent ist, der wirksam ist, um die Bindung zu erleichtern oder die immunogene oder antigene Wirksamkeit des Peptids zu erhöhen; und
b ein Carboxy-Terminus, ein bis acht Aminosäuren, jedoch vorzugsweise ein bis fünf Aminosäuren und insbesonder ein bis drei Aminosäuren, oder ein Substituent ist, der wirksam ist, um die Bindung zu erleichtern oder die immunogene oder antigene Wirksamkeit des Peptids zu erhöhen.
Die in den Kits und Verfahren dieser Erfindung nützlichen HIV-2-Peptide sind ausgewählt aus der Gruppe der Peptide der Formel a Y-b, worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
und deren Analoga; und a und b der obigen Definition entsprechen.
Die in den Kits und Verfahren dieser Erfindung geeigneten HTLV-I-Peptide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Peptiden der Formel a-Z-b, worin Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
und deren Analoga; und a und b der obigen Definition entsprechen.
Die in den Kits und Verfahren dieser Erfindung nützlichen HTLV-II-Peptide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Peptiden der Formel a-W-b, wobei W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
und deren Analoga; und a und b der obigen Definition entsprechen.
Mindestens ein Peptid aus jeder Gruppe -- HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II -- wird in den Assay-Kits und Verfahren dieser Erfindung verwendet.

DETAILLIERTE BESCHRIEBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sieht Immunoassay-Kits vor, welche mindestens vier Peptide aufweisen, welche jeweils Epitope enthalten, die Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II erkennen und selektiv binden.
Wie oben definiert haben die einzelnen Peptide dieser vier Gruppen die Formel a-X-b, a-Y-b, a-Z-b bzw. a-W-b. Vorzugsweise wird ein Mitglied jeder Gruppe in den Kits und Verfahren dieser Erfindung verwendet. Diese Erfindung ist jedoch nicht derartig eingeschränkt. Beispielsweise kann auch mehr als ein Peptid von mindestens einer der Gruppen oder können auch mehrere Peptide aus jeder Gruppe verwendet werden. Es ist lediglich notwendig, daß mindestens ein Mitglied jeder Peptid-Gruppe a-X-b, a-Y-b, a- Z-b und a-W-b verwendet sind.
Wie hierein verwendet, bedeutet "Analoga" Aminosäure- Insertionen, -Deletionen, -Substitutionen und -Modifikationen an einer oder mehreren Stellen in der beschriebenen Peptidkette.
Bevorzugte Modifikationen und Substitutionen für die Aminosäuresequenz der Peptide dieser Erfindung sind konservative (z.B. jene mit minimalem Einfluß aus die sekundäre Struktur und hydropathische Natur der Peptide). Diese umfassen Substitutionen, wie die von Dayhoff in Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978, und von Argos in EMBO J. 8, 779-785, 1989, beschriebenen. Beispielsweise stellen Aminosäuren, die zu einer der folgenden Gruppen gehören, konservative Veränderungen dar: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; Cys, Ser, Tyr, Thr; Val, Ole, Leu, Met, Ala, Phe; Lys, Arg, His; und Phe, Tyr, Trp, His. Auf gleich Wesie kan Methionin, eine Aminosäure, die zur Oxidation neigt, durch Norleucin erstezt werden.
Die bevorzugten Substitutionen umfassen auch Substitutionen von D-Isomeren für die entsprechenden L-Aminosäuren.
Der Ausdruck "Aminosäure", wie in dieser Beschreibung verwendet (z.B. in der Definition von a und b), umfaßt alle natürlichen Aminosäuren, diese Aminosäuren in ihren D-Konfigurationen und nicht-native, synthetische und modifizierte Aminonsäuren, wie Homocystein, Ornithin, Norleucin und β-Valin.
Wie oben kurz angeführt ist es oft nützlich und liegt sicherlich im Bereich dieser Erfindung, die Peptide dieser Erfindung zu modifizieren, um die gewählten Peptide als immunodiagnostisches Reagens oder als Wirkstoff eines Vakzins besser geeignet zu machen. Solche Änderungen umfassen beispielsweise:
- die Addition eines Cysteinrests zu einem oder beiden Termini, um die Bindung des Peptids an einen geeigneten Trager mit heterobifunktionellen Vernetzungsreagentien, wie Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate, zu erleichtern, wobei bevorzugt Reagentien zur Bewirkung solcher Bindungen Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)- cyclohexan-1-carboxylat und N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)-propionat sind;
- die Addition von 1 bis 8 zusätzlichen Aminosäuren (vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3 Aminosäuren) an einen oder beide Termini des Peptids zur Erleichterung der Bindung der Peptide aneinander, zur Bindung an einen Träger oder ein größeres Peptid oder Protein oder zur Modifikation der physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids. Beispiele für solche Änderungen sind die Addition von N- oder C-terminalem Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure als Linker über eine Veresterungsreaktion und Lysin, das über eine Schiff'sche Base oder eine Amidbildung gebunden werden kann. Wie oben beschrieben, können solche zusätzlichen Aminosäuren jede der näturlichen Aminosäuren, diese Aminosäuren in ihrer D-Konfiguration und die bekannten nicht-nativen, synthetischen und modifizierten Aminosäuren umfassen; und
- die Drivatisierung eines oder beider Termini des Peptids durch beispielsweise Acrylierung oder Amidierung. Diese Modifikationen führen zu Veränderungen in der Netto-Ladung auf dem Peptid und können auch eine kovalente Bindung des Peptids an eine feste Oberfläche, einen Träger oder ein anderes Peptid erleichtern. Beispiele für die zur Erleichterung der Bindung oder zur Verbesserung der Immunogenität oder antigenen Aktivität des Peptids wirksamen Substituenten sind C&sub2;-C&sub1;&sub6;-Acylgruppen, Polyethylenglykol und Phospholipide.
Zur Herstellung der Peptide dieser Erfindung können alle herkömmlichen Peptidproduktionsmethodiken verwendet werden. Diese umfassen die Synthese, rekombinante DNA-Technik und Kombinationen derselben. Wir bevorzugten die Festphasensynthese. Bei dieser synthetischen Vorgangsweise kann der Harzträger jedes geeignete Harz sein, das herkömmlicherweise beim Stand der Technik für die Festphasenherstellung von Peptiden verwendet wird. Vorzugsweies ist ein ein p-Benzyloxyalkohol-Polystyrol- oder p-Methylbenzydrylamin-Harz. Nach der Bindung der ersten geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die Aminoschutzgruppe mittels Standardmethoden, die herkömmlicherweise auf diesem Gebiet verwendet werden, entfernt. Nach dem Entfenen der Aminoschutzgruppe werden sequenziell in der gewünschten Reihenfolge die übrigen geschützten Aminosäuren und, wenn nötig, Seitenketten-geschützten Aminosäuren gebunden, um das gewählte Peptid zu erhalten. Alternativ können mehrere Aminosäuregruppen unter Verwendung einer Lösungsmethodik - vor der Bindung an die auf dem Harzträger befindlichen Aminosäuresequenz - gebunden werden.
Als geeignetes Bindungsreagens wird ein auf diesem Gebiet übliches gewählt. Beispielsweise sind geeignete Bindungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Benzotriazol-1-yloxy-tris-(dimethyl)amino)-phosphonium-hexafluorphosphat, entweder alleine oder vorzugsweise in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol. Bei einem anderen geeigenten Bindungsverfahren werden vorgeformte symmetrische Anhydride geschützter Aminosäuren verwendet.
Die für jede, an der wachsenden Polypeptidkette eingeführte Aminosäure verwendete, notwendige α-Amino-Schutzgruppe ist vorzugsweise 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), obwohl jede andere geeignete Schutzgruppe verwendet werden kann, solange sie nicht unter den Bindungsbedingungen abgebaut wird und in Gegenwart jeder anderen, an der wachsenden Peptidkette bereits vorhandenen Schutzgruppe leicht selektiv entfernbar ist.
Die Kriterien für die Wahl der Schutzgruppen für die Seitenketten-Aminosäuren sind: (a) Stabilität der Schutzgruppe in jedem Schritt der Synthese gegenüber verschiedenen Reagenzien unter Reaktionsbedingungen, die für die Entfernung der α-Amino- Schutzgruppe selektiv sind; (b) Beibehaltung der strategischen Eigenschaften der Schutzgruppe (d.h., daß sie unter den Bindungsbedingungen nicht abgespalten wird); und (c) leichte Entfernbarkeit der Schutzgruppe nach Abschluß der Peptidsynthese und unter Bedinungen, die die Peptidstruktur ansonsten nicht beeinflussen.
Die vollständig geschützten, auf dem Harz getragenen Peptide dieser Erfindung werden vorzugsweise mit einer 50-60% Lösung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid während 1 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart geeigneter Radikalfänger, wie Anisol, Thioanisol, Ethylmethylsulfid, 1,2-Ethandithiol und verwandter Reagenzien vom p-Benzyloxyalkoholharz abgespalten. Gleichzeitig werden die meisten säurelabilen Seitenketten- Schutzgruppen entfernt. Besser säureresistente Schutzgruppen werden typischerweise mittels HF-Behandlung entfernt.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind als diagnostische Reagenzien zum gleichzeitigen Nachweis von HIV-1, HIV-2, HTLV-I oder HTLV-II-assoziierten Anitkörpern gemäß auf dem Gebiet wohlbekannter Methoden geeignet. Diese inkludieren ELISA, Hämagglutination, Einpunkt- und Mehrpunkt-Verfahren und Tests.
Vorzugsweise weisen die Test-Kits dieser Erfindung einen Enzym-verbundenen Immunoabsorptions-Test (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) auf. Dei dieser bevorzugten Ausführungsform wird ein Peptid oder eine Mischung aus mehreren Peptiden dieser Erfindung auf einem festen Träger, beispielsweise die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, adsorbiert oder kovalent an diesen gebunden. Überraschenderweise wird, wenn zuerst die HTLV-I/II-Peptide (oder vorzugswseise ein Mischung derselben) in die Vertiefungen gegeben werde, d.h., bevor die HIV-1/2-Peptide in die Vertiefungen gegeben werden, die Empfindlichkeit des Assays stark verbessert. Daher umfaßt die bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung einen Kit und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Kits, wobei eine Mischung oder ein Cocktail der HTLV-I- und -II-Peptide zuerst and den Träger gebunden wird und danach die HIV-1- und HIV-2- Peptide, und insbesondere eine Mischung derselben, an den Träger gebunden werden bzw. wird.
Geeignete feste Träger für die Assays und Verfahren dieser Erfindung inkludieren organische und anorganische Polymere, z.B. Amylasen, Dextrane, natürliche oder modifizierte Cellulosen, Polyethylen, Polystyrol, Polyacrylamide, Agarosen, Magnetit, poröses Glaspulver, Polyvinylfluorid (Kynar) und Latex, wobei die Innenwand des Testgefäßes (d.h. Teströhrchen, Titerplatten oder Küvetten aus Glas oder künstlichem Material) sowie die Oberfläche der Festkörper (d.h. Stäbe aus Glas und künstlichem Material, Stäbe mit Endverdickung, Stäbe mit mehreren Vertiefungen und Lappen oder Lamellen am Ende). Plastik-Mirkotiterplatten mit mehreren Vertiefungen sind besondes geeignet und als Festphasenträger bevorzugt.
Die bei dieser Erfindung verwendeten Peptide und Mischungen derselben können mittels jeglicher Methode und in jeder Menge, die zur Maximierung der Empfindlichkeit und Spezifität des resultierenden Kits wirksam ist, auf den festen Träger aufgetragen werden. Es wird bevorzugt, den festen Träger mit einer Lösung, die ein doer mehrere Peptide dieser Erfindung in einem Puffer gelöst aufweist, in Kontakt zu bringen. Obwohl der Puffer jeder herkömmlich zur Lösung von Peptiden und zu ihrer Aufbringung auf festen Trägern herkömmlich verwendete Puffer sein kann, wird die Verwendung einer 0,05 M Natriumcarbonatbicarbonatlösung (pH, 9,6) bevorzugt.
Die Peptidkonzentration im Puffer sollte ausreichen, um zu ermöglichen, daß eine wirksame Peptidmenge an der Oberfläche des festen Trägers haftet. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "wirksame Menge" eine Peptidmenge, mittels welcher auf einem festen Träger Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I bzw. HTLV-II in einer biologischen Probe wirksam nachweisbar sind.
Vorzugsweise weist die zur Bschichtung der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gemäß der Erfindung verwendete Peptidlösung eine Peptidkonzentration von zwischen 5 µg/ml und 10 µg/ml, und insbesondere 10 µg/ml, auf. Eine solche Peptidkonzentration kann auf ein einziges Peptid zurückzuführen sein, wenn nur ein einziges Peptid in der Lösung vorhanden ist, oder sie kann auf die Gesamtkonzentration aller Peptide in einem Cocktail zurückzuführen sein. Die Peptidcocktails dieser Erfindung werden typischerweise und vorzugsweise durch Mischen von Lösungen, die 5 µg/ml bis 10 µg/ml der einzelnen Peptide dieser Erfindung enthalten, hergestellt. Wenn beispielsweise ein Cocktail aus zwei Peptiden hergestellt werden soll, würde ein gewähltes Volumen einer 5 µg/ml- bis 10 µg/ml-Lösung von Peptid 1 mit einem gewählten Volumen einer 5 µg/ml- bis 10 µg/ml-Lösung von Peptid 2 gemischt. Der resultierende Cocktail würde infolgedessen eine Gesamtpeptidkonzentration von 5 µg/ml bis 10 µg/ml, und vorzugsweise 10 µg/ml, haben.
Die zur Herstellung der Peptidcocktails dieser Erfindung gewählten besonderen Volumina werden gewissermaßen empirisch ausgewählt, indem der resultierende Assay-Kit auf Empfindlichkewit und Spezifität für den Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II getestet wird. Die tatsächlichen Volumina der zur Bildung des Peptidcocktails gemischten Peptidlösungen können dann unabhängig voneinander innerhalb der oben angeführten Parameter variiert werdne, um im resultierenden Assay-Kit eine maximale Empfindlichkeit und maximale Spezifität zu erzielen, wobei man voraussetzt, daß die Peptidcocktails keine gleichen Mengen jedes Peptids, aus dem sie zusammengesetzt sind, enthalten müssen. Tatsächlich wird die Verwendung von Peptidcocktails bevorzugt, die mehr von sowohl BCH-408 als auch BCH-202ck als von BCH 132, und mehr BCH 456 als von sowohl BCH 234 als auch BCH 416 enthalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden die HTLV-I- und HTLV-II-Peptidlösungen (5 µg/ml bis 10 µg/ml, vorzugsweise 10 µg/ml) zur Bildung eines HTLV- Peptidcocktails vereinigt, bevor diese Peptide auf den festen Träger aufgetragen werden. Gleichermaßen ist die Vereinigung von HIV-1- und HIV-2-Peptidlösungen (5 µg/ml bis 10 µg/ml), vorzugsweise 10 µg/ml) zur Bildung eines HIV-Peptidcocktails vor Aufbringen derselben auf dem festen Träger bevorzugt. Die bei den Kits dieser Erfindung geeigneten bevorzugten Peptidzusammensetzungen sind: (1) ein HIV-1/2-Peptidcocktail enthaltend BCH-132, BCH-202ck und BCH-408 in einem Verhältnis von 1:40:60 und (2) ein HTLV-I/II-Peptidcocktail umfassend BCH-234, BCH-416 und BCH- 456 in einem Verhältnis von 1:1:4. Die Verhältnisse und Konzentrationen der Peptide in anderen Assay-kits dieser Erfindung können natürlich variiert werden, um die Empfindlichkeit und Spezifität der resultierenden Kits zu maximieren.
Die Peptidlösungen werden gemäß dieser Erfindung unter Verwendung herkömmlicher Techniken mit den Vertiefungen in Kontakt gebracht. Bei der Ausführungsform, bei welcher die Vertiefung mit jedem einzelnen Peptid separat beschichtet wird, werden typischerweise 60 µl der ersten Peptidlösung, 120 µl der zweiten, 180 µl der dritten und 240 µl der vierten verwendet. Dadurch ist es möglich, verschiedene Oberflächen der Vertiefung mit jedem Peptid zu beschichten. Bei der bevorzugten Ausführungsform, bei welcher ein HTLV-Cocktail und ein HIV-Cocktail verwendet wird, werden typischerweise 120 µl des HTLV-Cocktails und 240 µl des HIV-Cocktails - wieder aus demselben Grund - verwendet.
Die Zeitspanne, während welcher die Peptidlösung oder der Peptidcocktail mit dem festen Träger in Kontakt ist, sollte ausreichend sein, um zu ermöglichen, daß eine wirksame Menge des Peptids oder der Mischung von Peptiden an der Oberfläche des Trägermaterials anhaftet. Vorzugweise genügt eine Stunde bei Raumtemperatur. Bei 4ºC werden jedoch üblicherweise die Peptide und die Vertiefung über Nacht miteinander in Kontakt gebracht. Nach einer solchen Zeit wurden vorzugsweise jegliche nicht gebundenen Peptide entfernt. Dieser Schritt kann unter Verwendung jeder der herkömmlichen Methoden zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit von festen Trägern erfolgen. Vorzugsweise wird Absaugen verwendet. Nach dem Absaugen kann die Vertiefung auch mit einem Waschpuffer, wie Natriumphosphatpuffer (NaCl, 0,15 M; NaH&sub2;PO&sub4;; 0,06 M; Thimerosal, 0,01% und Tween 20, 0,05%, pH 7,4) gewaschen werden. Dieser Waschschritt ist jedoch nicht erforderlich. Nach dem Absaugen und/oder Waschen können dann zusätzliche Peptide oder Mischungen derselben durch Wiederholung der oben angeführten Aufbringungsvorgangsweise auf den festen Träger aufgetragen werden.
Bei einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird der Überschuß des ersten Peptids oder Cocktails aus der Vertiefung nicht entfernt, bevor die Vertiefung mit dem nächsten Peptid oder Cocktail in Kontakt gebracht wird. Bei dieser Ausführungsform werden vorzugsweise etwa gleiche Volumina jedes Peptids oder Cocktails verwendet. Wenn beispielsweise einzelne Peptidlösungen separat verwendet werden, würden 60 µml des ersten Peptids verwendet und nach 1 h 60 µl des zweiten Peptids hinzugefügt usw.. Wenn die HTLV- und HIV-Peptidcocktails verwendet würden, würden 120 µl des HTLV-Cocktails verwendet und nach 1 h 120 µl des HIV-Cocktails hinzugefügt. Nach einer weiteren Stunde würde die überschüssige Lösung entfernt und die Vertiefung gewöhnlich mit Puffer gewaschen werden.
Nachdem die gewünschten Peptide an das Trägermaterial gebunden worden sind und jegliche überschüssige Materialien entfernt worden sind, werden die Vertiefungen mit der zu testenden biologischen Probe behandelt. Vorzugsweise ist diese Probe ein Serum, obwohl andere Proben, wie Blut, Plasma, Speichel, Harn, Tränen, Milch oder Zerebrospinalflüssigkeit ebenfalls verwendet werden können. Die biologische Probe kann vor dem Assay auch mit einem Probenpuffer verdünnt werden. Ein Beispiel für einen solchen Puffer ist ein Natriumphosphatpuffer (Natriumphosphat, 6 mM; NaCl, 0,15 M; BSA, 2%; Pepton, 1,5%; Benzamidin, 80 mM; Tween 20, 1%; hitzeinaktiviertes Ziegenserum, 40%; Thimerosal, 0,01%; endgültiger pH: 7,2). Das pro Vertiefung zugegebene Volumen der Probenlösung ist vorzugsweise gleich fünf Sechstel des zur Beschichtung der Vertiefung verwendeten Maximalvolumnes. Wenn beispielsweise 240 µl Peptidlösung zur Beschichtung der Vertiefung verwendet würden, wäre das bevorzugte Volumen der zuzugebenden Probenlösung 200 µl.
Nach der Einwirkung der zu analysierenden Probe werden die Vertiefungen geleert, vorzugsweise unter Verwendung von Absaugen, und gewaschen. Nach dem Waschen wird mit Peroxidase markiertes anti-Human-IgG oder anti-Human-IgM in die Vertiefungen gegeben. Die Bestimmung der Peroxidase wird typischerweise mit einem entsprechenden Substrat, z.B. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, durchgeführt. Ohne von der Nützlichkeit dieses illustrativen Assays abzuweichen, kann die Peroxidase durch eine andere Markierung, z.B. durch radioaktive Fluoreszenz, Chemilumineszene oder Infrarot-emittierende oder -absorbierende Markierungen ausgetauscht werden.
Allgemeine Arbeitsvorschriften für die Synthese und die Verwendung der Peptide diese Erfindung sind nachstehend angegeben.

Arbeitsvorschrift 1: Herstellung von Harzen, die den mit N-FMOC geschützten Aminosäurerest tragen

Der gewünschtem mit N-FMOC geschützte Aminosäurerest in einer Mischung aus Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) und Dimethylformamid (DMF) (4:1) wurde zu einer Suspension aus p-Benzyloxyalkoholharz in CH&sub2;Cl&sub2;:DMF (4:1) bie 0ºC zugegeben. Die Mischung wurde händisch einige Sekunden lang gerührt und danach mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) behandelt, gefolgt von einer katalytischen Menge von 4-(Dimethylamino)-pyridin. Die Mischung wurde weitere 30 min lang bei 0ºC und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das gefilterte Harz wurde nacheinander mit CH&sub2;Cl&sub2;, DMF und Isopropanol (je 3 Waschungen) und schließlich mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das Harz wurde in CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert, in einem Eisbad gekühlt, und redestilliertes Pyridin wurde zur gerührten Suspension zugegeben, gefolgt von Benzoylchlorid. Es wurd 30 min lang bei 0ºC und danach 60 min lang bei Raumtemperatur weitergerührt. Nach dem Filtern wurde das Harz nacheinander mit CH&sub2;Cl&sub2;, DMF und Isopropanol (je 3 Waschungen) und schließlich mit Petrolether (zweimal) gewaschen, bevor es unter hohem Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurde.
Spektrophotometrische Bestimmung der Substitution nach Meienhofer et al. (Int. J. Peptide Protein Res., 13, 35, 1979) gibt den Substitutionsgrad am Harz an.

Arbeitsvorschrift 2: Bindung nachfolgender Aminosäuren

Das den ersten, mit N-FMOC geschützten Aminosäurerest tragende Harz wurde in ein Reaktionsgefäß eines Biosearch 9600 Peptide-Synthesizers gegeben und wie folge behandelt:
1) Waschen mit DMF (viermal je 20 s lang),
2) Vorwaschen mit einer 30% Lösung von Piperidin in DMF (3 min,
3) Entschützen mit einer 30% Lösung von Piperidin in DMF (7 min),
4) Waschen mit DMF (achtmal, je 20 s lang),
5) Überprüfen auf freie Aminogruppen - Kaiser-Test (muß positiv sein).
6) Das Peptidharz wurde dann 1 oder 2 h lang mit 8 Äquivalenten der gewünschten, mit FMOC geschützten Aminosäure und 1- Hydroxybenzotriazol und Benzotriazol-1-yloxy-tris- (dimethylamino)-phosphonium-hexafluorphosphat, alles in trockenem, redistilliertem DMF enthaltend 16 Äquivalente von 4-Methylmorpholin, sanft geschüttelt.
7) Waschen mit DMF (sechsmal, je 20 s lang).
Nach dem Schritt 7 wurde ein Aliquot für einen Ninhydrin- Test genommen. Sollte der Test negativ sein, geht man zu Schritt 1 zurück, um die nächste Aminosäure zu binden. Sollte der Test positiv oder schwach positiv sein, so sollte man die Schritte 6 und 7 wiederholen.
Das obige Schema kann zur Bindung jeder der Aminosäuren der bei dieser Erfindung beschriebenen Peptide verwendet werden. N- Schutz mit FMOC kann auch bei jder der übrigen Aminosäuren im Verlauf der ganzen Synthese verwendet werden.
Radioaktiv markierte Peptide können durch Einbau einer tritiierten Aminosäure unter Verwendung des obigen Bindungsprotokolls hergestellt werden.
Nach der Zugae der letzten Aminosäure wird der N-FMOC des N-terminalen Rests durch Rückkehr zu den Schritten 1-7 des obigen Schemas entfernt. Das Peptid-Harz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet, was das rohe, geschützte Peptid ergibt.

Arbeitsvorschrift 3: Entschützten und Abspalten des Peptids vom Harz

Das geschützte Peptid-Harz wurde in einer 55% Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) in CH&sub2;Cl&sub2;, enthaltend 2,5% Ethandithiol und 2,5% Anisol, suspendiert. Die Mischung wurde mit N&sub2; gespült und 1,5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert, und das Harz wurd mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das Harz wurde dann wiederum mit 20% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; behandelt, und zwar 5 min lang bei Raumtemperatur. Die Mischung wurde filtriert, und das Harz wurde mit 20% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; und danach mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum bei weniger als 35ºC eingedampft, und der Rückstand wurde mehrere Male mit trockenem Dimethylether trituriert. Der Feststoff wurde in 10% wässeriger Essigsäure gelöst und lyophilisiert, was das rohe Produkt ergab.
Die Arg- und Cys-Reste enthaltenden Peptide werden durch einstündige HF-Behandlung bei 0ºC in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid weiter entschützt. Die Peptide wurden mit 10% wässeriger Essigsäure extrahiert, mit Dimethylether gewaschen und lyophilisiert, was die rohen Peptide ergab.

Arbeitsvorschrift 4: Reinigung der Peptide

Die rohen Peptide wurden mittels präparativer HPLC auf einer Vydac Säule (2,5 x 25 mm) mit C&sub1;&sub8;- oder C&sub4;-Umkehrphase mit einem Gradienten der mobilen Phase gereinigt. Das Eluat wurde bei 220 nm und danach mittels analytischer HPLC überwacht. Relevante Fraktionen wurden gepoolt, eingedampft und lyophilisiert. Die Identität der synthetischen Peptide wurde mittels analytischer Umkehrphasenchromatographie und mittels Aminosäureanalyse verifiziert.

Arbeitsvorschrift 5: Gleichzeitiger Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II mittels eines Enzym-verbundenen Immunadsorptionstests (ELISA)

Die synthetischen Peptide wurden in 0,05 M Natriumcarbonat- Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) solubilisiert, um Peptidlösungen mit Peptidkonzentrationen zwischen etwa 5 µg/ml bis etwa 10 µg/ml zu bilden. Zwei Peptidcocktails wurden dann durch Mischung von Volumina dieser einzelnen Peptidlösungen hergestellt. Der erste Cocktail beinahltete synthetische Peptide für HTLV-I und HTLV- II. Der zweite Cocktail beinhaltete synthetische Peptide für HIV-1 und HIV-2. Die Gesamtpeptidkonzentration jedes Cocktails lag zwischen 5 µg/ml und 10 µg/ml.
Der HTLV-I/II-Cocktail wurde zuerst in die Vertiefungen gegeben. Danach wurde der HIV-1/2-Peptid-Cocktail an den Träger gebunden. In den nachfolgenden Beispielen wurden zuerste 120 µl des von HTLV-I/II-stammenden synthetischen Peptidcocktails in jede Vertiefung gegeben und die Platten über nacht bei 4ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann geleert und mit 240 µl des von HIV-1/2-stammenden synthetischen Peptidcocktails gefüllt. Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Es wurde ein Oyster Bay Versafill-Abgabesystem zum Füllen der Vertiefungen verwendet. Die Vertiefungen wurden durch Absaugen geleert und zweimal mit einem Waschpuffer (NaCl, 0,15 M; NaH&sub2;PO&sub4;, 0,06 M; Thimerosal, 0,01%, und Tween 20, 0,05%; pH 7,4 [0,3 ml/Vertiefung]) gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit 0,35 ml Waschpuffer 1 h lang bei 37ºC gesättigt und einmal mit dem gleichen Puffer ohne Tween 20 gewaschen. Die leeren Platten wurden 1 h lang bei 37ºC getrocknet und bis zur Verwendung vakuumverschlossen.
Zu anlaysierende Serumproben wurden mit Probenpuffer (Natriumphosphat, 6 mM; NaCl, 0,15 M; BSA, 2%; Pepton, 1,5%; Benzmidin, 80 mM; Tween 20, 1%; hitzeinaktiviertes Ziegenserum, 40%; Thimerosal, 0,01%, endgültiger pH: 7,2), verdünnt, und verdünnte Serumproben (0,2 ml) wurden in die Vertiefungen gegeben. Die gefüllten Vertiefungen wurden 30 min lang bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Die Vertiefungen wurden dann geleert und fünfmal mit Waschpuffer gewaschen.
Eine Konjugatlösung (mit Peroxidase markierter, Affinitätsgereinigter Ziegen-Antikörper zu Human-IgG, 0,5 mg in 5 ml 50% Glycerin), verdünnt mit 1% Gew./Vol. Rinderserumalbumin in einer Lösung enthaltend Tris, 0,05 M; NaCl, 0,5 M; Tween 20, 0,05%; Thimerosal 0,01% (pH 7,2) wurde in jede Vertiefung zugegeben (0,2 ml) und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann geleert und fünfmal mit dem Waschpuffer gewaschen. Eine Substratlösung (2 mg/ml, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in N-Methylpyrrolidon (NNP) in Acetatpuffer (0,1 M; pH 5,6) wurde mit 5 Volumina Peroxidlösung, enthaltend 0,015% Vol./Vol. 30% H&sub2;O&sub2; verdünnt und in jede Vertiefung zugegeben (0,2 ml pro Vertiefung). Nach 30 min wurde der Inhalt jeder Vertiefung mit 0,1 ml 1N H&sub2;SO&sub4; behandelt, und die optische Dichte wurde bei 450 nm abgelesen. Alle Bestimmungen erfolgten zweifach.
Unter Verwendung von Arbeitsvorschriften, die im wesentlichen wie die obigen waren, wurden die nachstehend besprochenen spezifischen Peptide hergestellt und dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit zum Nachweisen von HIV-1-, HIV-2-, HTLV-I- und HTLV- II-spezifischen Antikörpern bewertet.

Versuch 1

Bei diesem Versuch hatte der HTLV-Peptidcocktail eine Gesamtpeptidkonzentration von 10 µg/ml und war aus einer Mischung von BCH-219, BCH-234 und BCH-416 in einem Verhältnis von 1:1:1 zusammengesetzt, wobei jedes Peptid zuerst im in Arbeitsvorschrift 5 beschriebenen Carbonatspuffer zu einer Konzentration von 10 µg/ml gelöst wurde. Wie oben beschrieben wurden 120 µl diese synthetischen HTLV-I/II-Peptidcocktails in jede Vertiefung gegeben und bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Vertiefungen wurden geleert, und 240 µl des HIV-1/2-Peptidcocktails wurden zugegeben. Dieser HIV-1/2-Cocktail wurde durch Mischen von 3 Volumina einer BCH-408-Peptidlösung (10 µg/ml) mit zwei Volumina einer BCH-202ck-Lösung (10 µg/ml) gebildet, was einen Cocktail mit einer Gesamtpeptidkonzentration von 10 µg/ml ergab, der BCH-408 und BCH-202ck in einem Verhältnis von 3:2 enthielt. Die Adsorption der in diesem zweiten Cocktail vorhandenen Peptide und die weitere Verarbeitung der Platten erfolgte wie in Arbeitscorschrift 5 beschrieben. Zwei Serien von Platten wurden ebenfalls zubereitet, wobei 120 µl jedes Peptidcocktails verwendet wurden (d.h., eine Serie für von HIV-1/2-Stammende synthetische Peptide und eine Serie für von HTLV-I/II stammend synthetische Peptide). Diese Platten (HIV-EIA und HTLV-EIA) wurden in nebeneinanderlaufenden Untersuchungen mit den HTLV-HIV-kombinierten Platten (kombinierte HIV/HTLV-EIA) verwendet, um ihre Leistung beim Nachweisen von Antikörpern gegen HIV und HTLV in Blutserumproben zu vergleichen. Tabelle 1 zeigt diesen Vergleich. TABELLE 1 Signal/Cut off-Verhältnis aufgezeichnet unter Verwendung von: Probe Status kombinierter negative pos TABELLE 1 (Forts.) Signal/Cut off-Verhältnis aufgezeichnet unter Verwendung von: Probe Status kombinierter pos seroc.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 repräsentieren Signal/Cutoff- Verhältnisse. Der Cutoff ist die durchschnittliche Extinktion, die bei Plasmaproben erhalten wurde, welche von drei normalen Blutspendern genommen wurden, zu welchen ein Wert von 0,10 hinzugefügt wird. Ein Verhältnis ≥1,0 bedeutet eine positive Probe.
Proben, die in Tabelle 1 mit "NC" bezeichnet sind, waren negative Kontrollen, die von einem Patienten erhalten worden waren, der als HIV-1/2-negativ und HTLV-I/II-negativ bestätigt worden war. Proben mit der Bezeichnung "PC" waren positive Kontrollen, die von Patienten erhalten worden waren, die jeweils nur als HIV-1 positiv, HIV-2 positiv, HTLV-I positiv oder HTLV- II positiv verifiziert worden waren. Proben mit der Bezeichnung "AO2" (1 bis 25), "C" (20 bis 25) und "G" (80 bis 86) wurden von Boston Biomedia Inc. (BBI) erhalten. Ihr Status wurde durch BBI bestimmt. "Ind." ("indeterminate") bedeutet ein unklares Western Blot-Profil. "HIV-1 seroc." bedeutet, daß diese Plasma-Proben sequentiell von einem Spender genommen wurden, von welchem man im nachhinein herausfand, daß er mit HIV-1 infiziert war. Diese Patienten erzeugten mehrere Wochen, nachdem sie ein negatives Testergebnis für dieselben Antikörper erhalten hatten. Antikörper gegen HIV-1. Die Proben sind chronologische numeriert.
Im allgemeinen sind die Signal/Cutoff-Verhältnisse, die mit der HIV/HTLV-kombinierten Platte gemessen wurden, mit jenen vergleichbar, die mit Platten gemessen wurden, welche separat nur mit HIV-Peptiden beschichtet waren oder mit Platten gemessen wurden, die separat nur mit HTLV-Peptiden beschichtet waren. Dies ist ein überraschendes Ergebnis, weil man nach Verdünnung des Epitops, welches eine bestimmten Antikörper erkennt, eine wesentliche Signalverringerung hätte erwarten können. Im Falle co-infizierter HIV/HTLV-Proben, d.h. AO2-4, ist das mit der HIV/HTLV-Platte aufgezeichnete Signal/Cutoff-Verhältnis wesentlich höher (> 12) als jenes, welches auf der Platte gemessen wurde, die nur mit HTLV-Peptiden beschichtet war (2,95).
HIV-1-Serumkonversionen von Patienten C und G von anti-HIV- 1-negativ zu anti-HIV-1-positiv werden auf der HIV-Platte und der kombinierten HIV/HTLV-Platte gleichzeitig nachgewiesen.
Obwohl die kombinierte HIV/HTLV-Platte so gute Leistungen erbringt wie die mit HTLV-Peptid beschichtete Platte, wurden in mehreren Fällen (Proben AO2-3, AO2-13 und AO2-17) Proben, welche Antikörper gegen HTLV-II enthielten, weder in der kombinierten HIV-HTLV-, noch in der einzelnen HTLV-Platte als positiv nachgewiesen. Daher wurden im Bemühen, die Empfindlichkeit gegenüber HTLV-Antikörpern zu verbessern, andere Cocktails zusammengestellt und getestet.

Versuch 2

Dieser Versuch ist dem vorhergehenden sehr ähnlich. Die Zusammensetzung der beiden Peptidcocktails war folgende: der HTLV-Peptidcocktail hatte eine Gesamtpufferkonzentration von 10 µg/ml und enthielt BCH-234. BCH-416 und BCH-456 im Verhältnis 1:1:4. Er wurde unter Verwendung einzelner 10 µg/ml-Peptidlösungen hergestellt. Der HIV-Peptidcocktail hatte eine Gesamtpeptidkonzentration von 5 µg/ml und enthielt BCH-132, BCH-202ck und BCH-408 im Verhältnis 1:40:60. Er wurde unter Verwendung einzelner 5 µg/ml-Peptidlösungen hergestellt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, die in mit diesen Peptiden beschichteten Vertiefungen erhalten wurden. TABELLE 2 Probe Status Kombinierter Signal/Cutoff gemessen negativ pos TABELL2 (Forts.) Probe Status Kombinierter Signal/Cutoff gemessen pos seroc.
Die in Tabelle 2 angeführten Ergebnisse zeigten, daß die neuen Peptidzusammensetzungen die Empfindlichkeit gegenüber HTLV-spezifischen Antikörpern stark verbesserten. Beispielsweise stieg mit der neuen Peptidmischung die Probe AO2-3 von 0,69 (Tabelle 1) auf 1,08. Die acht Proben, die bei den in Versuch 1 verwendeten Cocktails schwach positiv waren (1,02 bis 1,70), ergaben bei den in Versuch 2 beschriebenen Peptidcocktails stark positive Signal/Cutoff-Verhältnisse (1,93 bis 9,79).
Die Empfindlichkeit gegenüber HIV-Antikörpernachweis wurde auch verbesert, jedoch in geringerem Ausmaß. Am meisten bemerkenswert ist die Erhöhung des Signal/Cutoff-Verhältnisses der Probe C-22 von 0,06 auf 0,89. Mit einer solchen Erhöhung wird diese Probe als "Grenz-negativ" klassifiziert. In vielen Labors werden "Grenz-negative" Proben für weitere Untersuchungen ausgewählt und hätten daher einer größere Chance, als positiv nachgewiesen zu werden.
Eine weitere Reihe von Tests wurde unter Verwendung von Platten mit denselben Peptidverhältnissen, hergestellt wie in Versuch 2 beschrieben, durchgeführt, um ihre Empfindlichkeit und Spezifität weiter zu beurteilen. Nachstehende Tabelle 3a und Tabelle 3b fassen die erhaltenen Daten zusammen. Tabelle 3a Status der getesteten Proben Anzahl getestet Anzahl reaktiv Anzahl als reaktiv bestätigt positiv (Platte mit niedr. Titer) Tabelle 3b Status der getesteten Proben Anzahl getestet Anzahl reaktiv Anzahl als reaktiv bestätigt % Spezifität Proben von schwangeren Frauen Routine HIV negativ Routine HTLV negativ Normale Blutspender * Beide Proben wurden als anti-HIV-1-positiv bestätigt.
Diese Ergebnisse zeigen die von diesem Assay-Kit bewiesene beeindruckende Empfindlichkeit. In Tabelle 3a wurde jeder der Antikörper gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II enthaltenden Proben mittels des kombinierten HIV/HTLV-Test-Kits richtig als positiv nachgewiesen. Diese Proben inkludierten eine Platte von Serumproben mit niedrigem Titer, die sehr geringe Konzentrationen von Antikörper gegen HIV-1 gegen.
Die Tabelle 3b zeigt die von diesem Assay-Kit bewiesene außerordentliche Spezifität. Von den 1295 geschreenten Proben wurde nur 1 falsch-positives Ergebnis bestätigt. Dieser Grad der Spezifität ist wesentlich besser als der akzeptable Bereich von um 99,5%.
Obwohl hierin eine Anzahl von Ausführungsform dieser Erfindung vorgelegt wurden, ist es offensichtlich, daß die grundlegende Konstruktion geändert werden kann, um andere Ausführungsformen zu schaffen, die die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung benützen. Daher ist es verständlich, daß der Umfang dieser Erfindung eher von den beigefügten Ansprüchen als von den spezifischen Ausführungsformen, die beispielhaft voranstehend angeführt sind, festgelegt ist.

Claims

1. Immunoassy-Kit zur gleichzeitigen Bestimmung von Antikörpern gegen HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II, der mindestens ein Peptid aus jeder von vier Gruppen von Peptiden, gebunden an einen festen Träger, enthält, wobei die Peptide der vier Gruppen die Formeln a-X-b, a-Y-b, a-Z-b und a-W-b aufweisen,

worin X ausgewählt ist unter und

sowie deren Analoga,

Y ausgewählt ist unter und

sowie deren Analoga,

Z ausgewählt ist unter

und

sowie deren Analoga

und

W ausgewählt ist unter und

sowie deren Analoga

wobei

a ein Carboxy-Terminus, 1 bis 8 Aminosäuren oder ein Substituent ist, der wirksam ist, um die Kupplung des Peptids zu erleichtern oder seine immunogene oder antigene Wirksamkeit zu erhöhen.

und

b ein Carboxy-Terminus, 1 bis 8 Aminosäuren oder ein Substituent ist, der wirksam ist, um die Kupplung des Peptids zu erleichtern oder seine immunogene oder antigene Wirksamkeit zu erhöhen.

und

2. Kit nach Anspruch 1, wobei die Peptide durch Festphasen- Peptidsynthese hergestellt sind.

3. Kit nach Anspruch 1, wobei die an den festen Träger gekuppelten HIV-1-Peptide.

und

sind

und das an den festen Träger gekuppelte HIV-2-Peptid

ist.

4. Kit nach Anspruch 1, wobei die an den Träger gekuppelten HTLV-I-Peptide.

und

sind

und das an den festen Träger gekuppelte HTLV-II-Peptid

ist.

5. Kit nach Anspruch 1, wobei der feste Träger eine Kunststoff- Mikrotitierplatte mit zahlreichen Vertiefungen ist.

6. Verfahren zur Herstellung des Immunoassay-Kits nach Anspruch 1, das folgende Schritte umfaßt:

(a) zunächst Kupplung der HTLV-I- und HTLV-II-Peptide an den festen Träger

sowie

(b) anschließende Kupplung der HIV-1- und HIV-2-Peptide an den festen Träger.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die HTLV-I-Peptide, die HTLV-II-Peptide, die HIV-1-Peptide und die HIV-2-Peptide zuerst mit 0,05 M Natriumcarbonat-hydrogencarbonat-Puffer unter Erhalt einer HTLV-I-Peptidlösung, einer HTLV-II- Peptidlösung, einer HIV-1-Peptidlösung bzw. einer HIV-2- Peptidlösung verdünnt werden, bevor sie an den festen Träger gekuppelt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die HTLV-I-Peptidlösung, die HTLV-II-Peptidlösung, die HIV-1-Peptidlösung und die HIV-2-Peptidlösung jeweils eine Peptidkonzentration von 5 bis 10 µg/ml aufweisen.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die HTLV-I-Peptidlösung und die HTLV-II-Peptidlösung zu einer HTLV-Peptid-Mischlösung gemischt werden, bevor die Kupplung an den festen Träger vorgenommen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die HTLV-Peptid-Mischlösung eine Gesamt-Peptidkonzentration von 5 bis 10 µg/ml aufweist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die HIV-1-Peptidlösung und die HIV-2-Peptidlösung zu einer HIV-Peptid-Mischlösung gemischt werden, bevor die Kupplung an den festen Träger vorgenommen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die HIV-Peptid-Mischlösung eine Gesamt-Peptidkonzentration von 5 bis 10 µg/ml aufweist.

13. Verwendung des Immunoassay-Kits nach Anspruch 1, die folgende Schritte umfaßt:

(a) Aufbringen einer biologischen Probe auf den festen Träger;

(b) Entfernung von überschüssiger biologischer Probe vom festen Träger;

(c) Waschen des beschichteten festen Trägers;

(d) Behandeln des gewaschenen festen Trägers mit einem entsprechenden Markierungsmittel

und

(e) Testen auf Vorliegen des Markierungsmittels am festen Träger.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die biologische Probe unter Blut, Plasma, Serum, Speichel, Urin, Tränenflüssigkeit, Milch und Cerebralflüssigkeit ausgewählt ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die biologische Probe Serum ist.

16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die biologische Probe zuerst mit einem Probenpuffer verdünnt wird, bevor sie auf den festen Träger aufgebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt (b) durch Absaugen durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Markierungsmittel mit Peroxidase markiertes anti-Humanimmunoglobulin G oder mit Peroxidase markiertes anti-Humanimmunoglobulin M ist.